CN112662663B - 一种适于常温运输的rna提取试剂盒及提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种适于常温运输的RNA提取试剂盒，其中的裂解结合液含有如下组分：1‑5M的异硫氰酸胍、0.2‑3M的硫氰酸钠、0.01‑0.1M的三羟甲基氨基甲烷、0.001‑0.05M的亚氨基二琥珀酸四钠、质量分数为0.05‑1%的抗坏血酸钠、质量分数为0.1‑2%的甜菜碱、质量分数为1‑6%的吐温20、0.05‑0.5M的乙酸钠、质量分数为25‑55%的异丙醇。该裂解结合液不含有苯酚等有毒有机溶剂，也不含蛋白酶K等需要冷链运输的试剂，因此RNA提取试剂盒可在常温条件下运输。本发明的试剂盒中裂解结合液具有裂解细胞/病毒和促进核酸与磁珠结合的作用，可一步完成裂解和结合，更加适配自动化核酸提取仪。

Description

一种适于常温运输的RNA提取试剂盒及提取方法

技术领域

本发明涉及核酸处理技术领域，具体涉及一种适于常温运输的RNA提取试剂盒及提取方法。

背景技术

随着检测技术的发展，病原核酸检测由于其高敏感和高特异的检测性能，已成为呼吸道病原诊断的主流检测手段。通过检测患者的鼻咽拭子、气道抽取物或痰液等呼吸道标本中病原体核酸，准确、快速地检测与区分普通呼吸道***感染与恶性病原感染，对病原感染做出快速诊断，且能快速区分病原型别和亚型/系，为后续采取针对性的防控、治疗措施提供依据和指导。

核酸提取是病原核酸检测的第一步，提取产物的得率和质量直接影响到后续检测结果的准确性和可靠性。高纯度、高浓度的核酸样品是分子生物学实验过程中获得良好实验结果的重要条件之一。目前最常用的核酸提取方法有Trizol法、柱膜法和磁珠吸附法。Trizol法主要使用试剂为苯酚，苯酚对人体有害，且提取过程需反复用枪吹打或剧烈震荡、多次离心等处理，不利于自动化；柱膜法虽然快速简便，获得的核酸纯度高、不使用有毒溶剂，但也需多次离心操作，且对RNA提取效率不高，也不利于自动化提取流程，通量较低。磁珠法以超顺磁纳米微球为载体，在微观界面上能与核酸分子特异性地识别和高效结合，可快速分离纯化DNA或RNA，提取过程无需离心或过滤，既可以手工操作，也可以使用自动化工作平台的形式完成，提取通量高、自动化程度好，适用于大样本量提取的需求。磁珠法核酸提取的操作步骤主要包括：(1)裂解；(2)结合；(3)洗涤；(4)分离四大部分。具体为细胞或病毒等在裂解液作用下将RNA释放出来，经过表面修饰的超顺磁性氧化硅纳米磁珠与所释放出的RNA进行特异性结合，形成核酸-磁珠复合物，后续在核酸-磁珠复合物中加入洗涤液，洗去非特异性吸附的蛋白质等杂质，去除杂质的核酸—磁珠复合物在磁场条件下分离富集磁珠，最后得到欲提取的核酸物质。

但是目前磁珠法提取也存在一些问题。主要包括以下几个方面：(1)大部分磁珠法核酸提取试剂盒包含蛋白酶K，蛋白酶K需要冷链运输，若常温下输送易导致蛋白酶K失活。冷链输送条件要求高，成本高(尤其是夏季)，不利于快速和应急运输。(2)目前市场上的基于磁珠法的商品化提取试剂盒提取过程一般需要加热步骤进行裂解孵育和核酸洗脱，而加热会对核酸产生一定程度的损伤，特别是对样本中的RNA，提取过程中如果采用50-60℃的加热会使样本中自带的、试剂耗材或环境中引入的RNase(RNA酶)达到最适温度条件，进而导致RNA样本降解损失。这种损失，对检测样本量不高、样本中病毒含量微量的情况更是无法接受的，容易造成严重的结果误判。(3)大部分磁珠法核酸提取核酸是将样本裂解、结合、洗涤和分离逐步完成，容易引入多个容器和耗材，增加引入外源RNA或RNase风险，同样不利于自动化。

发明内容

(一)要解决的技术问题

鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种适于常温运输的RNA提取试剂盒，其解决了基于蛋白酶K的RNA提取试剂盒存在的无法常温运输的问题，且本发明的RNA提取试剂盒不含有毒有机溶剂，在提取样本RNA过程中无需加热处理，采用一步处理同时完成裂解和结合，无需将裂解与结合分开操作，更加适配自动化核酸提取仪，操作流程简便快速，也适用于试剂预分装至深孔板，自动化操作更加简便快速。

(二)技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

第一方面，本发明提供一种适于常温运输的RNA提取试剂盒，其包括裂解结合液，所述裂解结合液含有如下组分：

浓度为1-5M的异硫氰酸胍、浓度为0.2-3M的硫氰酸钠、0.01-0.1M的三羟甲基氨基甲烷、0.001-0.05M的亚氨基二琥珀酸四钠、质量分数为0.05-1％的抗坏血酸钠、质量分数为0.1-2％的甜菜碱、质量分数为1-6％的吐温20、浓度为0.05-0.5M的乙酸钠、质量分数为25-55％的异丙醇。

根据本发明的较佳实施例，其中，所述裂解结合液的组成为：

浓度为2M的异硫氰酸胍、浓度为1M的硫氰酸钠、0.05M的三羟甲基氨基甲烷、0.01M的亚氨基二琥珀酸四钠、质量分数为0.10％的抗坏血酸钠、质量分数为0.5％的甜菜碱、质量分数为5％的吐温20、浓度为0.2M的乙酸钠、质量分数为45％的异丙醇。

根据本发明的较佳实施例，其中，RNA提取试剂盒还包含磁珠悬液、第一洗涤液、第二洗涤液和洗脱液；

优选地，所述磁珠悬液由以下成分组成：固含量20-40mg/mL的超顺磁性氧化硅纳米磁珠，所述超顺磁性氧化硅纳米磁珠的粒径介于200-500nm，分散于无核酸酶水中，磁珠悬液pH＝4.0-6.0。

优选地，所述第一洗涤液由以下成分组成：20-200mM的三羟甲基氨基甲烷、1-50mM的亚氨基二琥珀酸四钠、100-500mM的乙酸钠、0.1-2％的吐温20、体积分数40-60％的乙醇。

优选地，所述第二洗涤液为体积分数60-80％乙醇。

优选地，所述洗脱液由以下成分组成：1-10mM的亚氨基二琥珀酸四钠、1-100mM的tris-HCl缓冲液、0.01-0.2％的DEPC(焦碳酸二乙酯)。

根据本发明的较佳实施例，所述磁珠悬液的固含量为25mg/mL；所述第一洗涤液由以下成分组成：100mM的三羟甲基氨基甲烷、10mM的亚氨基二琥珀酸四钠、140mM的乙酸钠、0.50％的吐温20、55％的乙醇；所述第二洗涤液为70％无水乙醇；所述洗脱液由以下成分组成：1mM的亚氨基二琥珀酸四钠、10mM的tris-HCl缓冲液、0.010％的DEPC(焦碳酸二乙酯)。

需说明的是，上述裂解结合液、第一洗涤液、第二洗涤液、洗脱液中未作特别说明的剩余部分均为无RNase(核酸酶)水。

第二方面，本发明还提供一种使用上述RNA提取试剂盒从样本中提取病毒核酸的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)样本准备：取采样拭子样本浸泡于生理盐水中，充分震荡混匀后，静置2-5min，然后800-12,000rpm离心，制成病毒样本保存液；

(2)样本裂解及核酸吸附：取300-500μL病毒样本保存液用于检测；向步骤(1)的病毒样本保存液中加入1-2倍体积的裂解结合液，同时加入15-40uL的磁珠悬液，混匀后置于磁力架上，静置，待磁珠完全吸附后用弃去液体，得吸附后磁珠；

(3)漂洗：向步骤(2)所得磁珠中加入550-650μL第一次洗涤液，震荡混匀后置于磁力架上，静置至磁珠完全吸附后，弃去所有液体，保证无液体残留；再加入550-650μL第二次洗涤液震荡混匀后置于磁力架上，静置至磁珠完全吸附后，弃去所有液体，保证无液体残留；

(4)样本洗脱：向步骤(3)所得漂洗后磁珠中加入550-650μL的洗脱液，震荡混匀后置于磁力架上，待磁珠吸附后，收集洗脱液即为所得的核酸溶液，低温(-80℃)保存。

根据本发明方法的较佳实施例，所述提取过程采用32通道自动核酸提取仪进行提取。

根据本发明方法的较佳实施例，采用32通道自动核酸提取仪进行提取的方法为：在获得病毒样本保存液后，按照如下步骤操作：

步骤1：在深孔板1/7列加入裂解结合液400-500uL，病毒样本300-500uL病毒样本保存液，磁珠悬液15-40uL；提取仪设置为：混合15min，混合速度为快速，磁吸时间60s，不开启加热；

步骤2：在深孔板2/8列加入第一洗涤液550-600uL；提取仪设置为：混合2min，混合速度为中速，磁吸时间60s，不开启加热；

步骤3：在深孔板3/9列加入第二洗涤液550-600uL；提取仪设置为：混合2min，混合速度为中速，磁吸时间60s，不开启加热；

步骤4：在深孔板4/10列加入洗脱液55-60uL；提取仪设置为：等待6min后，混合10min，混合速度为慢速，磁吸时间90s，不开启加热。

最后对磁珠回收，即将洗脱液中的磁珠转移到前面的洗涤液中，避免磁珠粘附在磁棒套上，对检测环境产生污染。

(三)有益效果

(1)本发明的裂解结合液，同时包含裂解成分和结合促进剂，其中异硫氰酸胍和硫氰酸钠为蛋白变性剂，起到细胞/病毒结构裂解的作用；乙酸钠和异丙醇为结合促进剂，起到促进核酸与磁珠结合的作用；其中，三羟甲基氨基甲烷、亚氨基二琥珀酸四钠、抗坏血酸钠为稳定成分，三羟甲基氨基甲烷起到缓冲剂作用以提供稳定的缓冲坏境，亚氨基二琥珀酸四钠为金属离子螯合剂，起到抑制RNase(核酸酶)防止核酸降解的作用，抗坏血酸钠为还原剂，以稳定RNA分子结构；其中，甜菜碱为两性离子表面活性剂，吐温20为非离子型表面活性剂，共同起到去除蛋白、酯类等杂质等作用，减少磁珠吸附的杂质。亚氨基二琥珀酸四钠为可生物降解的绿色金属离子螯合剂，避免使用EDAT产生的水体污染和不易分解的问题。

(2)本发明的裂解结合液不含有苯酚等有毒有机溶剂，也不含有蛋白酶K等需要冷链运输的试剂，因此本发明的RNA提取试剂盒可在常温下条件运输。

(3)本发明的裂解结合液同时具有裂解细胞/病毒和促进核酸与磁珠结合的作用，因此可采用一步法实现裂解和结合，无需分开操作，减少RNA的损失或外源RNA引入的干扰，且更加适配自动化核酸提取仪，操作流程简便。

(4)本发明的裂解结合液将上述两种不同作用机理的蛋白变性剂联合使用，硫氰酸钠是一种离液剂，具有破坏水分子结构稳定性的特点，作用于疏水性分子，能够增加分子的水溶性，与表面活性剂配合使用，主要是用于加快蛋白质和脂类物质的消解速度，提高处理效率。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，主要用于溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。相比单独使用一种蛋白质变性剂，可以增强对复杂化学性质蛋白质等杂质的去除能力。

本发明联合使用了不同类型的表面活性剂(甜菜碱和吐温20)，用于与硫氰酸钠配合发挥裂解去污作用。蛋白质是一种包含非极性、极性和带电基团的复杂生物大分子，不同类型的表面活性剂与蛋白质的相互作用不同，甜菜碱属于两性离子表面活性剂，吐温20属于非离子型表面活性剂，添加两种类型的表面活性剂可以针对蛋白质化学性质的复杂性来增强去污能力。

本发明将两种结合促进剂乙酸钠和异丙醇联合使用，乙酸钠能够改变核酸表面的电荷分布，钠离子能够在磁珠表面羟基与核酸表面带负电基团间充当电桥，使核酸通过静电吸附至磁珠上，异丙醇能够破坏RNA周围的水化层，促使RNA脱水聚集结合到磁珠上。若单独使用其中一种结合促进剂，则需要提高使用浓度，而高浓度的乙酸钠会导致难以洗涤，提取的核酸携带大量的盐，会抑制后续的PCR反应。而过高浓度的异丙醇不利于样本中其他杂质的去除。

本发明还加入起到pH缓冲作用的三羟甲基氨基甲烷、金属螯合剂、还原剂抗坏血酸钠等稳定成分，有利于保证提取的RNA的稳定性，减少损失，特别有助于咽拭子等微量测试样本中病毒RNA的提取。

具体实施方式

为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合具体实施方式，对本发明作详细描述。

本发明提供一种不含蛋白酶K、不含苯酚等有毒有机物的RNA提取试剂盒，其包括裂解结合液、磁珠悬液、第一洗涤液、第二洗涤液和洗脱液。其中裂解结合液含有如下成分：

浓度为1-5M的异硫氰酸胍、浓度为0.2-3M的硫氰酸钠、0.01-0.1M的三羟甲基氨基甲烷、0.001-0.05M的亚氨基二琥珀酸四钠、质量分数为0.05-1％的抗坏血酸钠、质量分数为0.1-2％的甜菜碱、质量分数为1-6％的吐温20、浓度为0.05-0.5M的乙酸钠、质量分数为25-55％的异丙醇。

磁珠悬液是将粒径介于200-500nm的超顺磁性氧化硅纳米磁珠分散于无核酸酶水中得到，固含量为20-40mg/mL，pH＝4.0-6.0。

第一洗涤液成分为：20-200mM的三羟甲基氨基甲烷、1-50mM的亚氨基二琥珀酸四钠、100-500mM的乙酸钠、0.1-2％的吐温20、体积分数40-60％的乙醇。

第二洗涤液为体积分数60-80％乙醇。

洗脱液为：1-10mM的亚氨基二琥珀酸四钠、1-100mM的tris-HCl缓冲液、0.01-0.2％的DEPC(焦碳酸二乙酯)。焦碳酸二乙酯是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。

上述裂解结合液、磁珠悬液、洗涤液、洗脱液等中未做特别说明的部分为不含RNase的水或用于调节/维持所需pH的缓冲液。

实施例

采用本发明的RNA病毒核酸提取试剂盒(Cellpro)和市面在售的RNA病毒核酸提取试剂盒(CompA)进行RNA假病毒核酸提取，并经反转录、荧光定量PCR检测试剂盒检测。

样本准备：RNA假病毒浓度为5000copies/mL，500copies/mL样本，每种核酸提取试剂盒每种浓度平行提取8份，按照各自试剂盒说明书的提取程序进行核酸提取。提取完成后进行反转录，qPCR检测。

其中，本发明的RNA病毒核酸提取试剂盒(Cellpro)的组成如下：

①裂解结合液，组成如下(表1)：

②磁珠悬液，组成如下：

超顺磁性氧化硅纳米磁珠，粒径介于200-500nm，分散于无核酸酶水中，得到固含量25mg/mL的超顺磁性氧化硅纳米磁珠悬液，其pH＝5.0。

③第一洗涤液，组成如下(表2)：

组分	浓度
		三羟甲基氨基甲烷	100mM
亚氨基二琥珀酸四钠	10mM
		乙酸钠	140mM
吐温20	0.50％
		乙醇	55％

④第二洗涤液

70％乙醇溶液。

⑤洗脱液(表3)

洗脱液	浓度
		亚氨基二琥珀酸四钠	1mM
tris-HCl	10mM
		DEPC	0.10％

使用上述组成的RNA提取试剂盒，采用32通道自动核酸提取仪提取，操作步骤为：

步骤1:在深孔板1/7列加入裂解结合液400uL，RNA病毒样本保存液350uL，磁珠悬液20uL。

样本包括：RNA假病毒浓度为5000copies/mL，500copies/mL两个规格；

步骤2:在2/8列加入第一洗涤液600uL；

步骤3:在3/9列加入第二洗涤液600uL；

步骤4:在4/10列加入洗脱液60uL。

所述32通道自动核酸提取仪的参数设置如下表(表4)：

最终，RNA假病毒实验检测结果(PRC扩增的Ct值)如下表(表5)：

结果显示本发明的RNA病毒核酸检测试剂盒提取的RNA，qPCR检测CT值要比市面在售产品提前约1个CT，且8个样本重复性(cv)较好。检测结果表明本发明试剂盒具备较好的RNA病毒核酸提取效果。

上述实施例是以32通道自动核酸提取仪提取为例进行说明。可以理解的，也可采用手动人工操作，具体过程为：

(1)样本裂解及核酸吸附：取300-400μL假病毒制备样本保存液用于检测；向假病毒样本保存液中加入1-2倍体积的裂解结合液，同时加入15-40uL的磁珠悬液，混匀后置于磁力架上，静置，待磁珠完全吸附后用弃去液体，得吸附后磁珠；

(2)漂洗：向步骤(1)所得磁珠中加入550-650μL第一次洗涤液，震荡混匀后置于磁力架上，静置至磁珠完全吸附后，弃去所有液体，保证无液体残留；再加入550-650μL第二次洗涤液震荡混匀后置于磁力架上，静置至磁珠完全吸附后，弃去所有液体，保证无液体残留；

(3)样本洗脱：向步骤(2)所得漂洗后磁珠中加入550-650μL的洗脱液，震荡混匀后置于磁力架上，待磁珠吸附后，收集洗脱液即为所得的核酸溶液，-80℃保存。

对比例1

本例是在实施例1的“裂解结合液”基础上，去掉蛋白质变性剂“硫氰酸钠”，而将“异硫氰酸胍”浓度改为3M。

对比例2

本例是在实施例1的“裂解结合液”基础上，去掉蛋白质变性剂“异硫氰酸胍”，而将“硫氰酸钠”浓度改为3M。

对比例3

本例是在实施例1的“裂解结合液”基础上，去掉乙酸钠，同时提高异丙醇的用量至体积分数为60％。

对比例4

本例是在实施例1的“裂解结合液”基础上，去掉甜菜碱，同时提吐温-20的用量7.5％。

对比例5

本例是在实施例1的“裂解结合液”基础上，去掉吐温-20，同时提甜菜碱的用量5.5％。

使用对比例1-5组成的RNA提取试剂盒，采用32通道自动核酸提取仪提取，核酸提取仪参数参见表4。

RNA假病毒实验检测结果(PRC扩增的Ct值)如下表(表6)：

由此说明，本发明的裂解结合液将两种不同作用机理的蛋白变性剂联合使用，相比单独使用一种蛋白质变性剂，本发明使用硫氰酸钠和异硫氰酸胍联合使用，具有更好的扩增效果，实施例1提取的核酸PCR扩增的平均CT值比对比例1,2提前3-4个CT。说明单独使用一种蛋白变性剂，提取的核酸浓度偏低，裂解效果较差。

本发明将两种结合促进剂乙酸钠和异丙醇联合使用，相比单独使用一种结合促进剂，具有更好的核酸结合效果。核酸扩增结果表明，对比例3出现了未检出样本(NA)，扩增出的样本CT值也明显靠后。单独使用一种结合促进剂，核酸很难更完全地结合至磁珠上，而利用多种结合促进剂的协同效应，核酸更易结合至磁珠上。

本发明联合使用了不同类型的表面活性剂(甜菜碱和吐温20)，用于与硫氰酸钠配合发挥裂解作用，相比单独使用一种表面活性剂，提取的核酸具有更好的扩增效果。对比例4和对比例5单独使用一种类型的表面活性剂，会因蛋白质基团的多样性，导致去污能力下降，导致PCR扩增能力下降，CT至靠后甚至不检出。针对蛋白质基团化学性质的复杂多样性，添加多种类型的表面活性剂联用，能够增强表面活性剂与蛋白质的相互作用。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (5)

1.一种适于常温运输的RNA提取试剂盒，其特征在于，其包括裂解结合液，磁珠悬液、第一洗涤液、第二洗涤液和洗脱液；

所述裂解结合液含有如下组分：浓度为2M的异硫氰酸胍、浓度为1M的硫氰酸钠、0.05M的三羟甲基氨基甲烷、0.01M的亚氨基二琥珀酸四钠、质量分数为0.10%的抗坏血酸钠、质量分数为0.5%的甜菜碱、质量分数为5%的吐温20、浓度为0.2M的乙酸钠、质量分数为45%的异丙醇；

所述磁珠悬液由以下成分组成：固含量20-40mg/mL的超顺磁性氧化硅纳米磁珠，所述超顺磁性氧化硅纳米磁珠的粒径介于200-500nm，分散于无核酸酶水中，磁珠悬液pH=4.0-6.0；

所述第一洗涤液由以下成分组成：20-200mM的三羟甲基氨基甲烷、1-50mM的亚氨基二琥珀酸四钠、100-500mM的乙酸钠、0.1-2%的吐温20、体积分数40-60%的乙醇；

所述第二洗涤液为体积分数60-80％乙醇；

所述洗脱液由以下成分组成：1-10mM的亚氨基二琥珀酸四钠、1-100mM的tris-HCl缓冲液、0.01-0.2%的DEPC。

2.根据权利要求1所述的适于常温运输的RNA提取试剂盒，其特征在于，所述磁珠悬液的固含量为25mg/mL；所述第一洗涤液由以下成分组成：100mM的三羟甲基氨基甲烷、10mM的亚氨基二琥珀酸四钠、140mM的乙酸钠、0.50%的吐温20、55%的乙醇；所述第二洗涤液为70％无水乙醇；所述洗脱液由以下成分组成：1mM的亚氨基二琥珀酸四钠、10mM的tris-HCl缓冲液、0.010%的DEPC。

3.一种使用权利要求1或2所述的RNA提取试剂盒从样本中提取病毒核酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）样本准备：取采样拭子样本浸泡于生理盐水中，充分震荡混匀后，静置2-5min，然后800-12,000rpm离心，制成病毒样本保存液；

（2）样本裂解及核酸吸附：取300-500μL病毒样本保存液用于检测；向步骤（1）的病毒样本保存液中加入1-2倍体积的裂解结合液，同时加入15-40uL的磁珠悬液，混匀后置于磁力架上，静置，待磁珠完全吸附后用弃去液体，得吸附后磁珠；

（3）漂洗：向步骤（2）所得磁珠中加入550-650 μL第一次洗涤液，震荡混匀后置于磁力架上，静置至磁珠完全吸附后，弃去所有液体，保证无液体残留；再加入550-650μL第二次洗涤液震荡混匀后置于磁力架上，静置至磁珠完全吸附后，弃去所有液体，保证无液体残留；

（4）样本洗脱：向步骤（3）所得漂洗后磁珠中加入550-650 μL的洗脱液，震荡混匀后置于磁力架上，待磁珠吸附后，收集洗脱液即为所得的核酸溶液，-80℃保存。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，采用32通道自动核酸提取仪进行提取。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，采用32通道自动核酸提取仪进行提取的方法为：在获得病毒样本保存液后，按照如下步骤操作：

步骤1：在深孔板1/7列加入裂解结合液400-500uL，病毒样本300-500uL病毒样本保存液，磁珠悬液15-40uL；提取仪设置为：混合15min，混合速度为快速，磁吸时间60s，不开启加热；

步骤2：在深孔板2/8列加入第一洗涤液550-600uL；提取仪设置为：混合2min，混合速度为中速，磁吸时间60s，不开启加热；

步骤3：在深孔板3/9列加入第二洗涤液 550-600uL；提取仪设置为：混合2min，混合速度为中速，磁吸时间60s，不开启加热；

步骤4：在深孔板4/10列加入洗脱液55-60uL；提取仪设置为：等待6min后，混合10min，混合速度为慢速，磁吸时间90s，不开启加热。