CN114292841B

CN114292841B - 核酸提取试剂和核酸提取方法

Info

Publication number: CN114292841B
Application number: CN202111661343.9A
Authority: CN
Inventors: 邹永龙; 张佳斌; 田付友; 曲峰; 何宗顺
Original assignee: Suzhou Cretaceous Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suzhou Cretaceous Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-12-30
Filing date: 2021-12-30
Publication date: 2023-06-09
Anticipated expiration: 2041-12-30
Also published as: CN114292841A

Abstract

本发明属于核酸提取领域，涉及核酸提取试剂和核酸提取方法。具体地说，本发明涉及包括三羟基甲基氨基甲烷、氯化锂、NaSCN、甘油和十二烷基硫酸锂的一种裂解试剂，包括硫酸铝钾、醋酸钠和醋酸的抑制剂去除试剂以及由其制得的相应缓冲液及其在环境样品DNA提取中的应用。本发明还涉及采用所述裂解试剂和/或抑制剂去除试剂的核酸提取方法。本发明所提供的核酸提取试剂操作简单、快捷，可以针对不同的环境样本中微生物DNA实现高质量的提取。

Description

核酸提取试剂和核酸提取方法

技术领域

本发明涉核酸提取试剂领域，尤其涉及用于提取来自环境中的生物样本，特别是含有微生物的样本中的核酸的提取或检测试剂。

背景技术

环境样本中的微生物群落研究需要先提取其中生物样本中的核酸，这类样本的核酸提取和分析是极具挑战的，这主要是有以下几个原因造成的。1)环境样本如土壤、粪便、堆肥、污泥、废水等样本中包含多种PCR抑制剂，例如：重金属、多糖、多酚、胆酸盐、腐殖酸等极为少量的存在就会强烈地抑制PCR反应。例如土壤样本中富含了腐殖酸、富里酸和胡敏素，常规的提取土壤微生物的方法DNA的溶液是黄褐色的就是上述物质的污染。2)土壤、粪便和废水等环境样本中微生物相对于单纯培养的微生物更难以裂解，常规的提取方法获得了微生物细胞裂解率低，因此所获得DNA不能反映原始样品中的物种丰度。

因此，高度需要高效和实际的基础研究工具及试剂，以确保微生物群落的组成的精确表征、研究微生物群落内相互依赖的功能，并允许操作微生物群落内以及微生物群落与其宿主之间的相互作用。迫切需要下一代工具，例如用于微生物核酸的分离和纯化试剂盒。

目前市场上现有的用于从环境样本和生物样本中分离DNA的试剂盒包括MO BIOLaboratories公司提供的

DNA Isolation Kit，Power/>

DNA IsolationKit和/>

DNA Isolation kit，Qiagen公司提供的/>

ProDNA Kit、/>

Fast DNA Stool Mini Kit、/>

Pro Kit和

Kit，但是其操作非常繁琐，需要反复离心，且售价极为昂贵，单个样本的提取为30-50元RMB，操作不同的样本需要适用不同的提取试剂盒。

中国发明专利CN107475249 A提出一种从生物量低且富含腐殖质的土壤中提取微生物总DNA的方法，通过液氮研磨、蛋白酶K消化的方式，但其操作依然需要Qiagen公司的土壤DNA提取试剂盒对粗提取的DNA进行进一步纯化，其发明本质是提供了一种土壤样本的前处理方式并得到DNA粗提物，而非提供一种完整的解决方案。

综上所述，虽然现有技术中不能提供一种通用、简单、便捷的试剂盒去解决多种复杂环境样本中微生物基因组DNA的高质量提取，即得到纯度好、完整性好、得量高的微生物组DNA。

发明内容

本发明实施例的目的是提供一种核酸提取试剂，本发明所提供的核酸提取试剂操作简单、快捷，可以针对不同的环境样本中微生物DNA实现高质量的提取。

为了实现本发明的上述目的，本发明在第一方面提供了一种裂解试剂，所述裂解试剂包括如下组分：三羟基甲基氨基甲烷、氯化锂、NaSCN、甘油和十二烷基硫酸锂。

本发明在第二方面提供了一种裂解缓冲液，所述裂解缓冲液由本发明第一方面所述的裂解试剂配制得到。

优选的是，所述裂解缓冲液包含50-500mM的三羟基甲基氨基甲烷、100-500mM的氯化锂、1-5M的NaSCN、质量体积百分比为0.5-20％的甘油、0.1-5％的十二烷基硫酸锂，并且pH为8.0-12.5。

更优选的是，所述裂解缓冲液包含100-200mM的三羟基甲基氨基甲烷、200-300mM的氯化锂、2-3M的NaSCN、质量体积比为1-5％的甘油、0.5-2％的十二烷基硫酸锂，并且pH为8.5-11.5。

进一步优选的是，所述裂解缓冲液包含200mM三羟基甲基氨基甲烷，200mM氯化锂，3M NaSCN，质量体积比为5％甘油，2％十二烷基硫酸锂，并且pH为11.0。

本发明在第三方面提供给了一种抑制剂去除试剂，所述抑制剂去除试剂包括如下组分：硫酸铝钾、醋酸钠和醋酸。

本发明在第四方面提供了一种抑制剂去除缓冲液，所述抑制剂去除缓冲液由本发明第三方面所述的抑制剂去除试剂配制得到。

优选的是，所述抑制剂去除缓冲液包含0.1-2M硫酸铝钾、0.5-5M醋酸钠，并使用醋酸将pH调节至pH 3.5-7.5。

更优选的是，所述抑制剂去除缓冲液包含0.2-1M硫酸铝钾、0.5-2M醋酸钠和并使用醋酸将pH调节至pH 4-6。

进一步优选的是，所述抑制剂去除缓冲液包含0.5M硫酸铝钾、2M醋酸钠和并使用醋酸将pH调节至pH 4。

本发明在第五方面提供了一种核酸提取方法，所述方法包括如下步骤：

S1：利用研磨珠对环境样本进行机械裂解，并用裂解缓冲液对所述环境样本进行化学裂解，由此得到粗裂解物；

S2：将所述粗裂解物进行离心，获得上清液，向所述上清液中加入抑制剂去除缓冲液以去除所述环境样本包含的PCR抑制剂，离心获得粗DNA产物；

S3：使用磁性微球和结合缓冲液对所述粗DNA产物中的DNA进行结合绑定，得到结合DNA产物；

S4：使用洗涤液进行清洗，得到清洗DNA产物；

S5：使用TE缓冲液对所述清洗DNA产物进行加热洗脱，得到最终的DNA。

本发明对离心的转速和时间没有特别要求。在申请的上下文中，除非另有说明，否则本发明方法的各步骤中所涉及到的离心都采用转速为6000-12000rpm，时间为1-2min的离心条件。优选的是，在步骤S1中，所述研磨珠为0.1-3mm的氧化锆珠、0.1-5mm的玻璃珠、0.2-1.5mm的石榴石、0.2-0.5mm的碳化硅、0.3-4.5mm的金属球和/或其组合。优选的是，所述研磨珠为0.1-3mm的氧化锆珠、0.1-2mm的玻璃珠、0.3-1.0mm的石榴石和/或其组合。更优选的是，所述研磨珠为0.1-3mm的氧化锆珠、0.1-1mm的玻璃珠和/或其组合。

另外优选的，所述裂解缓冲液由本发明第一方面所述的裂解试剂制得或为本发明第二方面所述的裂解缓冲液。

优选的是，在步骤S2中，所述抑制剂去除缓冲液由本发明第三方面所述的抑制剂去除缓冲试剂配制得到，或者为本发明第四方面所述的抑制剂去除缓冲液。

优选的是，在步骤S3中，所述磁性微球为硅羟基磁珠、玻璃磁珠、羧基磁珠、氨基磁珠、甲苯磺酰基磁珠、环氧基磁珠和/或其组合。更优选的是，所述磁性微球为硅羟基磁珠、玻璃磁珠、羧基磁珠和/或其组合；进一步优选的是，所述磁性微球为苏州白垩纪生物科技有限公司生产的磁珠系列产品，例如为硅羟基磁珠MagH1N Silica(Cat#BMD007511)、硅羟基磁珠MagH1Silica(Cat#BMD003511)、玻璃磁珠Mag2000 Silica(Cat#BMD004511)。

另外优选的是，在步骤S3中，所述结合缓冲液为离液盐和醇的混合物。更优选的是，所述离液盐为盐酸胍、硫氰酸钾、异硫氰酸胍、硫氰酸钠、硫氰酸钾、碘化钠、高氯酸钠和/或其组合。另外优选的是，所述醇为乙醇或异丙醇。进一步优选的是，所述结合缓冲液包含1-5M异硫酸氰胍、0.2-2M碘化钠和体积比为30-70％的异丙醇。又进一步优选的是，所述结合缓冲液包含2-3M异硫酸氰胍、0.5-2M碘化钠和体积比为30-60％的异丙醇。

优选的是，在步骤S4中，所述清洗依次采用第一洗涤液和第二洗涤液进行清洗，并且所述第一洗涤液包含0.5-4异硫酸氰胍，0.5-3M氯化锂，0.1-0.5M三羟基甲基氨基甲烷，体积比为30-70％乙醇，并且pH为5.0-8.0，所述第二洗涤液为0.1-1M氯化钠、0.1-0.2M三羟基甲基氨基甲烷和积比为50-90％乙醇；

优选的是，所述第一洗涤液包含1-2M异硫酸氰胍，1-2M氯化锂，0.1-0.2M三羟基甲基氨基甲烷和体积比为50-60％的乙醇，并且pH为5.0-8.0，所述第二洗涤液为0.5M氯化钠，0.1M三羟基甲基氨基甲烷和积比为70-80％乙醇。

优选的是，在步骤S5中，所述TE缓冲液包含10mM Tris-HCl和1mM EDTA，并且pH为8.5。更优选的是，所述加热洗脱的加热温度为55℃至65℃(例如60℃)。进一步优选的是，所述加热洗脱之前还经过挥发除醇的步骤。

在一些更具体的实施方式中，所述方法包括如下步骤：

S1：提供一种裂解缓冲液和配套使用的研磨珠，使用组织研磨仪对环境样本中的微生物同时进行化学和机械裂解，以产生粗裂解物；

S2：将所述粗裂解物进行离心(取上清液，并加入IRS缓冲液(Inhibitor RemovalSolution)，涡旋振荡后以去环境样本中的PCR抑制剂，离心后得基本不含抑制剂的粗DNA产物；

S3：使用磁性微球和结合缓冲液对所述粗DNA产物进行结合绑定，得到结合DNA产物；

S4：使用第一洗涤液进行清洗1次，第二洗涤液清洗1次；

S5：挥发除醇后，使用TE Buffer进行加热洗脱，以得到最终(纯净)的DNA。

本发明对涡旋振荡的条件没有特别要求。在本申请的上下文中，除非另有说明，否则本发明方法的各步骤中所涉及到涡旋振荡都采用速度为1000rpm、时间为1min的涡旋条件。

在所述步骤S1中，所述裂解缓冲液采用特定的试剂组合和特定的配比以及适合的pH，能够溶解杂质、释放样本中的核酸。其中所述的NaSCN和甘油用来溶解腐殖酸、胆汁酸等环境样本中的PCR抑制剂。

在另一些更具体的实施方式中，所述方法包括如下步骤：

S1：提供一种裂解缓冲液(100-200mM三羟基甲基氨基甲烷，200-300mM氯化锂，2-3M NaSCN，质量体积比为1-5％甘油，0.5-2％十二烷基硫酸锂，pH 8.5-11.5。)和配套使用的研磨珠(0.1-3mm的氧化锆珠、0.1-1mm的玻璃珠和/或其组合)，使用组织研磨仪对环境样本中的微生物同时进行化学和机械裂解，以产生粗裂解物；

S2：将所述粗裂解物进行离心取上清液，并加入IRS缓冲液(100-250mM硫酸铝钾、200-500mM醋酸钠和并使用醋酸将pH调节至pH 4-6)，涡旋振荡后以去环境样本中的PCR抑制剂，离心后得基本不含抑制剂的粗DNA产物；

S3：使用磁性微球(硅羟基磁珠、玻璃磁珠、羧基磁珠和/或其组合)和结合缓冲液(2-3M异硫酸氰胍、1-2M碘化钠以及体积比为30-60％的异丙醇)对上述的DNA进行结合绑定，得到结合DNA产物；

S4：使用第一洗涤液(1-2M异硫酸氰胍，1-2M氯化锂，0.1-0.2M三羟基甲基氨基甲烷，体积比为50-60％乙醇，pH 5.0-8.0)进行清洗1次，第二洗涤液(0.2M氯化钠、0.1M三羟基甲基氨基甲烷,积比为70-80％乙醇)清洗1次，得到经清洗的DNA产物；

S5：挥发除醇后，使用TE Buffer(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.5)进行加热洗脱，以得到纯净的DNA。

在另一些更具体的实施方式中，所述方法依次包括如下步骤：

1)称取0.05-0.5g的环境样本(所述环境样本可以选自土壤、粪便、过滤废水膜、生物被膜等中的一种或多种样本)，加入0.4-1mL裂解缓冲液和0.25-2g的研磨珠，使用珠研磨仪进行机械裂解，研磨速度推荐为4-6m/s，研磨时间为1-3分钟。

2)将上述的粗裂解物进行离心取上清液，加入0.1-0.4mL IRS缓冲液，涡旋振荡后，离心去除PCR抑制剂，将上清液转移至1个干净的离心管中。

3)加入1-2mg磁性微球和等体积的结合缓冲液，涡旋振荡5min进行核酸绑定。

4)磁性分离，去除上清液，加入0.5-1mL第一洗涤液，涡旋振荡1min去除大分子杂质。

5)磁性分离，去除上清液，加入0.5-1mL第二洗涤液，涡旋振荡1min去除无机盐杂质。

6)磁性分离，去除上清液，室温挥发除醇后，使用50-200μL TE Buffer(10mMTris-HCl，1mM EDTA，pH8.5)在60度下加热洗脱5min，磁性分离后，吸取上清液，得到纯净的DNA。

本发明在第六方面提供了一种用于提取环境样本中的核酸的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的裂解试剂和/或本发明第三方面所述的抑制剂去除试剂。可选的或另外优选的是，所述试剂盒还包括用于配制本发明第五方面所述的第一洗涤液的试剂。可选的或另外优选的是，所述试剂盒还包括用于配制本发明第五方面所述的第二洗涤液的试剂。可选的或另外优选的是，所述试剂盒还包括本发明第五方面所述的研磨珠。可选的或另外优选的是，所述试剂盒还包括本发明第五方面所述的磁性微球。可选的或另外优选的是，所述试剂盒还包括用于配制本发明第五方面所述的结合缓冲液的试剂(例如离液盐和醇，所述离液盐和醇优选如上所述)。可选的或另外优选的是，所述试剂盒还包括用于配制本发明第五方面所述的TE缓冲液的试剂(例如Tris-HCl和EDTA)。本发明第六方面所提及的试剂可以如本发明第一至第五中所述，在此不再赘述。

本发明在第七方面提供了本发明第六方面所述的试剂盒中所包括的本发明第一方面所说的裂解试剂、本发明第二方面所述的裂解缓冲液、本发明第三方面所述的抑制剂去除试剂、本发明第四方面所述的抑制剂去除缓冲液、所述研磨珠中的一种或多种组合在环境样本的DNA提取或检测中的应用；或者，本发明第六方面所述的试剂盒中所包括的本发明第一方面所说的裂解试剂、本发明第二方面所述的裂解缓冲液、本发明第三方面所述的抑制剂去除试剂、本发明第四方面所述的抑制剂去除缓冲液、所述研磨珠中的一种或多种组合进一步与所述结合缓冲液(或用于配制所述结合缓冲液的试剂)、所述TE缓冲液(或用于配制所述TE缓冲液的试剂)、所述第一洗涤液(或用于配制所述第一洗涤液的试剂)、所述第二洗涤液(或用于配制所述第二洗涤液的试剂)组合在环境样本的DNA提取或检测中的应用。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

1)本发明提供一种环境样本微生物组DNA的核酸提取试剂，该提取试剂对土壤、粪便、堆肥、污泥等样本中微生物DNA都可以取得较好的效果。

2)本发明方法无需繁琐的操作，提取时间短、只需要30分钟以内就可以提取高质量的DNA。

3)本发明提供了一种可以几乎完全去除环境样本中PCR抑制剂的核酸提取试剂，使下游PCR、NGS实验顺利完成。

附图说明

图1显示本发明实施例3中核酸提取试剂盒A、核酸提取试剂盒B和商品化试剂对于6份不同类型土壤样本中的微生物基因组DNA进行提取并用Nanodrop检测其DNA浓度的数据。

图2显示本发明实施例3中核酸提取试剂盒A、核酸提取试剂盒B和商品化试剂对于6份不同类型土壤样本中的微生物基因组DNA进行提取并用Qubit检测其DNA浓度的数据。

图3显示本发明实施例3中核酸提取试剂盒A、核酸提取试剂盒B和商品化试剂对于6份不同类型土壤样本中的微生物基因组DNA进行提取并用Nanodrop检测其DNA纯度(A260/280)的数据。

图4显示本发明实施例3中核酸提取试剂盒A、核酸提取试剂盒B和商品化试剂对于6份不同类型土壤样本中的微生物基因组DNA进行提取并用Nanodrop检测其DNA纯度(A260/230)的数据。

图5显示本发明实施例4中核酸提取试剂盒A、核酸提取试剂盒B和商品化试剂对于6份志愿者的粪便样本中的微生物基因组DNA进行提取并用Nanodrop检测其DNA浓度的数据。

图6显示本发明实施例4中核酸提取试剂盒A、核酸提取试剂盒B和商品化试剂对于6份志愿者的粪便样本中的微生物基因组DNA进行提取并用Qubit检测其DNA浓度的数据。

图7显示本发明实施例4中核酸提取试剂盒A、核酸提取试剂盒B和商品化试剂对于6份志愿者的粪便样本中的微生物基因组DNA进行提取并用Nanodrop检测其DNA纯度(A260/280)的数据。

图8显示本发明实施例4中核酸提取试剂盒A、核酸提取试剂盒B和商品化试剂对于6份志愿者的粪便样本中的微生物基因组DNA进行提取并用Nanodrop检测其DNA纯度(A260/230)的数据。

图9显示本发明实施例4中核酸提取试剂盒A、核酸提取试剂盒B和商品化试剂对于6份志愿者的粪便样本中的微生物基因组DNA进行提取并对DNA进行16S rDNA PCR扩增的胶图。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请进行进一步的介绍。

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。不同实施例之间可以替换或者合并组合，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些实施例获得其他的实施方式。

定义

在详细描述本教导之前，应理解本公开不限于具体的组合物或工艺步骤，因为这些可以变化。应当注意，如本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确说明。

当本文提供值的范围时，除非另有明确说明，否则所述范围意在包括起始值和结束值，以及其间的值或值的范围。例如，“从0.2-0.5”是指0.2、0.3、0.4、0.5；其间的范围如0.2-0.3、0.3-0.4、0.2-0.4；其间的增量如0.25、0.35、0.220、0.325、0.49；其间的增量范围如0.26-0.39等诸如此类。

本文使用的术语“样本”或“样品”将被理解意为任何这样的样品：可能包含目标核酸物质的样品，术语“样本”或“样品”或可包括溶液，如水溶液、细胞、组织、活检、粉末、或其中一种或多种的组合。

应当理解，在本公开中讨论的温度、质量、重量、体积比、浓度、时间等之前存在暗示的“约”，使得轻微和非实质性的偏差在本文的教导的范围内。通常，术语“约”表示组合物的组分量的非实质性变化，其对组合物的效果或稳定性没有任何显著影响。而且，“包含”、“含有”、和“包括”的使用不旨在是限制性的。应理解，前面的一般性描述和详细描述都仅是示例性和解释性的，并不是对本教导的限制。就通过引用并入的任何材料与本公开的表述内容不一致的程度，则以表述内容为准。

除非特别指出，否则描述为“包含”各种组分的说明书中的实施方式除了表示含有列举的组分之外，还表示“由所述组分组成”或“基本上由所述组分组成”的意思；描述为“由各种组分组成”的说明书中的实施方式除了表示仅由所列举的组分之外，还表示“包含”或“基本上由所述组分组成”的意思。

在本申请中，“提取”、“分离”或“纯化”是指样品的一个或多个组分被除去或与其它样品组分分离。样品组分包含常处于通常水性溶液相中的目标核酸，其也可以包含细胞片段、蛋白质、碳水化合物、脂质、盐离子、金属离子和其它核酸。“提取”、“分离”或“纯化”并不意味着任何程度的纯化。通常，分离或纯化从其它样品组分中去除至少70％或至少80％或至少90％的目标核酸。

对于本文的方法，在对一部分进行称量之前，将收集的样本充分混合以产生均质样本。使用02g±0.05g动物的大便样本或环境样本，以便在2mL珠管中使用。对于小型动物的粪便样本，使用0.1±0.05g的量。这些样本量可以根据本文方法中使用的管的体积相应进行调整。

纯度分析：除影响裂解效率之外，所述核酸的纯度还可影响下游分析，因为某些方法比其他方法保留更多的和不同的干扰物。用来表征DNA或RNA的测定包括以下各项，所述DNA或RN A使用本文所述方案和试剂回收自包含微生物种群的环境和生物样本。使用(NanoDrop分光光度计(NanoDrop Technologies Inc)和Qubit 4.0荧光计(InvitrogenInc)。已观察到的是，由分光光度计所测的DNA浓度通常比由Qubit 4.0荧光计所测的DNA浓度略高。特定于DNA的所述Qubit 4.0测定据信可提供更可靠的浓度读出。A260/280nm比率以及A260/230nm比率是纯度的量度，纯DNA具有1.8-1.86的A260280nm比率，而纯RNA具有约2.0A260/280比率。A260/230nm比率是在230nm处吸收的污染物的量度；对于DNA和RNA中的每一个，预期的A260/230nm比率为2.0-2.5。

实施例

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1：配制如下试剂(其中所用试剂组分的总和合称为核酸提取试剂盒A)

本实施例配制如下核酸提取试剂盒A，其包含如下组分：

裂解缓冲液：200mM三羟基甲基氨基甲烷，200mM氯化锂，3M NaSCN，质量体积比为5％甘油，2％十二烷基硫酸锂，pH 11.0。

研磨珠：0.25g的0.7mm氧化锆珠和0.25g的0.1-0.2mm的玻璃珠的复合研磨珠。

IRS缓冲液：0.5M硫酸铝钾、2M醋酸钠和并使用醋酸将pH调节至pH4。

磁性微球：1.5mg玻璃磁珠Mag2000 Silica(Cat#BMD00451，100mg/mL)。

结合缓冲液：3M异硫酸氰胍、0.5M碘化钠以及体积比为60％的异丙醇。

第一洗涤液：2M异硫酸氰胍，1M氯化锂，0.1M三羟基甲基氨基甲烷，体积比为50％乙醇，pH6.0。

第二洗涤液：0.5M氯化钠、0.1M三羟基甲基氨基甲烷,积比为70％乙醇。

TE Buffer：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.5

实施例2：配制如下试剂盒(其中所用试剂组分的总和合称为核酸提取试剂盒B)

本实施例提供如下核酸提取试剂盒B，其包含如下组分：

裂解缓冲液：100mM三羟基甲基氨基甲烷，300mM氯化锂，2M NaSCN，质量体积比为1％甘油，0.5％十二烷基硫酸锂，pH 9.5。

研磨珠：0.25g 1mm氧化锆珠、0.25g 0.5mm氧化锆珠和0.5g 0.1-0.2的玻璃珠的复合研磨珠。

IRS缓冲液：0.2M硫酸铝钾、0.5M醋酸钠和并使用醋酸将pH调节至pH 6。

磁性微球：2mg MagH1N Silica(Cat#BMD007511,60mg/mL)

结合缓冲液：1M异硫酸氰胍、1M碘化钠以及体积比为30％的异丙醇。

第一洗涤液：1M异硫酸氰胍，2M氯化锂，0.2M三羟基甲基氨基甲烷，体积比为60％乙醇，pH5.0。

第二洗涤液：0.5M氯化钠、0.1M三羟基甲基氨基甲烷,体积比为80％乙醇。

TE缓冲液：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.5

实施例3：使用核酸提取试剂盒A和B对6份不同类型的土壤样本中的微生物基因组DNA进行提取，并与商品化试剂进行比较。

实施例1中的核酸提取试剂盒A的操作如下所示：

1)称取0.25g的土壤样本，加入0.6mL裂解缓冲液和实施例1提供的研磨珠，使用FastPrep-

(MP Biomedicals)匀浆仪时，速度为6.0m/s，时间为1分钟。

2)将上述的粗裂解物进行12000rpm离心1min取上清液，加入0.2mL IRS缓冲液，涡旋振荡后，12000rpm离心1min离心去除PCR抑制剂，将上清液转移至1个干净的离心管中。

3)加入1.5mg玻璃磁珠Mag2000 Silica和等体积的结合缓冲液，涡旋振荡5min进行核酸结合。

4)使用磁力架磁性分离，去除上清液，加入0.7mL第一洗涤液，涡旋振荡1min去除大分子杂质。

5)磁性分离，去除上清液，加入0.7mL第二洗涤液，涡旋振荡1min去除无机盐杂质。

6)磁性分离，去除上清液，室温挥发除醇后，使用100μL TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.5)在60度下加热洗脱5min，磁性分离后，吸取上清液，得到纯净的DNA。

实施例2中的核酸提取试剂盒B的操作如下所示：

1)称取0.25g的土壤样本，加入0.5mL裂解缓冲液和实施例1提供的研磨珠，使用FastPrep-

(MP Biomedicals)匀浆仪时，速度为6.0m/s，时间为1分钟。

2)将上述的粗裂解物进行12000rpm离心1min取上清液，加入0.25mL IRS缓冲液，涡旋振荡后，12000rpm离心1min离心去除PCR抑制剂，将上清液转移至1个干净的离心管中。

3)加入2mg MagH1N Silica和等体积的结合缓冲液，涡旋振荡5min进行核酸结合。

4)使用磁力架磁性分离，去除上清液，加入0.5mL第一洗涤液，涡旋振荡1min去除大分子杂质。

5)磁性分离，去除上清液，加入0.5mL第二洗涤液，涡旋振荡1min去除无机盐杂质。

商品化对照核酸提取试剂为：

Pro Kit(Qiagen,Cat#47014)，称取同样质量的土壤样本并按照试剂盒提供的说明书(Protocol)进行核酸提取。

结果如图1和图2的Nanodrop和Qubit浓度数据比较得知，核酸提取试剂盒A和核酸提取试剂盒B的核酸得率相对商品化

Pro Kit明显要高，尤其是对于高腐殖酸和高杂质的森林土和蚯蚓土，说明本发明的核酸提取试剂对于复杂的土壤样本处理能力更强。从图3和图4的Nanodrop纯度比较，我们发现核酸提取试剂盒A和核酸提取试剂盒B对于森林土和蚯蚓土的纯度要高于商品化试剂，其余的4个样本与商品化试剂接近。

实施例4：使用核酸提取试剂盒A和B对6份不同粪便样本(6位志愿者)中的微生物基因组DNA进行提取，并与商品化试剂进行比较。

核酸提取试剂盒A和B对于粪便样本的操作流程与实施例3对于土壤样的操作是一致的，商品化提取试剂为

Fast DNA Stool Mini Kit(Qiagen,Cat#51604)，称取同样质量的粪便样本并按照试剂盒的说明书(Protocol)进行核酸提取。

结果如图5和图6的Nanodrop和Qubit浓度数据比较得知，核酸提取试剂盒A和核酸提取试剂盒B的核酸得率相对商品化

Fast DNA Stool Mini Kit高出1倍多。从图7和图8的Nanodrop纯度比较，我们发现核酸提取试剂盒A和核酸提取试剂盒B对于粪便样本的纯度要高于商品化试剂。我们进一步通过16S rDNA PCR扩增进行验证，使用16S通用引物，商品化2x PCR Master Mix，在20μL体系中我们加入4μL DNA模板产物，如图9所述，发现核酸提取试剂盒A和B都可以很好进行扩增，而商品化试剂提取的DNA模板明显有含有PCR抑制剂，样本3和4的DNA产物中PCR抑制剂的含量过高导致无法进行有效的扩增。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上介绍仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种裂解缓冲液，其特征在于：

所述裂解缓冲液包含50-500mM的三羟基甲基氨基甲烷、100-500mM的氯化锂、1-5M的NaSCN、质量体积百分比为0.5-20%的甘油、0.1-5%的十二烷基硫酸锂，并且pH为8.0-12.5。

2.根据权利要求1所述的裂解缓冲液，其特征在于：

所述裂解缓冲液包含100-200mM的三羟基甲基氨基甲烷、200-300mM的氯化锂、2-3M的NaSCN、质量体积比为1-5%的甘油、0.5-2%的十二烷基硫酸锂，并且pH为8.5-11.5。

3.根据权利要求1所述的裂解缓冲液，其特征在于：

所述裂解缓冲液包含200mM 三羟基甲基氨基甲烷，200mM 氯化锂，3M NaSCN，质量体积比为5%甘油，2%十二烷基硫酸锂，并且pH为 11.0。

4.一种核酸提取方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1：利用研磨珠对环境样本进行机械裂解，并利用裂解缓冲液对所述环境样本进行化学裂解，由此得到粗裂解物；

S4：使用洗涤液进行清洗，得到清洗DNA产物，所述清洗依次采用第一洗涤液和第二洗涤液进行清洗，并且所述第一洗涤液包含0.5-4异硫酸氰胍，0.5-3M氯化锂，0.1-0.5M三羟基甲基氨基甲烷，体积比为30-70%乙醇，并且pH为5.0-8.0，所述第二洗涤液为0.1-1M氯化钠、0.1-0.2M三羟基甲基氨基甲烷和积比为50-90%乙醇；

S5：使用TE缓冲液对所述清洗DNA产物进行加热洗脱，得到最终的DNA；

其中：

所述裂解缓冲液为权利要求1至3中任一项所述的裂解缓冲液；

所述结合缓冲液包含1-5M 异硫酸氰胍、0.2-2M 碘化钠和体积比为30-70%的异丙醇；

所述抑制剂去除缓冲液包含0.1-2M硫酸铝钾、0.5-5M醋酸钠，并使用醋酸将pH调节至pH 3.5-7.5。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤S1中：

所述研磨珠为0.1-3mm的氧化锆珠、0.1-5mm的玻璃珠、0.2-1.5mm的石榴石、0.2-0.5mm的碳化硅、0.3-4.5mm的金属球和/或其组合。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述研磨珠为0.1-3mm的氧化锆珠、0.1-2mm的玻璃珠、0.3-1.0mm的石榴石和/或其组合。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述研磨珠为0.1-3mm的氧化锆珠、0.1-1mm的玻璃珠和/或其组合。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤S2中：

所述抑制剂去除缓冲液包含0.2-1M硫酸铝钾、0.5-2M醋酸钠和并使用醋酸将pH调节至pH 4-6。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤S2中：

所述抑制剂去除缓冲液包含0.5M硫酸铝钾、2M醋酸钠，并使用醋酸将pH调节至pH 4。

10.根据权利要求4至9中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤S3中：

所述磁性微球为硅羟基磁珠、玻璃磁珠、羧基磁珠、氨基磁珠、甲苯磺酰基磁珠、环氧基磁珠和/或其组合。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述磁性微球为硅羟基磁珠、玻璃磁珠、羧基磁珠和/或其组合。

12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述磁性微球为苏州白垩纪生物科技有限公司生产的磁珠系列产品。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述磁性微球为苏州白垩纪生物科技有限公司生产的货号为Cat#BMD007511的硅羟基磁珠MagH1N Silica、货号为Cat# BMD003511的硅羟基磁珠MagH1 Silica、货号为Cat# BMD004511的玻璃磁珠Mag2000 Silica。

14.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述结合缓冲液包含2-3 M 异硫酸氰胍、0.5-2M 碘化钠和体积比为30-60%的异丙醇。

15.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一洗涤液包含1-2M异硫酸氰胍，1-2M氯化锂，0.1-0.2M三羟基甲基氨基甲烷和体积比为50-60%的乙醇，并且pH为5.0-8.0，所述第二洗涤液为0.5M 氯化钠，0.1M三羟基甲基氨基甲烷和积比为70-80%乙醇。

16.一种用于提取环境样本中的核酸的试剂盒，其特征在于：

所述试剂盒包括：（i）用于配制权利要求1至3中任一项所述的裂解缓冲液的裂解试剂，所述裂解试剂包括三羟基甲基氨基甲烷、氯化锂、NaSCN、甘油和十二烷基硫酸锂的裂解试剂；或

所述试剂盒包括：（i）用于配制权利要求1至3中任一项所述的裂解缓冲液的裂解试剂，所述裂解试剂包括三羟基甲基氨基甲烷、氯化锂、NaSCN、甘油和十二烷基硫酸锂的裂解试剂；和（ii）用于配制抑制剂去除缓冲液的抑制剂去除试剂，所述抑制剂去除试剂包括硫酸铝钾、醋酸钠和醋酸的抑制剂去除试剂，其中所述抑制剂去除缓冲液包含0.1-2M硫酸铝钾、0.5-5M醋酸钠，并使用醋酸将pH调节至pH 3.5-7.5。

17.根据权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括如下试剂中的一种或多种：（1）用于配制第一洗涤液的试剂，所述第一洗涤液包含1-2M异硫酸氰胍，1-2M氯化锂，0.1-0.2M三羟基甲基氨基甲烷和体积比为50-60%的乙醇；（2）用于配制第二洗涤液的试剂，所述第二洗涤液包含0.5M 氯化钠，0.1M三羟基甲基氨基甲烷和体积比为70-80%的乙醇；（3）研磨珠，所述研磨珠为0.1-3mm的氧化锆珠、0.1-5mm的玻璃珠、0.2-1.5mm的石榴石、0.2-0.5mm的碳化硅、0.3-4.5mm的金属球和/或其组合；（4）磁性微球，硅羟基磁珠、玻璃磁珠、羧基磁珠、氨基磁珠、甲苯磺酰基磁珠、环氧基磁珠和/或其组合；（5）用于结合缓冲液的试剂，所述结合缓冲液为离液盐和醇的混合物；（6）用于配制TE缓冲液的试剂。

18.根据权利要求17所述的试剂盒，其特征在于，所述研磨珠为0.1-3mm的氧化锆珠、0.1-2mm的玻璃珠、0.3-1.0mm的石榴石和/或其组合。

19.根据权利要求17所述的试剂盒，其特征在于，所述研磨珠为0.1-3mm的氧化锆珠、0.1-1mm的玻璃珠和/或其组合。

20.根据权利要求17所述的试剂盒，其特征在于，所述磁性微球为硅羟基磁珠、玻璃磁珠、羧基磁珠和/或其组合。

21.根据权利要求17所述的试剂盒，其特征在于，所述磁性微球为苏州白垩纪生物科技有限公司生产的磁珠系列产品。

22.根据权利要求17所述的试剂盒，其特征在于，所述磁性微球为苏州白垩纪生物科技有限公司生产的货号为Cat#BMD007511的硅羟基磁珠MagH1N Silica、货号为Cat#BMD003511的硅羟基磁珠MagH1 Silica、货号为Cat# BMD004511的玻璃磁珠Mag2000Silica。