CN103827301A - 从兽医学全血样品中分离核酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于从兽医学全血样品中分离核酸的方法，其中所述方法包括至少如下步骤a)制备结合混合物，所述结合混合物包含：-经裂解的样品-至少一种离液剂-至少一种醇-至少一种聚氧乙烯脂肪醇醚；b)使所述结合混合物通过包含核酸结合固相的柱，由此使核酸结合至所述核酸结合固相；c)可任选地，在所述核酸结合至所述固相时洗涤所述核酸；d)可任选地，从所述固相洗脱所述核酸。现有技术中柱堵塞妨碍了从这种困难样品中有效地分离核酸，本发明发现添加特定的非离子型去污剂克服了现有技术方法中的问题。当结合混合物中包含特定的非离子型去污剂时，没有发生堵塞，因此能够从兽医学全血样品有效分离核酸。

Description

从兽医学全血样品中分离核酸的方法

发明领域

本发明涉及从兽医学全血样品中分离核酸的方法。具体而言，本发明提供从兽医学全血样品中分离病原体核酸的方法。

发明背景

现有技术已经知晓了数种从不同样品中分离核酸的方法。然而，各方法对所有样品作用的良好程度不同。例如，使用一种方法时能从某些样品（例如组织、血浆、血清、或尿液）中有效分离核酸。但是所述方法可能不能从其他样品（例如全血样品）中有效分离核酸。尤其对于包含高细胞数量、高蛋白和/或脂质含量的生物样品，例如从大型家畜（如马或牛）中获得的兽医学全血样品而言特别有难度。现有技术中已知的方法经常在从各有难度的样品有效分离核酸方面不尽如人意。例如，对于处理兽医学全血样品，特别是获自大型家畜（如牛、绵羊、山羊、马和猪）的血液样品，基于现有离心柱的核酸分离方法的适用性非常有限。使用已建立的核酸分离方法从各动物全血样品中分离核酸时的主要问题是，这些样品的特殊组成容易堵塞分离柱。具体而言，高细胞数量、高蛋白和/或脂质含量可造成这种堵塞。来自血液的物质阻塞所述柱，导致纯化效率低。结果，分离到较少核酸或甚至没有分离到核酸。另外，分离的核酸经常被杂质/抑制性物质污染，这破坏所述经分离的核酸的下游操作，特别是在扩增反应如RT-PCR中。这给在所述经分离的核酸中检测某些靶标核酸带来困难。另外，观察到的堵塞效应导致在一个样品制备物中，仅能处理少量的样品。通常，为了减少堵塞，必需限制样品的输入体积(例如25μl～50μl，而不是例如200μl)。

具体而言，当试图使用例如96多格式(multi format)或使用自动化***从大量样品中分离核酸时，所述堵塞导致了一个问题。当特定样品发生所述问题时，(例如通过稀释结合混合物、将结合混合物重新应用到膜和/或将结合混合物应用到不同的膜)不太可能单独解决所述堵塞问题。因此，具体而言，当处理大数量样品和/或当使用自动化***时，要分析的各核酸样品会丢失。因为样品的丢失会导致需要重新收集该样品，所以这在医疗领域和/或诊断领域是不能接受的。因此，具体到兽医诊断和医疗领域，需要一种可靠并有效的方法，所述方法也适合于自动化，并且使得能从兽医学全血样品中分离核酸。特别是在使用基于离液剂、去污剂和醇与柱联用的核酸分离化学法时会发生所述堵塞问题。然而，基于离心柱的分离方法在可获得的核酸产量和易于操作方面有优势，因此经常优选这种方法。

当试图分离全血样品中可能包含的特定靶标核酸时，低纯化效率和可输入体积方面的限制是严重的缺点。例如，病原体核酸（例如病毒和/或细菌核酸）可能仅仅以小量包含于全血样品中。所观察到的低纯化效率和可输入体积方面的限制导致常规核酸分离方法经常不能以有效量来分离靶标病原体核酸，从而不能进行标准检测试验(例如聚合酶链反应)的后续操作。然而，检测动物全血样品中的各病原体核酸是最初从各样品分离核酸的主要原因之一。因此，现有技术特别需要提供某种核酸分离方法，所述方法能够以高产量和高纯度从动物全血样品中分离核酸。另外，需要提供某种核酸分离方法，所述方法能够从很多种动物样品（包含全血样品）中分离核酸。

因此，本发明的目的是提供基于改良柱的核酸分离方案，所述方案能够从兽医学全血样品中分离核酸。

发明内容

本发明基于如下发现：若将特定的非离子型去污剂添加至结合混合物则能防止柱堵塞。本发明人发现，添加聚氧乙烯脂肪醇醚能防止在不加入相应去污剂的现有技术分离方法中所观察到的堵塞。因此，本发明提供了对现有技术已知问题的解决方法。因为当结合混合物包含其他非离子型去污剂(例如常用的曲通X-100或吐温20)时会观察到堵塞，所以向结合混合物添加特定的非离子型去污剂能防止柱堵塞是非常出乎意料的。因此，去污剂的选择（特别是在非离子型去污剂组中选择）对膜堵塞和核酸分离效率有如此大的影响是非常令人惊讶的。如实施例所示，根据本发明的方法能够以高效率、高纯度和高可靠性分离兽医学全血样品中包含的核酸。具体而言，所述方法能够从兽医学全血样品有效分离病原体核酸。这相对于现有技术方法是显著的改进，因为现有技术方法尽管能从其他兽医样品（例如血浆、尿液或组织）有效分离核酸，但是不能从兽医学全血样品有效分离核酸，特别是病原体核酸。

根据第一方面，本发明提供用于从兽医学全血样品中分离核酸的方法，其中所述方法包含至少如下步骤：

a)制备结合混合物，所述结合混合物包含：

-经裂解的样品

-至少一种离液剂

-至少一种醇

-至少一种聚氧乙烯脂肪醇醚；

b)使所述结合混合物通过包含核酸结合固相的柱，由此使核酸结合到所述核酸结合固相；

c)可任选地，当所述核酸结合到所述固相时洗涤所述核酸；

d)可任选地，从所述固相洗脱所述核酸。

如上述，发现了在所述结合混合物中加入至少一种聚氧乙烯脂肪醇醚能使所述结合混合物通过柱中包含的核酸结合固相。由此防止使用现有技术方法中所观察到的柱堵塞，由此能从兽医学全血样品有效、不受干扰地分离核酸。因此所述方法非常可靠。

根据其他方面，本发明提供从兽医学全血样品分离病原体核酸的方法，其中根据本发明第一方面进行所述方法。如实施例所示，根据本发明的方法尤其能够以高效率和高可靠性从兽医学全血样品分离病原体核酸。这个优势对医药领域和/或诊断领域特别重要，在所述领域中，分析兽医学全血样品是否存在特定的病原体。

附图说明

图1：显示使用包含盐酸胍与吐温20联用的结合混合物的标准方法中，牛全血的堵塞(管1+2)。当使用包含聚氧乙烯(20)鲸蜡醇醚的结合混合物时没有发生堵塞(管3+4)。

图2：显示相较于没有加入聚氧乙烯(20)鲸蜡醇醚而是以曲通X-100作为去污剂的方法，使用在本发明方法的不同裂解/结合条件下分离的核酸的BVDV检测试验的结果。本发明方法获得的更低Ct值显示所述方法更适合于从不同兽医学全血样品中分离核酸。

图3：显示相较于使用吐温20作为去污剂的方法，使用在本发明方法的不同裂解/结合条件下分离的核酸的BVDV检测试验的结果。本发明方法获得的更低Ct值显示所述方法更适合于从不同兽医学全血样品中分离核酸。

图4：显示使用在本发明方法的不同裂解/结合条件下分离的核酸的BHV1检测试验的结果。所述图指示聚氧乙烯(20)鲸蜡醇醚的样品类型和浓度。

图5和6：显示采用方案2处理的6种不同动物血液样品的分光光度测量和溴化乙啶染色的琼脂糖凝胶。使用λDNA/Hind III标志物作为标志物。

图7：显示了当不同使用者使用本发明方法分离核酸时，获得相同的结果。

发明详述

根据第一方面，本发明提供用于从兽医学全血样品中分离核酸的方法，其中所述方法包括至少如下步骤：

a)制备结合混合物，所述结合混合物包含：

-经裂解的样品

-至少一种离液剂

-至少一种醇

-至少一种聚氧乙烯脂肪醇醚；

b)使所述结合混合物通过包含核酸结合固相的柱，由此使核酸结合到核酸结合固相：

c)可任选地，当所述核酸结合到所述固相时洗涤所述核酸；

d)可任选地，从所述固相洗脱所述核酸。

本发明的实质是在结合混合物中加入特定的去污剂。所述特定去污剂令人惊奇地防止核酸结合柱的堵塞。这是意料之外的，因为当使用包含利用离液剂和醇的相似/相同的核酸结合化学法时，其他非离子型去污剂(例如曲通X-100或吐温20)不能防止所述柱堵塞。由实施例所示，所述结合混合物中加入聚氧乙烯脂肪醇醚预防柱堵塞。尽管同样使用离液剂、醇和非离子型去污剂的非常相似的核酸分离方案与本发明方法就从其他兽医样品（例如血浆、血清或尿液）中分离核酸而言是同样有效的，但是所述非常相似的核酸分离方案不能从兽医学全血样品中分离核酸。显然，造成所述问题的原因是兽医学全血样品的特殊组分，尤其是高细胞数量、高蛋白和/或脂质含量。实施例显示本发明方法能够从所有测试的兽医样品有效分离核酸，所述样品包含来自不同物种的兽医学全血样品，但是其他方法却失败了。

在本发明方法的步骤a)中，制备结合混合物。就结合混合物的制备而言，建立能使所述结合混合物中包含的核酸在步骤b)中与核酸结合固相结合的条件。所述结合混合物包含经裂解的样品，和由此从所述样品释放的核酸，至少一种离液剂，至少一种醇，以及重要的是至少一种聚氧乙烯脂肪醇醚。

出于本发明的目的，术语“脂肪醇”具体表示链长6～22个碳原子的醇，优选8～20个碳原子，优选10～18个碳原子，特别优选12～18个碳原子。尤其优选具有12、14、16或18个碳原子的醇。虽然脂肪醇可以是单不饱和或多不饱和的脂肪醇，但是它们优选是饱和脂肪醇。

出于本发明的目的，术语“聚氧乙烯”具体表示HO-(CH₂CH₂O)_n单元，其中n优选是2～150的整数，更优选4～120的整数，甚至更优选8～80的整数，最优选是选自下组的整数：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149和150。

合适的聚氧乙烯脂肪醇醚的优选例子是聚乙氧基化月桂基、鲸蜡基、油酰基或硬脂基醇，它们可以单独使用或作为混合物使用。根据本发明的优选实施方式，至少一种聚氧乙烯脂肪醇醚包括具有6～22个碳原子的脂肪醇部分和具有2～150个(CH₂CH₂O)单元的聚氧乙烯部分。优选聚氧乙烯脂肪醇醚选自：聚氧乙烯月桂醇醚、聚氧乙烯鲸蜡醇醚，聚氧乙烯硬脂醇醚，和/或聚氧乙烯油酰基醇醚。各结合混合物可通过不同方法来制备，并且下文描述了优选的实施方式。

在结合混合物中可（至少部分）完成全血样品的裂解。然而，所述样品优选在制备所述结合混合物之前至少部***解，从而首先有效释放核酸。因此，根据一个实施方式，在步骤a)中制备结合混合物包括如下步骤：

i)裂解兽医学全血样品；和

ii)向经裂解的样品添加一种或多种添加剂，所述添加剂优选是结合溶液形式，由此制备结合混合物，所述结合混合物包含：

-经裂解的样品

-至少一种离液剂

-至少一种醇

-至少一种聚氧乙烯脂肪醇醚。

能使用不同的方法以实现样品的裂解，并且现有技术已知有合适的裂解方法。它们也可以根据应从动物全血样品分离的靶核酸的类型而不同。通常，裂解步骤可以包括但不限于：对样品进行机械作用、化学作用、物理作用和/或酶作用。各裂解步骤的示例包括但不限于：在球磨器中或存在玻璃珠时研磨样品，施加超声，加热，添加去污剂和/或添加蛋白降解化合物，例如蛋白降解酶或离液剂。

根据一个实施方式，所述裂解包括向兽医学全血样品添加至少一种蛋白水解酶。蛋白水解酶指催化切割肽键(例如蛋白质、多肽、寡肽和肽中的肽键)的酶。示例性蛋白水解酶包括但不限于：蛋白水解酶（proteinase）和蛋白酶（protease），具体例如枯草杆菌蛋白酶（subtilisin）、枯草杆菌酶（subtilase）、碱性丝氨酸蛋白酶等。枯草杆菌酶是丝氨酸蛋白酶家族，即在活性侧链有丝氨酸残基的酶。枯草杆菌蛋白酶是有广泛底物特异性的细菌丝氨酸蛋白酶。枯草杆菌蛋白酶对由离液剂（例如尿素和盐酸胍）和阴离子去污剂（例如十二烷基硫酸钠(SDS)）的变性相对具有抗性。示例性枯草杆菌蛋白酶包括但不限于：蛋白水解酶K、蛋白水解酶R、蛋白水解酶T、枯草杆菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶A、恰根公司(QIAGEN)蛋白酶等。枯草杆菌酶、枯草杆菌蛋白酶、蛋白水解酶K和其他蛋白酶的讨论可以在其他文献如Genov等，Int.J.Peptide Protein Res.45:391-400,1995等中找到。优选地，所述蛋白水解酶是蛋白水解酶K。在非限定的方面中，向兽医学全血样品的裂解物以选自下组的浓度添加蛋白水解酶：约0.1mg/ml～约10mg/ml、约0.5mg/ml～约5mg/ml、约1mg/ml～约4.0mg/ml、约1.5mg/ml～约2.5mg/ml和约2mg/ml。所指示的浓度范围是对蛋白水解酶和兽医学全血样品的混合物而言。

任选但优选在添加支持裂解的其他试剂(例如离液剂和/或去污剂，见下文)之后，使全血样品在允许蛋白水解酶消化所述样品的条件下孵育至少3分钟，优选至少5分钟，更优选至少10分钟。所述孵育可以在室温下进行(例如持续10～20分钟)，这仍然能够消化样品，但是不需要能加热样品的特殊装置。然而，样品也可以在支持样品消化的条件(例如加热和/或振荡)下孵育。优选地，将样品加热到至少35℃、至少40℃或至少50℃的温度，并且优选在孵育中加热到至少55℃的温度。如果使用蛋白水解酶(例如蛋白水解酶K)作为蛋白降解化合物，并且所述化合物在较高温度显示其最优的和相应的最高活性，那么在孵育过程中使用相应的较高温度是尤其有利的。在这种条件下会促进样品的消化。当然，应该使用所述蛋白水解酶有活性的温度。另外，优选所述孵育步骤是在搅动所述样品的条件下进行。搅动的非限定性示例包括振荡、搅拌、混合或振动。在某些方面，搅动包括振荡。所述振荡能是一维、二维或三维振荡。可使用多种振荡或搅动装置。非限定性示例包含热混合器(Eppendorf公司)、TurboMix(SI公司（Scientific Industries）)、Mo Bio涡旋转接器（Vortex Adapter）(MO生物实验室公司（MO Bio Laboratories）)、微管（Microtube）固定器涡旋转接器(Troemner公司)和微管泡沫架涡旋附件(SI公司)。搅动可以例如至少50rpm、至少100rpm、至少200rpm或至少500rpm在混合器上进行。优选地，加热和搅动同时进行，例如通过使用热搅拌器或允许同时加热和搅动的等同设备。当使用至少一种蛋白水解酶时，采用确保所述酶有效作用和催化活性的孵育条件。所述条件取决于所用的蛋白水解酶，并且由本领域技术人员已知且可相应地测定。优选地，所述孵育在能促进和/或维持蛋白水解酶活性的盐和/或离子存在的条件下进行。合适的盐包括但不限于：NaCl、KCl、MgCl₂或CaCl₂或离液剂(如离液盐)。根据一个实施方式，用蛋白水解酶裂解样品的孵育条件包括以下一种或多种：加热、搅动、盐存在、pH值6～9和/或孵育时间至少3分钟，优选至少5分钟，最优选至少10分钟。

优选地，兽医学全血样品的裂解包括添加至少一种离液剂。可以使用任何用于所述目的的导致蛋白或核酸紊乱的离液剂，所述紊乱例如但不限于：改变蛋白质或核酸的二级、三级或四级结构。优选使用离液盐。所述离液盐优选包含胍盐、硫氰酸盐、异硫氰酸盐、高氯酸盐、三氯乙酸盐和/或三氟乙酸盐作为离液离子。优选地，所述离液剂选自下组：盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、硫氰酸钠、碘化钠、高氯酸钠、三氯乙酸钠、三氟乙酸钠和脲。也能使用离液剂混合物。优选地，使用盐酸胍和/或硫氰酸胍作为用于裂解的离液剂。优选地，离液剂包含在裂解溶液中，所述裂解溶液例如添加至兽医学全血样品的裂解缓冲液。所述裂解溶液可以包含离液剂，所述离液剂优选是上述离液盐，浓度范围选自约0.1M到最多饱和极限、约0.2M～6M、约0.5M～4M或约0.5M～3M。因此，已经添加以供裂解的离液剂也包含在经裂解的样品中。由于裂解的样品构成结合混合物的部分，已经添加以供裂解的离液剂也对结合混合物中离液剂、各离液剂的总浓度有贡献。

根据一个优选实施方式，样品的裂解包括添加至少一种去污剂。所述去污剂可以是阴离子型去污剂、阳离子型去污剂和/或非离子型去污剂。优选地，在裂解过程中添加至少一种非离子型去污剂。根据本发明指导的包含在结合混合物中以防止柱堵塞的特定非离子型去污剂可以在裂解样品的过程中就已经添加。因此，根据一个实施方式，向兽医学全血样品添加至少一种聚氧乙烯脂肪醇醚以支持裂解，所述聚氧乙烯脂肪醇醚优选选自下组：聚氧乙烯月桂醇醚、聚氧乙烯鲸蜡醇醚、聚氧乙烯硬脂醇醚和聚氧乙烯油酰基醇醚。所以，相应的去污剂已经存在于裂解的样品中，并且因此包含在结合混合物中。优选在裂解样品之后添加更多的相应去污剂，以建立结合条件，并且确保所述结合混合物包含足够高浓度的相应聚氧乙烯脂肪醇醚以防止堵塞。根据一个实施方式，添加不同于聚氧乙烯脂肪醇醚的至少一种非离子型去污剂或不同于聚氧乙烯脂肪醇醚的各非离子型去污剂的混合物以供裂解。本文中，在裂解过程中不添加聚氧乙烯脂肪醇醚，但是过后添加聚氧乙烯脂肪醇醚以建立结合条件。根据一个实施方式，裂解包括添加选自下组的至少一种非离子型去污剂：烷基葡糖苷和/或聚氧乙烯烷基苯基醚。优选地，各非离子型去污剂或非离子型去污剂的混合物以如下浓度包含在裂解混合物中：至少0.5%、至少1%、至少3%、至少4%和至少5%。优选浓度范围包括但不限于：0.5%～15%，更优选1.5%～10%和2%～7%。对于烷基葡糖苷，优选使用来自聚山梨酯组的非离子型去污剂，优选聚山梨酯20、聚山梨酯40或聚山梨酯80，更优选聚山梨酯20。聚氧乙烯烷基苯基醚的优选示例包含曲通X-100和Nonidet P-40。优选地，向兽医全血添加曲通X-100和/或吐温20以实现裂解。各去污剂还可以包含在含有离液剂(见上)的裂解溶液中。裂解过程中，添加除不同于聚氧乙烯脂肪醇醚的至少一种非离子型去污剂以外的聚氧乙烯脂肪醇醚也包含在本发明的范围内。

另外，样品的裂解可以包括添加至少一种螯合剂。合适的螯合剂包括但不限于：二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)和N,N-双(羧甲基)甘氨酸(NTA)。根据一个优选实施方式，使用EDTA。本文使用术语"EDTA"指示但不限于EDTA化合物的EDTA部分，所述EDTA化合物例如K₂EDTA、K₃EDTA或Na₂EDTA。使用螯合剂(例如EDTA)还有抑制核酸酶(例如DNA酶)的有利作用。各螯合剂也可以包含在裂解溶液中。

可以使用其他化合物以实现样品的有效裂解和/或保护释放的核酸免于降解。保护释放的核酸（如DNA以及特别是RNA）免于降解的相应化合物为本领域已知，因此不需要本文更详细描述。各化合物可以单独添加到全血样品，或者可以包含在裂解溶液中。

如果试图分离特定的靶标病原体核酸，那么可能需要特定的裂解作用以确保所述病原体核酸的有效释放。例如当试图从兽医全血细胞样品的***分离核酸时，可能推荐特定的裂解步骤以有效释放相应的病原体核酸。对于一些主要病原体而言的合适的裂解步骤在下文描述。然而，还可使用替代方法，并且对于不同病原体而言的合适的裂解方法也为本领域熟知。因此在本文中不作详细描述。

如上所述，添加以供兽医学全血样品裂解的一种或多种化合物可以方便地包含在裂解溶液中。各裂解溶液优选包含如上述的至少一种离液剂和至少一种去污剂。另外，它可以包含螯合剂和缓冲化合物。优选分开向兽医学全血样品添加优选添加以消化所述全血样品的蛋白水解酶来防止由包含于所述裂解溶液中的离液剂所致的降解。

为了制备结合混合物，随后可使裂解的样品与一种或多种其他化合物接触以备制结合条件，所述结合条件使得核酸与核酸结合柱有效结合。本文所用的结合具体是指使核酸吸附至核酸结合固相。是否添加化合物并且添加何种化合物以建立本发明的结合混合物，也取决于经裂解样品的组成和因此可能已经添加以实现样品裂解的化合物。

本发明的结合混合物包含至少一种离液剂。如果在单独的裂解步骤（见上文）中不添加离液剂，那么必需在制备结合混合物的过程中添加离液剂，例如通过添加包含离液剂的结合溶液。可使用任何用于所述目的的导致蛋白质或核酸紊乱的离液剂，所述紊乱例如但不限于：虽然保持其初级结构完整但改变蛋白质或核酸的二级、三级或四级结构。优选使用离液盐。所述离液盐优选包含胍盐、硫氰酸盐、异硫氰酸盐、高氯酸盐、三氯乙酸盐和/或三氟乙酸盐作为离液离子。优选所述离液剂选自下组：盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、硫氰酸钠、碘化钠、高氯酸钠、三氯乙酸钠、三氟乙酸钠和脲。也能使用离液剂混合物。特别地，可使用盐酸胍和/或硫氰酸胍作为离液剂。优选地，即便在样品的裂解过程中已经添加了离液剂，可以添加额外量的至少一种离液剂或离液剂混合物以制备结合混合物。相应的结合溶液可以包含离液剂，所述离液剂优选是上述离液盐，其浓度范围选自约0.1M到最多饱和极限、约0.2M～6M、约0.5M～4M、约1M～3.5M或约1.5M～3.5M。结合混合物中的离液剂浓度优选选自约0.2M～6M、约0.5M～4M、约1M～3.5M或约1M～3M。

本发明的结合混合物包含至少一种醇。所述醇促进核酸与柱中包含的固相结合。所述醇优选是具有1～5个碳原子的短链支链或非支链醇。优选地，所述醇选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和丁醇。特别合适的是乙醇和异丙醇。所述醇优选以选自下列的浓度包含在结合混合物中：至少10%v/v、至少15%v/v和至少25%v/v。根据一个实施方式，结合混合物中所述醇的浓度小于60%v/v、优选小于50%v/v、小于40%v/v或小于30%v/v。也可使用醇的混合物。

另外，结合混合物包含至少一种聚氧乙烯脂肪醇醚。也可使用聚氧乙烯脂肪醇醚的混合物。合适的实施方式如上所述。优选地，所述聚氧乙烯脂肪醇醚选自聚氧乙烯月桂醇醚、聚氧乙烯鲸蜡醇醚、聚氧乙烯硬脂醇醚和聚氧乙烯油酰基醇醚。更优选地，所述聚氧乙烯脂肪醇醚选自聚氧乙烯(4)月桂醇醚、聚氧乙烯(23)月桂醇醚、聚氧乙烯(2)鲸蜡醇醚、聚氧乙烯(10)鲸蜡基醚、聚氧乙烯(20)鲸蜡基醚、聚氧乙烯(2)硬脂醇醚、聚氧乙烯(10)硬脂醇醚、聚氧乙烯(20)硬脂醇醚、聚氧乙烯(2)油酰基醇醚、聚氧乙烯(10)油酰基醇醚、聚氧乙烯(20)油酰基醇醚和/或聚氧乙烯(100)硬脂醇醚。数字表述环氧乙烷单元的平均数目。最优选，聚氧乙烯脂肪醇醚是聚氧乙烯鲸蜡醇醚，最优选聚氧乙烯(20)鲸蜡醇醚。如实施例所述，聚氧乙烯(20)鲸蜡醇醚对预防柱的堵塞特别合适。

聚氧乙烯脂肪醇醚优选以选自下列的浓度包含在结合混合物中：至少0.5%、至少1%、至少2%、至少3%和至少5%。优选地，浓度范围选自约0.5%～约20%、约2%～约12%、约3%～约9%、优选4%～约8%。当使用聚氧乙烯(20)鲸蜡醇醚时，这些浓度范围尤其合适。

如上所述，聚氧乙烯脂肪醇醚能通过裂解溶液加入结合混合物。如果没有添加相应的聚氧乙烯脂肪醇醚来实现样品裂解，那么其必需在制备结合混合物的过程中添加。然而，尽管在样品裂解的过程中添加相应的聚氧乙烯脂肪醇醚，但是优选在备制结合条件的过程中添加额外量的聚氧乙烯脂肪醇醚。这能通过添加包含相应聚氧乙烯脂肪醇醚的结合溶液来实现。

因此，根据一个优选的实施方式，在所述结合混合物的制备过程中向裂解的样品添加结合溶液，其中所述结合溶液包含至少一种离液剂(或离液剂混合物)(优选上述离液盐)，至少一种上述聚氧乙烯脂肪醇醚，和任选的缓冲物质。合适的缓冲剂包括但不限于：三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、N-(三(羟甲基)甲基)甘氨酸(Tricine)、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸(BICINE)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(HEPES)、哌嗪-1,4-双(2-乙磺酸)(PIPES)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)和/或磷酸盐缓冲液。另外，结合溶液也可以包含上述至少一种醇。然而，醇也可以单独添加至裂解样品以制备结合混合物。

步骤b)中，使相应制备的结合混合物通过包含核酸结合固相的柱，由此使核酸结合至核酸结合固相。在向柱施加结合混合物之后，并且通过所述柱之前，也可使所述结合混合物首先在柱上/柱内停留。如上所述，特定聚氧乙烯脂肪醇醚（优选是聚氧乙烯鲸蜡醇醚、更优选聚氧乙烯(20)鲸蜡醇醚）的存在有效预防了包含在柱中的核酸结合固相的堵塞。这是非常令人吃惊的，因为其他非离子型去污剂(例如吐温20或曲通X-100)不能防止堵塞。

本发明包括使用包含在柱中的核酸结合固相。本文使用的术语“柱”具体描述有至少两个开口的容器。因而结合混合物能通过所述柱。术语“柱”具体并不表示对容器的形状有任何限制，所述容器可以是例如圆形或有角容器，并且优选是圆柱形。然而，也能使用其他形状，特别是当使用多重柱(multi-column)时。所述柱包含核酸结合固相。包含在所述柱中的所述固相应该使得本发明的结合混合物在施加至所述柱时能够通过。这意味着如果对柱施加例如离心力，所述结合混合物能沿着离心力的方向通过所述柱。或者，能施加负压或正压。当使用基于相应柱的核酸分离方法时，结合混合物通常在例如离心或真空的帮助下通过柱，并且在所述通过的过程中，核酸结合至所包含的核酸结合固相。能以单个形式或多个形式使用所述柱。这种具有类似多孔板形式并且包含核酸结合固相（如膜）的多重柱为本领域熟知。优选所述柱是离心柱。

作为核酸结合固相，能使用通常用在基于柱的核酸分离方法中的任何固相。优选核酸通过吸附结合至所述固相。包含在柱中的核酸结合固相的材料可以由包含二氧化硅的化合物制成，或可以含有包含二氧化硅的化合物，其包括但不限于：硅石、硅石颗粒、二氧化硅、硅藻土、玻璃、烷基硅、硅酸铝和硼硅酸盐；硝酸纤维素；重氮化纸；羟磷灰石（也称为羟基磷灰石）；尼龙；金属氧化物；氧化锆；氧化铝；聚合材料；包含核酸结合官能团(优选阴离子交换基团)的材料等。术语固相并不试图表明关于其形式或设计的任何限制，只要其能包含在柱中即可。根据一个实施方式，固相（例如二氧化硅固相）的表面不经修饰，例如不用官能团修饰。优选使用核酸结合膜和因而能结合核酸的膜。合适的膜包括但不限于：亲水膜、疏水膜和通过离子交换结合核酸的膜。示例包括但不限于包含下列物质的膜或由下列物质构成的膜：二氧化硅、二氧化硅膜、玻璃纤维膜、尼龙膜、纤维素膜如硝酸纤维素膜、修饰的纤维素膜(如乙酰基-或羟基-)、纸膜，特别是经修饰的纸。优选多孔膜。另外，优选使用含有二氧化硅或由二氧化硅构成的膜。其他常见的包含在柱中的核酸结合固相是核酸结合颗粒（例如金属氧化物颗粒，特别是二氧化硅颗粒）填充物，或者是核酸结合材料（如硅胶）的层。例如可使核酸结合颗粒(如二氧化硅颗粒)排列成位于惰性过滤器或膜之上的层，由此形成核酸结合固相。使用相应核酸结合固相时也可能发生上述问题。因为柱中包含的核酸结合固相的这种经填充薄层(类似于核酸结合膜)增加了结合混合物不能通过的风险，因而增加了柱被堵塞的风险。根据一个实施方式，包含在柱中的核酸结合固相的总高度等于或小于其宽度。例如，核酸结合固相可以由核酸结合材料层和/或核酸结合颗粒（优选二氧化硅颗粒）的相应层填充物构成，所述核酸结合固相作为小层施加于膜或过滤器之上。

为了改善结合混合物在柱中包含的核酸结合固相中的通过，可采用合适的方法，例如离心或使用压差生成设备，所述设备挤压样品通过柱中相应的核酸结合固相或者通过施加真空来抽吸样品通过核酸结合固相。各方法为本领域熟知，因此本文不必进一步描述。

根据一个实施方式，步骤c)中进行一个或多个洗涤步骤以进一步纯化核酸。根据一个实施方式，当核酸结合至固相时，进行一个或多个洗涤步骤。出于该目的，可使用常规洗涤溶液。根据一个实施方式，用于洗涤的溶液包含至少一种离液剂和至少一种醇。能用于所述洗涤溶液中的离液剂包括但不限于：盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍和碘化钠或者其他离液盐。就醇而言，相应地在所述洗涤溶液可用于洗涤的醇是优选具有1～5个碳原子的短链支链或非支链醇。示例为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和丁醇。优选使用异丙醇和/或乙醇。优选所述洗涤溶液包含至少50％醇和1M离液盐，优选至少2M离液盐，更优选至少3M离液盐。

能替代性或补充本文所述洗涤溶液使用的其他合适的洗涤溶液包含醇和任选的生物缓冲液。优选异丙醇或乙醇，最优选乙醇用于该第二洗涤步骤。优选地，以如下浓度使用乙醇：至少50%v/v、至少60%v/v、优选至少70%v/v。生物缓冲液优选Tris。

能替代或任选补充上述洗涤溶液使用的其他合适的洗涤溶液包含醇但是不含盐。优选以如下浓度包含醇：至少50%v/v、至少60%v/v、优选至少70%v/v。优选浓度范围是50%v/v～100%v/v，更优选90%v/v～100%v/v。

根据一个实施方式，包含在柱（或其部分）中的核酸结合固相直接用于结合核酸，以用于分析例如扩增反应。已经熟知例如可以将PCR反应中结合的核酸直接施加至膜或其他核酸结合固相。此处，归因于PCR条件，核酸被至少部分洗脱。但是，优选步骤d)中进行单独的洗脱步骤。本文中，能使用传统洗脱溶液来进行洗脱，所述洗脱溶液例如水、洗脱缓冲液、特别是生物缓冲液如Tri_s或其他合适的生物缓冲液，并且优选使用不干扰下游要进行的应用的洗脱溶液。因此，例如可使用低盐溶液供于洗脱。洗脱溶液可以包含叠氮化物。还可通过加热来辅助洗脱。洗脱之后，还可对洗脱物加热使其变性。

可以从有蹄类动物或有爪哺乳动物获得兽医学全血样品。所述样品优选从大型家畜获得，所述动物优选有蹄类动物如牛、绵羊、山羊、马、瘤牛、斑马、北美野牛、水牛、驴、羊驼、单峰骆驼、骆驼、美洲驼、鹿和猪。收集后，动物全血样品可以用或已经用EDTA、柠檬酸盐或肝素作为抗凝血剂处理。各经处理/稳定的全血样品合适用于本发明方法，并且常作为处理全血样品时的标准。样品可以是新鲜的，或者是冷冻的。使用优选50μl～500μl，优选50μl～250μl的兽医全血作为起始材料。通常，当使用本发明方法时，可使用200μl全血。当然，合适的输入体积也取决于柱的大小。推荐使用最多250μl、优选最多200μl的全血作为标准实验室离心柱的输入体积，所述实验室离心柱有约600～700μl的整体容纳能力。然而，例如由于炎症或肿瘤疾病导致的细胞数量的大幅增加可能会显著增加样品中的宿主核酸含量。在这种情况下，减少样品输入可以改善下游试验的结果。

另外，本发明方法还可以用于其他兽医样品类型，例如组织、血浆、血清、乳汁、尿、拭子、洗涤液等。实施例显示，本发明方法不仅能从兽医全血有效分离核酸，也能从其他兽医样品有效分离核酸。这特别合适于从因为样品组成（如乳汁样品或某些组织样品）而存在堵塞风险的样品分离核酸。因此，根据一个实施方式，本发明方法不用于从动物全血样品分离核酸，而是用于从下列样品中分离核酸：乳汁样品或其他样品，特别是如果不将聚氧乙烯脂肪醇醚添加至结合混合物就会发生堵塞的样品。

本文使用术语"核酸"具体是指包含共价连接的核糖核苷和/或脱氧核糖核苷的聚合物，所述连接通常通过亚基之间的磷酸二酯键，但是在一些情况中也通过硫代磷酸酯、甲基膦酸酯等。核酸包括但不限于gDNA；环状DNA；低分子量DNA、质粒DNA；循环DNA；hnRNA；mRNA；非编码RNA(ncRNA)，包括但不限于rRNA、tRNA、miRNA(微小RNA)、siRNA(小干扰RNA)、snoRNA(小核仁RNA)、snRNA(小核RNA)和stRNA(时序调节小RNA)；病原体核酸如病毒或细菌核酸、片段化的或降解的核酸；获自亚细胞细胞器（如线粒体或叶绿体）的核酸；以及获自生物样品中可能存在的微生物、寄生虫或者DNA或RNA病毒的核酸。合成的核酸序列也在本发明范围内，所述合成的核酸序列可以包含或不包含添加或"穿刺（spike）"到生物样品中的核酸类似物。

本发明方法特别合适用于一起分离RNA和DNA。然而，应用特定手段以从RNA单独分离DNA或者从DNA单独分离RNA也在本发明的范围内。合适的方法包括但不限于如下方法：在能使主要为非靶标核酸结合到固相的条件下，首先添加合适的固相。EP0880537和WO95/21849中描述了用于从靶核酸中选择性除去非靶核酸，因而允许例如从RNA中分离DNA的合适的方法。此外或或者，可以使用降解酶(DNA酶和RNA酶)。

根据一个实施方式，分离的核酸包含病原体核酸，即源自病原体的核酸。如实施例所示，根据本发明的方法特别合适于从兽医学全血样品分离病原体核酸。因为动物全血中经常仅包含非常少量的各病原体核酸，所以从动物全血分离病原体核酸特别困难。病原体核酸包括但不限于来自以下生物的核酸：病毒、细菌(包含革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌)、寄生虫(如原生动物和真核寄生虫)。对于兽医领域重要的主要病原体的示例包括但不限于：牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、蓝舌病毒（Bluetonguevirus）(BTV)、猪圆环病毒(PCV)、沙门氏菌属（salmomella spp.）和巴贝虫属（babesiaspp.）。具体而言，本发明提供用于制备核酸供分析或检测病原体的存在或病原体的量的优势，其中选择所述诊断方法基于或必需基于来自全血的核酸提取物，例如蓝舌病毒的情况。

在样品包含或疑似包含革兰氏阴性菌时，上述采用化学品和蛋白水解酶K的处理也通常足以完全裂解样品。然而，根据靶标病原体的类型，推荐特定的裂解方法，以确保样品的有效裂解和可能包含的病原体核酸的释放。因此，可以建议进行特定的预处理方案以确保有效裂解。例如，通常应使用额外的方法来破裂革兰氏阳性菌的细胞壁。当试图从全血样品的所述细菌分离核酸时，为了获得最大裂解效率，推荐使用机械破裂（例如使用玻璃珠）来帮助裂解。另外，可以用消泡剂和阴离子去污剂(如优选SDS)来处理样品。因此，根据一个实施方式，可任选地在机械破裂（见上文）过程中，采用消泡剂和包含阴离子去污剂（优选SDS）的裂解溶液来处理全血样品，所述裂解溶液中阴离子去污剂的浓度为至少1%、优选浓度2%～15%、2%～10%、最优选2～5%。所述（预）裂解混合物中阴离子去污剂（优选SDS）的浓度优选为0.3%～5%。所述裂解溶液还可以包含螯合剂和盐。pH优选大于8。然后，还将包含例如用于帮助机械破裂的玻璃珠的各混合物涡旋约5～15分钟。获得上清并随后用于上述常规裂解步骤，其中优选添加离液剂、非离子型去污剂和蛋白水解酶。上文详述了合适的裂解方案。

采用本发明方法提取的核酸不含蛋白、核酸酶和其他杂质，因此即可用于下游应用，例如用于检测是否存在特定靶核酸或定量所述核酸的方法，或用于测定靶标基因型的方法。基本上，分离自兽医学全血样品的核酸可用于包括使用相应核酸（包括兽医基因组DNA）的任何标准方法，包括但不限于例如用于饲养目的的病原体检测和基因分型。

可使用任何核酸分析/处理方法对经分离的核酸的进行分析/进一步处理，所述方法包括但不限于：扩增技术、聚合酶链式反应(PCR)、等温扩增、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、定量实时聚合酶链反应(Q-PCR)、数字PCR、凝胶电泳、毛细管电泳、质谱、荧光检测、紫外光谱法、杂交试验、DNA或RNA测序、限制性分析、逆转录、NASBA、等位基因特异性聚合酶链反应、聚合酶循环组装(PCA)、不对称聚合酶链反应、指数后线性聚合酶链反应(LATE-PCR)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、热启动聚合酶链反应、序列间特异性聚合酶链式反应(ISSR)、反向聚合酶链反应、连接介导的聚合酶链反应、甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)、多重聚合酶链式反应、巢式聚合酶链反应、固相聚合酶链反应或其任意组合。各种技术为本领域技术人员熟知，因此不需要本文进一步描述。

另外，本发明提供从兽医学全血样品中分离病原体核酸的方法，其中进行上述用于分离核酸的方法。如实施例所示，各方法特别适合于从兽医学全血样品分离病原体核酸。

另外，本发明涉及用于检测兽医学全血样品中是否存在至少一种靶标病原体核酸的方法，所述方法包括进行根据本发明第一方面所述的方法，并且检测经分离的核酸中是否存在至少一种病原体靶标核酸。优选地，使用扩增方法（优选通过聚合酶链反应）来检测靶标病原体核酸。如果应该检测病原体RNA，那么优选进行RT-PCR。检测也包括病原体核酸的定量。典型的病原体描述于上述各公开文献中。

现在通过多个实施例来讲述本发明，所述实施例并不限定本发明的范围。

实施例

本发明人测试并比较了多种核酸分离方法从兽医学全血样品中分离核酸的能力，在所述方法的结合混合物中都使用离液盐和醇(多数还有非离子型去污剂)。发现尽管结合混合物中使用不同的离液盐(例如盐酸胍或硫氰酸胍)、不同的离液盐浓度(例如1.9～2.6M)和/或不同的醇浓度(如10～45%)，但是使用基于标准膜的核酸纯化方法，总是发生柱堵塞。另外，在这些现有技术方案中使用非离子型去污剂(如吐温20或曲通X100)也不能预防柱的堵塞。因此，尽管这些方法能从多种兽医样品类型（如血浆、尿液和组织）中良好分离核酸，但是由于柱堵塞，这些方法对从兽医学全血样品中分离核酸并不合适。因此，令人非常惊讶的是，主要使用在结合混合物中包含特定去污剂的标准核酸分离方案即可防止所观察到的柱的堵塞。发现在结合混合物中加入至少一种聚氧乙烯脂肪醇醚能有效防止柱堵塞。因此，可有效防止从动物全血分离核酸时的膜堵塞。使用相应的结合混合物能防止柱堵塞。另外，实施例显示可使用不同的裂解方法以提供经裂解的样品。另外，实施例显示使用不同浓度的一种或多种醇、一种或多种离液盐和聚氧乙烯脂肪醇醚也能防止柱堵塞。

因此，在结合步骤中纳入相应的特定去污剂显著降低从动物全血分离核酸时的膜堵塞的风险，所述去污剂优选聚氧乙烯鲸蜡基醚，更优选聚氧乙烯(20)鲸蜡基醚。

图1显示相比现有技术方法，本发明方法的优势作用。图1显示当试图使用标准方法从牛全血分离核酸时发生了堵塞，所述标准方法使用包含盐酸胍和吐温20（浓度约6.5%）的结合缓冲液(见管1+2)。由于发生柱堵塞，所以该结合混合物不能通过所述柱。如果在结合混合物中加入聚氧乙烯(20)鲸蜡醇醚（浓度约10%），则没有发生柱的堵塞(见管3+4)。

1.实施例1

使不同的兽医样品(和作为阳性对照的PBS缓冲液)穿刺带有BVDV病毒颗粒，并且使用不同结合条件下的不同方案来分离核酸。在所有方案中，添加蛋白水解酶K(20μl)以供裂解。

在方案1中，通过添加包含聚氧乙烯(20)鲸蜡醇醚和GTC的裂解缓冲液来进行裂解。然后，将包含GTC、异丙醇和聚氧乙烯(20)鲸蜡醇醚的结合缓冲液添加至裂解的样品。所得的结合混合物包含2.31M GTC、13%异丙醇和6.5%聚氧乙烯(20)鲸蜡醇醚。

在方案2中，通过添加包含盐酸胍和非离子型去污剂混合物(吐温20和曲通X-100)的裂解缓冲液来进行裂解。然后，将包含GTC、异丙醇和聚氧乙烯(20)鲸蜡醇醚的结合缓冲液添加至裂解的样品。所得的结合混合物包含离液盐GTC和GuHCL（总浓度2.3M）、22%异丙醇和6.7%聚氧乙烯(20)鲸蜡醇醚。

在方案3中，通过添加包含盐酸胍和曲通X-100的裂解缓冲液来进行裂解。然后，将包含GTC和醇的结合缓冲液添加至裂解的样品。所得的结合混合物包含离液盐GTC和GuHCL（总浓度2M）、33%乙醇和曲通X-100。

用各方案分离的5μl核酸用于后续RT-PCR以检测经分离的核酸中的BVDVRNA。在这种试验中获得的更低的Ct值表明所述反应中存在更多的BVDV RNA，因此以更高产量分离了该BVDV RNA。结果见图2。方案1～3获得了针对PBS阳性对照样品、血清、尿液和粪便的相当一致的Ct值。这显示当从所述兽医样品中分离核酸时，方案1～3都可以起同样良好的作用。然而，使用方案3在分离自不同兽医学全血样品(牛血和绵羊血)的核酸中无法检测出BVDV RNA。使用方案3时，柱有堵塞。因此，使用结合混合物中包含曲通X-100作为非离子型去污剂的方案3，不能从动物全血分离核酸。然而，使用方案1和2以及因而本发明方法能从所述兽医学全血样品有效分离核酸。

2.实施例2

使来自不同物种的200μl全血样品(和作为阳性对照的0.9%氯化钠溶液)穿刺带有BVDV颗粒。所述样品使用标准方法或本发明指导的不同变化形式来处理，所述标准方法采用包含盐酸胍(GuHCL)和吐温20的结合混合物，本发明指导的不同变化形式在结合混合物中采用不同浓度的硫氰酸胍(GTC)和聚氧乙烯(20)鲸蜡醇醚。添加蛋白水解酶K来帮助裂解：

方法A：结合混合物中有1.81M GuHCl、32.2%EtOH、6.5%吐温20

方法B：结合混合物中有1.9M GTC、24%异丙醇、8.5%聚氧乙烯(20)鲸蜡醇醚

方法C：结合混合物中有1.5M GTC、17%异丙醇、7.6%聚氧乙烯(20)鲸蜡醇醚、0.3%SDS

方法D：结合混合物中有1.5M GTC、19%异丙醇、6.8%聚氧乙烯(20)鲸蜡醇醚、0.3%SDS

使用真空装置在QIAamp96板上完成处理。当使用方法A时，柱发生堵塞。当使用方法B、C和D时，没有观察到堵塞。在后续用于检测包含于经分离的核酸中的BVDV RNA的RT-PCR中，方法B、C和D获得的Ct值低于方法A的Ct值，其中甚至就绵羊和猪血而言甚至丢失了数据点。Ct值越低表明所述反应中存在的BVDVRNA越多，并因而以越高产量分离了所述BVDV RNA。结果见图5。

3.实施例3

使牛和绵羊血穿刺带有BHV1病毒颗粒，并使用本发明的不同变化形式来处理。使用蛋白水解酶K以及包含非离子型去污剂混合物(吐温20和曲通X-100)和离液盐(GuHCL)的裂解溶液来裂解样品。为了结合，添加含有离液盐(GTC)、异丙醇和聚氧乙烯(20)鲸蜡醇醚的不同体积的结合溶液。因此，获得具有不同浓度的离液盐(2.14M～2.36M)、醇(12.8%～23.4%)和聚氧乙烯(20)鲸蜡醇醚(3.8%～7%)的不同结合混合物。使用不同浓度的聚氧乙烯(20)鲸蜡醇醚能有效防止堵塞。本发明的所有不同变化形式均能从测试的全血样品分离核酸，如图6的结果所示。2.5μl～10μl模板体积之间的ct的差大约是2显示PCR反应缺乏抑制。因此，本发明的方法能使用不同浓度的离液盐、醇和聚氧乙烯(20)鲸蜡醇醚来进行。

4.实施例4

图5和图6还显示了本发明的方法合适于从不同动物全血样品分离细胞核酸，此处是基因组DNA。图5和图6显示了用实施例1的方案2处理的6种不同动物血液样品的分光光度测量和溴化乙啶染色的琼脂糖凝胶。凝胶显示与自动化的、基于顺磁二氧化硅颗粒的DNA分离方法的比较(QIAsymphony DNA血)。显示了对各样品的三次重复。

5.实施例5

核酸分离方法能可靠地进行并因而能被不同使用者等同有效地使用也很重要。为了测试所述使用者之间的一致性，使不同的样品穿刺带有肠道沙门氏菌（S.enterica）。使用实施例1的方案2来提取细菌DNA。由不同的使用者平行处理相同的样品。结果见图7。使用本发明的方法实现了使用者之间的高度一致性，这对于医学/诊断领域是非常重要的。

6.实施例6

根据本发明的这个方案，用吸量管将20μl蛋白水解酶K移入2ml微量离心管中。将200μl的全血样品添加至蛋白水解酶K。然后加入裂解缓冲液，所述裂解缓冲液包含盐酸胍（浓度高于5M）和非离子型去污剂混合物(吐温20和曲通X-100)（浓度约15%）。为了确保有效裂解，使样品与裂解缓冲液混合以生成均一溶液。由此获得包含约2M GuHCL、约5%非离子型去污剂(吐温20和曲通X-100)的裂解混合物。如果试图从革兰氏阳性菌分离靶核酸，推荐在蛋白水解酶K处理之前，用包含阴离子去污剂（优选SDS）的裂解缓冲液对样品进行预处理(如可以使用缓冲液ATL(恰根公司(QIAGEN))。

各混合物在20～25℃孵育15分钟以裂解样品。然后短暂离心所述管以除去盖子内的液滴。然后向样品添加350μl的结合缓冲液。各缓冲液包含聚氧乙烯(20)鲸蜡醇醚、离液盐(GTC)和异丙醇。盖上盖子并且通过脉冲涡旋来完全混合。由此获得包含2.3M离液盐(GuHCl和GTC)、21%异丙醇和6.3%聚氧乙烯(20)鲸蜡醇醚的结合混合物。

各制备的结合混合物置于2ml收集管中的QIAamp小抽柱(包含二氧化硅膜)中，且不浸润到边缘。盖上盖子，并且以8000rpm离心1分钟。QIAamp小抽柱置于干净的2ml收集管中，并且丢弃包含滤液的收集管。

然后，添加600μl洗涤缓冲液AW1(恰根公司)，且不浸润到边缘。以8000rpm离心1分钟之后，QIAamp小抽柱置于干净的2ml收集管中，并且丢弃包含滤液的管。然后，加入600μl洗涤缓冲液AW2(恰根公司)，且不浸润到边缘。以8000rpm离心1分钟之后，QIAamp小抽柱置于干净的2ml收集管中，并且丢弃包含滤液的管。然后通过全速(14,000rpm)离心2分钟来干燥膜。

QIAamp小抽柱置于干净的1.5ml微量离心管中，并且丢弃包含滤液的收集管。为了洗脱，将50～150μl缓冲液AVE(恰根公司)添加至膜的中心。盖上盖子，并在室温孵育1分钟。全速离心(14,000rpm)1分钟之后即可收集洗脱液。

Claims (15)

1.一种用于从兽医学全血样品中分离核酸的方法，其特征在于，所述方法包括至少如下步骤

a)制备结合混合物，所述结合混合物包含：

-经裂解的样品

-至少一种离液剂

-至少一种醇

-至少一种聚氧乙烯脂肪醇醚；

b)使所述结合混合物通过包含核酸结合固相的柱，由此使核酸结合至所述核酸结合固相；

c)可任选地，在所述核酸结合至所述固相时洗涤所述核酸；

d)可任选地，从所述固相洗脱所述核酸。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：

i)所述聚氧乙烯脂肪醇醚选自下组：聚氧乙烯月桂醇醚、聚氧乙烯鲸蜡醇醚，聚氧乙烯硬脂醇醚和聚氧乙烯油酰基醇醚；

ii)所述聚氧乙烯脂肪醇醚选自下组：聚氧乙烯(4)月桂醇醚、聚氧乙烯(23)月桂醇醚、聚氧乙烯(2)鲸蜡醇醚、聚氧乙烯(10)鲸蜡醇醚、聚氧乙烯(20)鲸蜡醇醚、聚氧乙烯(2)硬脂醇醚、聚氧乙烯(10)硬脂醇醚、聚氧乙烯(20)硬脂醇醚、聚氧乙烯(2)油酰基醇醚、聚氧乙烯(10)油酰基醇醚、聚氧乙烯(20)油酰基醇醚和/或聚氧乙烯(100)硬脂醇醚；

ii)所述聚氧乙烯脂肪醇醚是聚氧乙烯鲸蜡醇醚；和/或

iii)所述聚氧乙烯脂肪醇醚是聚氧乙烯(20)鲸蜡醇醚。

3.如权利要求1～2中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述聚氧乙烯脂肪醇醚以选自如下范围的浓度包含在所述结合混合物中：约0.5%～约20%、约2%～约15%、约3%～约12%、优选4%～约10%。

4.如权利要求1～3中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述离液剂具有以下特征中的一种或多种：

i)所述离液剂是离液盐；

ii)所述离液剂是选自下组的离液盐：盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、硫氰酸钠、碘化钠、高氯酸钠、三氯乙酸钠和三氟乙酸钠；和/或

iii)所述离液剂以选自如下范围的浓度包含在所述结合混合物中：约0.1M～最多7M、约0.2M～6M、约0.5M～4M和约0.5～3M。

5.如权利要求1～4中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述结合混合物中包含的至少一种醇具有以下特征中的一种或多种：

i)所述醇是具有1～5个碳原子的短链支链或非支链醇；

ii)所述醇选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和丁醇；和

iii)所述醇以选自下列的浓度包含在所述结合混合物中：至少10%、至少15%和至少20%。

6.如权利要求1～5中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述经分离的核酸包含病原体核酸。

7.如权利要求1～6中一项或多项所述的方法，其特征在于，步骤a)中所述结合混合物的制备包括如下步骤：

i)使所述兽医学全血样品裂解；和

ii)向所述经裂解的样品添加一种或多种添加剂，由此制备结合混合物，所述添加剂优选是结合溶液形式，所述结合混合物包含：

-经裂解的样品

-至少一种离液剂

-至少一种醇，和

-至少一种聚氧乙烯脂肪醇醚。

8.如权利要求1～7中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述全血样品是经稳定化处理过的，优选经抗凝血剂稳定化的全血样品。

9.如权利要求1～8中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述样品裂解包括一个或多个如下步骤：

i)添加至少一种蛋白水解酶；

ii)添加至少一种离液剂；

iii)添加至少一种去污剂；

iv)添加至少一种螯合剂；

v)加热，和/或

vi)振荡。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述样品裂解包括添加包含至少一种离液剂和至少一种去污剂的裂解溶液以及添加至少一种蛋白水解酶。

11.如权利要求1～10中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述兽医学全血样品获自选自下组的大型家畜：牛、绵羊、山羊、驴、马和猪。

12.如权利要求9～11中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述螯合剂选自二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)和N,N-双(羧甲基)甘氨酸(NTA)。

13.如权利要求1～12中一项或多项所述的方法，其特征在于，通过向所述经裂解的样品添加结合溶液来建立所述结合混合物中的条件，其中所述结合溶液有如下特征中的一种或多种，优选至少两种：

i)所述结合溶液包含至少一种离液盐，所述离液盐的浓度选自约0.1M～最多7M、约0.2M～6M、约0.5M～4M和约0.5～3M；

ii)所述结合溶液包含选自下组的至少一种聚氧乙烯脂肪醇醚：聚氧乙烯月桂醇醚、聚氧乙烯鲸蜡醇醚、聚氧乙烯硬脂醇醚和/或聚氧乙烯油酰基醇醚，其浓度范围选自约0.5%～约20%、约2%～约15%、约3%～约12%、优选4%～约8%；

iii)所述结合溶液包含至少一种缓冲剂；和/或

iv)所述结合溶液包含具有1～5个碳原子的短链支链或非支链醇。

14.一种从兽医学全血样品中分离病原体核酸的方法，所述方法包括进行如权利要求1～13中一项或多项所述的方法。

15.如权利要求1～14中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述经分离的核酸包含病原体核酸，其中所述病原体核酸获自选自下组的病原体：病毒、细菌和寄生虫。

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