CN115702168A - 靶向Her2的激动性CD28抗原结合分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及特征在于与CD28单价结合的靶向Her2的双特异性激动性CD28抗原结合分子、其生产方法、含有这些抗体的药物组合物以及使用其的方法。

Description

靶向Her2的激动性CD28抗原结合分子
技术领域
本发明涉及靶向Her2的双特异性激动性CD28抗原结合分子(其特征在于与CD28单价结合)、它们的制备方法、含有这些分子的药物组合物，以及它们在疾病，特别是癌症的治疗中作为免疫调节剂和/或共刺激物的用途。
背景技术
癌症免疫疗法正在成为越来越有效的疗法选择，其可以在黑色素瘤、非小细胞肺癌和肾细胞癌等癌症类型中产生显著和持久的反应。这主要是由几种免疫检查点阻断剂的成功推动的，包括抗PD-1(例如Keytruda、Merck；Opdivo、BMS)、抗CTLA-4(例如Yervoy、BMS)和抗PD-L1(例如Tecentriq、罗氏)。这些药剂可能作为许多癌症类型的标准治疗，或作为组合疗法的支柱，然而，只有一小部分患者(<25％)从这些疗法中受益。此外，各种癌症(***癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肉瘤、非三阴性乳腺癌等)对这些免疫调节剂存在原发耐药性。许多报告表明，缺乏预先存在的抗肿瘤T细胞会导致一些患者缺乏反应或反应不佳。总之，尽管现有免疫疗法具有令人印象深刻的抗癌作用，但对于解决较大癌症患者群体和开发旨在诱导和增强新型肿瘤特异性T细胞反应的疗法来说，显然存在医学需求。
CD28是共刺激分子亚家族的创始成员，其特征在于成对的V-set免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域连接到单个跨膜结构域和包含关键信号传导基序的细胞质结构域(Carreno和Collins,2002)。该亚家族的其他成员包括ICOS、CTLA-4、PD1、PD1H、TIGIT和BTLA(Chen和Flies，2013)。CD28表达仅限于T细胞，并且普遍存在于所有初始型亚群和大多数经历抗原刺激的亚群中，包括那些表达PD-1或CTLA-4的亚群。CD28和CTLA-4高度同源并竞争结合相同的B7分子CD80和CD86，这两种B7分子在树突细胞、B细胞、巨噬细胞和肿瘤细胞上表达(Linsley等人，1990)。CTLA-4对B7配体家族的更高亲和力使CTLA-4在配体结合方面胜过CD28并抑制效应T细胞应答(Engelhardt等人，2006)。相比之下，PD-1被证明通过使CD28的细胞质结构域部分去磷酸化来抑制CD28信号转导(Hui等人，2017)。通过专职性抗原提呈细胞表面上的CD80或CD86连接CD28对于初始T细胞的功能性从头启动、随后的克隆扩增、细胞因子产生、靶细胞裂解和长期记忆的形成是严格必需的。CD28配体的结合还促进诱导型共刺激受体如OX-40、ICOS和4-1BB的表达(综述于Acuto和Michel，2003)。在连接CD28(二硫键连接的同型二聚体)后，膜近端YMNM基序和远端PYAP基序已被证明与几种激酶和衔接蛋白复合(Boomer和Green，2010)。这些基序对于诱导IL2转录来说很重要，该IL2转录由NFAT、AP-1和NFκB家族转录因子的CD28依赖性激活介导(Fraser等人，1991)(June等人，1987)(Thompson等人，1989)。然而，在CD28的细胞质结构域内发现了另外的表征不佳的磷酸化和泛素化位点。正如(Esensten等人，2016)该，CD28启动的通路在促进常规T细胞的增殖和效应功能方面具有关键作用。CD28连接还促进调节性T细胞的抗炎功能。CD28通过部分增强来自T细胞受体的信号来共同刺激T细胞，但也被证明介导独特的信号传导事件(Acuto和Michel，2003；Boomer和Green，2010；June等人，1987)。由CD28特异性触发的信号控制T细胞功能的许多重要方面，包括下游蛋白的磷酸化和其他翻译后修饰(例如，PI3K介导的磷酸化)、转录变化(例如Bcl-xL表达)、表观遗传变化(例如IL-2启动子)、细胞骨架重塑(例如微管组织中心的取向)和糖酵解速率的变化(例如糖酵解通量)。CD28缺陷小鼠对传染性病原体、同种异体移植物抗原、移植物抗宿主病、接触性过敏反应和哮喘的反应降低(Acuto和Michel，2003)。缺乏CD28介导的共刺激导致T细胞体外和体内增殖减少，严重抑制生发中心形成和免疫球蛋白同种型转换，减少辅助性T(Th)细胞分化和Th2-型细胞因子表达。CD4依赖性细胞毒性CD8+T细胞应答也受到影响。重要的是，CD28缺陷型初始T细胞的增殖反应降低，尤其是在较低抗原浓度下。越来越多的文献主体支持使CD28结合在T细胞上具有抗肿瘤潜力的观点。最近的证据表明，PD-L1/PD-1和CTLA-4检查点抑制剂的抗癌作用取决于CD28(Kamphorst等人，2017；Tai等人，2007)。调查CTLA-4和PD-1阻断治疗效果的临床研究在晚期黑色素瘤和其他癌症患者中显示出非常有希望的结果。此外，输注表达人工嵌合T细胞受体的基因工程T细胞已显示出在B细胞癌症和其它癌症中的高应答率和耐久性，该人工嵌合T细胞受体包含与细胞内TCR信号结构域(Cd3z)和细胞内共刺激结构域(CD28和/或4-1BB结构域)融合的细胞外抗原识别结构域。
CD28激动性抗体可分为两类：(i)CD28超激动抗体和(ii)CD28常规激动抗体。通常，为了激活初始T细胞，需要T细胞抗原受体(TCR，信号1)的参与和CD28的共刺激信号(信号2)。CD28超级激动剂(CD28SA)是CD28特异性单克隆抗体，能够在没有明显T细胞受体参与的情况下自主激活T细胞(Hünig,2012)。在啮齿动物中，CD28SA激活常规和调节性T细胞。CD28SA抗体在多种自身免疫、炎症和移植模型中具有治疗效果。然而，人类CD28SA抗体TGN1412的I期研究在2006年引发了一场危及生命的细胞因子风暴。后续研究表明，该毒性是由于人类T细胞和临床前动物模型的T细胞的CD28反应性差异导致的剂量错误引起的。目前正在针对RA患者和转移性或不可切除的晚期实体恶性肿瘤患者的开放标签、多中心剂量递增研究中对TGN1412进行重新评估。CD28常规激动性抗体，例如克隆9.3，模拟CD28天然配体，并且仅在存在T细胞受体信号(信号1)的情况下能够增强T细胞活化。已发表的见解表明，抗体的结合表位对激动性抗体是超级激动剂还是常规激动剂具有重大影响(Beyersdorf等人，2005)。超激动TGN1412与CD28的横向基序结合，而常规激动分子9.3与配体结合表位紧密结合。由于不同的结合表位，超激动抗体和常规激动抗体在T细胞表面形成CD28分子线性复合物的能力不同。准确地说，TGN1412能够有效地形成CD28的线性阵列，这可能导致聚合的信号成分足以超过T细胞活化的阈值。另一方面，常规激动剂9.3会导致复合物的结构不是线性的。先前已经发表了基于9.3克隆的常规激动结合剂的转化尝试(Otz等人，2009)，该尝试使用针对黑素瘤相关蛋白聚糖和CD28的重组双特异性单链抗体。尽管基于双特异性单链抗体形成多聚体构建体的内在趋势，使用了常规CD28激动结合剂9.3，但据报道，所报告的双特异性单链抗体仍发挥“超激动”活性。
人表皮生长因子受体-2(Her2；ErbB2)是一种受体酪氨酸激酶，并且是跨膜受体的表皮生长因子受体(EGFR)家族的成员。Her2在一系列肿瘤类型中过表达，并与疾病的发生和进展相关。它与预后不良有关。例如，在大约30％的人类乳腺癌中观察到Her2的过表达，并且其同与这些肿瘤相关的侵袭性生长和不良的临床结果相关(Slamon等人，(1987)Science235:177-182)。
人源化抗Her2单克隆抗体曲妥珠单抗(CAS 180288-69-1、
Figure BDA0004009238190000041
huMAb4D5-8、rhuMAb Her2，基因泰克)靶向Her-2的胞外域(US 5677171；US 5821337；US6054297；US 6165464；US 6339142；US 6407213；US 6639055；US 6719971；US 6800738；US7074404；Coussens等人(1985)Science 230:1 132-9；Slamon等人，(1989)Science 244:707-12；Slamon等人，(2001)New Engl.J.Med.344:783-792)。曲妥珠单抗已显示抑制过表达Her-2的人肿瘤细胞的增殖，并且是抗体依赖性细胞毒性ADCC的介质(Hudziak等人(1989)Mol Cell Biol 9:1165-72；Lewis等人(1993)Cancer Immunol Immunother；37:255-63；Baselga等人(1998)Cancer Res.58:2825-2831；Hotaling等人(1996)[摘要]。Proc.Annual Meeting Am Assoc Cancer Res；37:471；Pegram MD等人(1997)[摘要]。ProcAm Assoc癌症研究中心；38:602；Sliwkowski et al(1999)Seminars in Oncology 26(4),Suppl 12:60-70；Yarden Y.和Sliwkowski,M.(2001)Nature Reviews:Molecular CellBiology,Macmillan Magazines,Ltd.,Vol.卷2:127-137)。
Figure BDA0004009238190000042
(曲妥珠单抗，基因泰克公司)在1998年被批准用于治疗患有过表达Her2的转移性乳腺癌的患者(Baselga等人，(1996)J.Clin.Oncol.14:737-744)。2006年，FDA批准
Figure BDA0004009238190000043
作为含有阿霉素、环磷酰胺和紫杉醇的治疗方案的一部分，用于辅助治疗患有Her2阳性、***阳性的乳腺癌的患者。帕妥珠单抗(也称为重组人源化单克隆抗体2C4、rhuMAb 2C4、
Figure BDA0004009238190000044
Genentech,Inc,South San Francisco)是另一种靶向Her2的抗体治疗方法。帕妥珠单抗是一种Her二聚化抑制剂(HDI)，具有抑制Her2与其他Her受体(例如EGFR/Her l、Her2、Her3和Her4)形成活性异二聚体或同二聚体的能力。参见，例如，Harari和Yarden Oncogene 19:6102-14(2000)；Yarden和Sliwkowski.Nat RevMol Cell Biol 2:127-37(2001)；Sliwkowski,Nat Struct Biol 10:158-9(2003)；Cho等人，Nature 421:756-60(2003)；和Malik等人，Pro Am Soc Cancer Res 44:176-7(2003)；US 7560111。
Figure BDA0004009238190000051
在2012年首次获批与曲妥珠单抗和多西他赛组合用于治疗患有晚期或后期(转移性)Her2阳性乳腺癌的患者。同时，使用曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的联合疗法也获批用于Her2阳性、局部晚期、炎症或早期乳腺癌的新辅助(手术前)治疗和具有复发的高风险的Her2阳性早期乳腺癌(EBC)的辅助(手术后)治疗。Perjeta和Herceptin的作用机制被认为是相互补充的，因为两者都结合到Her2受体，但结合到不同的地方。Perjeta和Herceptin的组合被认为提供了HER信号传导通路的更全面的双重阻断，从而防止肿瘤细胞生长和存活。WO 2012/143523中公开了针对人ErbB2的结构域II、III和IV的双特异性二价Her2抗体。包含抗体rhuMab 2C4和hu4D5的优化变体的双特异性HER-2抗体，称为赫赛达(Herceptarg)，已经在WO 2015/091738中进行描述。
尽管曲妥珠单抗在乳腺癌中的治疗效果得到了很好的证明，但是仍然有许多患者因为耐药性而无法从曲妥珠单抗中获益。鉴于在表达低水平Her2的特定癌症中缺乏有效的抗Her2疗法、对当前疗法的耐药性以及表达Her2的癌症的流行，需要新疗法来治疗此类癌症。
已经发现，当有限量的抗CD3双特异性抗体，即T细胞双特异性抗体(TCB)，例如靶向Her2的CD3抗体，与激动性抗CD28分子组合时，可以实现更好的T细胞活化。鉴于CD28在各种肿瘤适应症中T细胞的基线表达(Lavin等人，2017；Tirosh等人，2016；Zheng等人，2017)并且CD28信号传导的激活增强了T细胞受体信号，TCB分子与靶向Her2的CD28抗原结合分子的组合预期协同作用以诱导强而持久的抗肿瘤应答。因此，我们在本文中描述了新型Her2的激动性CD28分子，该分子显示出与TCB的协同作用，并且在存在TCB信号的情况下需要CD28结合单价以实现严格的肿瘤靶标依赖性。
发明内容
本发明描述了靶向Her2的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其实现肿瘤依赖性T细胞活化和肿瘤细胞杀伤，而无需形成多聚体。本发明的双特异性CD28抗原结合分子的特征在于与CD28的单价结合并且在于它们包含能够特异性结合人表皮生长因子受体-2(Her2)的第二抗原结合结构域。此外，它们具有由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基组成的Fc结构域，该第一亚基和第二亚基包含一个或多个氨基酸取代，该一个或多个氨基酸取代降低该抗原结合分子与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能。从而消除了Fc受体介导的交联，并且通过结合能够特异性结合Her2的第二抗原结合结构域的交联来实现肿瘤特异性活化。
因此，本发明提供了双特异性激动性CD28抗原结合分子，其特征在于与CD28单价结合，该双特异性激动性CD28抗原结合分子包含
(a)能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域，
(b)能够与抗原结合结构域特异性结合的第二抗原结合结构域，该抗原结合结构域能够与人表皮生长因子受体-2(Her2)特异性结合，以及
(c)包含能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基的Fc结构域，其包含一个或多个氨基酸取代，该一个或多个氨基酸取代降低该抗原结合分子与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能。
特别地，本发明提供了双特异性激动性CD28抗原结合分子，其特征在于与CD28单价结合，该双特异性激动性CD28抗原结合分子包含
(a)能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域，
(b)能够与抗原结合结构域特异性结合的第二抗原结合结构域，该抗原结合结构域能够与人表皮生长因子受体-2(Her2)特异性结合，以及
(c)由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域，该第一亚基和第二亚基包含一个或多个氨基酸取代，该一个或多个氨基酸取代降低抗原结合分子与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能，
其中能够与Her2特异性结合的该第二抗原结合结构域包含
(i)重链可变区(VHHer2)和轻链可变区(VLHer2)，该重链可变区包含以下的重链互补决定区：SEQ ID NO:2的CDR-H1、SEQ ID NO:3的CDR-H2和SEQ ID NO:4的CDR-H3，该轻链可变区包含以下的轻链互补决定区：SEQ ID NO:5的CDR-L1、SEQ ID NO:6的CDR-L2和SEQID NO:7的CDR-L3；或
(ii)重链可变区(VHHer2)和轻链可变区(VLHer2)，该重链可变区包含以下的重链互补决定区：SEQ ID NO:10的CDR-H1、SEQ ID NO:11的CDR-H2和SEQ ID NO:12的CDR-H3，该轻链可变区包含以下的轻链互补决定区：SEQ ID NO:13的CDR-L1、SEQ ID NO:14的CDR-L2和SEQ ID NO:15的CDR-L3；或
(iii)重链可变区(VHHer2)和轻链可变区(VLHer2)，该重链可变区包含以下的重链互补决定区：SEQ ID NO:132的CDR-H1、SEQ ID NO:133的CDR-H2和SEQ ID NO:134的CDR-H3，该轻链可变区包含以下的轻链互补决定区：SEQ ID NO:135的CDR-L1、SEQ ID NO:136的CDR-L2和SEQ ID NO:137的CDR-L3，或
(iv)重链可变区(VHHer2)和轻链可变区(VLHer2)，该重链可变区包含以下的重链互补决定区：SEQ ID NO:140的CDR-H1、SEQ ID NO:141的CDR-H2和SEQ ID NO:142的CDR-H3，该轻链可变区包含以下的轻链互补决定区：SEQ ID NO:143的CDR-L1、SEQ ID NO:144的CDR-L2和SEQ ID NO:145的CDR-L3。
在一个方面，本发明提供了双特异性激动性CD28抗原结合分子，其特征在于与CD28单价结合，该双特异性激动性CD28抗原结合分子包含
(a)能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域，
(b)能够与抗原结合结构域特异性结合的第二抗原结合结构域，该抗原结合结构域能够与人表皮生长因子受体-2(Her2)特异性结合，以及
(c)由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域，该第一亚基和第二亚基包含一个或多个氨基酸取代，该一个或多个氨基酸取代降低抗原结合分子与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能，
其中能够与Her2特异性结合的该第二抗原结合结构域包含
(i)重链可变区(VHHer2)和轻链可变区(VLHer2)，该重链可变区包含以下的重链互补决定区：SEQ ID NO:2的CDR-H1、SEQ ID NO:3的CDR-H2和SEQ ID NO:4的CDR-H3，该轻链可变区包含以下的轻链互补决定区：SEQ ID NO:5的CDR-L1、SEQ ID NO:6的CDR-L2和SEQID NO:7的CDR-L3；或
(ii)重链可变区(VHHer2)和轻链可变区(VLHer2)，该重链可变区包含以下的重链互补决定区：SEQ ID NO:10的重链互补决定区CDR-H1、SEQ ID NO:11的CDR-H2和SEQ IDNO:12的CDR-H3，该轻链可变区包含以下的轻链互补决定区：SEQ ID NO:13的CDR-L1、SEQID NO:14的CDR-L2和SEQ ID NO:15的CDR-L3。
在另一个方面，本发明提供了双特异性激动性CD28抗原结合分子，其特征在于与CD28单价结合，该双特异性激动性CD28抗原结合分子包含
(a)能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域，
(b)能够与抗原结合结构域特异性结合的第二抗原结合结构域，该抗原结合结构域能够与人表皮生长因子受体-2(Her2)特异性结合，以及
(c)由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域，该第一亚基和第二亚基包含一个或多个氨基酸取代，该一个或多个氨基酸取代降低抗原结合分子与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能，
其中能够与Her2特异性结合的该第二抗原结合结构域包含
(iii)重链可变区(VHHer2)和轻链可变区(VLHer2)，该重链可变区包含以下的重链互补决定区：SEQ ID NO:132的CDR-H1、SEQ ID NO:133的CDR-H2和SEQ ID NO:134的CDR-H3，该轻链可变区包含以下的轻链互补决定区：SEQ ID NO:135的CDR-L1、SEQ ID NO:136的CDR-L2和SEQ ID NO:137的CDR-L3，或
(iv)重链可变区(VHHer2)和轻链可变区(VLHer2)，该重链可变区包含以下的重链互补决定区：SEQ ID NO:140的CDR-H1、SEQ ID NO:141的CDR-H2和SEQ ID NO:142的CDR-H3，该轻链可变区包含以下的轻链互补决定区：SEQ ID NO:143的CDR-L1、SEQ ID NO:144的CDR-L2和SEQ ID NO:145的CDR-L3。
在一个方面，提供了如本文所定义的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中Fc结构域是IgG，特别是IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc结构域。在一个特定方面，由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域是IgG1 Fc结构域。在一个方面，Fc结构域包含氨基酸取代L234A和L235A(根据Kabat EU索引编号)。在一个方面，Fc结构域属于人IgG1亚类，并且包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面，提供了如上文所定义的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域包含(i)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含以下的重链互补决定区：SEQ ID NO:26的CDR-H1、SEQ ID NO:27的CDR-H2和SEQ ID NO:28的CDR-H3，该轻链可变区包含以下的轻链互补决定区：SEQ IDNO:29的CDR-L1、SEQ ID NO:30的CDR-L2和SEQ ID NO:31的CDR-L3；或(ii)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:18的CDR-H1、SEQ ID NO:19的CDR-H2和SEQ ID NO:20的CDR-H3，该轻链可变区包含SEQ ID NO:21的CDR-L1、SEQ IDNO:22的CDR-L2和SEQ ID NO:23的CDR-L3。
在一个方面，双特异性激动性CD28抗原结合分子的能够与CD28特异性结合的抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ IDNO:26的CDR-H1、SEQ ID No:26的CDR-H2 NO:27和SEQ ID NO:28的CDR-H3，该轻链可变区包含SEQ ID NO:29的CDR-L1、SEQ ID NO:30的CDR-L2和SEQ ID NO:31的CDR-L3。
在另一个方面，双特异性激动性CD28抗原结合分子的能够与CD28特异性结合的抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ IDNO:18的CDR-H1、SEQ ID NO:19的CDR-H2和SEQ ID NO:20的CDR-H3，该轻链可变区包含SEQID NO:21的CDR-L1、SEQ ID NO:22的CDR-L2和SEQ ID NO:23的CDR-L3。
在进一步方面，提供了如上文所定义的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域包含
(i)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含以下的重链互补决定区：SEQ ID NO:52的CDR-H1、SEQ ID NO:53的CDR-H2和SEQ ID NO:54的CDR-H3，该轻链可变区包含以下的轻链互补决定区：SEQ ID NO:55的CDR-L1、SEQ ID NO:56的CDR-L2和SEQ ID NO:57的CDR-L3；或
(ii)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:58的CDR-H1、SEQ ID NO:59的CDR-H2和SEQ ID NO:60的CDR-H3，该轻链可变区包含SEQ IDNO:61的CDR-L1、SEQ ID NO:62的CDR-L2和SEQ ID NO:63的CDR-L3；或
(ii)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:64的CDR-H1、SEQ ID NO:65的CDR-H2和SEQ ID NO:66的CDR-H3，该轻链可变区包含SEQ IDNO:67的CDR-L1、SEQ ID NO:68的CDR-L2和SEQ ID NO:69的CDR-L3。
在一个方面，双特异性激动性CD28抗原结合分子的能够与CD28特异性结合的抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含以下的重链互补决定区：SEQ ID NO:52的CDR-H1、SEQ ID NO:53的CDR-H2和SEQ ID NO:54的CDR-H3，该轻链可变区包含以下的轻链互补决定区：SEQ ID NO:55的CDR-L1、SEQ ID NO:56的CDR-L2和SEQ ID NO:57的CDR-L3。
在另一个方面，双特异性激动性CD28抗原结合分子的能够与CD28特异性结合的抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ IDNO:58的CDR-H1、SEQ ID NO:59的CDR-H2和SEQ ID NO:60的CDR-H3，该轻链可变区包含SEQID NO:61的CDR-L1、SEQ ID NO:62的CDR-L2和SEQ ID NO:63的CDR-L3。
在另一个方面，双特异性激动性CD28抗原结合分子的能够与CD28特异性结合的抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ IDNO:64的CDR-H1、SEQ ID NO:65的CDR-H2和SEQ ID NO:66的CDR-H3，该轻链可变区包含SEQID NO:67的CDR-L1、SEQ ID NO:68的CDR-L2和SEQ ID NO:69的CDR-L3。
而且，提供了如上文所定义的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在进一步方面，提供了双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含选自由SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41组成的组的氨基酸序列，该轻链可变区包含选自由SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQID NO:50和SEQ ID NO:51组成的组的氨基酸序列。
在另一个方面，提供了双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域包含
(a)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，或
(b)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，或
(c)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，或
(d)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，或
(e)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，或
(f)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，或
(g)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，或
(h)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，或
(i)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，或
(j)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，或
(k)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
在一个特定的方面，提供了双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域包含(i)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含以下的重链互补决定区：SEQ ID NO:52的CDR-H1、SEQ ID NO:53的CDR-H2和SEQ ID NO:54的CDR-H3，该轻链可变区包含以下的轻链互补决定区：SEQ ID NO:55的CDR-L1、SEQ ID NO:56的CDR-L2和SEQ ID NO:57的CDR-L3。在一个方面，能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD28)的CDR和轻链可变区(VLCD28)的CDR，该重链可变区包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。
在另一个特定的方面，提供了双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与CD28特异性结合的抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列。在进一步特定的方面，提供了双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与CD28特异性结合的抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
在一个方面，提供了双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包含重链可变区(VHHer2)和轻链可变区(VLHer2)，该重链可变区包含以下的重链互补决定区：SEQ ID NO:2的CDR-H1、SEQ ID NO:3的CDR-H2和SEQ ID NO:4的CDR-H3，该轻链可变区包含以下的轻链互补决定区：SEQ ID NO:5的CDR-L1、SEQ ID NO:6的CDR-L2和SEQ ID NO:7的CDR-L3。在一个方面，能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区(VHHer2)和包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链可变区(VLHer2)。在一个特定的方面，能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区(VHHer2)和包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链可变区(VLHer2)。
在另一个方面，提供了如本文所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包含重链可变区(VHHer2)和轻链可变区(VLHer2)，该重链可变区包含以下的重链互补决定区：SEQ ID NO:10的CDR-H1、SEQ ID NO:11的CDR-H2和SEQ ID NO:12的CDR-H3，该轻链可变区包含以下的轻链互补决定区：SEQ ID NO:13的CDR-L1、SEQ ID NO:14的CDR-L2和SEQ ID NO:15的CDR-L3。在一个方面，能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链可变区(VHHer2)和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链可变区(VLHer2)。在一个特定的方面，能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链可变区(VHHer2)和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链可变区(VLHer2)。
在又一方面，提供了如本文所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包含重链可变区(VHHer2)和轻链可变区(VLHer2)，该重链可变区包含以下的重链互补决定区：SEQ ID NO:132的CDR-H1、SEQ ID NO:133的CDR-H2和SEQ ID NO:134的CDR-H3，该轻链可变区包含以下的轻链互补决定区：SEQ ID NO:135的CDR-L1、SEQ ID NO:136的CDR-L2和SEQ ID NO:137的CDR-L3。在一个方面，能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的重链可变区(VHHer2)和包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列的轻链可变区(VLHer2)。在一个特定的方面，能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的重链可变区(VHHer2)和包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列的轻链可变区(VLHer2)。
在另一个方面，提供了如本文该的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包含重链可变区(VHHer2)和轻链可变区(VLHer2)，该重链可变区包含以下的重链互补决定区：SEQ ID NO:140的CDR-H1、SEQ ID NO:141的CDR-H2和SEQ ID NO:142的CDR-H3，该轻链可变区包含以下的轻链互补决定区：SEQ ID NO:143的CDR-L1、SEQ ID NO:144的CDR-L2和SEQ ID NO:145的CDR-L3。在一个方面，能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的重链可变区(VHHer2)和包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的轻链可变区(VLHer2)。在一个特定的方面，能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的重链可变区(VHHer2)和包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的轻链可变区(VLHer2)。
在进一步的方面，提供了如前文定义的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域和/或能够与Her2特异性结合的第二抗原结合结构域是Fab片段或crossFab片段。在一个方面，提供了如本文所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其包含(a)能够与CD28特异性结合的Fab片段，(b)能够与Her2特异性结合的crossFab片段和(c)由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域，该第一亚基和第二亚基包含一个或多个氨基酸取代，该取代降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能。在另一个方面，提供了如本文所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其包含(a)能够与CD28特异性结合的crossFab片段，(b)能够与Her2特异性结合的Fab片段和(c)由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域，该第一亚基和第二亚基包含一个或多个氨基酸取代，该一个或多个氨基酸取代降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能。
在一个方面，能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域为Fab片段，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换或恒定结构域CL和CH1彼此替换，特别是可变结构域VL和VH彼此替换。在一个方面，能够与Her2特异性结合的第二抗原结合结构域是常规Fab片段。在一方面，能够与Her2特异性结合的第二抗原结合结构域是Fab分子，其中在恒定结构域CL中，第123位(根据Kabat EU索引编号)氨基酸被选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)的氨基酸取代，并且第124位(根据Kabat EU索引编号)氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代，其中在恒定结构域CH1，第147位(根据Kabat EU索引编号)氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代，并且第213位(根据Kabat EU索引编号)氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个特定的方面，提供了双特异性激动性CD28抗原结合分子，其包含(i)含有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的第一轻链、含有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的第二重链和含有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的第二轻链，或(ii)含有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的第一轻链、含有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:98的氨基酸序列的第二重链和含有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的第二轻链，或(iii)含有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的第一轻链、含有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:101的氨基酸序列的第二重链和含有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的第二轻链。
在另一个特定的方面，提供了双特异性激动性CD28抗原结合分子，其包含(i)含有SEQ ID NO:179的氨基酸序列的第一轻链、含有SEQ ID NO:178的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:180的氨基酸序列的第二重链和含有SEQ ID NO:181的氨基酸序列的第二轻链，或(ii)含有SEQ ID NO:179的氨基酸序列的第一轻链、含有SEQ ID NO:178的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:182的氨基酸序列的第二重链和含有SEQ ID NO:183的氨基酸序列的第二轻链。
在进一步的方面，提供了如本文所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与Her2特异性结合的第二抗原结合结构域为Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换或恒定结构域CL和CH1彼此替换，特别是可变结构域VL和VH彼此替换。在一个方面，能够与CD28特异性结合的抗原结合结构域是常规Fab分子。在一个方面，能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域是Fab分子，其中在恒定结构域CL中，第123位(根据Kabat EU索引编号)氨基酸被选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)的氨基酸取代，并且第124位(根据Kabat EU索引编号)氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代，其中在恒定结构域CH1中，第147位(根据Kabat EU索引编号)氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代，并且第213位(根据Kabat EU索引编号)氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个特定的方面，提供了双特异性激动性CD28抗原结合分子，其包含(i)含有SEQ ID NO:83的氨基酸序列的第一轻链、含有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:99的氨基酸序列的第二重链和含有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的第二轻链，或(ii)含有SEQ ID NO:83的氨基酸序列的第一轻链、含有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的第二重链和含有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的第二轻链。
在另一个方面，提供了如本文所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域各自是Fab分子，并且Fc结构域由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成；并且其中(i)第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一亚基的N末端融合，并且第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端与Fc结构域的第二亚基的N末端融合，或(ii)第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一亚基的N末端融合，并且第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端与该Fc结构域的第二亚基的N末端融合。在一个方面，Fc结构域包含促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰。在一个方面，Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W(EU编号)，Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。
根据本发明的另一个方面，提供了一种或多种分离的多核苷酸，其编码本发明的双特异性激动性CD28抗原结合分子。本发明进一步提供了一种或多种载体(特别是表达载体)和宿主细胞，该载体包含本发明的分离的多核苷酸，该宿主细胞包含本发明的分离的多核苷酸或表达载体。在一些方面，宿主细胞是真核细胞，特别是哺乳动物细胞。在一些方面，宿主细胞为原核细胞.在另一个方面，提供了制备如本文所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子的方法，该方法包含在适合于双特异性激动性CD28抗原结合分子的表达的条件下培养宿主细胞。任选地，该方法还包含回收双特异性激动性CD28抗原结合分子。本发明还涵盖通过本发明的方法制备的双特异性激动性CD28抗原结合分子。
本发明进一步提供了药物组合物，该药物组合物包含本发明的双特异性激动性CD28抗原结合分子和至少一种药学上可接受的赋形剂。在一个方面，药物组合物用于疾病，特别是癌症的治疗。在一个方面，药物组合物用于Her2-阳性癌症的治疗。
本发明还包括使用本发明的双特异性激动性CD28抗原结合分子或药物组合物的方法。在一个方面，本发明提供了用作药物的根据本发明的双特异性激动性CD28抗原结合分子或药物组合物。在一个方面，提供了用于(a)增强细胞活化或(b)增强T细胞效应子功能的如本文所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子。在一个方面，提供了用于疾病的治疗的根据本发明的双特异性激动性CD28抗原结合分子或药物组合物。在具体方面，该疾病是癌症，特别是Her2-阳性癌症。在另一个方面，提供了根据本发明的用于癌症的治疗的双特异性激动性CD28抗原结合分子或药物组合物，其中该激动性CD28抗原结合分子用于与化疗剂、放射疗法和/或用于癌症免疫疗法的其他药剂联合施用。在进一步的方面，提供了用于癌症的治疗的双特异性激动性CD28抗原结合分子或药物组合物，其中双特异性激动性CD28抗原结合分子用于与T细胞活化性抗CD3双特异性抗体联合施用。在一个方面，T细胞活化抗CD3双特异性抗体是抗Her2/抗CD3抗体。在又一方面，提供用于癌症的治疗的双特异性激动性CD28抗原结合分子或药物组合物，其中双特异性激动性CD28抗原结合分子用于与抗PD-L1抗体或抗PD-1抗体联合施用。
还提供了根据本发明的双特异性激动性CD28抗原结合分子或药物组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途；以及治疗个体疾病的方法，该方法包含向该个体施用治疗有效量的根据本发明的双特异性激动性CD28抗原结合分子或以药学上可接受的形式包含根据本发明的双特异性激动性CD28抗原结合分子的组合物。在具体方面，疾病为癌症。在一个方面，提供了(a)增强个体中的T细胞活化或(b)增强T细胞效应子功能的方法，该方法包含向该个体施用根据本发明的双特异性激动性CD28抗原结合分子或以药学上可接受的形式包含根据本发明的双特异性激动性CD28抗原结合分子的组合物。在另一个方面，提供了根据本发明的双特异性激动性CD28抗原结合分子在制备用于治疗疾病的药物中的用途，其中该治疗包含与化疗剂、放射疗法和/或用于癌症免疫疗法的其他药剂共同施用。在进一步方面，提供了治疗个体中的疾病的方法，该方法包含向该个体施用治疗有效量的根据本发明的双特异性激动性CD28抗原结合分子或以药学上可接受的形式包含根据本发明的双特异性激动性CD28抗原结合分子的组合物，其中该方法包含与化疗剂、放射疗法和/或用于癌症免疫疗法的其他药剂共同施用。在进一步方面，提供了治疗个体中的疾病的方法，包含向该个体施用治疗有效量的根据本发明的双特异性激动性CD28抗原结合分子或以药学上可接受的形式包含根据本发明的双特异性激动性CD28抗原结合分子的组合物，其中该方法包含与T细胞活化抗CD3双特异性抗体共同施用。在一个方面，T细胞活化抗CD3双特异性抗体是抗Her2/抗CD3抗体。在另一个方面，提供了治疗个体中的疾病的方法，该方法包含向该个体施用治疗有效量的根据本发明的双特异性激动性CD28抗原结合分子或以药学上可接受的形式包含根据本发明的双特异性激动性CD28抗原结合分子的组合物，其中该方法包含与抗PD-L1抗体或抗PD-1抗体共同施用。还提供了抑制个体中肿瘤细胞生长的方法，该方法包含向个体施用有效量的根据本发明的双特异性激动性CD28抗原结合分子，或以药学上可接受的形式包含根据本发明的双特异性激动性CD28抗原结合分子的组合物，以抑制肿瘤细胞的生长。在上述方面中的任何方面，个体优选为哺乳动物，特别是人。
附图说明
在图1A至1D中示出了如本文所述的示例性分子的示意图。图1A示出了CD28激动性抗体变体作为单价hu IgG1 PGLALA同种型(“Fc沉默”)的示意图。图1B示出了1+1形式的双特异性Her2-CD28抗原结合分子，其中在包含CD28抗原结合结构域的Fab分子中，VH和VL结构域彼此交换(VH/VL crossfab)并且其中在包含Her2抗原结合结构域的Fab中，CH1和CL结构域中的某些氨基酸(带电荷的变体)交换以允许与轻链更好地配对。Fc结构域是hu IgG1PGLALA版本。图1C示出1+1形式的双特异性Her2-CD28抗原结合分子，其两条重链均包含N297G突变，其中两种Fab分子均在不同细胞系中表达、纯化并组装成完整的双特异性。图1D示出1+1形式的双特异性Her2-CD28抗原结合分子，其中在包含Her2抗原结合结构域的Fab分子中，VH和VL结构域彼此交换(VH/VL crossfab)，其中在包含CD28抗原结合结构域的Fab中，CH1和CL结构域中的某些氨基酸(带电荷的变体)交换以允许与轻链更好地配对。
CD28(SA)及其变体的可变结构域的比对显示在图2A至2D中。图2A示出了CD28(SA)VH结构域及其变体的比对以去除半胱氨酸50并将所得抗CD28结合剂的亲和力降低到不同程度。值得注意的是，在VH变体i和j中，CD28(SA)的CDR从IGHV1-2框架移植到IGHV3-23框架中(图2B)。在图2C中，示出了CD28(SA)VL结构域及其变体的比对以将所得抗CD28结合剂的亲和力降低到不同程度。在变体t中，CDR被移植到曲妥珠单抗(赫赛汀)VL序列的框架序列中(图2D)。
在图3A至3C中，示出了来自上清液的单特异性、单价IgG形式的亲和力降低的CD28激动性抗体变体与细胞上的人CD28的结合。与阴性对照(抗DP47)和原始CD28抗体CD28(SA)相比，与表达人CD28的CHO细胞(亲本细胞系CHO-k1 ATCC#CCL-61，经修饰以稳定过表达人CD28)结合的中位荧光强度，通过流式细胞仪进行评估。变体1-10的结合曲线示于图3A，变体11至22的结合曲线示于图3B，变体23至31的结合曲线示于图3C。所描绘的是SD的技术重复。
图4A示出了Her2-CD28双特异性抗原结合分子与人乳腺癌细胞系KPL-4在细胞表面上表达的Her2的结合。Her2-CD28(P1AF6741)或对照分子(DP47 huIgG1 P329G LALA抗体)与表达Her2的细胞系KPL-4以不同浓度孵育，如X轴所示。然后洗去过量的和未结合的分子，并用次级结合R-藻红蛋白AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人IgG，Fcγ片段特异性检测结合的分子。通过流式细胞术测量荧光强度的中值(MFI)，并以剂量依赖性方式指示测试分子的亲和力。显示的值是技术重复的平均值+/-SEM。
图4B示出Her2-CD28双特异性抗原结合分子与在CHOk1-huCD28细胞系的细胞表面上表达的CD28的结合。将Her2-CD28(P1AF6741)或对照分子(DP47 huIgG1 P329G LALA抗体)与如X轴所示的不同浓度的CHOk1-huCD28细胞系一起孵育。然后洗去过量的和未结合的分子，并用次级结合R-藻红蛋白AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人IgG，Fcγ片段特异性检测结合的分子。通过流式细胞术测量荧光强度的中值(MFI)，并以剂量依赖性方式指示测试分子的亲和力。显示的值是技术重复的平均值+/-SEM。
图5示出在KPL-4细胞存在的情况下，在IL-2报告子分析中，Her2-CD28双特异性抗原结合分子增强了T细胞对抗CD3刺激的应答。显示了在抗CD3 IgG克隆OKT3(10nM)的次优浓度以及Her2-CD28(P1AF6741)或对照分子(DP47)的增加的浓度的存在下，与KPL-4细胞共孵育6小时后，通过发光读出法测量的IL-2报告子细胞的活化。虚线仅示出抗CD3。显示的值是技术重复的平均值+/-SEM。
图6A示出Her2-CD28双特异性抗原结合分子B、D和A与在人乳腺癌细胞系KPL-4的细胞表面上表达的Her2的结合。所有分子，包括阴性对照(种系对照DP47 IgG1 Fc PGLALA)在0.01nM-500nM的浓度范围内以5倍稀释孵育。之后，洗去过量和未结合的分子,并用Fcγ片段特异性山羊抗人IgG R-藻红蛋白AffiniPure F(ab')2二抗检测结合的分子。通过流式细胞术测量中位荧光强度(MFI)，并以剂量依赖性方式指示测试分子的亲和力。所有值都被描述为技术重复的平均值+/-SEM。
图6B示出Her2-CD28双特异性抗原结合分子B、D和A与在CHOk1huCD28的细胞表面上表达的CD28的结合。所有分子，包括阴性对照(DP47 IgG1 Fc PGLALA)，在0.01-500nM的浓度范围内以5倍稀释孵育。之后，洗去过量和未结合的分子,并用Fcγ片段特异性山羊抗人IgG R-藻红蛋白AffiniPure F(ab')2二抗检测结合的分子。通过流式细胞术测量中位荧光强度(MFI)，并以剂量依赖性方式指示测试分子的亲和力。所有值都被描述为技术重复的平均值+/-SEM。
图7A和图7B示出在KPL4肿瘤靶细胞存在(图7A)或不存在(图7B)的情况下曲妥珠单抗CLC-CD28(分子D)和帕妥珠单抗CLC-CD28(分子A和B)的交叉变体之间的比较。包括DP47 IgG1 Fc PGLALA作为非结合对照。报告子细胞和靶细胞以5:1的E:T比例铺板。加入浓度为10nM的抗CD3后，将分子以0.002nM至10nM的浓度孵育，稀释因子为4。孵育6小时后，加入底物缓冲液并测量发光。所有值都被描述为技术重复的平均值+/-SEM。
图8A是显示Her2-CD28双特异性抗原结合分子2C4/CD28(分子F)和4D5/CD28(分子G)以及浓度为500ng/mL的CD28抗体对HER2 TDB诱导的用高Her2表达细胞系KPL4培养的人CD4+T细胞的活化的作用的图。通过CD69和CD25的双重表达测量T细胞活化。图8B是显示Her2-CD28双特异性抗原结合分子2C4/CD28和4D5/CD28以及浓度为500ng/mL的CD28抗体对HER2 TDB诱导的用高Her2表达细胞系KPL4培养的人CD8+T细胞的活化的作用的图。通过CD69和CD25的双重表达测量T细胞活化。
图8C是显示Her2-CD28双特异性抗原结合分子2C4/CD28和4D5/CD28以及CD28抗体对HER2 TDB介导的KPL-4肿瘤细胞的靶细胞杀伤作用的图。
图9A至9G示出Her2-CD28双特异性抗原结合分子2C4/CD28和4D5/CD28以及CD28抗体对HER2 TDB诱导的细胞因子释放的作用，如在处理后24小时从T细胞活化分析中收获的上清液样品中测量的。显示了可溶性细胞因子GM-CSF(图9A)、IFN-γ(图9B)、IL-10(图9C)、IL-6(图9D)、TNF-α(图9E)、IL-2(图9F)和IL-1b(图9G)的量。
图10A至10D示出与Her2-CD28双特异性抗原结合分子2C4/CD28和4D5/CD28以及CD28抗体的共刺激对在用HER2-TDB处理后长达15天的各个时间点的免疫细胞数量的影响。总免疫细胞计数显示在图10A中，而图10B示出CD4+细胞计数。图10C示出CD8+细胞计数，NK细胞计数显示在图10D中。
具体实施方式
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数，反之亦然。
如本文所用，术语“抗原结合分子”在其最广义上是指特异性结合抗原决定簇的分子。抗原结合分子的示例是抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段和支架抗原结合蛋白。
如本文所用，术语“与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域”或“能够与肿瘤相关抗原特异性结合的部分”是指与肿瘤相关抗原Her2特异性结合的多肽分子。在一个方面，抗原结合结构域能够通过Her2激活信号传导。在特定方面，抗原结合结构域能够将其所连接的实体(例如CD28抗体)导向表达Her2的细胞，例如导向特定类型的肿瘤细胞。能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包括如本文进一步定义的抗体及其片段。另外，能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域包括如本文进一步定义的支架抗原结合蛋白，例如基于设计的重复序列蛋白或设计的重复序列结构域的结合结构域(参见例如WO2002/020565)。
关于抗原结合分子，即抗体或其片段，术语“抗原结合结构域”是指分子的一部分，其包含与抗原的一部分或全部特异性结合并且与之互补的区域。可通过例如一种或多种抗体可变结构域(也称为抗体可变区)来提供能够特异性抗原结合的抗原结合结构域。特别地，能够特异性抗原结合的抗原结合结构域包括抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。在另一个方面，“能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域”也可以是Fab片段或crossFab片段。如本文所用，关于抗原结合结构域等的术语“第一”、“第二”或“第三”在每种类型的部分多于一种时用于方便区分。除非明确说明，否则这些术语的使用并非旨在赋予部分的特定次序或取向。
本文的术语“抗体”以最广义使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，以及抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变异抗体(例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少量存在)之外，包含该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。
如本文所用，术语“单特异性”抗体表示具有一个或多个结合位点的抗体，每个结合位点与相同抗原的相同表位结合。术语“双特异性”意指抗原结合分子能够特异性结合至至少两种独特的抗原决定簇。通常，双特异性抗原结合分子包含两个抗原结合位点，这两个抗原结合位点中的每个抗原结合位点对不同的抗原决定簇具有特异性。然而，双特异性抗原结合分子还可以包含与其他抗原决定簇结合的额外抗原结合位点。在某些方面，双特异性抗原结合分子能够同时结合两种抗原决定簇，特别是在两种不同细胞或同一细胞上表达的两种抗原决定簇。因此，根据本发明的术语“双特异性”也可以包括三特异性分子，例如包含CD28抗体和针对两种不同靶细胞抗原的两个抗原结合结构域的双特异性分子。
本申请中所用的术语“价态”表示在对一种独特抗原决定簇具有特异性的抗原结合分子中存在特定数量的对一种独特抗原决定簇具有特异性的结合位点。因此，术语“二价”、“四价”和“六价”分别表示在抗原结合分子中存在对特定抗原决定簇具有特异性的两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。在本发明的特定方面，根据本发明的双特异性抗原结合分子对特定抗原决定簇可以是单价的，意味着它们对该抗原决定簇仅具有一个结合位点，或者对特定抗原决定簇可以是二价或四价的，意味着它们对该抗原决定簇分别具有两个结合位点或四个结合位点。
术语“全长抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用，是指具有与天然抗体结构基本上相似的结构的抗体。“天然抗体”或“野生型”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG类抗体是约150000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由通过二硫键键合的两条轻链和两条重链构成。从N末端到C末端，每条重链具有可变区(VH)(也称为可变重链结构域或重链可变结构域)，接着是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)(也称为重链恒定区)。类似地，从N末端到C末端，每条轻链具有可变区(VL)(也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域)，接着是轻链恒定结构域(CL)(也称为轻链恒定区)。抗体的重链可以分配为五种类型中的一种，该五种类型被称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，它们中的一些可以进一步分为亚型，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以归属于两种类型中的一种，该两种类型称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。
“抗体片段”是指完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的示例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双体抗体、三体抗体、四体抗体、crossFa片段；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；以及单结构域抗体。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Plückthun，载于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag,New York，第269至第315页(1994)；还可参见WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。关于对包含补救受体结合表位残基并具有增加的体内半衰期的Fab片段和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利5,869,046。双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，该双体抗体可以是二价的或双特异性的，参见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)；以及Hollinger等人，Proc Natl Acad Sci USA 90,6444-6448(1993)。在Hudson等人，Nat Med9,129-134(2003)中也描述了三体抗体和四体抗体。单结构域抗体为包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施例中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.，Waltham，MA；参见例如美国专利6,248,516B1)。抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)生产，如本文该。
木瓜蛋白酶消化完整抗体产生两个称为“Fab”片段的相同的抗原结合片段，每个“Fab”片段含有重链可变结构域和轻链可变结构域以及轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。因此，如本文所用，术语“Fab片段”或“Fab分子”是指这样的抗体片段，其包含含有可变轻链(VL)结构域和轻链的恒定结构域(CL)的轻链片段，以及可变重链(VH)结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于Fab’片段在重链CH1结构域的羧基末端添加了一些残基，这些残基包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是Fab’片段，其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离巯基。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，其具有两个抗原结合位点(两个Fab片段)和Fc区的一部分。“常规Fab片段”由VL-CL轻链和VH-CH1重链构成。
术语“crossFab片段”或“xFab片段”或“交叉Fab片段”是指这样的Fab片段，其中重链和轻链的可变区或恒定区进行了交换。交叉Fab分子的两种不同链组成是可能的，并且包含在本发明的双特异性抗体中：在一个方面，Fab重链和轻链的可变区进行了交换，即交叉Fab分子包含由轻链可变(VL)结构域和重链恒定结构域(CH1)构成的肽链，以及由重链可变结构域(VH)和轻链恒定结构域(CL)构成的肽链。该交换型Fab分子也称为交叉Fab(VLVH)。在另一方面，当Fab重链和轻链的恒定区进行了交换时，交叉Fab分子包含由重链可变结构域(VH)和轻链恒定结构域(CL)构成的肽链，以及由轻链可变结构域(VL)和重链恒定结构域(CH1)构成的肽链。该交换型Fab分子也称为交叉Fab(CLCH1)。
“单链Fab片段”或“scFab”是由抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定结构域1(CH1)、抗体轻链可变结构域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成的多肽，其中该抗体结构域和该接头在N末端至C末端方向上具有以下顺序中的一种：a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CH1，或d)VL-CH1-接头-VH-CL；并且其中该接头是至少30个氨基酸，优选是32个至50个氨基酸的多肽。该单链Fab片段经由CL结构域与CH1结构域之间的天然二硫键而稳定化。此外，这些单链Fab分子可以通过经由***半胱氨酸残基(例如根据Kabat编号的可变重链中的44位和可变轻链中的100位)生成链间二硫键，而进一步稳定化。
“交换型单链Fab片段”或“x-scFab”是由抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定结构域1(CH1)、抗体轻链可变结构域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成的多肽，其中该抗体结构域和该接头在N末端至C末端方向上具有以下顺序中的一种：a)VH-CL-接头-VL-CH1和b)VL-CH1-接头-VH-CL；其中VH和VL一起形成与抗原特异性结合的抗原结合位点，并且其中该接头是至少30个氨基酸的多肽。此外，这些x-scFab分子可以通过经由***半胱氨酸残基(例如根据Kabat编号的可变重链中的44位和可变轻链中的100位)生成链间二硫键，而进一步稳定化。
“单链可变片段(scFv)”是抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的融合蛋白，通过10至约25个氨基酸的短接头肽连接。接头通常富含甘氨酸以获得柔性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以获得溶解度，并且可以将VH的N末端与VL的C末端连接，或反之亦然。尽管去除了恒定区并引入了接头，但该蛋白保留了原始抗体的特异性。scFv抗体例如描述于Houston,J.S.,Methods in Enzymol.203(1991)46-96)中。另外，抗体片段包含单链多肽，该单链多肽的特征在于具有VH结构域，即能够与VL结构域一起装配到功能性抗原结合位点；或具有VL结构域的特征，即能够与VH结构域一起装配到功能性抗原结合位点，从而提供全长抗体的抗原结合特性。
“支架抗原结合蛋白”是本领域已知的，例如纤连蛋白和设计的锚蛋白重复序列蛋白(DARPin)已被用作抗原结合结构域的替代支架，参见例如Gebauer和Skerra，Engineeredprotein scaffolds as next-generation antibody therapeutics.Curr Opin ChemBiol 13:245-255(2009)和Stumpp等人，Darpins:A new generation of proteintherapeutics.Drug Discovery Today 13:695-701(2008)。在本发明的一个方面，支架抗原结合蛋白选自由以下项组成的组：CTLA-4(Evibody)、脂质运载蛋白(Anticalin)、蛋白A衍生的分子(诸如蛋白A的Z结构域(亲和体))、A结构域(Avimer/巨型抗体)、血清转铁蛋白(反式体)；设计的锚蛋白重复序列蛋白(DARPin)、抗体轻链或重链的可变结构域(单结构域抗体，sdAb)、抗体重链的可变结构域(纳米抗体，aVH)、VNAR片段、纤连蛋白(AdNectin)、C型凝集素结构域(四连接素)；新抗原受体β-内酰胺酶的可变结构域(VNAR片段)、人γ-晶体蛋白或泛素蛋白(Affilin分子)；人蛋白酶抑制剂的kunitz型结构域、微型体(诸如来自knottin家族的蛋白质)、肽适体和纤连蛋白(adnectin)。CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4)是主要在CD4+T细胞上表达的CD28家族受体。其细胞外结构域具有可变结构域样Ig折叠。对应于抗体CDR的环可以用异源序列取代，以赋予不同的结合性质。经工程化改造以具有不同结合特异性的CTLA-4分子也称为Evibody(例如US7166697B1)。Evibody与抗体(例如结构域抗体)的分离的可变区大小大致相同。关于进一步的细节，参见Journal ofImmunological Methods 248(1-2),31-45(2001)。脂质运载蛋白是细胞外蛋白质家族，可转运小的疏水性分子，如类固醇、胆素、类视黄醇和脂质。它们具有刚性β-片层二级结构，在锥形结构的开口端处具有许多环，可以工程化改造成与不同的靶抗原结合。Anticalin的大小介于160-180个氨基酸之间，并且来源于脂质运载蛋白。关于进一步的细节，参见BiochimBiophys Acta 1482:337-350(2000)、US7250297B1和US20070224633。亲和体是来源于金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A的支架，其可以被工程化改造以结合抗原。该结构域由约58个氨基酸的三螺旋束组成。已经通过表面残基的随机化形成了文库。关于进一步细节，参见Protein Eng.Des.Sel.2004,17,455-462和EP 1641818A1。Avimer是来源于A结构域支架家族的多结构域蛋白质。约35个氨基酸的天然结构域采用确定的二硫键键合结构。多样性是通过重组A结构域家族表现出的自然变异而形成的。关于进一步的细节，参见Nature Biotechnology 23(12),1556-1561(2005)和Expert Opinion onInvestigational Drugs 16(6),909-917(2007年6月)。转铁蛋白是单体血清转运糖蛋白。可以通过在允许的表面环中***肽序列来工程化改造转铁蛋白，以结合不同的靶抗原。工程化改造的转铁蛋白支架的示例包括反式体。关于进一步的细节，参见J.Biol.Chem 274,24066-24073(1999)。设计的锚蛋白重复序列蛋白(DARPin)来源于锚蛋白，锚蛋白是介导整合膜蛋白附着于细胞骨架的蛋白家族。单个锚蛋白重复序列是由两个α-螺旋和一个β-转角组成的33残基基序。它们可通过随机化每个重复序列中的第一α-螺旋和β-转角中的残基，而工程化改造成结合不同的靶抗原。它们的结合界面可以通过增加模块的数量来增加(亲和力成熟方法)。关于进一步的细节，参见J.Mol.Biol.332,489-503(2003)、PNAS 100(4),1700-1705(2003)和J.Mol.Biol.369,1015-1028(2007)以及US20040132028A1。单结构域抗体是由单一单体可变抗体结构域组成的抗体片段。第一单结构域来源于骆驼科动物的抗体重链的可变结构域(纳米抗体或VHH片段)。此外，术语单结构域抗体包含自体人重链可变结构域(aVH)或来源于鲨鱼的VNAR片段。纤连蛋白可以经工程化改造以结合抗原的支架。Adnectin由III型人纤连蛋白(FN3)的15个重复单元的第10结构域的天然氨基酸序列的主链组成。β-夹层的一个端部处的三个环可以经工程化改造，以使Adnectin能够特异性识别目标治疗靶标。关于进一步细节，参见Protein Eng.Des.Sel.18,435-444(2005)、US20080139791、WO2005056764和US6818418B1。肽适体是组合的识别分子，该组合的识别分子由恒定的支架蛋白，通常是硫氧还蛋白(TrxA)组成，该恒定的支架蛋白含有在活性位点处***的受约束的可变肽环。关于进一步细节，参见Expert Opin.Biol.Ther.5,783-797(2005)。微型体来源于含有3-4个半胱氨酸桥、长度为25-50个氨基酸的天然存在的微蛋白，该微蛋白的示例包括KalataBI和芋螺毒素以及knottin。微蛋白具有环，其可以经工程化改造为包括多达25个氨基酸而不影响微蛋白的整体折叠。关于工程化改造的knottin结构域的进一步细节，参见WO2008098796。
作为参考分子的“结合相同表位的抗原结合分子”是指这样的抗原结合分子，在竞争测定中该抗原结合分子使参考分子与其抗原的结合被阻断50％或更多，并且相反地，在竞争测定中参考分子使抗原结合分子与其抗原的结合被阻断50％或更多。
术语“抗原结合结构域”是指抗原结合分子的一部分，其包含与抗原的一部分或全部特异性结合并互补的区域。在抗原较大的情况下，抗原结合分子可以仅与抗原的特定部分结合，该部分称为表位。抗原结合结构域可以由例如一个或多个可变结构域(也称为可变区)提供。优选地，抗原结合结构域包含抗体轻链可变结构域(VL)和抗体重链可变结构域(VH)。
如本文所用，术语“抗原决定簇”与“抗原”和“表位”同义，并且是指多肽大分子上的位点(例如一段连续的氨基酸或由非连续氨基酸的不同区域组成的构象构型)，抗原结合部分与该位点结合，从而形成抗原结合部分-抗原复合物。有用的抗原决定簇可以在例如肿瘤细胞的表面上、病毒感染细胞的表面上、其他患病细胞的表面上、免疫细胞的表面上、血清中的游离物和/或细胞外基质(ECM)中找到。除非另有说明，否则本文中用作抗原的蛋白质可以是来自任何脊椎动物来源的任何天然形式的蛋白质，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在一个特定实施例中，抗原是人蛋白质。当提及本文中的特定蛋白质时，该术语涵盖“全长”、未加工的蛋白质，以及由细胞内加工而产生的任何形式的蛋白质。该术语还涵盖天然存在的蛋白质变体，例如剪接变体或等位基因变体。
术语“能够特异性结合到Her2”是指能够以足够的亲和力结合到Her2的抗原结合分子，使得该抗原结合分子可用作靶向Her2的诊断和/或治疗剂。抗原结合分子包括但不限于抗体、Fab分子、交换型Fab分子、单链Fab分子、Fv分子、scFv分子、单域抗体以及VH和支架抗原结合蛋白。在一个方面，如例如通过表面等离子体共振(SPR)测量的，抗Her2抗原结合分子与不相关的、非Her2蛋白的结合程度小于抗原结合分子与Her2的结合的约10％。具体地，能够特异性结合到Her2的抗原结合分子具有以下解离常数(Kd)：≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在某些方面，抗Her2抗原结合分子结合到来自不同物种的Her2。具体地，抗Her2抗原结合分子结合到人和食蟹猴Her2。
术语“表位”表示抗原结合的蛋白质或非蛋白质抗原上的位点。表位可以由连续的氨基酸段形成(线性表位)，或者包含非连续的氨基酸(构象表位)，例如由于抗原折叠，即通过蛋白质抗原的三级折叠而在空间上接近。在蛋白质抗原暴露于变性剂后，线性表位通常仍被抗体结合，而构象表位通常在用变性剂处理后被破坏。表位包含独特的立体构象中的至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或8-10个氨基酸。
“表位4D5”或“4D5表位”或“4D5”是HER2的胞外域中的与抗体4D5(ATCC CRL10463)和曲妥珠单抗结合的区域。该表位靠近HER2的跨膜结构域，并且在HER2的结构域IV内。为了筛选与4D5表位结合的抗体，需要进行常规的交叉阻断测定诸如Antibodies,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow and David Lane(1988)该。可替代地，可以进行表位作图(mapping)以评估抗体是否结合到HER2的4D5表位(诸如，人HER2(SEQ ID NO:54)的约残基550至约残基610(包括端值)的区域中的任何一个或多个残基)。
“表位2C4”或“2C4表位”是HER2的胞外域中的与抗体2C4结合的区域。为了筛选与2C4表位结合的抗体，可以进行常规的交叉阻断测定诸如Antibodies,A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow and David Lane(1988)中描述的。可替代地，可以进行表位作图以评估抗体是否结合到HER2的2C4表位。表位2C4包含来自HER2的胞外域中的结构域II的残基。2C4抗体和帕妥珠单抗在结构域I、II和III的连接处结合到HER2的胞外域(Franklin等人，Cancer Cell 5:317-328(2004))。
“特异性结合”是指结合对于抗原具有选择性，并且可以与不需要的或非特异性的相互作用区分开。抗原结合分子与特定抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术(例如表面等离子体共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等人，Glyco J 17,323-329(2000))以及传统的结合测定(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))来测量。在一个实施例中，例如如通过SPR所测得的，抗原结合分子与不相关蛋白的结合程度小于该抗原结合分子与抗原的结合程度的约10％。在某些实施例中，与抗原结合的分子的解离常数(Kd)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。
“亲和力”或“结合亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映了结合对的成员(例如抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)表示，解离常数(Kd)是解离速率常数与缔合速率常数(分别为koff和kon)的比率。因此，等效亲和力可以包括不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同即可。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文该的那些方法。测量亲和力的特定方法是表面等离子体共振(SPR)。
如本文所用的“肿瘤相关抗原”或TAA是指存在于靶细胞表面上的抗原决定簇，该靶细胞为例如肿瘤中的细胞(诸如癌细胞或肿瘤基质的细胞)。在某些方面，靶细胞抗原为肿瘤细胞表面的抗原。在一个特定方面，TAA是Her2。
术语“Her2”，也称为“ErbB2”、“ErbB2受体”或“c-Erb-B2”，是指由细胞中HER2前体蛋白的加工产生的任何天然、成熟的HER2。除非另外指明，否则术语包括来自任何脊椎动物来源的HER2，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(诸如，人和食蟹猴)和啮齿动物(诸如，小鼠和大鼠)。该术语还包括HER2的天然存在变体，例如，剪接变体或等位基因变体。示例性人HER2蛋白的氨基酸序列示出于SEQ ID NO:103中。
除非另外指明，否则术语“CD28”(分化簇28，Tp44)是指来自任何脊椎动物来源的任何CD28蛋白，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。CD28在T细胞上表达并提供T细胞活化和存活所需的共刺激信号。除了T细胞受体(TCR)之外，通过CD28刺激T细胞可以为各种白介素的产生提供有效的信号。CD28为CD80(B7.1)和CD86(B7.2)蛋白质的受体，并且是唯一在初始T细胞上组成型表达的B7受体。人CD28的氨基酸序列示出于UniProt(www.uniprot.org)登录号P10747(SEQ ID NO:1)中。
“激动性抗体”是指包含针对给定受体的激动功能的抗体。通常，当激动剂配体(因子)与受体结合时，受体蛋白的三级结构发生变化，受体被激活(当受体为膜蛋白时，通常转导细胞生长信号等)。如果受体是二聚体形成类型，激动性抗体可以在适当的距离和角度使受体二聚化，因此与配体的作用类似。合适的抗受体抗体可以模拟配体进行的受体二聚化，因此可以成为激动性抗体。
“CD28激动性抗原结合分子”或“CD28常规激动性抗原结合分子”是模仿CD28天然配体(CD80或CD86)在存在T细胞受体信号时增强T细胞活化的作用的抗原结合分子(“信号2”)。T细胞需要两个信号才能完全激活。在生理条件下，“信号1”由T细胞受体(TCR)分子与抗原呈递细胞(APC)上的肽/主要组织相容性复合物(MHC)复合物的相互作用产生，“信号2”由共刺激受体，例如CD28提供。CD28激动性抗原结合分子能够共刺激T细胞(信号2)。它还能够与对TCR复合物具有特异性的分子联合诱导T细胞增殖和细胞因子分泌，但是CD28激动性抗原结合分子在没有额外刺激TCR的情况下不能完全激活T细胞。然而，存在CD28特异性抗原结合分子的亚类，即所谓的CD28超激动性抗原结合分子。“CD28超激动性抗原结合分子”是CD28抗原结合分子，它能够在不额外刺激TCR的情况下完全激活T细胞。CD28超激动性抗原结合分子能够诱导T细胞增殖和细胞因子分泌，而无需预先激活T细胞(信号1)。
如本文所用，“T细胞抗原”是指存在于T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞表面上的抗原决定簇。
如本文所用，“T细胞活化性治疗剂”是指能够在受试者中诱导T细胞活化的治疗剂，特别是设计用于在受试者中诱导T细胞活化的治疗剂。T细胞活化性治疗剂的实例包括特异性结合活化性T细胞抗原，诸如CD3和靶细胞抗原诸如CEA或叶酸受体的双特异性抗体。
如本文所用，“活化性T细胞抗原”是指通过T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞表达的抗原决定簇，其在与抗原结合分子相互作用时能够诱导或增强T细胞活化。具体而言，抗原结合分子与活化性T细胞抗原的相互作用可通过触发T细胞受体复合物的信号传导级联来诱导T细胞活化。示例性的活化性T细胞抗原是CD3。
除非另外指明，否则术语“CD3”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然CD3，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语包括“全长”的未加工CD3，以及通过细胞中加工产生的任何形式的CD3。该术语还涵盖CD3的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。在一个实施例中，CD3是人CD3，特别是人CD3的ε亚基(CD3ε)。人CD3ε的氨基酸序列以UniProt(www.uniprot.org)登录号P07766(144版)或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_000724.1示出。还可参见SEQ ID NO:188。食蟹猴[Macaca fascicularis]CD3ε的氨基酸序列示出于UniProt(www.uniprot.org)登录号Q95LI5中。还可参见SEQ ID NO:189。
术语“可变结构域”或“可变区”是指参与抗原结合分子与抗原的结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如，Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指抗原结合可变结构域中在序列上高变并确定抗原结合特异性的各个区域，例如“互补决定区”(“CDR”)。通常，抗原结合结构域包含六个CDR；三个在VH中(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，并且三个在VL中的(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。本文中的示例性CDR包括：
(a)在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处发生的高可变环(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)在氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))处发生的CDR；以及
(c)存在于氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处的抗原接触(MacCallum et al.J.Mol.Biol.262:732-745(1996))。
除非另有说明，否则CDR根据Kabat等人该的方法(同上)确定。本领域的技术人员将理解，CDR名称也可以根据出处同上的Chothia该的方法、出处同上的McCallum该的方法或者任何其他在科学上接受的命名法来确定。Kabat等人还定义了适用于任何抗体的可变区序列的编号***。本领域普通技术人员可以明确地将该“Kabat编号”***分配给任何可变区序列，而不依赖于序列本身之外的任何实验数据。如本文所用，“Kabat编号”是指由Kabat等人，U.S.Dept.of Health and Human Services,"Sequence of Proteins ofImmunological Interest"(1983)该的编号***。除非另有说明，否则提及抗体可变区中特定氨基酸残基位置的编号是根据Kabat编号***。
如本文所用，术语“亲和力成熟的”在抗原结合分子(例如抗体)的上下文中是指源自参考抗原结合分子的抗原结合分子，例如通过突变，结合与参考抗体相同的抗原，优选结合相同的表位；并且具有比参考抗原结合分子更高的对抗原的亲和力。亲和力成熟通常涉及抗原结合分子的一个或多个CDR中的一个或多个氨基酸残基的修饰。通常，亲和力成熟的抗原结合分子结合与初始参考抗原结合分子相同的表位。
“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常在VH(或VL)中以如下序列出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
出于本文目的的“受体人框架”是这样的框架，其包含来源于如下所定义的人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列。“来源于”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含与该人免疫球蛋白框架或人共有框架相同的氨基酸序列，或者其可以包含氨基酸序列变化。在一些实施例中，氨基酸变化的数量为10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少，或2个或更少。在一些实施例中，VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。
术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，在该抗体中重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同的来源或物种。
抗体的“类别”是指抗体的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的若干可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施例中，人源化抗体将基本上包含所有的至少一个，通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的HVR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。“人源化形式”的抗体，例如非人抗体，是指已经经历进行过人源化的抗体。本发明涵盖的“人源化抗体”的其他形式是这些抗体，该抗体相对于原始抗体，恒定区已经经额外的修饰或改变以产生根据本发明该的特性，尤其是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合的特性。
“人”抗体是这样的抗体，其具有的氨基酸序列与由人或人细胞产生的或来源于利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列相对应。人抗体的该定义特别地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
术语“CH1结构域”表示大致从EU 118位延伸至EU 215位(根据Kabat的EU编号***)的抗体重链多肽部分。在一个方面，CH1结构域具有ASTKGPSVFP LAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKV(SEQ ID NO:104)的氨基酸序列。通常，具有EPKSC的氨基酸序列(SEQ ID NO:107)的片段跟随以连接CH1结构域与铰链区。
术语“铰链区”表示抗体重链多肽的在野生型抗体重链中连接CH1结构域和CH2结构域的部分，例如根据Kabat的EU编号***从约216位至约230位，或根据Kabat的EU编号***从约226位至约230位。其他IgG亚类的铰链区可以通过与IgG1亚类序列的铰链区半胱氨酸残基比对来确定。铰链区通常是由两种氨基酸序列相同的多肽组成的二聚体分子。铰链区通常包含多达25个氨基酸残基，并且是柔性的，允许相关联靶结合位点独立移动。铰链区可细分为三个结构域：上铰链区、中铰链区和下铰链区(例如，参见Roux,等人,J.Immunol.161(1998)4083)。
在一个方面，铰链区具有氨基酸序列DKTHTCPXCP(SEQ ID NO:108)，其中X为S或P。在一个方面，铰链区具有氨基酸序列HTCPXCP(SEQ ID NO:109)，其中X为S或P。在一个方面，铰链区具有氨基酸序列CPXCP(SEQ ID NO:110)，其中X为S或P。
本文中的术语“Fc结构域”或“Fc区”用于定义含有恒定区的至少一部分的抗体重链的C末端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。IgG Fc区包含IgG CH2结构域和IgGCH3结构域。
人IgG Fc区的“CH2结构域”通常从约EU 231位的氨基酸残基延伸至约EU 340位的氨基酸残基(根据Kabat的EU编号***)。在一个方面，CH2结构域具有APELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQESTYRW SVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAK(SEQ ID NO:105)的氨基酸序列。CH2结构域的独特之处在于它与另一个结构域的配对不紧密。相反，两个N连接的支链碳水化合物链介于完整天然Fc区的两个CH2结构域之间。据推测，碳水化合物可能为结构域-结构域配对提供替代物，并有助于稳定CH2结构域。Burton,Mol.Immunol.22(1985)161-206。在一个实施例中，碳水化合物链附接至CH2结构域。本文的CH2结构域可以是天然序列CH2结构域或变体CH2结构域。
“CH3结构域”包括Fc区中残基C末端至CH2结构域的延伸部分，表示大致从EU 341位延伸至EU 446位(根据Kabat的EU编号***)的抗体重链多肽部分。在一个方面，CH3结构域具有以下氨基酸序列：GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG(SEQ ID NO:106)。本文的CH3区可以是天然序列CH3结构域或变体CH3结构域(例如在一条链中具有引入的“突起”(“杵”)而在另一条链中具有相应的引入的“空腔”(“臼”)的CH3结构域；参见以引用方式明确并入本文的美国专利号5,821,333)。此类变体CH3结构域可用于促进如本文该的两条不相同的抗体重链的异二聚化。在一个实施例中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文另外规定，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号***，EU编号***也称为EU索引，如在Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中该。
“杵臼结构(knob-into-hole)”技术描述于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng 9,617-621(1996)和Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)中。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入突起(“杵”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“臼”)，使得该突起可以定位在该空腔中，以便促进异二聚体的形成并阻碍同二聚体的形成。突起是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建的。具有与突起相同或相似大小的补偿空腔是通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链而在第二多肽的界面中创建的。突起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸来制备，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成。在具体实施例中，杵修饰包含Fc结构域的两个亚基中的一个中的氨基酸取代T366W，而臼修饰包含Fc结构域的两个亚基中的另一个中的氨基酸取代T366S、L368A和Y407V。在另一个具体实施例中，包含杵修饰的Fc结构域的亚基另外包含氨基酸取代S354C，而包含臼修饰的Fc结构域的亚基另外包含氨基酸取代Y349C。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc区的两个亚基之间形成二硫键，从而进一步稳定化二聚体(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
“与免疫球蛋白的Fc区等同的区域”旨在包括免疫球蛋白的Fc区的天然存在的等位基因变体，以及具有产生取代、添加或缺失但基本上不降低免疫球蛋白介导效应子功能(诸如抗体依赖性细胞毒性)的能力的修改的变体。举例而言，可以使一个或多个氨基酸从免疫球蛋白的Fc区的N末端或C末端缺失，而基本上不丧失生物学功能。可以根据本领域中已知的一般规则来选择此类变体，以便对活性具有最小的影响(参见例如Bowie,J.U.等人，Science 247:1306-10(1990))。
术语“野生型Fc结构域”表示与自然界中发现的Fc结构域的氨基酸序列相同的氨基酸序列。野生型人Fc结构域包括天然人IgG1 Fc区(非A和A同种异型)、天然人IgG2 Fc区、天然人IgG3 Fc区和天然人IgG4 Fc区以及其天然存在的变体。野生型Fc区表示在SEQ IDNO:111(IgG1，白种人同种异型)、SEQ ID NO:112(IgG1，非裔美国人同种异型)、SEQ ID NO:113(IgG2)、SEQ ID NO:114(IgG3)和SEQ ID NO:115(IgG4)中。
术语“变体(人)Fc结构域”表示与“野生型”(人)Fc结构域氨基酸序列的氨基酸序列区别在于至少一个“氨基酸突变”的氨基酸序列。在一个方面，与天然Fc区相比，变体Fc区具有至少一个氨基酸突变，诸如在天然Fc区中从约1个至约10个氨基酸突变，并且在一个方面，从约1个至约5个氨基酸突变。在一个方面，(变体)Fc区与野生型Fc区具有至少约95％的同源性。
术语“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区、随着抗体同种型的变化而变化的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)，以及B细胞活化。
Fc受体结合依赖性效应子功能可通过抗体的Fc区与Fc受体(FcR)的相互作用来介导，Fc受体是造血细胞上的特异性细胞表面受体。Fc受体属于免疫球蛋白超家族，并且已被证明可通过吞噬免疫复合物来介导去除抗体包被的病原体，并且通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)来裂解涂有相应抗体的红细胞以及其他各种细胞靶点(例如，肿瘤细胞)(参见例如Van de Winkel,J.G.和Anderson,C.L.，J.Leukoc.Biol.49(1991)511-524)。FcR由其对免疫球蛋白同种型的特异性来定义：IgG抗体的Fc受体称为FcγR。Fc受体结合描述于例如：Ravetch,J.V.和Kinet,J.P.，Annu.修订版，Immunol.9(1991)457-492；Capel,P.J.等人，Immunomethods 4(1994)25-34；de Haas,M.等人，J.Lab.Clin.Med.126(1995)330-341；以及Gessner,J.E.等人，Ann.Hematol.76(1998)231-248。
IgG抗体(FcγR)Fc区受体的交联触发多种效应子功能，包括吞噬作用、抗体依赖性细胞细胞毒性、炎症介质的释放以及免疫复合物清除和抗体产生的调节。已在人体中鉴定出三类FcγR，其中包括：
-FcγRI(CD64)以高亲和力结合单体IgG，并且在巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞上表达。Fc区IgG中在至少一个氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327和P329(根据Kabat的EU索引编号)的修饰，降低与FcγRI的结合。在233-236位的IgG2残基被IgG1和IgG4取代，使得与FcγRI的结合力降低103倍，并且消除了人单核细胞对抗体敏化红细胞的应答(Armour,K.L.等人，Eur.J.Immunol.29(1999)2613–2624)。
-FcγRII(CD32)以中等至低亲和力结合复合IgG，并得到广泛表达。该受体可分为两种亚型，即FcγRIIA和FcγRIIB。FcγRIIA存在于许多参与杀伤的细胞(例如巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞)中，并且似乎能够活化杀伤过程。FcγRIIB似乎在抑制过程中起作用，并且存在于B细胞、巨噬细胞以及肥大细胞和嗜酸性粒细胞中。在B细胞上，它似乎起到抑制免疫球蛋白进一步产生以及同种型转换为例如IgE类的作用。在巨噬细胞上，FcγRIIB用于抑制由FcγRIIA介导的吞噬作用。在嗜酸性粒细胞和肥大细胞上，B型可能通过IgE与其单独受体的结合而有助于抑制这些细胞的活化。发现例如抗体(包含在至少一个氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、R292和K414(根据Kabat的EU索引编号)的突变的IgG Fc区)对FcγRIIA的结合力降低。
-FcγRIII(CD16)以中等至低亲和力结合IgG，并且包括两种类型。FcγRIIIA存在于NK细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞以及一些单核细胞和T细胞上，并且介导ADCC。FcγRIIIB在中性粒细胞上的表达水平高。发现例如抗体(包含在至少一个氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、S239、E269、E293、Y296、V303、A327、K338和D376(根据Kabat的EU索引编号)的突变的IgG Fc区)对FcγRIIIA的结合力降低。
Shields,R.L.等人(J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)描述了人IgG1上与Fc受体的结合位点的定位、上述突变位点以及测量与FcγRI和FcγRIIA结合的方法。
术语“ADCC”或“抗体依赖性细胞细胞毒性”是导致免疫效应细胞裂解抗体包被的靶细胞的免疫机制。靶细胞是与包含Fc区的抗体或其衍生物特异性结合的细胞，该特异性结合通常是通过Fc区的N末端的蛋白质部分。如本文所用，术语“降低的ADCC”被定义为在靶细胞周围的培养基中给定抗体浓度下在给定时间内通过上面定义的ADCC机制裂解的靶细胞数量减少，和/或在靶细胞周围的培养基中通过ADCC机制在给定时间内实现对给定数量的靶细胞的裂解所必需的抗体浓度增加。ADCC降低是相对于使用相同的标准生产、纯化、配制和储存方法(该等方法为本领域技术人员已知的)，由相同类型的宿主细胞产生但尚未被工程化的相同抗体介导的ADCC。例如，由在Fc结构域中包含降低ADCC的氨基酸取代的抗体介导的ADCC的降低是相对于由在Fc结构域中没有该氨基酸取代的相同抗体介导的ADCC。用于测量ADCC的合适测定法是本领域中熟知的(参见例如PCT公开号WO 2006/082515或PCT公开号WO 2012/130831)。例如，通过测量抗体与表达Fcγ受体的细胞(例如重组表达FcγRI和/或FcγRIIA的细胞或NK细胞(在本质上表达FcγRIIIA))的结合，来研究抗体诱导介导ADCC的初始步骤的能力。特别地，测量与NK细胞上与FcγR的结合。
“活化性Fc受体”是这样的Fc受体，其在抗体的Fc区接合后，引起刺激携带受体的细胞执行效应子功能的信号传导事件。活化性Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。特定的活化性Fc受体是人FcγRIIIa(参见UniProt登录号P08637，版本141)。
“胞外域”是延伸到细胞外空间(即靶细胞外的空间)的膜蛋白的结构域。胞外域通常是蛋白质的启动与表面接触从而导致信号转导的部分。
术语“肽接头”是指包含一个或多个氨基酸，通常约2至20个氨基酸的肽。肽接头是本领域中已知的或在本文中描述的。合适的非免疫原性连接肽是例如(G4S)n、(SG4)n或G4(SG4)n肽接头，其中“n”通常为介于1与5之间、通常介于2与4之间的数字，特别地是2，即选自由以下项组成的组的肽：GGGGS(SEQ ID NO:117)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:118)、SGGGGSGGGG(SEQ ID NO:119)和GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:120)，但也包括以下序列：GSPGSSSSGS(SEQ ID NO:121)、(G4S)3(SEQ ID NO:122)、(G4S)4(SEQ ID NO:123)、GSGSGSGS(SEQ ID NO:124)、GSGSGNGS(SEQ ID NO:125)、GGSGSGSG(SEQ ID NO:126)、GGSGSG(SEQ IDNO:127)、GGSG(SEQ ID NO:128)、GGSGNGSG(SEQ ID NO:129)、GGNGSGSG(SEQ ID NO:130)和GGNGSG(SEQ ID NO:131)。特定目标肽接头为(G4S)(SEQ ID NO:117)、(G4S)2或GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:118)、(G4S)3(SEQ ID NO:122)和(G4S)4(SEQ ID NO:123)。
如本申请中所用的术语“氨基酸”表示包括以下项的天然存在的羧基α-氨基酸的组：丙氨酸(三字母代码：ala，单字母代码：A)、精氨酸(arg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、赖氨酸(lys，K)、蛋氨酸(met，M)、苯丙氨酸(phe，F)、脯氨酸(pro，P)、丝氨酸(ser，S)、苏氨酸(thr，T)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸(tyr，Y)，以及缬氨酸(val，V)。
“融合”或“连接”意指组分(例如多肽和该TNF配体家族成员的胞外域)通过肽键、直接或经由一个或多个肽连接基连接。
相对于参考多肽(蛋白质)序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基并引入缺口(如果需要的话)以实现最大的序列同一性百分比后，并且在不将任何保守取代考虑为该序列同一性的一部分的情况下，与该参考多肽序列中的氨基酸残基相同的该候选序列中的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用公众可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN.SAWI或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，为了本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2来生成氨基酸序列同一性％的值。ALIGN-2序列比较计算机程序由基因泰克公司(Genentech,Inc.)编写，并且源代码已经与用户文档一起提交到U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559，在那里以美国版权登记号TXU510087注册。ALIGN-2程序可从基因泰克公司(Genentech,Inc.,South San Francisco,California)公开获得，或者可以从该源代码编译。ALIGN-2程序应经编译以在UNIX操作***上使用，该UNIX操作***包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设置并且不变。在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(其可以另选地表达为给定氨基酸序列A具有或包含与给定氨基酸序列B的某一氨基酸序列同一性％)计算如下：100乘以分数X/Y，其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序对A和B的比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，而其中Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A与B的氨基酸序列一致性％将不等于B与A的氨基酸序列一致性％。除非另外特别指明，否则本文所使用的所有氨基酸序列一致性％的值是如前一段中所述使用ALIGN-2计算机程序获得的。
在某些实施例中，考虑了本文提供的CD28抗原结合分子的氨基酸序列变体。例如，可能期望改善CD28抗原结合分子的结合亲和力和/或其它生物学特性。CD28抗原结合分子的氨基酸序列变体可以通过对编码分子的核苷酸序列引入适当的修饰或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内残基的缺失、和/或***和/或取代。可以进行缺失、***和取代的任何组合以实现最终构建体，前提条件是最终构建体具有所需特征，例如抗原结合。用于取代诱变的感兴趣的位点包括HVR和框架(FR)。保守性取代在表B中表头“优选的取代”下提供，并在下文中参考氨基酸侧链类别(1)至(6)进一步描述。可以将氨基酸取代引入感兴趣的分子中，并对产物进行所需活性(例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC)筛选。
表A
Figure BDA0004009238190000421
Figure BDA0004009238190000431
可根据共同的侧链特性将氨基酸分组：
(1)疏水性；正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代将需要用这些类别中的一个的成员交换另一类别。
术语“氨基酸序列变体”包括实质性变体，其中在亲本抗原结合分子(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基中存在氨基酸取代。通常，相对于亲本抗原结合分子，选为用于进一步研究的一个或多个所得变体将在某些生物学特性方面(例如，亲和力增加、免疫原性降低)有改变(例如，改善)和/或将基本上保留亲本抗原结合分子的某些生物学特性。示例性取代变体是亲和力成熟抗体，其可例如使用诸如本文该的那些基于噬菌体展示的亲和力成熟技术方便地生成。简言之，将一个或多个HVR残基突变并且将变体抗原结合分子展示在噬菌体上并针对特定生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。在某些实施例中，取代、***或缺失可发生在一个或多个HVR内，只要此类改变基本上不降低抗原结合分子的抗原结合能力即可。举例而言，可在HVR中进行基本上不降低结合亲和力的保守性改变(举例而言，如本文提供的保守性取代)。可用于鉴别可被靶向诱变的抗体残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085该。在此方法中，鉴定残基或一组靶残基(例如，带电残基，诸如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并用中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)替代以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可在对初始取代展示功能敏感性的氨基酸位置引入其他取代。另选地或另外地，利用抗原-抗原结合分子复合物的晶体结构鉴别抗体与抗原之间的接触点。可靶向或消除作为取代的候选的此类接触残基和相邻残基。可筛选变体以确定它们是否具备期望的特性。
氨基酸序列***包括长度范围为一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及一个或多个氨基酸残基的序列内***。***的实例包括CD28抗原结合分子，其N末端或C末端与多肽融合，这增加了CD28抗原结合分子的血清半衰期。
在某些实施例中，本文提供的CD28抗原结合分子被改变以增加或降低抗体糖基化的程度。可通过改变氨基酸序列，使得产生或去除一个或多个糖基化位点，从而便利地获得分子的糖基化变体。当激动性CD28抗原结合分子包含Fc结构域时，与其连接的碳水化合物可以被改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含具有支链的双触角寡糖，该双触角寡糖通常通过N-键连接至Fc区的CH2结构域的Asn297。参见，例如，Wright等人TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及附接于双触角寡糖结构的“茎”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施例中，可以对激动性ICOS结合分子中的寡糖进行修饰，以便产生具有某些改善的特性的变体。在一个方面，提供了激动性CD28结合分子的变体，其具有缺乏连接(直接或间接)至Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。此类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能，参见例如美国专利公开号US 2003/0157108(Presta,L.)或US 2004/0093621(协和发酵工业株式会社(KyowaHakko Kogyo Co.,Ltd))。本发明的CD28抗原结合分子的其他变体包括具有两分型寡糖的变体，例如其中连接至Fc区的双触角寡糖是通过GlcNAc两分的。此类变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能，参见例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利号6,602,684(Umana等人)；以及US 2005/0123546(Umana等人)。还提供了在附接于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的变体。此类抗体变体可具有改善的CDC功能并描述于例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；以及WO 1999/22764(Raju,S.)中。
在某些实施例中，可期望产生本发明的CD28抗原结合分子的半胱氨酸工程化改造的变体，例如“thioMAb”，其中分子的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定实施例中，取代的残基存在于分子的可接近位点。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基由此定位于抗体的可接近位点，并且可用于将抗体与其他部分，诸如药物部分或接头-药物部分缀合，以产生免疫缀合物。在某些实施例中，可用半胱氨酸取代下列残基中的任何一个或多个：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；以及重链Fc区的S400(EU编号)。可如例如美国专利号7,521,541中该形成半胱氨酸工程化改造的抗原结合分子。
在某些方面，本文提供的CD28抗原结合分子可被进一步修饰，以包含本领域已知且容易获得的额外的非蛋白质部分。适合于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性示例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)和葡聚糖或聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇以及它们的混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在制造中可具有优势。聚合物可具有任何分子量，并且可以具有支链或不具有支链。附接于抗体的聚合物的数目可变化，并且如果附接了多于一个聚合物，那么它们可以为相同或不同的分子。通常，可基于以下考虑因素确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体待改善的特定特性或功能、双特异性抗体衍生物是否将用于限定条件下的疗法等。在另一方面，提供可通过暴露于辐射而选择性加热的抗体和非蛋白质性部分的缀合物。在一个实施例中，非蛋白质性部分是碳纳米管(Kam,N.W.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2005)11600-11605)。辐射可具有任何波长，并且包括但不限于对普通细胞没有伤害，但是将非蛋白质性部分加热至抗体-非蛋白质性部分附近的细胞被杀死的温度的波长。在另一方面，可以获得本文提供的CD28抗原结合分子的免疫缀合物。“免疫缀合物”是与一种或多种异源分子，包括但不限于细胞毒性剂缀合的抗体。
术语“多核苷酸”是指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)、病毒来源的RNA或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包含常规磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键，诸如在肽核酸(PNA)中存在的)。术语“核酸分子”是指存在于多核苷酸中的任何一个或多个核酸区段，例如DNA或RNA片段。每个核苷酸由碱基，特别是嘌呤碱基或嘧啶碱基(即胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(即脱氧核糖或核糖)和磷酸基团构成。通常，核酸分子通过碱基序列进行描述，由此该碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基序列通常表示为从5'至3'。在本文中，术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(DNA)(包括例如互补DNA(cDNA)和基因组DNA)、核糖核酸(RNA)(特别是信使RNA(mRNA))、DNA或RNA的合成形式，以及包含这些分子中的两种或更多种的混合聚合物。核酸分子可以是线性的或环状的。此外，术语核酸分子包括有义链和反义链，以及单链和双链形式。此外，本文所描述的核酸分子可含有天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的示例包括具有衍生化的糖或磷酸主链键或经化学修饰的残基的经修饰的核苷酸碱基。核酸分子还涵盖适合作为用于本发明的抗体的体外和/或体内(例如，在宿主或患者体内)直接表达的载体的DNA和RNA分子。此类DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)载体可以是未修饰的或经修饰的。例如，可以对mRNA进行化学修饰以增强RNA载体的稳定性和/或编码分子的表达，使得可以将mRNA注射到受试者体内以产生体内抗体(参见例如Stadler等人，(2017)Nature Medicine 23:815-817，或EP 2 101 823 B1)。
关于“分离的”核酸分子或多核苷酸，是指已经从其天然环境中移除的核酸分子，DNA或RNA。例如，编码包含在载体中的多肽的重组多核苷酸出于本发明的目的被视为分离的。分离的多核苷酸的另外的实施例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或处于溶液中的纯化的(部分地或基本上纯化的)多核苷酸。分离的多核苷酸包括多核苷酸分子，该多核苷酸分子包含在通常包含多核苷酸分子的细胞中，但该多核苷酸分子存在于染色体外或存在于与其天然染色***置不同的染色***置上。分离的RNA分子包括本发明的体内或体外RNA转录物，以及正链和负链形式和双链形式。根据本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括通过合成生产的此类分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可包括调控元件，诸如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
关于与本发明的参考核苷酸序列具有至少例如95％“一致”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸，是指除了多核苷酸序列可包括参考核苷酸序列的每100个核苷酸至多五个点突变之外，多核苷酸的核苷酸序列与参考序列是一致的。换句话讲，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95％一致的核苷酸序列的多核苷酸，参考序列中至多5％的核苷酸可缺失或被另外的核苷酸取代，或参考序列中总核苷酸的至多5％的数量的核苷酸可***到参考序列中。参考序列的这些改变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置或那些末端位置之间的任意位置，或单个地散布在参考序列的残基之中，或以一个或多个连续的组散布在参考序列内。作为一种实际情况，可以使用已知的计算机程序，诸如上文针对多肽所讨论的程序(例如ALIGN-2)，常规确定任何特定多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
术语“表达盒”是指通过重组或合成生成的多核苷酸，其具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列特定核酸元件。重组表达盒可以掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。典型地，表达载体的重组表达盒部分除其他序列之外还包括待转录的核酸序列和启动子。在某些实施例中，本发明的表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
术语“载体”或“表达载体”与“表达构建体”是同义的并且是指用于将特定基因引入与其可操作地关联的靶细胞中并指导该基因的表达的DNA分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及整合入其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体允许大量稳定mRNA的转录。一旦表达载体处于靶细胞内部，即通过细胞转录和/或翻译机制产生由该基因编码的核糖核酸分子或蛋白。在一个实施例中，本发明的表达载体包含表达盒，该表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
术语“宿主细胞”“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指外源核酸已被引入其中的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和来源于该原代转化细胞的子代，不考虑传代次数。子代可能不与亲本细胞的核酸内容物完全相同，而是可能含有突变。本文包括如在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。宿主细胞是可以用于生成本发明的双特异性抗原结合分子的任何类型的细胞***。宿主细胞包括培养的细胞，举几个例子，例如培养的哺乳动物细胞，诸如CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞，以及包括在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中的细胞。
药剂的“有效量”是指在其所施用的细胞或组织中产生生理学变化所需的量。
药剂(例如药物组合物)的“治疗有效量”是指在必需的剂量和时段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。治疗有效量的药剂例如消除、减少、延迟、最小化或预防疾病的不良影响。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。具体地，个体或受试者是人。
术语“药物组合物”是指处于允许包含在其中的活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对于将被施用配制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外组分的制剂。
“药用赋形剂”是指药物组合物中除有效成分之外的成分，其对受试者无毒。药用赋形剂包括但不限于缓冲剂、稳定剂或防腐剂。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包括的说明书，其含有涉及此类治疗产品的使用的有关适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变型，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变所治疗个体的自然进程的临床干预，并且可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施例中，本发明的分子用于延迟疾病的发展或用于减缓疾病的进展。
本文所指出的术语“联合治疗”或“共同施用”涵盖联合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在相同或单独的制剂中)和单独施用，在单独施用的情况下，本文所报告的抗体的施用可以在施用另外的一种或多种治疗剂(优选一种或多种抗体)之前、同时和/或之后进行。
术语“癌症”是指或描述哺乳动物中通常以细胞生长/增殖不受调控为特征的生理状况。因此，本文使用的术语癌症是指增殖性疾病，例如癌、淋巴瘤(例如，霍奇金和非霍奇金淋巴瘤)、母细胞瘤、肉瘤和白血病。特别地，术语癌症包括淋巴细胞性白血病、肺癌、非小细胞肺(NSCL)癌、支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子***、***癌、外阴癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌***癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、***癌、***癌、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆管癌、中枢神经***(CNS)肿瘤、脊椎轴肿瘤、脑干胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、成髓细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤和尤文氏肉瘤，包括以上癌症中的任一种的难治性形式，或一种或多种以上癌症的组合。在一个方面，癌症是实体瘤。在另一个方面，癌症是血液癌症，特别是白血病，最特别是急性淋巴细胞白血病(ALL)或急性髓性白血病(AML)。
“Her2阳性”癌症包含癌细胞的Her2水平高于正常水平。Her2阳性癌症的实例包括Her2阳性乳腺癌和Her2阳性胃癌。任选地，Her2阳性癌症的免疫组织化学(IHC)评分为2+或3+和/或原位杂交(ISH)扩增比率>2.0。
术语“早期乳腺癌(EBC)”或“早期乳腺癌”在本文中用于指尚未扩散到乳腺或腋窝***之外的乳腺癌。这包括原位导管癌和I期、IIA期、IIB期和IIIA期乳腺癌。
将肿瘤或癌症称为“0期”、“I期”、“II期”、“III期”或“IV期”、以及此分类中的各个子阶段，表示使用本领域已知的整体分期(Overall Stage Grouping)或罗马数字分期(Roman Numeral Staging)方法的肿瘤或癌症的分类。尽管癌症的实际阶段取决于癌症的类型，但总的来说，0期癌症是原位病变，I期癌症是小的局部肿瘤，II期和III期癌症是表现出局部***受累的局部晚期肿瘤，以及IV期癌症代表转移性癌症。每种类型的肿瘤的特定阶段是熟练的临床医生已知的。
术语“转移性乳腺癌”是指癌细胞通过血管或***从原始部位传递到身体其他位置的一个或多个部位，从而在除乳腺外的一个或多个器官中形成一个或多个继发性肿瘤的状态。
“晚期”癌症是指由于局部侵袭或转移而扩散到原发部位或器官之外的癌症。因此，术语“晚期”癌症包括局部晚期和转移性疾病。
“复发性”癌症是指对初始疗法(例如手术)产生反应后，在初始部位或远处复发的癌症。“局部复发”癌症是指在治疗后与先前治疗过的癌症在同一位置复发的癌症。“可手术的”或“可切除的”癌症是局限于主要器官且适合手术(切除)的癌症。“非可切除的”或“不可切除的”癌症不能通过手术去除(切除)。
本发明的双特异性激动性CD28抗原结合分子
本发明提供了新型双特异性激动性CD28抗原结合分子，其具有特别有利的性质，例如可生产性、稳定性、结合亲和力、生物学活性、靶向效率、降低的毒性、可以给予患者的扩展剂量范围以及从而可能增强的功效。新型双特异性激动性CD28抗原结合分子包含Fc结构域，该Fc结构域由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成，该第一亚基和第二亚基包含一个或多个降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的氨基酸取代(Fc沉默)，因此避免了通过Fc受体的非特异***联。相反，它们包含至少一个能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域，这在肿瘤部位引起交联。因此，实现了肿瘤特异性T细胞活化。
本文提供了与CD28单价结合的双特异性激动性CD28抗原结合分子，包含
(a)能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域，
(b)能够与抗原结合结构域特异性结合的第二抗原结合结构域，该抗原结合结构域能够与人表皮生长因子受体-2(Her2)特异性结合，以及
(c)由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域，该第一亚基和第二亚基包含一个或多个氨基酸取代，该一个或多个氨基酸取代降低抗原结合分子与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能，
其中能够与Her2特异性结合的该第二抗原结合结构域包含
(i)重链可变区(VHHer2)和轻链可变区(VLHer2)，该重链可变区包含以下的重链互补决定区：SEQ ID NO:2的CDR-H1、SEQ ID NO:3的CDR-H2和SEQ ID NO:4的CDR-H3，该轻链可变区包含以下的轻链互补决定区：SEQ ID NO:5的CDR-L1、SEQ ID NO:6的CDR-L2和SEQID NO:7的CDR-L3；或
(ii)重链可变区(VHHer2)和轻链可变区(VLHer2)，该重链可变区包含以下的重链互补决定区：SEQ ID NO:10的CDR-H1、SEQ ID NO:11的CDR-H2和SEQ ID NO:12的CDR-H3，该轻链可变区包含以下的轻链互补决定区：SEQ ID NO:13的CDR-L1、SEQ ID NO:14的CDR-L2和SEQ ID NO:15的CDR-L3；或
(iii)重链可变区(VHHer2)和轻链可变区(VLHer2)，该重链可变区包含以下的重链互补决定区：SEQ ID NO:132的CDR-H1、SEQ ID NO:133的CDR-H2和SEQ ID NO:134的CDR-H3，该轻链可变区包含以下的轻链互补决定区：SEQ ID NO:135的CDR-L1、SEQ ID NO:136的CDR-L2和SEQ ID NO:137的CDR-L3，或
(iv)重链可变区(VHHer2)和轻链可变区(VLHer2)，该重链可变区包含以下的重链互补决定区：SEQ ID NO:140的CDR-H1、SEQ ID NO:141的CDR-H2和SEQ ID NO:142的CDR-H3，该轻链可变区包含以下的轻链互补决定区：SEQ ID NO:143的CDR-L1、SEQ ID NO:144的CDR-L2和SEQ ID NO:145的CDR-L3。
本文提供了与CD28单价结合的双特异性激动性CD28抗原结合分子，包含
(a)能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域，
(b)能够与抗原结合结构域特异性结合的第二抗原结合结构域，该抗原结合结构域能够与人表皮生长因子受体-2(Her2)特异性结合，以及
(c)由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域，该第一亚基和第二亚基包含一个或多个氨基酸取代，该一个或多个氨基酸取代降低抗原结合分子与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能，
其中能够与Her2特异性结合的该第二抗原结合结构域包含
(i)重链可变区(VHHer2)和轻链可变区(VLHer2)，该重链可变区包含以下的重链互补决定区：SEQ ID NO:2的CDR-H1、SEQ ID NO:3的CDR-H2和SEQ ID NO:4的CDR-H3，该轻链可变区包含以下的轻链互补决定区：SEQ ID NO:5的CDR-L1、SEQ ID NO:6的CDR-L2和SEQID NO:7的CDR-L3；或
(ii)重链可变区(VHHer2)和轻链可变区(VLHer2)，该重链可变区包含以下的重链互补决定区：SEQ ID NO:10的重链互补决定区CDR-H1、SEQ ID NO:11的CDR-H2和SEQ IDNO:12的CDR-H3，该轻链可变区包含以下的轻链互补决定区：SEQ ID NO:13的CDR-L1、SEQID NO:14的CDR-L2和SEQ ID NO:15的CDR-L3。
在另一个方面，本发明提供了双特异性激动性CD28抗原结合分子，其特征在于与CD28单价结合，该双特异性激动性CD28抗原结合分子包含
(a)能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域，
(b)能够与抗原结合结构域特异性结合的第二抗原结合结构域，该抗原结合结构域能够与人表皮生长因子受体-2(Her2)特异性结合，以及
(c)由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域，该第一亚基和第二亚基包含一个或多个氨基酸取代，该一个或多个氨基酸取代降低抗原结合分子与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能，
其中能够与Her2特异性结合的该第二抗原结合结构域包含
(iii)重链可变区(VHHer2)和轻链可变区(VLHer2)，该重链可变区包含以下的重链互补决定区：SEQ ID NO:132的CDR-H1、SEQ ID NO:133的CDR-H2和SEQ ID NO:134的CDR-H3，该轻链可变区包含以下的轻链互补决定区：SEQ ID NO:135的CDR-L1、SEQ ID NO:136的CDR-L2和SEQ ID NO:137的CDR-L3，或
(iv)重链可变区(VHHer2)和轻链可变区(VLHer2)，该重链可变区包含以下的重链互补决定区：SEQ ID NO:140的CDR-H1、SEQ ID NO:141的CDR-H2和SEQ ID NO:142的CDR-H3，该轻链可变区包含以下的轻链互补决定区：SEQ ID NO:143的CDR-L1、SEQ ID NO:144的CDR-L2和SEQ ID NO:145的CDR-L3。
在一个方面，提供了如上文定义的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中Fc结构域是IgG，特别是IgG1 Fc域或IgG4 Fc域。在一个特定方面，由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域是IgG1 Fc结构域。特别地，Fc结构域包含降低抗原结合分子与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代。在一个方面，Fc结构域包含氨基酸取代L234A和L235A(根据Kabat EU索引编号)。在一个方面，Fc结构域属于人IgG1亚类，并且包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G(根据Kabat EU索引编号)。在一个方面，提供了双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域，其中第一亚基包含SEQ ID NO:70(Fc臼PGLALA)的氨基酸序列，并且第二亚基包含SEQ ID NO:71(Fc杵PGLALA)的氨基酸序列。
在一个方面，提供了如上文所定义的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域包含(i)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含以下的重链互补决定区：SEQ ID NO:26的CDR-H1、SEQ ID NO:27的CDR-H2和SEQ ID NO:28的CDR-H3，该轻链可变区包含以下的轻链互补决定区：SEQ IDNO:29的CDR-L1、SEQ ID NO:30的CDR-L2和SEQ ID NO:31的CDR-L3；或(ii)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:18的CDR-H1、SEQ ID NO:19的CDR-H2和SEQ ID NO:20的CDR-H3，该轻链可变区包含SEQ ID NO:21的CDR-L1、SEQ IDNO:22的CDR-L2和SEQ ID NO:23的CDR-L3。
在一个方面，双特异性激动性CD28抗原结合分子的能够与CD28特异性结合的抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ IDNO:26的CDR-H1、SEQ ID No:26的CDR-H2 NO:27和SEQ ID NO:28的CDR-H3，该轻链可变区包含SEQ ID NO:29的CDR-L1、SEQ ID NO:30的CDR-L2和SEQ ID NO:31的CDR-L3。
在另一个方面，能够与双特异性激动性CD28抗原结合分子的CD28特异性结合的抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ IDNO:18的CDR-H1、SEQ ID NO:19的CDR-H2和SEQ ID NO:20的CDR-H3，该轻链可变包含SEQ IDNO:21的CDR-L1、SEQ ID NO:22的CDR-L2和SEQ ID NO:23的CDR-L3。
在进一步方面，提供了如上文所定义的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域包含
(i)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含以下的重链互补决定区：SEQ ID NO:52的CDR-H1、SEQ ID NO:53的CDR-H2和SEQ ID NO:54的CDR-H3，该轻链可变区包含以下的轻链互补决定区：SEQ ID NO:55的CDR-L1、SEQ ID NO:56的CDR-L2和SEQ ID NO:57的CDR-L3；或
(ii)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:58的CDR-H1、SEQ ID NO:59的CDR-H2和SEQ ID NO:60的CDR-H3，该轻链可变区包含SEQ IDNO:61的CDR-L1、SEQ ID NO:62的CDR-L2和SEQ ID NO:63的CDR-L3；或
(ii)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:64的CDR-H1、SEQ ID NO:65的CDR-H2和SEQ ID NO:66的CDR-H3，该轻链可变区包含SEQ IDNO:67的CDR-L1、SEQ ID NO:68的CDR-L2和SEQ ID NO:69的CDR-L3。
在一个方面，双特异性激动性CD28抗原结合分子的能够与CD28特异性结合的抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含以下的重链互补决定区：SEQ ID NO:52的CDR-H1、SEQ ID NO:53的CDR-H2和SEQ ID NO:54的CDR-H3，该轻链可变区包含以下的轻链互补决定区：SEQ ID NO:55的CDR-L1、SEQ ID NO:56的CDR-L2和SEQ ID NO:57的CDR-L3。
在另一个方面，双特异性激动性CD28抗原结合分子的能够与CD28特异性结合的抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ IDNO:58的CDR-H1、SEQ ID NO:59的CDR-H2和SEQ ID NO:60的CDR-H3，该轻链可变区包含SEQID NO:61的CDR-L1、SEQ ID NO:62的CDR-L2和SEQ ID NO:63的CDR-L3。
在另一个方面，双特异性激动性CD28抗原结合分子的能够与CD28特异性结合的抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ IDNO:64的CDR-H1、SEQ ID NO:65的CDR-H2和SEQ ID NO:66的CDR-H3，该轻链可变区包含SEQID NO:67的CDR-L1、SEQ ID NO:68的CDR-L2和SEQ ID NO:69的CDR-L3。
而且，提供了如上文所定义的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与CD28特异性结合的抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一个方面，能够与CD28特异性结合的抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含选自由SEQID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41组成的组的氨基酸序列，该轻链可变区包含选自由SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50和SEQ IDNO:51组成的组的氨基酸序列。
在另一方面，提供了双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域包含
(a)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，或
(b)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，或
(c)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，或
(d)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，或
(e)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，或
(f)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，或
(g)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，或
(h)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，或
(i)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，或
(j)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，或
(k)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
在一个方面，提供了双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD28)的CDR和轻链可变区(VLCD28)的CDR，该重链可变区包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。在另一个方面，能够与CD28特异性结合的双特异性激动性CD28抗原结合分子的第一抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQID NO:52的CDR-H1、SEQ ID NO:53的CDR-H2和SEQ ID NO:54的CDR-H3，该轻链可变区包含SEQ ID NO:55的CDR-L1、SEQ ID NO:56的CDR-L2和SEQ ID NO:57的CDR-L3。
在另一个方面，提供了双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与CD28特异性结合的抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD28)的CDR和轻链可变区(VLCD28)的CDR，该重链可变区包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列。在另一个方面，能够与双特异性激动性CD28抗原结合分子的CD28特异性结合的抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:58的CDR-H1、SEQ ID NO:59的CDR-H2和SEQ ID NO:60的CDR-H3，该轻链可变包含SEQ IDNO:61的CDR-L1、SEQ ID NO:62的CDR-L2和SEQ ID NO:63的CDR-L3。
在另一个方面，提供了双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与CD28特异性结合的抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD28)的CDR和轻链可变区(VLCD28)的CDR，该重链可变区包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。在另一个方面，能够与双特异性激动性CD28抗原结合分子的CD28特异性结合的抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:64的CDR-H1、SEQ ID NO:65的CDR-H2和SEQ ID NO:66的CDR-H3，该轻链可变包含SEQ IDNO:67的CDR-L1、SEQ ID NO:68的CDR-L2和SEQ ID NO:69的CDR-L3。
在一个方面，提供了双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中与包含重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)的抗原结合结构域相比，能够与CD28特异性结合的抗原结合结构域以降低的亲和力结合Cd28，该重链可变区包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。亲和力通过流式细胞术测量为与表达CD28的CHO细胞的结合。在一个方面，与包含含有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链可变区(VHCD28)和含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链可变区(VLCD28)的抗原结合结构域相比，能够与CD28特异性结合的抗原结合结构域以降低的亲和力结合CD28，并且抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的重链可变区(VHCD28)的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链可变区(VLCD28)的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一个方面，与包含含有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链可变区(VHCD28)和含有SEQ IDNO:25的氨基酸序列的轻链可变区(VLCD28)的抗原结合结构域相比，以降低的亲和力与CD28特异性结合的抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:44的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一个特定的方面，提供了双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与CD28特异性结合的抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。
在另一个特定的方面，提供了双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与CD28特异性结合的抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列。
在进一步特定的方面，提供了双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与CD28特异性结合的抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
靶向Her2的双特异性激动性CD28抗原结合分子
本文提供了双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域是能够与人表皮生长因子受体-2(Her2)特异性结合的抗原结合结构域。
在一个方面，提供了如本文所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包含重链可变区(VHHer2)和轻链可变区(VLHer2)，该重链可变区包含：含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-H1、含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H2和含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H3，该轻链可变区包含：含有SEQ IDNO:5的氨基酸序列的CDR-L1、含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L2和含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-L3。在一个方面，能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区(VHHer2)和包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链可变区(VLHer2)。在一个方面，提供了双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包含重链可变区(VHHer2)和轻链可变区(VLHer2)，该重链可变区包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。特别是，能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区(VHHer2)和包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链可变区(VLHer2)。
在另一个方面，提供了如本文所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包含重链可变区(VHHer2)和轻链可变区(VLHer2)，该重链可变区含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-H1、含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H2和含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-H3，该轻链可变区包含含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L1、含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L2和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L3。在一个方面，能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链可变区(VHHer2)和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链可变区(VLHer2)。在一个方面，提供了双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包含重链可变区(VHHer2)和轻链可变区(VLHer2)，该重链可变区包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:17的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。特别是，能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链可变区(VHHer2)和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链可变区(VLHer2)。
本文还公开了如本文所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包含重链可变区(VHHer2)和轻链可变区(VLHer2)，该重链可变区包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ IDNO:133的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列，该轻链可变区包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列。在一个方面，能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包含重链可变区(VHHer2)和轻链可变区(VLHer2)，该重链可变区包含与SEQ ID NO:138的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:139的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。特别地，能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的重链可变区(VHHer2)和包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列(帕妥珠单抗，2C4)的轻链可变区(VLHer2)。
而且，本文公开了如本文所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包含重链可变区(VHHer2)和轻链可变区(VLHer2)，该重链可变区包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQID NO:141的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列，该轻链可变区包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ IDNO:144的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列。在一个方面，能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包含重链可变区(VHHer2)和轻链可变区(VLHer2)，该重链可变区包含与SEQ ID NO:146的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:147的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。特别是，能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的重链可变区(VHHer2)和包含SEQ IDNO:147的氨基酸序列(曲妥珠单抗，4D5)的轻链可变区(VLHer2)。
另外，本文公开了如本文所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包含重链可变区(VHHer2)和轻链可变区(VLHer2)，该重链可变区包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQID NO:157的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:158的氨基酸序列，该轻链可变区包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ IDNO:160的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:161的氨基酸序列。在一个方面，能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包含重链可变区(VHHer2)和轻链可变区(VLHer2)，该重链可变区包含与SEQ ID NO:162的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:163的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。特别是，能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的重链可变区(VHHer2)和包含SEQ IDNO:163的氨基酸序列(7C2)的轻链可变区(VLHer2)。
用于与CD28单价结合和用于与Her2单价结合的双特异性激动性CD28抗原结合分子(1+1形式)
在一个方面，提供了双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域和/或能够与Her2特异性结合的第二抗原结合结构域是Fab片段。在一个特定的方面，能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域和能够与Her2特异性结合的第二抗原结合结构域是Fab片段。
在一个方面，提供了如本文所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其包含(a)能够与CD28特异性结合的crossFab片段，(b)能够与Her2特异性结合的常规Fab片段，和(c)由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域，该第一亚基和第二亚基包含一个或多个氨基酸取代，该取代降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能。在另一个方面，提供了如本文所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其包含(a)能够与CD28特异性结合的常规Fab片段，(b)能够与Her2特异性结合的crossFab片段，和(c)由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域，该第一亚基和第二亚基包含一个或多个氨基酸取代，该一个或多个氨基酸取代降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能。
在一个方面，提供了如本文所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域是Fab片段，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换或恒定结构域CL和CH1彼此替换，特别是可变结构域VL和VH彼此替换(crossfab片段)。在一个方面，能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域是Fab片段，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换或该恒定结构域CL和CH1彼此替换，特别是可变结构域VL和VH彼此替换，并且能够与Her2特异性结合的第二抗原结合结构域是常规Fab片段。在一个方面，能够与Her2特异性结合的第二抗原结合结构域是Fab片段，其中在恒定结构域CL中，第123位(根据Kabat Eu索引编号)氨基酸被选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)的氨基酸取代，第124(根据Kabat Eu索引编号)氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代，其中在恒定结构域CH1中，第147位(根据Kabat EU索引编号)氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代，第213位(根据Kabat EU索引编号)氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个特定的方面，提供了双特异性激动性CD28抗原结合分子，其包含：第一轻链，其包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列；第一重链，其包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列；第二重链，其包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列；和第二轻链，其包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列(分子A)。在进一步特定的方面，提供了双特异性激动性CD28抗原结合分子，其包含：第一轻链，其包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列；第一重链，其包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列；第二重链，其包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列；和第二轻链，其包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列(分子B)。在另一个特定的方面，提供了双特异性激动性CD28抗原结合分子，其包含：第一轻链，其包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列；第一重链，其包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列；第二重链，其包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列；和第二轻链，其包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列(分子D)。
在另一个特定的方面，提供了双特异性激动性CD28抗原结合分子，其包含含有SEQID NO:179的氨基酸序列的第一轻链、含有SEQ ID NO:178的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:180的氨基酸序列的第二重链和含有SEQ ID NO:181的氨基酸序列的第二轻链。在另一个特定的方面，提供了双特异性激动性CD28抗原结合分子，其包含含有SEQ ID NO:179的氨基酸序列的第一轻链、含有SEQ ID NO:178的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ IDNO:182的氨基酸序列的第二重链和含有SEQ ID NO:183的氨基酸序列的第二轻链。
在一个方面，提供了如本文所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与Her2特异性结合的第二抗原结合结构域是Fab片段，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换或恒定结构域CL和CH1彼此替换，特别是可变结构域VL和VH彼此替换(crossfab片段)。在一个方面，能够与Her2特异性结合的第二抗原结合结构域是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换或恒定结构域CL和CH1彼此替换，特别是可变结构域VL和VH彼此替换，并且能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域是常规Fab片段。在一个方面，能够与CD28特异性结合的抗原结合结构域是Fab片段，其中在恒定结构域CL中，第123位(根据Kabat EU索引编号)的氨基酸被选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)的氨基酸取代，并且第124位(根据Kabat EU索引编号)的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代，并且其中在恒定结构域CH1中，第147位(根据Kabat EU索引编号)的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代，并且第213位(根据Kabat EU索引编号)的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个特定的方面，提供了双特异性激动性CD28抗原结合分子，其包含含有SEQID NO:83的氨基酸序列的第一轻链、含有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的第一重链、含有SEQID NO:99的氨基酸序列的第二重链和含有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的第二轻链。在一个特定的方面，提供了双特异性激动性CD28抗原结合分子，其包含含有SEQ ID NO:83的氨基酸序列的第一轻链、含有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的第二重链和含有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的第二轻链。
减少Fc受体结合和/或效应子功能的Fc结构域修饰
本发明的双特异性激动性CD28抗原结合分子的Fc结构域由包含免疫球蛋白分子的重链结构域的一对多肽链组成。例如，免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc结构域是二聚体，该二聚体的每个亚基包含CH2和CH3 IgG重链恒定结构域。Fc结构域的两个亚基能够彼此稳定缔合。Fc结构域为本发明的抗原结合分子赋予有利的药代动力学特性，包括有助于靶组织中的良好积聚的长血清半衰期和有利的组织-血液分配比。然而，另一方面，可能导致本发明的双特异性抗体不期望地靶向表达Fc受体的细胞，而不是优选的抗原携带细胞。
因此，与天然IgG1 Fc结构域相比，本发明的双特异性激动剂CD28抗原结合分子的Fc结构域表现出对Fc受体降低的的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在一个方面，Fc基本上不结合到Fc受体和/或不诱导效应子功能。在特定方面，Fc受体是Fcγ受体。在一个方面，Fc受体是人Fc受体。在具体方面，Fc受体是活化性人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具体地是人FcγRIIIa。在一个方面，Fc结构域不诱导效应子功能。降低的效应子功能可以包括但不限于以下中的一个或多个：降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)、降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、降低的抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)、减少的细胞因子分泌、减少的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、减少的与NK细胞的结合、减少的与巨噬细胞的结合、减少的与单核细胞的结合、减少的与多形核细胞的结合、减少的直接信号传导诱导性细胞凋亡、降低的树突细胞成熟或减少的T细胞引发。
在某些方面，一个或多个氨基酸修饰可引入本文提供的抗体的Fc区中，从而生成Fc区变体。Fc区变体可包含人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，其在一个或多个氨基酸位置上包含氨基酸修饰(例如取代)。
在一个特定方面，本发明提供了抗原结合分子，其中Fc区包含一个或多个氨基酸取代，该一个或多个氨基酸取代减少与Fc受体的结合，特别是与Fcγ受体的结合。在一个方面，本发明提供了抗体，其中Fc区包含一个或多个氨基酸取代，并且其中由该抗体诱导的ADCC降低至由包含野生型人IgG1 Fc区的抗体诱导的ADCC的0％-20％。
在一个方面，本发明的抗原结合分子的Fc结构域包含降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸突变。典型地，相同的一个或多个氨基酸突变存在于Fc结构域的两个亚基中的每一个中。特别地，Fc结构域在E233、L234、L235、N297、P331和P329位(EU编号)处包含氨基酸取代。特别地，Fc结构域包含IgG重链234和235位(EU编号)和/或329位(EU编号)的氨基酸取代。更具体地，提供了根据本发明的抗原结合分子，其包含在IgG重链中具有氨基酸取代L234A、L235A和P329G(“P329G LALA”，EU编号)的Fc结构域。氨基酸取代L234A和L235A是指所谓的LALA突变。氨基酸取代的“P329G LALA”组合几乎完全消除人IgG1 Fc结构域的Fcγ受体结合，如国际专利申请公开号WO 2012/130831 A1该，该专利申请公开还描述制备这种突变Fc结构域的方法和用于确定其特性(诸如Fc受体结合或效应子功能)的方法。
具有降低的Fc受体结合和/或效应子功能的Fc结构域还包括具有Fc结构域残基238、265、269、270、297、327和329中一个或多个的取代的那些(美国专利号6,737,056)。此类Fc突变体包括在第265、269、270、297和327位氨基酸中两个或更多个处具有取代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其残基265和297被取代为丙氨酸(美国专利号7,332,581)。
在另一方面，Fc结构域为IgG4 Fc结构域。与IgG1抗体相比，IgG4抗体表现出降低的与Fc受体的结合亲和力和降低的效应子功能。在一个更具体的方面，Fc结构域是在S228位处(Kabat编号)包含氨基酸取代，具体地是氨基酸取代S228P的IgG4 Fc结构域。在一个更具体的方面，Fc结构域是包含氨基酸取代L235E和S228P以及P329G(EU编号)的IgG4 Fc结构域。WO 2012/130831中也描述了此类IgG4 Fc结构域突变体及其Fcγ受体结合特性。
另外地或可替代地，一个或多个取代突变包含去糖基化位点突变(例如，在氨基酸残基N297(EU编号)处的去糖基化位点突变，例如，N297G或N297A(EU编号)的去糖基化位点突变，其也降低与Fc受体和/或效应子功能的结合。在一个特定的方面，Fc结构域是包含氨基酸取代N297G(根据EU编号)的IgG1 Fc结构域。
可以使用本领域熟知的遗传或化学方法，通过氨基酸缺失、取代、***或修饰来制备突变Fc结构域。遗传方法可包括对编码DNA序列的位点特异性诱变、PCR、基因合成等。可以例如通过测序来验证正确的核苷酸变化。
与Fc受体的结合可以例如通过ELISA或通过表面等离子体共振(SPR)使用标准仪器(诸如BIAcore仪器(GE Healthcare))容易地确定，并且Fc受体诸如可以通过重组表达获得。可替代地，可以使用已知表达特定Fc受体的细胞系(例如表达FcγIIIa受体的人NK细胞)来评估Fc结构域或包含Fc结构域的细胞活化性抗体对Fc受体的结合亲和力。
Fc结构域的效应子功能，或本发明的包含Fc结构域的抗原结合分子，可以通过本领域已知的方法来测量。本文描述了用于测量ADCC的合适的方法。用于评估目标分子的ADCC活性的体外测定的其他示例描述于美国专利号5,500,362；Hellstrom等人，Proc NatlAcad Sci USA 83,7059-7063(1986)和Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 82,1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337；Bruggemann等人，J Exp Med 166,1351-1361(1987)。可替代地，可以使用非放射性测定方法(参见例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；以及CytoTox
Figure BDA0004009238190000671
非放射性细胞毒性测定(威斯康星州，麦迪逊市，普洛麦格公司(Promega,Madison,WI))。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。替代地或另外地，可例如在诸如在Clynes等人，Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)中公开的动物模型中体内评定目标分子的ADCC活性。
在一些方面，Fc结构域与补体组分，特别是C1q的结合减少。因此，在一些方面，其中Fc结构域经工程化以具有降低的效应子功能，该降低的效应子功能包括降低的CDC。可以进行C1q结合测定以确定本发明的双特异性抗体是否能够结合C1q并因此具有CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可以执行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人，J Immunol Methods 202,163(1996)；Cragg等人，Blood 101,1045-1052(2003)；以及Cragg和Glennie，Blood 103,2738-2743(2004))。
在一个特定的方面，与初始IgG1 Fc结构域相比表现出对Fc受体降低的的结合亲和力和/或降低的效应子功能的Fc结构域是包含氨基酸取代L234A、L235A和任选地P329G的人IgG1 Fc结构域，或者是包含氨基酸取代S228P、L235E和任选地P329G的人IgG4 Fc结构域(根据Kabat EU索引编号)。更具体地，Fc结构域是包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(根据Kabat EU索引编号)的人IgG1 Fc结构域。
在另一个方面，Fc结构域是IgG1或IgG4 Fc结构域，其中降低与Fc受体的结合和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代位于N297。在一个特定的方面，Fc结构域是包含氨基酸取代N297G(根据EU编号)的IgG1 Fc结构域。
促进异源二聚化的Fc结构域修饰
本发明的双特异性激动性CD28抗原结合分子包含与Fc结构域的两个亚基中的一个或另一个融合的不同抗原结合位点，因此Fc结构域的两个亚基可包含在两个不同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后的二聚化导致了两种多肽的几种可能的组合。为了在重组产生中提高本发明的双特异性抗原结合分子的产率和纯度，因此在本发明的双特异性抗原结合分子的Fc结构域中引入促进所需多肽的缔合的修饰将是有利的。
因此，在特定方面，本发明涉及与CD28单价结合的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其包含(a)一个能够与CD28特异性结合的抗原结合结构域，(b)至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域和(c)由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域，该第一亚基和第二亚基包含一个或多个氨基酸取代，该一个或多个氨基酸取代降低抗原结合分子与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能，其中Fc结构域包含促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的修饰。人IgG Fc结构域的两个亚基之间最广泛的蛋白质间相互作用位点在Fc结构域的CH3结构域中。因此，在一个方面，该修饰在Fc结构域的CH3结构域中。
在具体方面，该修饰是所谓的“杵臼结构”修饰，该修饰包括Fc结构域的两个亚基中的一个中的“杵”修饰和Fc结构域的两个亚基中的另一个中的“臼”修饰。因此，本发明涉及与CD28单价结合的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其包含(a)一个能够与CD28特异性结合的抗原结合结构域，(b)至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原结合结构域和(c)由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域，该第一亚基和第二亚基包含一个或多个氨基酸取代，该一个或多个氨基酸取代降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能，其中Fc结构域的第一亚基包含杵，并且Fc结构域的第二亚基根据杵进入臼的方法包含臼。在特定的方面，Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S 354C和/或T366W(EU编号)，Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。
杵臼结构技术描述于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng9，617-621(1996)和Carter，J Immunol Meth 248，7-15(2001)中。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入突起(“杵”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“臼”)，使得该突起可以定位在该空腔中，以便促进异二聚体的形成并阻碍同二聚体的形成。突起是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建的。具有与突起相同或相似大小的补偿空腔是通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链而在第二多肽的界面中创建的。
因此，在一个方面，在本发明的双特异性抗原结合分子的Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替代，从而在第一亚基的CH3结构域内产生突起，该突起可定位于第二亚基的CH3结构域内的空腔中，并且在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替代，从而在第二亚基的CH3结构域内产生空腔，第一亚基的CH3结构域内的突起可定位在该空腔内。突起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸来制备，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成。在具体方面，在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，366位处的苏氨酸残基被色氨酸残基(T366W)替代，而在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中，407位处的酪氨酸残基被缬氨酸残基(Y407V)替代。在一个方面，另外在Fc结构域的第二亚基中，366位处的苏氨酸残基被丝氨酸残基(T366S)替代，并且368位处的亮氨酸残基被丙氨酸残基(L368A)替代。
在又进一步的方面，另外在Fc结构域的第一亚基中，354位处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基(S354C)替代，并且另外在Fc结构域的第二亚基中，349位的酪氨酸残基被半胱氨酸残基(Y349C)替代。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc结构域的两个亚基之间形成二硫桥，从而进一步稳定该二聚体(Carter(2001),J Immunol Methods 248,7-15)。在特定方面，Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W(EU编号)而Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。
在一个替代方面，促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰包括介导静电转向效应的修饰，例如如在PCT公开WO 2009/089004中该。通常，该方法涉及用带电荷的氨基酸残基取代两个Fc结构域亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基，使得同源二聚体形成变得在静电上不利，但异源二聚化在静电上有利。
如本文报告的双特异性激动性CD28抗原结合分子的重链的C末端可以是以氨基酸残基PGK结束的完整C末端。重链的C末端可以是缩短的C末端，在该缩短的C末端中已经去除了一个或两个C末端氨基酸残基。在一个优选的方面，重链的C末端是以P结束的缩短的C末端。在一个优选的方面，重链的C末端是以PG结束的缩短的C末端。在如本文报告的所有方面中的一个方面，如本文所指定的包含含有C末端CH3结构域的重链的CD28抗原结合分子，包含C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat EU索引编号)。在如本文报告的所有方面的一个方面，如本文所指定的包含含有C末端CH3结构域的重链的CD28抗原结合分子，包含C末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat EU索引编号)。
Fab结构域中的修饰
在一个方面，本发明涉及双特异性激动性CD28抗原结合分子，其特征在于与CD28单价结合，该双特异性激动性CD28抗原结合分子包含(a)能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域，(b)能够与Her2特异性结合的第二抗原结合结构域和(c)由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域，该第一亚基和第二亚基包含一个或多个降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的氨基酸取代，其中能够与Her2特异性结合的第二抗原结合结构域是Fab片段，并且在Fab片段中可变结构域VH和VL或恒定结构域CH1和CL交换根据Crossmab技术进行交换。
在WO2009/080252和Schaefer,W.等人，PNAS,108(2011)11187-1191中详细描述了在一个结合臂中具有结构域置换/交换的多特异性抗体(CrossMabVH-VL或CrossMabCH-CL)。它们明显减少了由针对第一抗原的轻链与针对第二抗原的错误重链的错配导致的副产物(与没有此类结构域交换的方法相比)。
在一个方面，本发明涉及双特异性激动性CD28抗原结合分子，其特征在于与CD28单价结合，该双特异性激动性CD28抗原结合分子包含(a)能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域，(b)能够与Her2特异性结合的第二抗原结合结构域和(c)由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域，该第一亚基和第二亚基包含一个或多个降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的氨基酸取代，其中在能够与CD28特异性结合的Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，使得VH结构域是轻链的一部分，VL结构域是重链的一部分。
在另一个方面，并且为了进一步改善正确配对，特征在于与CD28单价结合的双特异性激动性CD28抗原结合分子包含(a)能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域，(b)能够与Her2的特异性结合的第二抗原结合结构域和(c)由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域可以包含不同的带电氨基酸取代(所谓的“带电残基”)，该第一亚基和第二亚基包含一个或多个氨基酸取代，该一个或多个氨基酸取代降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能。将这些修饰引入交叉或非交叉的CH1和CL结构域中。在特定的方面，本发明涉及双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中在CL结构域之一中，第123位(EU编号)氨基酸已被精氨酸(R)取代并且第124位(EU编号)氨基酸已被赖氨酸(K)取代，其中在CH1结构域之一中，第147位(EU编号)和第213位(EU编号)氨基酸已被谷氨酸(E)取代。在一个特定的方面，在能够与CD28特异性结合的Fab片段的CL结构域中，第123位(EU编号)氨基酸已被精氨酸(R)取代，第124位(EU编号)氨基酸已被赖氨酸(K)取代，并且在能够与CD28特异性结合的Fab片段的CH1结构域中，第147位(EU编号)氨基酸和第213位(EU编号)氨基酸已被谷氨酸(E)取代。
多核苷酸
本发明进一步提供了编码如本文所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸。编码本发明的双特异性激动性CD28抗原结合分子一种或多种分离的多核苷酸可以表达为编码完整抗原结合分子的单个多核苷酸，或表达为共表达的多个(例如两个或更多个)多核苷酸。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以经由例如二硫键或其他手段缔合以形成功能性抗原结合分子。举例而言，免疫球蛋白的轻链部分可以由来自免疫球蛋白的重链部分的单独多核苷酸编码。当共表达时，重链多肽将与轻链多肽缔合以形成免疫球蛋白。在一些方面，分离的多核苷酸编码如本文所述的根据本发明的整个双特异性激动性CD28抗原结合分子。在其他实施例中，分离的多核苷酸编码包含在如本文所述的根据本发明的双特异性激动性CD28抗原结合分子中的多肽。在某些方面，多核苷酸或核酸是DNA。在其他方面，本发明的多核苷酸是RNA，例如以信使RNA(mRNA)的形式。本发明的RNA可以是单链或双链的。
重组方法
本发明的双特异性激动性CD28抗原结合分子可以例如通过固态肽合成(例如Merrifield固相合成)或重组生产来获得。对于重组生产，将例如上述编码双特异性激动性CD28抗原结合分子或其多肽片段的一种或多种多核苷酸分离并***至一个或多个载体中，以用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类多核苷酸可使用常规方法容易地分离并且测序。在本发明的一个方面，提供一种载体，优选为表达载体，该载体包含本发明的多核苷酸中的一种或多种多核苷酸。可以使用本领域技术人员熟知的方法来构建含有抗体(片段)的编码序列以及适当转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。参见例如以下文献该的技术：Maniatis等人，MOLECULARCLONING:A LABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(1989)；和Ausubel等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，Greene PublishingAssociates and Wiley Interscience，N.Y.(1989)。表达载体可以是质粒、病毒的一部分，或者可以是核酸片段。表达载体包括表达盒，编码抗体或其多肽片段的多核苷酸(即编码区)与启动子和/或其他转录或翻译控制元件可操作缔合地克隆至该表达盒中。如本文所用，“编码区”是核酸的一部分，该部分由翻译成氨基酸的密码子组成。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)未被翻译成氨基酸，但其(如果存在的话)可被认为是编码区的一部分，而任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5'和3'非翻译区等不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可存在于单个多核苷酸构建体中(例如在单个载体上)，或在单独的多核苷酸构建体中(例如在单独的(不同的)载体上)。此外，任何载体可含有单一编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如本发明的载体可以编码一种或多种多肽，该一种或多种多肽在翻译后或翻译时通过蛋白水解切割分离成最终的蛋白质。此外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可编码异源编码区，该异源编码区与编码本发明的抗体或其多肽片段的多核苷酸或其变体或衍生物融合或不融合。异源编码区包括但不限于特化元件或基序，诸如分泌信号肽或异源功能结构域。可操作缔合是当基因产物(例如多肽)的编码区以某种方式与一个或多个调控序列缔合，以使基因产物的表达处于调控序列的影响或控制下。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mRNA的转录，并且如果两个DNA片段之间的键结性质不干扰表达调控序列指导基因产物表达的能力或干扰待转录的基因模板的能力，则该两个DNA片段(诸如多肽编码区和与其相关的启动子)是“可操作地缔合的”。因此，如果启动子能够影响该核酸的转录，则启动子区域将与编码多肽的核酸可操作地缔合。启动子可以是细胞特异性启动子，该细胞特异性启动子仅在预定细胞中指导DNA的实质转录。除启动子外，其他转录控制元件，例如增强子、操纵子、阻遏物和转录终止信号，可以与多核苷酸可操作地缔合以指导细胞特异性转录。
本文公开了合适的启动子和其他转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些转录控制区包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，诸如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子区段(例如立即早期启动子结合内含子-A)、猿猴病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(诸如例如劳氏肉瘤病毒)。其他转录控制区包括来源于脊椎动物基因(诸如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔a珠蛋白)的那些转录控制区，以及能够控制真核细胞中基因表达的其他序列。其他合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素可诱导启动子)。类似地，各种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些翻译控制元件包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子，以及来源于病毒***的元件(特别是内部核糖体进入位点，或IRES，也称为CITE序列)。表达盒还可以包括其他特征，诸如复制起点，和/或染色体整合元件，诸如逆转录病毒长末端重复序列(LTR)，或腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌肽或信号肽的附加编码区缔合，该附加编码区指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如，如果需要分泌抗体或其多肽片段，可以将编码信号序列的DNA置于本发明的抗体或其多肽片段的核酸的上游。根据信号假设，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦已经起始跨粗面内质网输出生长的蛋白质链，该信号肽或分泌前导序列就被从成熟蛋白质上切割下来。本领域普通技术人员知道由脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有与该多肽的N末端融合的信号肽，该信号肽被从翻译的多肽上切割下来以生产该多肽的分泌或“成熟”形式。在某些实施例中，使用天然信号肽(例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽)，或保留指导与其可操作地缔合的多肽分泌的能力的该序列的功能性衍生物。可替代地，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可以被人组织纤溶酶原活化剂(TPA)或小鼠β葡糖醛酸酶的前导序列取代。
编码可用于促进后续纯化(例如组氨酸标签)或辅助标记双特异性激动性CD28抗原结合分子的短蛋白质序列的DNA可包含在编码本发明抗体或其多肽片段的多核苷酸内或其末端。
在本发明的另一方面，提供了包含一种或多种本发明的多核苷酸的宿主细胞。在某些实施例中，提供了包含一种或多种本发明的载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可以单独或组合地渗入本文中分别关于多核苷酸和载体描述的任何特征。在一个方面，宿主细胞包含(例如，已转化或转染)载体，该载体包含编码本发明的抗体(的一部分)的多核苷酸。如本文所用，术语“宿主细胞”是指可以被工程化改造以产生本发明的融合蛋白或其片段的任何种类的细胞***。适于复制和支持抗原结合分子表达的宿主细胞是本领域中熟知的。此类细胞可以用特定的表达载体适当地转染或转导，并且可以生长大量含有载体的细胞以用于接种大规模发酵罐来获得足够量的抗原结合分子用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物，诸如大肠杆菌，或各种真核细胞，诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。例如，多肽可以在细菌中生产，特别是当不需要糖基化时。多肽在表达后可以在可溶性级分中从细菌细胞糊状物中分离，并可以进一步纯化。除原核生物外，诸如丝状真菌或酵母之类的真核微生物也是用于编码多肽的载体的合适克隆或表达宿主，包括这样的真菌和酵母菌株，该真菌和酵母菌株的糖基化途径已经被“人源化”，从而导致生产具有部分或完全人糖基化模式的多肽。参见Gerngross,Nat Biotech 22,1409-1414(2004)和Li等人，NatBiotech 24,210-215(2006)。
用于表达(糖基化)多肽的合适宿主细胞还来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定出了可以与昆虫细胞结合使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的许多杆状病毒株。植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例为由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293T细胞，如例如在Graham等人，J Gen Virol 36,59(1977)中该)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠塞尔托利氏细胞(TM4细胞，如例如在Mather,Biol Reprod 23,243-251(1980)中该)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人***细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT 060562)、TRI细胞(如例如在Mather等人，Annals N.Y.Acad Sci 383,44-68(1982)中该)、MRC 5细胞，以及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括dhfr-CHO细胞(Urlaub等人，Proc Natl Acad Sci USA 77,4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，诸如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。关于适用于蛋白质生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，请参见例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编辑，HumanaPress,Totowa,NJ)，第255-268页(2003)。宿主细胞包括培养细胞，例如仅举几个例子而言哺乳动物培养细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞，还包括转基因动物、转基因植物或培养植物或动物组织中所包含的细胞。在一个实施例中，宿主细胞是真核细胞，优选哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞或淋巴细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。用于在这些***中表达外源基因的标准技术是本领域已知的。可以对表达包含免疫球蛋白的重链或轻链的多肽的细胞进行工程化改造，以便也表达另一条免疫球蛋白链，使得表达的产物为具有重链和轻链的免疫球蛋白。
在一个方面，提供了制备本发明的双特异性激动性CD28抗原结合分子或其多肽片段的方法，其中该方法包含在适于表达本发明的抗体或其多肽片段的条件下培养包含编码如本文提供的本发明的抗体或其多肽片段的多核苷酸的宿主细胞，以及从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收本发明的抗体或其多肽片段。
在某些方面，形成抗原结合分子的一部分的能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域(例如Fab片段)包含至少能够与抗原结合的免疫球蛋白可变区。可变区可形成天然或非天然存在的抗体及其片段的一部分并由其衍生。产生多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域熟知的(参见例如Harlow和Lane，"Antibodies,a laboratory manual",ColdSpring Harbor Laboratory,1988)。非天然存在的抗体可以使用固相肽合成来构建，可以重组产生(例如，如在美国专利号4,186,567中该)，或者可以例如通过筛选包含可变重链和可变轻链的组合文库来获得(参见例如McCafferty的美国专利号5,969,108)。
免疫球蛋白的任何动物物种都可用于本发明。用于本发明的非限制性免疫球蛋白可以是鼠、灵长类或人来源的免疫球蛋白。如果融合蛋白旨在用于人类使用，则可以使用嵌合形式的免疫球蛋白，其中该免疫球蛋白的恒定区来自人。也可以根据本领域熟知的方法来制备人源化或完全人形式的免疫球蛋白(参见例如Winter的美国专利号5,565,332)。人源化可通过各种方法实现，该各种方法包括但不限于(a)将非人(例如供体抗体)CDR移植到人(例如受体抗体)架构和恒定区上，该架构和恒定区有或没有保留关键架构残基(例如对于保持良好的抗原结合亲和力或抗体功能来说重要的关键架构残基)，(b)仅将非人特异性决定区(SDR或a-CDR；对抗体-抗原相互作用至关重要的残基)移植到人架构和恒定区上，或者(c)移植整个非人可变结构域，但通过替换表面残基而用人样区段“隐藏”它们。人源化抗体及其制备方法在例如Almagro and Fransson,Front Biosci 13,1619-1633(2008)中综述，并且进一步描述于例如Riechmann等人,Nature 332,323-329(1988)；Queen等人,ProcNatl Acad Sci USA 86,10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Jones等人,Nature 321,522-525(1986)；Morrison等人,Proc Natl AcadSci 81,6851-6855(1984)；Morrison and Oi,Adv Immunol 44,65-92(1988)；Verhoeyen等人,Science 239,1534-1536(1988)；Padlan,Molec Immun 31(3),169-217(1994)；Kashmiri等人,Methods 36,25-34(2005)(描述了SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol Immunol28,489-498(1991)(描述了“表面再塑”)；Dall’Acqua等人,Methods 36,43-60(2005)(描述了“FR改组”)；以及Osbourn等人,Methods 36,61-68(2005)和Klimka等人,Br J Cancer83,252-260(2000)(描述了用于FR改组的“指导选择”方法)中。根据本发明的特定免疫球蛋白是人免疫球蛋白。可以使用本领域已知的各种技术来产生人抗体和人可变区。人抗体一般描述于van Dijk和van de Winkel,Curr Opin Pharmacol 5,368-74(2001)和Lonberg,Curr Opin Immunol 20,450-459(2008)中。人可变区可以形成通过杂交瘤方法制备的人单克隆抗体的一部分并衍生自该抗体(参见，例如Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。也可以通过以下方式来制备人抗体和人可变区：将免疫原施用于转基因动物，该转基因动物已被修饰以产生具有对抗原激发作出应答的人可变区的完整人抗体或完整抗体(参见例如Lonberg,Nat Biotech 23,1117-1125(2005))。也可通过以下方式来产生人抗体和人可变区：分离选自人来源的噬菌体展示文库的Fv克隆可变区序列(参见，例如Hoogenboom等人Methods in Molecular Biology 178,1-37(O’Brien等人,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2001)；以及McCafferty等人,Nature 348,552-554；Clackson等人,Nature 352,624-628(1991))。噬菌体通常将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或Fab片段。
在某些方面，根据例如在PCT公开WO 2012/020006(参见与亲和力成熟相关的实例)或美国专利申请公开号2004/0132066中公开的方法，包含在双特异性激动性CD28抗原结合分子中的抗原结合结构域被工程化以具有增强的结合亲和力。本发明的抗原结合分子与特定抗原决定簇结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术(例如表面等离子体共振技术(Liljeblad,等人,Glyco J 17,323-329(2000))以及传统的结合测定(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))来测量。竞争测定可用于鉴定与参考抗体竞争结合特定抗原的抗原结合分子。在某些实施例中，此类竞争抗原结合分子与由参考抗原结合分子结合的同一表位(例如，线性或构象表位)结合。用于定位抗原结合分子结合与之结合的表位的详细示例性方法提供于：Morris(1996)，“Epitope MappingProtocols”，出自Methods in Molecular Biology第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)。在示例性竞争测定中，将固定化抗原在包含与该抗原结合的第一标记抗原结合分子和正在测试其与第一抗原结合分子竞争结合该抗原的能力的第二未标记抗原结合分子的溶液中孵育。第二抗原结合分子可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定化抗原在包含第一标记抗原结合分子而非第二未标记抗原结合分子的溶液中孵育。在容许第一抗体与抗原结合的条件下孵育之后，去除过量未结合的抗体，并且测量与固定化抗原缔合的标记的量。若与固定化抗原缔合的标记的量相对于对照样品在测试样品中基本上减少，则表明第二抗原结合分子与第一抗原结合分子竞争结合抗原。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:ALaboratory Manual第14章(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
如本文所述制备的本发明的双特异性激动性CD28抗原结合分子可通过本领域已知的技术纯化，这些技术为例如高效液相色谱、离子交换色谱、凝胶电泳法、亲和色谱法、尺寸排阻色谱法等。用于纯化特定蛋白质的实际条件将部分取决于诸如净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且对于本领域技术人员而言将是显而易见的。对于亲和色谱法纯化，可以使用抗原结合分子结合的抗体、配体、受体或抗原。例如，对于本发明的抗原结合分子的亲和色谱法纯化，可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。基本上如实例中该，可使用顺序蛋白A或G亲和色谱和尺寸排阻色谱来分离抗原结合分子。CD28抗原结合分子或其片段的纯度可以通过多种众所周知的分析方法中的任一种来确定，该分析方法包括凝胶电泳法、高压液相色谱法等。例如，如实例中所述的表达的CD28抗原结合分子被证明为是完整并且适当组装，如还原和非还原SDS-PAGE所示。
测定
本文所提供的双特异性激动性CD28抗原结合分子的物理/化学性质和/或生物学活性可通过本领域已知的各种测定进行鉴定、筛选或表征。
1.亲和力测定
本文提供的抗原结合分子对相应靶标的亲和力可以根据实例中阐述的方法使用标准仪器如Proteon仪器(Bio-rad)通过表面等离子体共振(SPR)来测定，并且受体或靶蛋白如可通过重组表达获得。抗原结合分子对靶细胞抗原的亲和力也可以使用标准仪器如Proteon仪器(Bio-rad)通过表面等离子体共振(SPR)来测定，并且受体或靶蛋白如可通过重组表达获得。根据一个方面，在25℃使用
Figure BDA0004009238190000791
机器(Bio-Rad)通过表面等离子体共振来测量KD。
2.结合测定和其他测定
本文所提供的双特异性抗原结合分子与表达相应受体的细胞的结合可使用表达特定受体或靶抗原的细胞系通过流式细胞术(FACS)来评估。在一个方面，表达人CD28的CHO细胞(亲本细胞系CHO-k1 ATCC#CCL-61，经修饰以稳定过表达人CD28)用于结合测定。
在另一方面，表达Her2的癌细胞系(例如人乳腺癌细胞系KPL-4，川崎医科大学(Kawasaki Medical School))用于证明双特异性抗原结合分子与靶细胞抗原的结合。
3.活性测定
在一个方面，提供了用于鉴定其具有生物活性的CD28抗原结合分子的测定。生物活性可以包括，例如用实施例3中描述的方法测量的T细胞活化和细胞因子分泌或肿瘤细胞杀伤。还提供了在体内和/或体外具有此类生物活性的抗原结合分子。
药物组合物、制剂和施用途径
在进一步的方面，本发明提供了包含本文提供的双特异性激动性CD28抗原结合分子中任一者的药物组合物，其例如用于以下治疗方法中的任一者中。在一个实施例中，药物组合物包含本文提供的双特异性激动性CD28抗原结合分子和至少一种药学上可接受的赋形剂。在另一方面，药物组合物包含本文提供的双特异性激动性CD28抗原结合分子和如下文所述的至少一种另外的治疗剂。
本发明的药物组合物包含溶于或分散于药用赋形剂中的一种或多种双特异性抗原结合分子治疗有效量。短语“药物”或“药学上可接受”是指分子实体和组合物在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，即当视情况而定施用于动物(诸如例如人)时不产生不利的、过敏的或其他不良反应。含有至少一种双特异性激动性CD28抗原结合分子和任选的附加活性成分的药物组合物的制备将是鉴于本公开而为本领域的技术人员已知的，如由Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company,1990所示例的，该文献以引用方式并入本文。特别地，该组合物是冻干制剂或水溶液。如本文所用，“药用赋形剂”包括任何和所有溶剂、缓冲剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、盐、稳定剂及它们的组合，如对本领域的普通技术人员所知。
肠胃外组合物包括设计用于注射(例如，皮下、皮内、病灶内、静脉内、动脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射)的那些组合物。为了注射，可在水溶液中配制本发明的含TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，优选在生理相容性缓冲剂诸如Hanks溶液、林格氏溶液或生理盐水中配制。溶液可含有配制剂(formulatory agent)，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。另选地，双特异性激动性CD28抗原结合分子可以是粉末形式，用于在使用前用合适的载体)例如无菌无热原水)构建。根据需要，通过将本发明的融合蛋白以所需的量与下面列举的各种其他成分一起掺入适当的溶剂中，来制备无菌可注射溶液。例如，无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入含有基础分散介质和/或其他成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液、悬浮液或乳液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥或冻干技术，该真空干燥或冻干技术产生来自先前无菌过滤的液体介质的活性成分加上任何附加所需成分的粉末。如果需要的话，液体介质应适当缓冲，并且在注射之前应首先使用足够的盐水或葡萄糖来使液体稀释剂等渗。该组合物必须是在制造和贮存条件下稳定的，并且保存为抗诸如细菌和真菌等微生物的污染作用。应当理解，内毒素污染应以例如低于0.5ng/mg蛋白质的安全水平保持最低。合适的药用赋形剂包括但不限于：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的化合物，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、葡聚糖等。任选地，悬浮液还可含有合适的稳定剂或增大化合物溶解度的试剂，以允许制备高浓度溶液。另外，活性化合物的悬浮液可以制备成适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，诸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，诸如油酸乙酯或甘油三酯；或脂质体。
活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中；在胶体药物递送***(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中；或在粗乳液中。此类技术在Remington's Pharmaceutical Sciences(第18版，Mack Printing Company,1990)中公开。可以制备缓释制备物。缓释制备物的合适示例包括含有多肽的固态疏水聚合物的半透性基质，该基质是例如膜或微胶囊等成型制品的形式。在特定实施例中，可注射组合物的延长吸收可以通过在该组合物中使用延迟吸收的试剂(诸如例如单硬脂酸铝、明胶或它们的组合)来实现。本文的示例性药用赋形剂还包括间质药物分散剂，诸如可溶中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(
Figure BDA0004009238190000821
Baxter International,Inc.)。某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20，描述于美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中。在一个方面，将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶(诸如软骨素酶)组合。示例性的冻干抗体制剂描述于美国专利号6,267,958中。水性抗体制剂包括在美国专利号6,171,586和WO2006/044908中描述的那些，后一者中的制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲剂。除了先前描述的组合物之外，双特异性激动性CD28抗原结合分子也可以配制成长效制剂。此类长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内植入)或通过肌内注射施用。因此，例如，双特异性激动性CD28抗原结合分子可以用合适的聚合材料或疏水材料配制(例如作为可接受油中的乳液)或用离子交换树脂配制，或配制为微溶的衍生物，例如配制为微溶盐。
包含本发明的双特异性激动性CD28抗原结合分子的药物组合物可通过常规的混合、溶解、乳化、包封、包埋或冻干工艺进行制备。药物组合物可以使用一种或多种生理上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂以常规方式配制，该载体、稀释剂、赋形剂或助剂有助于将蛋白质加工成可以在药学上使用的制备物。适当的配方取决于所选择的施用途径。本发明的双特异性激动性CD28抗原结合分子可以配制成以游离酸或碱、中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐是基本上保留游离酸或碱的生物活性的盐。这些药用盐包括酸加成盐，例如用蛋白质性质组合物的游离氨基形成的酸加成盐，或用无机酸(诸如盐酸或磷酸)或有机酸(诸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸)形成的酸加成盐。用游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或者有机碱，诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因。与相应的游离碱形式相比，药用盐倾向于更易溶于水性和其他质子溶剂中。本文的组合物还可含有多于一种对于所治疗的特定适应症是必需的活性成分，优选是具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性成分。此类活性成分适当地以对预期目的有效的量组合存在。待用于体内施用的制剂通常是无菌的。例如，无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。
治疗方法和组合物
本文提供的双特异性激动性CD28抗原结合分子中任一者可单独或组合用于治疗方法中。
在一个方面，提供了用作药物的双特异性激动性CD28抗原结合分子。在进一步方面，提供了用于治疗癌症的双特异性激动性激动性CD28抗原结合分子。在某些方面，提供了用于治疗方法的双特异性激动性激动性CD28抗原结合分子。在某些方面，本文提供了用于治疗患有癌症的个体的方法中的双特异性激动性激动性CD28抗原结合分子，该方法包含向该个体施用治疗有效量的双特异性激动性激动性CD28抗原结合分子。在一个这样的实施例中，该方法进一步包含向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂。
在一方面，双特异性激动性CD28抗原结合分子用于抑制表达Her2的癌细胞的生长。因此，在特定方面，双特异性激动性CD28抗原结合分子用于治疗Her2阳性癌症。Her2阳性癌症的实例包括乳腺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、唾液腺癌、子宫内膜癌、胰腺癌和非小细胞肺癌(NSCLC)。在一个方面，Her2阳性癌症是Her2+阳性乳腺癌，例如早期或局部晚期Her2+阳性乳腺癌。因此，提供了用于治疗这些癌症的如本文所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子。需要治疗的对象、患者或“个体”通常是哺乳动物，更特别是人。
在某些方面，提供了用于治疗方法的双特异性激动性激动性CD28抗原结合分子。在某些方面，本文提供了用于治疗患有癌症的个体的方法中的双特异性激动性激动性CD28抗原结合分子，该方法包含向该个体施用治疗有效量的双特异性激动性激动性CD28抗原结合分子。在另一个方面，提供了用于治疗患有her2阳性癌症，特别是乳腺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、唾液腺、子宫内膜癌、胰腺癌和非小细胞肺癌(NSCLC)的个体的方法中的双特异性激动性CD28抗原结合分子，该方法包含向个体施用有效量的双特异性激动性CD28抗原结合分子。在一个这样的实施例中，该方法进一步包含向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂。
在进一步方面，本发明提供了如本文所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子在制造或制备药物中的用途。在一个实施例中，该药物用于癌症，特别是Her2阳性癌症的治疗。在进一步方面，该药物用于治疗癌症的方法，该方法包含向患有癌症的个体施用有效量的药物。在一个这样的方面，例如如下所描述的，该方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂。在另一个方面，该药物用于Her2阳性癌症的治疗。在进一步方面，该药物用于治疗癌症，特别是Her2阳性癌症的方法，该方法包含向患有癌症的个体施用有效量的药物。在进一步方面，本文提供了用于治疗癌症，特别是Her2阳性癌症的方法。在一个方面，该方法包含向患有癌症的个体施用有效量的双特异性激动性CD28抗原结合分子。在一个这样的方面，如下所描述的，该方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂。根据上述实施例中的任一实施例的“个体”可以是人。
在进一步方面，本文提供了包含本文报告的双特异性激动性CD28抗原结合分子中任一者的药物配方，其例如用于以上治疗方法中的任一者中。在一个方面，药物配方包含本文报告的双特异性激动性CD28抗原结合分子中任一者和药学上可接受的载体。在另一个方面，药物组合物包含本文报告的双特异性激动性CD28抗原结合分子中任一者和至少一种另外的治疗剂。
如本文报告的双特异性激动性CD28抗原结合分子可以单独使用或与治疗中的其他药剂组合使用。例如，本文报告的双特异性激动性CD28抗原结合分子可以与至少一种另外的治疗剂共同施用。因此，提供了如本文所述的用于癌症免疫疗法的双特异性激动性CD28抗原结合分子。在某些实施例中，提供了用于癌症免疫治疗方法的双特异性激动性CD28抗原结合分子。根据任一个上述方面例的“个体”优选是人。
上述这种组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在相同或单独的制剂中)和单独施用，在单独施用的情况下，本文报告的抗体的施用可以在施用另外的治疗剂或药剂之前、同时和/或之后进行。在一个方面，双特异性激动性CD28抗原结合分子的施用和附加治疗剂的施用彼此在约1个月内或在约1、2或3周内或在约1、2、3、4、5或6天内发生。
本文报告的抗原结合分子(和任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内，并且如果需要的话用于局部治疗、病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。投配可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短暂的还是长期的。本文考虑了各种投配时间安排，包括但不限于在各个时间点处的单次或多次施用、推注施用，以及脉冲输注。
本文报告的双特异性激动性CD28抗原结合分子将以符合良好医学实践的方式配制、给药和给药。在这种情况下需要考虑的因素包括所治疗的特定疾患、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、疾患的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用的时间安排，以及执业医师已知的其他因素。双特异性激动性CD28抗原结合分子不是必须的，而是任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所讨论的病症的药剂共同配制。此类其他药剂的有效量取决于所用制剂中存在的抗体的量、疾患或治疗的类型，以及上面讨论的其他因素。这些通常以与本文该相同的剂量和施用途径使用，或以本文该剂量的约1％至99％使用，或以任何剂量且通过经验/临床上确定为合适的任何途径使用。
为了预防或治疗疾病，本文所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病类型、抗体的类型、疾病的严重程度和病程、施用抗体用于预防还是治疗目的、先前疗法、患者的病史和对抗体的应答以及主治医师的酌情决定权。双特异性激动性CD28抗原结合分子适当地一次或在一系列治疗中施用于患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.5mg/kg-10mg/kg)的双特异性激动性CD28抗原结合分子可以是例如通过一次或多次单独施用或通过连续输注而施用于患者的初始候选剂量。取决于上述因素，一种典型的日剂量的范围可以为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于数天或更长时间的重复施用，取决于病症，治疗通常会持续直至发生所需的疾病症状抑制。抗体的一种示例性剂量的范围为约0.05mg/kg至约10mg/kg。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或它们的任何组合)的一种或多种剂量。此类剂量可以间歇施用，例如每周或每三周施用(例如，使得患者接受约两次至约二十次，或例如约六次剂量的抗体)。可施用初始较高负荷剂量，然后施用一种或多种较低剂量。然而，其他剂量方案可能有用。通过常规技术和测定可以容易地监测该疗法的进展。
其他药剂和治疗
如上文所述，本发明的双特异性激动性CD28抗原结合分子可在治疗中与一种或多种其他药剂联合施用。例如，本发明的抗原结合分子可以与至少一种另外的治疗剂共同施用。术语“治疗剂”包括可以施用用于治疗需要此类治疗的个体的症状或疾病的任何药剂。此类附加治疗剂可包含适合于所治疗的具体适应症的任何活性成分，优选地是具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性成分。在某些实施例中，另外的治疗剂是另一种抗癌剂，例如微管破坏剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、DNA嵌入剂、烷化剂、激素疗法、激酶抑制剂、受体拮抗剂、肿瘤细胞凋亡活化剂，或抗血管生成剂。在某些方面，附加治疗剂为免疫调节剂、细胞生长抑制剂、细胞粘附抑制剂、细胞毒性剂或细胞抑制剂、细胞凋亡活化剂或增加细胞对细胞凋亡诱导剂的敏感性的药剂。
因此，提供了本发明的双特异性激动性CD28抗原结合分子或包含它们的药物组合物，用于治疗癌症，其中该双特异性抗原结合分子与化疗剂、放射和/或用于癌症免疫疗法的其他药剂联合施用。
此类其他药剂适当地以对预期目的有效的量组合存在。此类其他药剂的有效量取决于所用融合蛋白的量、疾患或治疗的类型，以及上面讨论的其他因素。本发明的双特异性抗原结合分子或抗体通常以与本文所述相同的剂量和施用途径，或本文所述剂量的约1％至99％，或以任何剂量且通过经验/临床上确定为合适的途径使用。上述此类联合疗法涵盖联合施用(其中两种或更多种治疗剂被包含在同一组合物或分开的组合物中)，以及分开施用，在分开施用的情况下，本发明的双特异性抗原结合分子或抗体的施用可以在施用附加治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后发生。
在进一步方面，提供了用于治疗癌症，特别是Her2阳性癌症的如上文所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中该双特异性抗原结合分子与另一免疫调节剂联合施用。术语“免疫调节剂”是指影响免疫***的任何物质，包括单克隆抗体。本发明的分子可被认为是免疫调节剂。免疫调节剂可用作治疗癌症的抗肿瘤剂。在一个方面，免疫调节剂包括但不限于抗CTLA4抗体(例如，伊匹单抗)、抗PD1抗体(例如，纳武单抗或帕博利珠单抗)、PD-L1抗体(例如，阿特珠单抗、阿维单抗或德瓦鲁单抗)、OX-40抗体、4-1BB抗体和GITR抗体。上述此类联合疗法涵盖联合施用(其中两种或更多种治疗剂被包含在同一组合物或分开的组合物中)，以及分开施用，在分开施用的情况下，双特异性抗原结合分子的施用可以在施用另外的治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后进行。
与T细胞双特异性抗体组合
在一个方面，本发明的双特异性激动性CD28抗原结合分子可以与T细胞活化性抗CD3双特异性抗体组合施用。在一个方面，对肿瘤相关抗原具有特异性的T细胞活化性抗CD3双特异性抗体是抗Her2/抗CD3双特异性抗体。在一方面，包含至少一个能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域的双特异性激动性CD28抗原结合分子适合与抗Her2/抗CD3双特异性抗体组合施用。在一个方面，抗Her2/抗CD3抗体包含与CD3特异性结合的第一抗原结合结构域和与Her2特异性结合的第二抗原结合结构域。在一个特定方面，与Her2结合的第二结合结构域与Her2上的不同于含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子所结合者的表位结合。
在一个方面，如本文所用的抗Her2/抗CD3双特异性抗体包含第一抗原结合结构域，其包含重链可变区(VHCD3)和/或轻链可变区(VLCD3)，该重链可变区包含SEQ ID NO:148的CDR-H1序列、SEQ ID NO:149的CDR-H2序列和SEQ ID NO:150的CDR-H3序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:151的CDR-L1序列、SEQ ID NO:152的CDR-L2序列和SEQ ID NO:153的CDR-L3序列。更具体地，抗Her2/抗CD3双特异性抗体包含第一抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:154的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的重链可变区(VHCD3)和/或与SEQ ID NO:155的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的轻链可变区(VLCD3)。在进一步方面，抗Her2/抗CD3双特异性抗体包含重链可变区(VHCD3)和/或轻链可变区(VLCD3)，该重链可变区包含SEQ ID NO:154的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列。
在一个方面，抗Her2/抗CD3双特异性抗体包含第二抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域与抗体4D5(其人源化版本称为曲妥珠单抗)结合相同的表位。在另一个方面，抗Her2/抗CD3双特异性抗体包含第二抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域与抗体2C4(其人源化版本称为帕妥珠单抗)结合相同的表位。在又一方面，抗Her2/抗CD3双特异性抗体包含与抗体7C2(美国专利号9518118)结合相同表位的第二抗原结合结构域。
在另一方面，抗Her2/抗CD3双特异性抗体包含第二抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域包含(a)重链可变区(VHHer2)和/或轻链可变区(VLHer2)，该重链可变区包含SEQID NO:140的CDR-H1序列、SEQ ID NO:141的CDR-H2序列和SEQ ID NO:142的CDR-H3序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:143的CDR-L1序列、SEQ ID NO:144的CDR-L2序列和SEQ ID NO:145的CDR-L3序列，或(b)重链可变区(VHHer2)和/或轻链可变区(VLHer2)，该重链可变区包含SEQ ID NO:132的CDR-H1序列、SEQ ID NO:133的CDR-H2序列和SEQ ID NO:134的CDR-H3序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:135的CDR-L1序列、SEQ ID NO:136的CDR-L2序列和SEQID NO:137的CDR-L3序列，或(c)重链可变区(VHHer2)和/或轻链可变区(VLHer2)，该重链可变区包含SEQ ID NO:156的CDR-H1序列、SEQ ID NO:157的CDR-H2序列和SEQ ID NO:158的CDR-H3序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:159的CDR-L1序列、SEQ ID NO:160的CDR-L2序列和SEQ ID NO:161的CDR-L3序列。
在一个方面，抗Her2/抗CD3双特异性包含第二抗原结合结构域，其包含与SEQ IDNO:146的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的重链可变区(VHHer2)和/或与SEQ ID NO:147的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的轻链可变区(VLHer2)。在进一步的方面，抗Her2/抗CD3双特异性包含第二抗原结合结构域，其包括包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的重链可变区(VHHer2)和/或包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的轻链可变区(VLHer2)。
在一个方面，抗Her2/抗CD3双特异性抗体包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:154的氨基酸序列的重链可变区(VHCD3)和/或包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列的轻链可变区(VLCD3)；该第二抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的重链可变区(VHHer2)和/或包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的轻链可变区(VLHer2)。
在一个方面，抗Her2/抗CD3双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:174的氨基酸序列的第一重链、和/或含有SEQ ID NO:175的氨基酸序列的第一轻链、和含有SEQ ID NO:176的氨基酸序列的第二重链以及含有SEQ ID NO:177的氨基酸序列的第二轻链(HER2 TDB)。
在另一个方面，抗Her2/抗CD3双特异性包含第二抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:138的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的重链可变区(VHHer2)和/或与SEQ ID NO:139的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的轻链可变区(VLHer2)。在进一步的方面，抗Her2/抗CD3双特异性包含第二抗原结合结构域，其包括包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的重链可变区(VHHer2)和/或包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列的轻链可变区(VLHer2)。在另一个方面，抗Her2/抗CD3双特异性包含第二抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:162的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的重链可变区(VHHer2)和/或与SEQ IDNO:163的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的轻链可变区(VLHer2)。在进一步的方面，抗Her2/抗CD3双特异性包含第二抗原结合结构域，其包括包含SEQ IDNO:162的氨基酸序列的重链可变区(VHHer2)和/或包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列的轻链可变区(VLHer2)。
在一个方面，抗Her2/抗CD3双特异性抗体包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:154的氨基酸序列的重链可变区(VHCD3)和/或包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列的轻链可变区(VLCD3)；该第二抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的重链可变区(VHHer2)和/或包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列的轻链可变区(VLHer2)。
在进一步方面，双特异性激动性CD28抗原结合分子与T细胞活化抗CD3双特异性抗体联合使用，并且T细胞活化抗CD3双特异性抗体与双特异性激动性CD28抗原结合分子同时施用或在该抗原结合分子之前或之后施用。
在进一步方面，提供了双特异性激动性CD28抗原结合分子在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中双特异性激动性CD28抗原结合分子与T细胞活化抗CD3双特异性抗体，特别是抗Her2/抗CD3双特异性抗体联合使用。在某些方面，待治疗的疾病是Her2阳性癌症。Her2阳性癌症的实例包括乳腺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、唾液腺癌、子宫内膜癌、胰腺癌和非小细胞肺癌(NSCLC)。在某些方面，待治疗的癌症是Her2阳性乳腺癌，特别是Her2阳性转移性乳腺癌。
在进一步方面，本发明提供了治疗个体重的癌症的方法，该方法包含向该个体施用治疗有效量的双特异性激动性CD28抗原结合分子和有效量的T细胞活化抗CD3双特异性抗体，特别是如上定义的抗Her2/抗CD3双特异性抗体。在某些方面，该方法用于Her2阳性癌症的治疗。Her2阳性癌症的实例包括乳腺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、唾液腺癌、子宫内膜癌、胰腺癌和非小细胞肺癌(NSCLC)。在一个方面，该方法用于治疗Her2阳性转移性乳腺癌。
在另一个方面，提供了组合产品，其包含如本文所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子和T细胞活化性抗CD3双特异性抗体。在一个方面，对肿瘤相关抗原具有特异性的T细胞活化性抗CD3双特异性抗体是抗Her2/抗CD3双特异性抗体。
与阻断PD-L1/PD-1相互作用的药剂组合
在一方面，本发明的双特异性激动性CD28抗原结合分子可以与阻断PD-L1/PD-1相互作用的药剂如PD-L1结合拮抗剂或PD-1结合拮抗剂，特别是抗PD-L1抗体或抗PD-1抗体联合施用。
在一个方面，阻断PD-L1/PD-1相互作用的药剂是抗PD-L1抗体。术语“PD-L1”也称为CD274或B7-H1，是指来自任何脊椎动物来源的任何天然PD-L1，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，特别是指“人PD-L1”。完整人PD-L1的氨基酸序列示出于UniProt(www.uniprot.org)登录号Q9NZQ7(SEQ ID NO:164)中。术语“PD-L1结合拮抗剂”是指减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L1与其一种或多种结合配偶体(诸如PD-1、B7-1)相互作用产生的信号传导的分子。在一些方面，PD-L1结合拮抗剂是抑制PD-L1与其结合配偶体的结合的分子。在具体方面，PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1至PD-1和/或B7-1的结合。在一些方面，PD-L1结合拮抗剂包括抗PD-L1抗体，其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白、寡肽和其他减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L1与其一个或多个结合配偶体(诸如PD-1、B7-1)相互作用产生的信号传导的分子。在一个方面，PD-L1结合拮抗剂减少由或通过T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白介导的通过PD-L1的信号传导所介导的负共刺激信号，从而使功能障碍的T细胞功能障碍较少(例如，增强对抗原识别的效应子应答)。特别地，PD-L1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。术语“抗PD-L1抗体”或“与人PD-L1结合的抗体”或“与人PD-L1特异性结合的抗体”或“拮抗性抗PD-L1”是指与人PD-L1抗原特异性结合的抗体，其结合亲和力KD值为1.0×10-8mol/L或更低，并且在一个方面，KD值为1.0×10-9mol/L或更低。使用标准结合测定(诸如表面等离子体共振技术(
Figure BDA0004009238190000921
GE-Healthcare Uppsala，瑞典))来确定结合亲和力。在一个特定方面，阻断PD-L1/PD-1相互作用的药剂是抗PD-L1抗体。在一个特定方面，抗PD-L1抗体选自由阿特珠单抗(MPDL3280A、RG7446)、德瓦鲁单抗(MEDI4736)、阿维单抗(MSB0010718C)和MDX-1105组成的组。在具体方面，抗PD-L1抗体为本文该的YW243.55.S70。在另一具体方面，抗PD-L1抗体为本文该的MDX-1105。在仍另一具体方面，抗PD-L1抗体为MEDI4736(德瓦鲁单抗)。在再进一步的方面，抗PD-L1抗体为MSB0010718C(阿维单抗)。更具体地，阻断PD-L1/PD-1相互作用的药剂是阿特珠单抗(MPDL3280A)。在另一个方面，阻断PD-L1/PD-1相互作用的药剂是抗PD-L1抗体，其包含SEQ ID NO:165的重链可变结构域VH(PDL-1)和SEQ ID NO:166的轻链可变结构域VL(PDL-1)。在另一个方面，阻断PD-L1/PD-1相互作用的药剂是抗PD-L1抗体，其包含SEQ ID NO:167的重链可变结构域VH(PDL-1)和SEQ ID NO:168的轻链可变结构域VL(PDL-1)。
术语“PD-1”，也称为CD279、PD1或程序性细胞死亡蛋白1，是指来自任何脊椎动物来源的任何天然PD-L1，该脊椎动物来源包括哺乳动物例如灵长类(如人)、非人灵长类(如食蟹猴)和啮齿动物(如小鼠和大鼠)，特别是具有UniProt(www.uniprot.org)保藏号Q15116(SEQ ID NO:1691)所示氨基酸序列的人蛋白PD-1。术语“PD-1结合拮抗剂”是指抑制PD-1与其配体结合配偶体结合的分子。在一些实施例中，PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L1的结合。在一些实施例中，PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L2的结合。在一些实施例中，PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L1和PD-L2两者的结合。特别地，PD-L1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。术语“抗PD-1抗体”或“与人PD-1结合的抗体”或“与人PD-1特异性结合的抗体”或“拮抗性抗PD-1”是指与人PD1抗原特异性结合的抗体，其结合亲和力KD值为1.0×10-8mol/l或更低，在一个方面，KD值为1.0×10-9mol/l或更低。使用标准结合测定(诸如表面等离子体共振技术(
Figure BDA0004009238190000931
GE-Healthcare Uppsala，瑞典))来确定结合亲和力。在一个方面，阻断PD-L1/PD-1相互作用的药剂是抗PD-1抗体。在一个特定的方面，抗PD-1抗体选自由MDX1106(纳武单抗)、MK-3475(派姆单抗)、CT-011(匹利珠单抗)、MEDI-0680(AMP-514)、PDR001、REGN2810和BGB-108组成的组，尤其选自派姆单抗和纳武单抗。在另一个方面，阻断PD-L1/PD-1相互作用的药剂是抗PD-L1抗体，其包含SEQ ID NO:170的重链可变结构域VH(PDL-1)和SEQ ID NO:171的轻链可变结构域VL(PDL-1)。在另一个方面，阻断PD-L1/PD-1相互作用的药剂是抗PD-L1抗体，其包含SEQ ID NO:172的重链可变结构域VH(PDL-1)和SEQID NO:173的轻链可变结构域VL(PDL-1)。
在另一个方面，提供了组合产品，其包含如本文所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子和阻断PD-L1/PD-1相互作用的药剂，例如PD-L1结合拮抗剂或PD-1结合拮抗剂，特别是抗PD-L1抗体或抗PD-1抗体。
上述此类组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在相同或单独的制剂中)和单独施用，在单独施用的情况下，治疗剂的施用可以在施用另外的治疗剂或药剂之前、同时和/或之后进行。在一个实施例中，治疗剂的施用和另外的治疗剂的施用在彼此相距约1个月内，或在约1周、2周或3周内，或在约1天、2天、3天、4天、5天或6天内进行。
制品
在本发明的另一方面中，提供了一种制品，其含有可用于治疗、预防和/或诊断上述疾患的物质。该制品包括容器和在该容器上或与该容器相关的标签或包装插页(packageinsert)。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、静脉注射(IV)溶液袋等。该容器可以由诸如玻璃或塑料等多种材料形成。该容器容纳组合物，该组合物单独或与另一种有效用于治疗、预防和/或诊断该病症的组合物组合，并且该容器可具有无菌入口(例如该容器可以是静脉注射溶液袋或具有可用皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的双特异性激动性CD28抗原结合分子。标签或包装插页指示该组合物用于治疗所选择的病症。此外，制品可包含(a)第一容器，该第一容器中含有包含本发明的双特异性激动性CD28抗原结合分子的组合物；和(b)第二容器，该第二容器中包含组合物，该组合物包含另外的细胞毒性剂或其他治疗剂。本发明该实施例中的制品还可包含包装插页，该包装插页指示该组合物可用于治疗特定病症。可替代地或另外地，该制品还可包含第二(或第三)容器，该第二(或第三)容器包含药用缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。制品还可以包括从商业和用户角度所需的其他物质，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
表B(序列)：
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Figure BDA0004009238190001181
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Figure BDA0004009238190001201
关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息给出于：Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中。根据如上所定义的根据Kabat(Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))的编号***来对抗体链的氨基酸进行编号和引用。
以下编号的段落描述了本发明的各方面：
1.一种双特异性激动性CD28抗原结合分子，其特征在于与CD28单价结合，所述双特异性激动性CD28抗原结合分子包含
(a)能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域，
(b)能够与抗原结合结构域特异性结合的第二抗原结合结构域，该抗原结合结构域能够与人表皮生长因子受体-2(Her2)特异性结合，以及
(c)由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域，该第一亚基和第二亚基包含一个或多个氨基酸取代，该一个或多个氨基酸取代降低抗原结合分子与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能，
其中能够与Her2特异性结合的该第二抗原结合结构域包含
(i)重链可变区(VHHer2)和轻链可变区(VLHer2)，该重链可变区包含以下的重链互补决定区：SEQ ID NO:2的CDR-H1、SEQ ID NO:3的CDR-H2和SEQ ID NO:4的CDR-H3，该轻链可变区包含以下的轻链互补决定区：SEQ ID NO:5的CDR-L1、SEQ ID NO:6的CDR-L2和SEQID NO:7的CDR-L3；或
(ii)重链可变区(VHHer2)和轻链可变区(VLHer2)，该重链可变区包含以下的重链互补决定区：SEQ ID NO:10的重链互补决定区CDR-H1、SEQ ID NO:11的CDR-H2和SEQ IDNO:12的CDR-H3，该轻链可变区包含以下的轻链互补决定区：SEQ ID NO:13的CDR-L1、SEQID NO:14的CDR-L2和SEQ ID NO:15的CDR-L3。
2.根据段落1所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中Fc结构域包含人IgG1亚类并且包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G(根据Kabat EU索引编号)。
3.根据段落1或2所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域包含
(i)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含以下的重链互补决定区：SEQ ID NO:26的CDR-H1、SEQ ID NO:27的CDR-H2和SEQ ID NO:28的CDR-H3，该轻链可变区包含以下的轻链互补决定区：SEQ ID NO:29的CDR-L1、SEQ ID NO:30的CDR-L2和SEQ ID NO:31的CDR-L3；或
(ii)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:18的CDR-H1、SEQ ID NO:19的CDR-H2和SEQ ID NO:20的CDR-H3，该轻链可变区包含SEQ IDNO:21的CDR-L1、SEQ ID NO:22的CDR-L2和SEQ ID NO:23的CDR-L3。
4.根据段落1至3中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
5.根据段落1至4中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，所述重链可变区包含选自由SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41组成的组的氨基酸序列，所述轻链可变区包含选自由SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:42、SEQID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQID NO:49、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51组成的组的氨基酸序列。
6.根据段落1至3或5中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域包含
(a)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，或
(b)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，或
(c)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，或
(d)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，或
(e)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，或
(f)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，或
(g)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，或
(h)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，或
(i)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，或
(j)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，或
(k)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
7.根据段落1至6中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域包含(i)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，该重链可变区包含以下的重链互补决定区：SEQ ID NO:52的CDR-H1、SEQ ID NO:53的CDR-H2和SEQ ID NO:54的CDR-H3，该轻链可变区包含以下的轻链互补决定区：SEQ IDNO:55的CDR-L1、SEQ ID NO:56的CDR-L2和SEQ ID NO:57的CDR-L3。
8.根据段落1至6中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD28)的CDR和轻链可变区(VLCD28)的CDR，所述重链可变区包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。
9.根据段落1至8中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区(VHHer2)的CDR和包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链可变区(VLHer2)的CDR。
10.根据段落1至9中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区(VHHer2)和包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链可变区(VLHer2)。
11.根据段落1至8中任一项该的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链可变区(VHHer2)的CDR和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链可变区(VLHer2)的CDR。
12.根据段落1至8或11中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链可变区(VHHer2)和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链可变区(VLHer2)。
13.根据段落1至12中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域和/或能够与Her2特异性结合的第二抗原结合结构域是Fab分子。
14.根据段落1至13中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换或恒定结构域CL和CH1彼此替换，特别是可变结构域VL和VH彼此替换。
15.根据段落1至14中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与Her2特异性结合的第二抗原结合结构域是常规Fab分子。
16.根据段落1至15中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与Her2特异性结合的第二抗原结合结构域是Fab分子，其中在恒定结构域CL中第123位(根据Kabat EU索引编号)氨基酸被选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)的氨基酸取代，并且第124位(根据Kabat EU索引编号)氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代，其中在恒定结构域CH1中，第147位(根据Kabat EU索引编号)氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代，并且第213位(根据Kabat EU索引编号)氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)。
17.根据段落1至16中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其包含
(i)含有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的第一轻链、含有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的第二重链和含有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的第二轻链，或
(ii)含有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的第一轻链、含有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:98的氨基酸序列的第二重链和含有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的第二轻链，或
(iii)含有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的第一轻链、含有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:101的氨基酸序列的第二重链和含有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的第二轻链。
18.根据段落1至13中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与Her2特异性结合的第二抗原结合结构域为Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换或恒定结构域CL和CH1彼此替换，特别是所述可变结构域VL和VH彼此替换。
19.根据段落1至13或18中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域是常规Fab分子。
20.根据段落1至13或18或19中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域是Fab分子，其中在恒定结构域CL中，第123位(根据Kabat EU索引编号)氨基酸被选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)的氨基酸取代，并且第124位(根据Kabat EU索引编号)氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代，其中在恒定结构域CH1中，第147位(根据Kabat EU索引编号)氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代，并且第213位(根据Kabat EU索引编号)氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)。
21.根据段落1至13或18至20中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其包含
(i)含有SEQ ID NO:83的氨基酸序列的第一轻链、含有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:99的氨基酸序列的第二重链和含有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的第二轻链，或
(ii)含有SEQ ID NO:83的氨基酸序列的第一轻链、含有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的第二重链和含有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的第二轻链。
22.根据段落1至21中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域各自为Fab分子，并且Fc结构域由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成；并且其中(i)所述第一抗原结合结构域在所述Fab重链的C末端与所述Fc结构域的第一亚基的N末端融合，并且所述第二抗原结合结构域在所述Fab重链的C末端与所述Fc结构域的第二亚基的N末端融合，或(ii)所述第二抗原结合结构域在所述Fab重链的C末端与所述Fc结构域的第一亚基的N末端融合，并且所述第一抗原结合结构域在所述Fab重链的C末端与所述Fc结构域的第二亚基的N末端融合。
23.根据段落1至22中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中Fc结构域包含促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的杵臼结构修饰。
24.根据段落1至23中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W(EU编号)，并且Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。
25.一种或多种分离的多核苷酸，其编码根据段落1至24中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子。
26.一种或多种载体，特别是表达载体，所述载体包含根据段落25所述的多核苷酸。
27.一种宿主细胞，其包含根据段落25所述的多核苷酸或根据段落26所述的载体。
28.一种产生双特异性激动性CD28抗原结合分子的方法，其包含以下步骤：a)在适合于表达所述双特异性激动性CD28抗原结合分子的条件下培养根据段落27所述的宿主细胞，和b)任选地回收所述双特异性激动性CD28抗原结合分子。
29.一种双特异性激动性CD28抗原结合分子，其通过根据段落28所述的方法产生。
30.一种药物组合物，其包含根据段落1至24中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子和至少一种药学上可接受的赋形剂。
31.根据段落1至24中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子或根据段落30所述的药物组合物，其用作药物。
32.根据段落1至24中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子或根据段落30所述的药物组合物，其用用于增强(a)T细胞活化或(b)T细胞效应子功能。
33.根据段落1至24中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子或根据段落30所述的药物组合物，其用于癌症的治疗。
34.根据段落33所述的用途的双特异性激动CD28抗原结合分子或药物组合物，其中所述疾病是癌症。
35.根据段落1至24中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子或根据段落30所述的药物组合物，其用于癌症的治疗，其中所述用途是与化疗剂、放射疗法和/或用于癌症免疫疗法的其他药剂联合施用。
36.根据段落1至24中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子或根据段落30所述的药物组合物，其用于癌症的治疗，其中所述用途是与T细胞活化性抗CD3双特异性抗体联合施用。
37.根据段落1至24中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子或段落30所述的药物组合物，其用于癌症的治疗，其中所述用途是与抗PD-L1抗体或抗PD-1抗体联合施用。
38.根据段落1至24中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子或根据段落30所述的药物组合物在制备用于治疗疾病，特别是治疗癌症的药物中的用途。
39.一种治疗个体中的疾病，特别是癌症的方法，其包含向所述个体施用有效量的根据段落1至24中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子或根据段落30所述的药物组合物。
40.根据段落39所述的方法，其进一步包含与化疗剂、放射疗法和/或用于癌症免疫疗法的其他药剂，特别是T细胞活化抗CD3双特异性抗体或抗PD-L1抗体或抗PD-1抗体联合施用。
***
实例
以下是本发明的方法和组合物的实例。应当理解，在给出以上提供的一般描述的情况下，可以实践各种其他实施例。
重组DNA技术
使用标准方法来操纵DNA，如在Sambrook等人，Molecular cloning:A laboratorymanual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中该。根据制造商的说明来使用分子生物学试剂。关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息在以下参考文献中给出：Kabat,E.A.等人，(1991)Sequences of Proteinsof Immunological Interest，第五版，NIH Publication No 91-3242。
DNA测序
通过双链测序确定DNA序列。
基因合成
在需要时，通过使用适当模板进行PCR生成所需的基因区段，或在Geneart Ag(德国雷根斯堡)或Genscript(美国新泽西州)通过自动化基因合成从合成寡核苷酸和PCR产物合成所需的基因区段。将侧接有单个限制性内切酶切割位点的基因区段克隆到标准克隆/测序载体中。从转化的细菌中纯化出质粒DNA，并通过紫外光谱法确定浓度。通过DNA测序来确认亚克隆基因片段的DNA序列。设计具有合适限制性位点的基因区段，以允许亚克隆到相应的表达载体中。所有构建体均设计有5’端DNA序列，该序列编码前导肽，该前导肽靶向真核细胞分泌的蛋白。
细胞培养技术
使用如在Current Protocols in Cell Biology(2000),Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.和Yamada,K.M.(编辑)，John Wiley&Sons,Inc中该的标准细胞培养技术。
蛋白纯化
参照标准方案从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白质。简言之，将抗体施加至蛋白A琼脂糖柱(GE healthcare)并用PBS洗涤。在pH 2.8下实现抗体的洗脱，之后立即中和样品。通过尺寸排阻色谱法(Superdex 200，GE Healthcare)在PBS中或在20mM组氨酸、150mM NaCl pH 6.0中将聚集的蛋白与单体抗体分离。将单体抗体级分合并，使用例如MILLIPORE Amicon Ultra(30MWCO)离心浓缩器浓缩(若需要)，冷冻并储存在-20℃或-80℃下。提供样品的部分以例如通过SDS-PAGE、尺寸排阻色谱(SEC)或质谱法来进行后续的蛋白质分析和分析表征。
SDS-PAGE
根据制造商的说明使用
Figure BDA0004009238190001291
预制凝胶***(Invitrogen)。特别地，使用10％或4-12％
Figure BDA0004009238190001292
Bis-TRIS预制凝胶(pH 6.4)和
Figure BDA0004009238190001301
MES(还原凝胶，具有
Figure BDA0004009238190001302
抗氧化剂电泳缓冲添加剂)或MOPS(非还原凝胶)电泳缓冲液。
分析尺寸排阻色谱法
通过HPLC色谱法执行用于测定抗体的聚集和寡聚状态的尺寸排阻色谱法(SEC)。简而言之，将蛋白A纯化的抗体施加至Agilent HPLC 1100***上的300mM NaCl、50mMKH2PO4/K2HPO4，pH 7.5中的Tosoh TSKgel G3000SW柱，或施加至Dionex HPLC***上的2×PBS中的Superdex 200柱(GE Healthcare)。通过UV吸光度和峰面积积分来定量洗脱的蛋白。将BioRad凝胶过滤标准品151-1901用作标准品。
质谱法
本节描述了对具有VH/VL交换(VH/VL CrossMab)的多特异性抗体的表征，重点在于该多特异性抗体的正确装配。通过对脱糖基化的完整CrossMab和脱糖基化/纤溶酶消化或者脱糖基化/限制性LysC消化的CrossMab进行电喷雾电离质谱(ESI-MS)，来分析预期的一级结构。
在37℃下以1mg/ml的蛋白质浓度将VH/VL CrossMab用磷酸盐或Tris缓冲液中的N-糖苷酶F脱糖基化至多17h。纤溶酶消化或有限的LysC(罗氏)消化用pH 8的Tris缓冲液中的100μg去糖基化的VH/VL CrossMab分别在室温执行120小时和在37℃执行40min。在质谱法之前，将样品经由HPLC在Sephadex G25柱(GE Healthcare)上脱盐。在配备有TriVersaNanoMate源(Advion)的maXis 4G UHR-QTOF MS***(Bruker Daltonik)上经由ESI-MS来测定总质量。
使用表面等离子体共振(SPR)测定多特异性抗体对相应抗原的结合亲和力(BIACORE)
通过使用BIACORE仪器(GE Healthcare Biosciences AB，Uppsala,Sweden)进行表面等离子体共振来研究产生的抗体与相应抗原的结合。简言之，对于亲和力测量，山羊抗人IgG、JIR 109-005-098抗体通过胺偶联固定在CM5芯片上，用于针对相应抗原呈递抗体。在HBS缓冲液(HBS-P(10mM HEPES，150mM NaCl，0.005％Tween 20，ph 7.4)中、在25℃(或替代性地在37℃)测量结合。在溶液中加入不同浓度的抗原(R&D***或内部纯化)。通过注射抗原80秒至3分钟来测量关联性；通过用HBS缓冲液洗涤芯片表面3-10分钟来测量解离，并且使用1:1的朗缪尔结合模型来估计KD值。从样品曲线中减去负控制数据(如缓冲曲线)，用于校正***固有基线漂移和降低噪声信号。使用相应的Biacore评估软件来分析传感图和计算亲和力数据。
实例1
靶向CD28和人表皮生长因子受体2(Her2)的双特异性抗原结合分子的产生和制备
1.1靶向CD28和人表皮生长因子受体2(Her2)的双特异性抗原结合分子的克隆
抗原的克隆：
将编码人CD28(Uniprot:P10747)胞外域(成熟蛋白的氨基酸1-134)的DNA片段***两个不同的哺乳动物受体载体的框架中，该载***于用作溶解度和纯化标签的编码humIgG1 Fc片段的片段的上游。其中一种表达载体在Fc区含有“臼”突变，另一个含有“杵”突变以及C末端avi标签(GLNDIFEAQKIEWHE，SEQ ID No:88)，允许在与Bir A生物素连接酶共表达期间进行特异性生物素化。另外，两种Fc片段都含有PG-LALA突变。将两种载体与编码BirA生物素连接酶的质粒组合共转染，以获得在Fc杵链的C末端具有单价生物素化avi标签的二聚体CD28-Fc构建体。
没有热点且亲和力降低的CD28(SA)变体的生成和表征
WO 2006/050949中描述了具有包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VH和包含SEQID NO:25的氨基酸序列的VL的CD28超原性抗体(SA)。
去除未配对的半胱氨酸残基、色氨酸残基、脱酰胺位点和产生亲和力降低的CD28 (SA)变体
作为我们详细结合物表征的一部分，对CD28(SA)可变结构域序列进行了计算分析。该分析揭示了VH的CDR2区(第50位，Kabat编号)中的未配对半胱氨酸、VH的CDR3(第100a位，Kabat编号)和VL的CDR1(第32位，Kabat编号)中的色氨酸残基，以及VH的CDR2(第56位，Kabat编号)中潜在的天冬酰胺脱酰胺位点。虽然色氨酸的氧化是一个相当缓慢的过程，并且可以通过添加还原化合物来防止，但抗体可变结构域中未配对半胱氨酸的存在可能是至关重要的。游离半胱氨酸具有反应性，可以与其他蛋白质或细胞或培养基成分的其他未配对半胱氨酸形成稳定的键。因此，这可能导致具有未知修饰的异质且不稳定的产品，这些修饰具有潜在的免疫原性，因此可能对患者构成风险。此外，天冬酰胺的脱酰胺作用和由此产生的异天冬氨酸和琥珀酰亚胺的形成会影响体外稳定性和体内生物学功能。亲本鼠结合物5.11A的晶体结构分析表明，C50不参与与人CD28的结合，因此可以被类似的氨基酸如丝氨酸替代，而不影响与CD28的亲和力。然而，色氨酸残基以及第50位的天冬酰胺都靠近或参与结合界面，因此用相似的氨基酸替代会导致结合亲和力降低。在本实例中，我们特别旨在降低CD28(SA)对人CD28的亲和力，原因如下：CD28(SA)的亲和力在1-2nM范围内，结合半衰期约为32分钟。当静脉注射到患者体内时，这种强大的亲和力会导致含有大量表达CD28的细胞的组织(例如血液和淋巴组织)产生下沉效应。结果，通过靶向组分对化合物的位点特异性靶向可能会降低，并且构建体的功效可能会降低。为了使这种影响最小化，产生了几种VH和VL变体，以将亲和力降低到不同程度(图2A和2C)。除了前面提到的代表潜在稳定性热点的位置外，直接或间接参与与人CD28结合的其他残基被原始鼠种系氨基酸或类似氨基酸取代。此外，CD28(SA)VL和VH的CDR也被移植到曲妥珠单抗各自的框架序列中(图2B和2D)。然后将VH和VL变体的几种组合表达为单价单臂抗CD28 IgG样构建体，并通过SPR表征结合。
通过SPR分析减少的单臂抗CD28变体的解离速率常数(koff)
为了在第一步中表征抗CD28结合物变体，所有结合物均表示为单价单臂IgG样构建体(图1A)。选择这种形式是为了以1:1模型表征与CD28的结合。转染HEK细胞5天后，收集上清液并测定表达构建体的效价。
使用ProteOn XPR36仪器(Biorad)在25℃下通过表面等离子体共振(SPR)测量测定抗CD28结合物变体的解离率，其中生物素化的huCD28-Fc抗原通过neutravidin捕获固定在NLC芯片上。对于重组抗原(配体)的固定，huCD28-Fc用PBST(含吐温20的磷酸盐缓冲盐水，由10mM磷酸盐、150mM氯化钠pH 7.4、0.005％吐温20组成)稀释至浓度范围为100nM至500nM，然后在不同的接触时间以25μl/分钟的速度注射。这导致垂直方向的固定水平在1000到3000响应单位(RU)之间。
对于单次动力学测量，将注入方向改变为水平取向。根据产生的上清液的效价，用PBST稀释单价单臂IgG，以得到100nM至6.25nM的两倍稀释系列。沿单独的通道1-5以50μl/min的速度同时进行注射，缔合时间为120秒，解离时间为300秒。沿第六个通道注入缓冲液(PBST)，以提供“在线”空白供参考。由于结合相互作用是用来自上清液的单价单臂IgG测量的，没有纯化和生化表征，因此仅使用蛋白质：蛋白质相互作用的解离率来进一步得出结论。在ProteOn Manager v3.1软件中使用简单的一对一Langmuir结合模型，通过同时拟合传感图来计算解离率。所有克隆的解离速率常数(koff)值总结在表1中。对产生的变体进行比较显示，与亲本序列相比，koff值降低了多达30倍。
表1：所有表达的具有解离速率常数(koff)值的单价抗CD28变体的总结
Figure BDA0004009238190001331
Figure BDA0004009238190001341
用表达人CD28的CHO细胞(亲本细胞系CHO-k1 ATCC#CCL-61，经修饰以稳定过表达人CD28)测试与人CD28的结合。为了评估结合，收集细胞、计数、检查活力并以2.5x105/ml重悬于FACS缓冲液(eBioscience，目录号00-4222-26)中。5x104个细胞在4℃的圆底96孔板中孵育2小时，其中CD28结合剂浓度增加(1pM–100nM)。然后，将细胞用冷FACS缓冲液洗涤3次，在4℃下与PE缀合的山羊抗人PE(Jackson ImmunoReserach，Cat No 109-116-098)再孵育60分钟，用冷FACS缓冲液洗涤一次，离心并重悬于100ul FACS缓冲液中。为了监测构建体和细胞之间的非特异性结合相互作用，包括抗DP47 IgG作为阴性对照。通过流式细胞术用FACS Fortessa(BD,Software FACS Diva)评估结合。使用GraphPadPrism6获得结合曲线。从图3A至3C可以看出，单价单臂IgG样CD28变体构建体显示出结合差异。
靶向CD28和Her2的双特异性抗原结合分子的克隆
对于表达质粒的产生，使用各个可变结构域的序列，并与预先***各个受体哺乳动物表达载体中的各个恒定区框内亚克隆。根据国际专利申请公开号WO 2012/130831中所述的方法，在Fc结构域中，在人IgG1重链的恒定区引入Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变(PG-LALA)，以消除与Fcγ受体的结合。对于双特异性抗体的产生，Fc片段包含“杵”(T366W突变，根据EU索引编号，任选还有S354C突变，根据EU索引编号)或“臼”突变(T366S/L368A/Y407V突变，根据EU索引)到EU索引，可选地还根据EU索引的Y349C突变)以避免重链的错配。在某些情况下，杵和臼抗体在单独的细胞中表达、纯化并组装成完整的双特异性抗体，如前所述。为了避免双特异性抗原结合分子中轻链的错配，在一个结合部分中引入了VH/VL或CH1/Ckappa结构域的交换(CrossFab技术)。在另一个结合物部分中，电荷被引入到CH1和Ckappa结构域中，如国际专利申请公开号WO 2015/150447中所述。
Her2抗体帕妥珠单抗CLC和曲妥珠单抗CLC的产生和制备描述于WO 2015/091738。
克隆了以下分子，其示意图示于图1B、1C或1D中：
分子A：Her2(帕妥珠单抗CLC_WT)-CD28(SA_变体8)1+1形式、双特异性huIgG1野生型/PG-LALA嵌合CrossFab分子在CD28(SA_变体8)Fab片段(杵)中具有VH/VL交换，并且在Her2(帕妥珠单抗CLC_WT)Fab片段(臼)中具有带电荷的修饰(图1B，然而只有Fc杵链包含PG-LALA突变)，其包含SEQ ID NO:91和96的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:92和97的轻链氨基酸序列(P1AF6741)。
分子B：Her2(帕妥珠单抗CLC)-CD28(SA_变体8)1+1形式、双特异性huIgG1 PG-LALA CrossFab分子在CD28(SA_变体8)Fab片段(杵)中具有VH/VL交换，并且在Her2(帕妥珠单抗CLC)Fab片段(臼)中具有带电荷的修饰(图1B)，其包含SEQ ID NO:91和98的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:92和97的轻链氨基酸序列(P1AF8305)。
分子C：Her2(帕妥珠单抗CLC)-CD28(SA_变体8)1+1、双特异性huIgG1 PG-LALACrossFab分子在CD28(SA_变体8)Fab片段(杵)中具有带电荷的修饰，在Her2(帕妥珠单抗CLC)Fab片段(臼)中具有VH/VL交换(图1D)，其包含SEQ ID NO:74和99的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:83和100的轻链氨基酸序列。
分子D：Her2(曲妥珠单抗CLC)-CD28(SA_变体8)1+1，双特异性huIgG1 PG-LALACrossFab分子，在CD28(SA_变体8)Fab片段(杵)中具有VH/VL交换，并且在Her2(曲妥珠单抗CLC)Fab片段(臼)中具有带电荷的修饰-Fab片段(臼)(图1B)，其包含SEQ ID No：91和101的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：92和97的轻链氨基酸序列(P1AF8338)。
分子E：Her2(曲妥珠单抗CLC)-CD28(SA_变体8)1+1，双特异性huIgG1 PG-LALACrossFab分子，在CD28(SA_变体8)Fab片段(杵)中具有带电修饰，在Her2(曲妥珠单抗CLC)Fab片段(臼)(图1D)中具有VH/VL交换，其包含SEQ ID NO：74和102的重链氨基酸序列和SEQID NO：83和100的轻链氨基酸序列。
分子F：Her2(4D5)-CD28(SA_变体8)1+1，双特异性huIgG1 N297G(图1C)，包含SEQID NO:178和180的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:179和181的轻链氨基酸序列。
分子G：Her2(2C4)-CD28(SA_变体8)1+1，双特异性huIgG1 N297G(图1C)，包含SEQID NO:178和182的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:179和183的轻链氨基酸序列。
1.2靶向CD28和Her2的双特异性抗原结合分子的制备
上述分子的表达由嵌合MPSV启动子或CMV启动子驱动。多聚腺苷酸化由位于CDS的3’端的合成polyA信号序列驱动。此外，每个载体都包含用于常染色体复制的EBV OriP序列。
通过瞬时转染HEK293 EBNA细胞或CHO EBNA细胞，形成抗体和双特异性抗体。对细胞进行离心，然后用经过预热的CD CHO培养基(Thermo Fisher，目录号10743029)代替原培养基。将表达载体在CD CHO培养基中混合，加入PEI(聚乙烯亚胺，Polysciences，Inc，目录号23966-1)，将溶液涡旋混合，并且在室温下孵育10分钟。然后，将细胞(2Mio/ml)与载体/PEI溶液混合，将其转移至烧瓶中，并且置于振荡培养箱中，在5％CO2的气氛下于37℃下孵育3小时。孵育后，加入含有补充剂(占总体积的80％)的Excell培养基(W.Zhou和A.Kantardjieff，Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing，DOI：10.1007/978-3-642-54050-9；2014)。转染后1天，加入补充剂(饲料，占总体积的12％)。7天后，通过离心和随后的过滤(0.2μm过滤器)获得细胞上清液，并且使用如下所示的标准方法从获得的上清液中纯化蛋白质。
替代地，本文该的抗体和双特异性抗体由Evitria使用其专有的载体***通过常规的(基于非PCR)克隆技术并且使用悬浮液适应的CHO K1细胞(最初接收自ATCC，并且适于在Evitria的悬浮液培养物中进行无血清生长)制备。在生产过程中，Evitria使用了其专有的无动物成分和无血清的培养基(eviGrow和eviMake2)及其专有的转染试剂(eviFect)。通过离心和随后的过滤(0.2μm过滤器)收获细胞上清液，并且使用标准方法从收获的上清液中纯化蛋白质。
1.3靶向CD28和Her2的双特异性抗原结合分子的纯化
参照标准方案从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白质。简言之，利用蛋白A亲和色谱法(平衡缓冲液：20mM柠檬酸钠，20mM磷酸钠，pH 7.5；洗脱缓冲液：20mM柠檬酸钠，pH3.0)从细胞培养上清液中纯化含Fc的蛋白质。在pH 3.0下实现洗脱，随后立即中和样品的pH。通过离心(Millipore
Figure BDA0004009238190001372
ULTRA-15(Art.Nr.:UFC903096)浓缩蛋白质，然后利用尺寸排阻色谱法在20mM组氨酸、140mM氯化钠(pH 6.0)中将聚集蛋白质与单体蛋白质分离。
1.4靶向CD28和Her2的双特异性抗体的分析数据
通过测量280nm处的吸光度来测定纯化的蛋白质的浓度，其中根据Pace等人(Protein Science,1995,4,2411-1423)该的方法，使用基于氨基酸序列计算得出的质量消光系数。在存在和不存在还原剂的情况下，使用LabChipGXII或LabChip GX Touch(PerkinElmer)(Perkin Elmer)，通过CE-SDS分析蛋白质的纯度和分子量。使用在运行缓冲液(200mM KH2PO4，250mM KCl pH 6.2，0.02％NaN3)中平衡的分析尺寸排阻柱(TSKgel G3000SW XL或UP-SW3000,Tosoh Bioscience)在25℃通过HPLC色谱进行聚集含量的确定。所有分子的纯化参数总结见表2。
表2：双特异性CD28抗原结合分子的制备和纯化概述
Figure BDA0004009238190001371
Figure BDA0004009238190001381
实例2
靶向Her2的双特异性CD28激动性抗原结合分子与表达Her2和CD28的细胞的结合
使用人乳腺癌细胞系KPL-4(川崎医学院)测试Her2-CD28双特异性抗原结合分子与Her2的结合，使用表达人CD28的CHO细胞(亲本细胞系CHO-k1 ATCC#CCL-61，经修饰以稳定过表达人CD28)测试与人CD28的结合。
为了评估结合，获得细胞、计数、检查活力并以2Mio细胞/ml重新悬浮在PBS中，将2x105细胞培养在圆底96孔板(greiner bio-one，cellstar，Cat.No.-650185)在4℃下孵育60分钟，其中Her2-CD28构建体或对照分子(DP47 huIgG1 P329G LALA，包含SEQ ID NO:186的重链和SEQ ID NO:187的轻链)的浓度增加。然后，用PBS洗涤细胞两次，在4℃下与二级结合R-藻红蛋白AffiniPure F(ab')2Fragment Goat Anti-Human IgG，Fcγ片段特异性(Jackson ImmunoResearch，Cat.No.109-116-098)再孵育30分钟，用PBS洗涤两次，离心并重悬于150μl PBS+Dapi(4',6-二脒-2'-苯基吲哚二盐酸盐，在PBS中1:10000稀释，10236276001Roche)。通过流式细胞术用FACS Fortessa(BD,Software FACS Diva)评估结合。使用GraphPadPrism 7(Graph Pad Software Inc.)获得结合曲线。
如图4A和4B以及图6A和6B所示，Her2-CD28双特异性抗原结合分子显示与KPL-4细胞上的Her2结合和与表达人CD28的CHO-k1(ATCC#CCL-61)细胞上的CD28结合。
实例3
靶向Her2的双特异性CD28激动性抗原结合分子的体外功能表征
3.1基于IL-2报告子测定的靶向Her2的双特异性CD28激动性抗原结合分子的体外功能表征-用CD3-IgG刺激
为了评估Her2-CD28双特异性抗原结合分子支持抗CD3介导的T细胞活化的能力，在IL-2报告子细胞测定中测试了Her2-CD28双特异性抗原结合分子。IL-2报告子细胞(Promega，Ca No J1651)用作效应细胞(表达由IL-2启动子驱动的荧光素酶报告子的Jurkat T细胞系)，KPL-4细胞用作肿瘤靶标。包括DP47 huIgG1 P329G LALA抗体作为非结合对照。在10nM抗CD3(eBioscience#16-0037-85)单独存在或与浓度增加的Her2-CD28双特异性抗体(2.44pM–10nM)联合存在的情况下，将10000个肿瘤靶细胞与50000个IL-2报告子细胞(E:T 5:1)一起在37℃的白色平底96孔板(Greiner 655083)中培养6h。在测量之前，将板在室温下孵育15分钟，然后将100μl底物(ONE-Glo溶液，Promega，Ca No E6120)添加到细胞中。在室温下在黑暗中孵育10分钟后，用Tecan Spark 10M测量发光(计数/秒)。
如图5和图7A所示，Her2-CD28双特异性抗原结合分子能够增强T细胞活化，这可以通过以浓度依赖性方式暴露于次优CD3刺激的T细胞中增加的IL-2产生来判断。对于DP47huIgG1 P329G LALA抗体或在不存在表达Her2的KPL4肿瘤细胞的情况下，没有观察到T细胞活化(图7B)。
3.2使用外周血单核细胞(PBMC)通过靶向Her2的双特异性CD28激动性抗原结合分子体外评估T细胞活化
在存在或不存在单特异性或双特异性CD28激动剂抗体的情况下，通过用HER2 TDB处理健康供体PBMC和Her2扩增的KPL-4乳腺癌细胞来测试Her2-CD28双特异性抗原结合分子对HER2 TDB诱导的T细胞活化的影响。通过流式细胞术测量CD4和CD8 T细胞的活化。
人PBMC和肿瘤靶细胞(KPL-4)(以10:1的比例)在HER2 TDB(Her2-CD3双特异性抗体，包含SEQ ID NO:174的重链HCl、SEQ ID NO:175的轻链LC1、SEQ ID NO:176的第二重链HC2和SEQ ID NO:177的第二轻链)与Her2-CD28双特异性抗原结合分子Her2(4D5)/CD28或Her2(2C4)/CD28(500ng/ml)或单特异性抗CD28抗体(CD28二价，500ng/ml)在平底96孔板(BD)中孵育24小时。孵育后，将细胞转移至新的V型底96孔板中。细胞用CD4-PE-Cy7、CD8-FITC、CD69-PE和CD25-APC染色。通过流式细胞术在CD4+或CD8+T细胞上检测到CD69和CD25表面表达。CD4+CD69+CD25+和CD8+CD69+CD25+T细胞的百分比报告为CD4+(图8A)和CD8+T细胞活化(图8B)。
正如预期的那样，用HER2 TDB单药治疗导致CD4和CD8细胞的强烈活化。HER2 TDB与三种CD28激动剂中的任何一种的联合治疗进一步增加了活化T细胞的分数和T细胞活化的效力。与非靶向二价CD28抗体相比，靶向Her2的双特异性抗原结合分子更有效地增强了T细胞活化。
3.3在Her2 TDB存在下通过靶向Her2的双特异性CD28激动性抗原结合分子对肿瘤细胞杀伤的体外评估
使用与实施例3.2相同的实验装置来分析CD28共刺激对HER2 TDB诱导的肿瘤细胞杀伤的影响。通过Cell Titer-Glow Luminescent Cell Viability测定法检测肿瘤细胞活力的丧失。为了评估双特异性Her2-CD28抗原结合分子实现肿瘤细胞杀伤或支持TDB介导的肿瘤细胞杀伤的能力，将表达Her2的KPL-4细胞作为肿瘤靶标。靶细胞KPL-4以每孔10000个细胞的密度接种在黑色透明底96孔板中。人PBMC以10:1E:T的比例添加到孔中。将所示浓度的HER2 TDB添加到具有Her2-CD28双特异性抗原结合分子Her2(4D5)/CD28或Her2(2C4)/CD28(500ng/ml)的孔中。48小时后，将板用PBS洗涤两次。添加了100uL细胞滴度-发光法细胞活力检测试剂(Promega cat#G7570)，并按照说明中所述在光度计上读取平板。
与三种CD28激动剂中的任何一种联合治疗增加了HER2 TDB在介导KPL-4细胞杀伤中的效力(图8C)。与T细胞活化类似，与非靶向二价CD28抗体相比，靶向HER2的双特异性CD28抗原结合分子的作用更强。与使用抗HER2克隆4D5的Her2靶向相比，使用抗HER2克隆2C4的Her2靶向在T细胞活化和肿瘤细胞杀伤方面的反应增强，这可能是由于与靶向4D5的HER2 TDB的非竞争性结合导致的。
3.4体外细胞因子释放试验
在处理后24h从T细胞活化测定中收获上清液用于分析可溶性细胞因子。使用Bio-Plex Pro Human Cytokine Assay(Biorad；Hercules,CA)按照制造商的说明研究从体外T细胞活化测定法(在实施例3.2中描述)收集的上清液样品。
添加二价CD28抗体对HER2 TDB诱导的细胞因子释放只有很小的影响，而添加任一靶向HER2的CD28双特异性抗原结合分子导致所有测量的细胞因子显着增加。在图9A至9G中，示出了GM-CSF(图9A)、IFN-γ(图9B)、IL-10(图9C)、IL-6(图9D)、TNF-α(图9E)、IL-2(图9F)和IL-1b(图9G)的细胞因子释放。
3.5体外T细胞和NK细胞计数
CD28共刺激对免疫细胞数量的影响通过流式细胞术在用HER2-TDB治疗后长达数周的各个时间点进行测量。按照制造商的说明，用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE；ThermoFisher Scientific；Waltham,MA)标记人PBMC。在平底96孔板(BD)中，在存在或不存在50ng HER2 TDB和500ng/ml HER2-CD28双特异性抗原结合分子Her2(4D5)/CD28或Her2(2C4)/CD28的情况下，将CFSE标记的PBMC和靶细胞(KPL-4)(以10:1的比例)孵育3、7、10或14天。在孵育时间结束时，对细胞进行CD4-PE-Cy7、CD8-太平洋蓝、CD56-APC染色，并使用计数珠和流式细胞仪对细胞数进行计数。
与仅用HER2 TDB处理的样品相比，用三种CD28激动剂分子中的任何一种共同处理会导致第7-14天的CD4+细胞数量增加(图10B)。所有CD28激动剂分子在第14天也明显增加了CD8+细胞数量，而两种靶向Her2的双特异性CD28抗原结合分子仅略微增加了NK细胞数量(图10D)。与T细胞活化、肿瘤细胞杀伤和细胞因子释放类似，与二价CD28抗体相比，与靶向Her2的双特异性抗原结合分子的共同治疗导致免疫细胞数量更强烈的增加。
***
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<211> 220
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val
1 5 10 15
Thr Gly Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr
20 25 30
Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser
35 40 45
Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu
50 55 60
Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser
65 70 75 80
Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr
85 90 95
Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys
100 105 110
Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser
115 120 125
Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro
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Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
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Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met
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Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
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<223> 重链 CDR-H1, 帕妥珠单抗 CLC
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<220>
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Gly
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Asn Leu Gly Pro Phe Phe Tyr Phe Asp Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
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Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变结构域 VH, 帕妥珠单抗 CLC
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Val Asn Arg Arg Phe
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Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Phe Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链可变结构域 VL, 帕妥珠单抗 CLC
<400> 9
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 CDR-H2, 曲妥珠单抗 CLC
<400> 11
Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 CDR-H3, 曲妥珠单抗 CLC
<400> 12
Trp Gly Gly Glu Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 轻链 CDR-L1, 曲妥珠单抗 CLC
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Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
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<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 CDR-L2, 曲妥珠单抗 CLC
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Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr
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<213> 人工序列
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<223> 轻链 CDR-L3, 曲妥珠单抗 CLC
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Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变结构域 VH, 曲妥珠单抗 CLC
<400> 16
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
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Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ser Arg Trp Gly Gly Glu Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链可变结构域 VL, 曲妥珠单抗 CLC
<400> 17
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<220>
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Cys Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
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Asp
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val
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<213> 人工序列
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His Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Val Trp Leu Asn
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<223> CD28(SA) CDR-L3
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Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr Thr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28(SA) VH
<400> 24
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Cys Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
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Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
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Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
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Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln
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Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<211> 107
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<213> 人工序列
<220>
<223> CD28(SA) VL
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Val Trp
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<221> 变体
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<221> 变体
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<221> 变体
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Asp
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<221> 变体
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<220>
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<220>
<221> 变体
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Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 33
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 VH 变体 b
<400> 33
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Gln Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp His Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 34
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 VH 变体 c
<400> 34
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Gln Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Thr Arg Ser His Tyr Gly Ala Asp His Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 35
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 VH 变体 d
<400> 35
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ser Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Gln Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Tyr Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 VH 变体 e
<400> 36
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Gln Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 VH 变体 f
<400> 37
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Gln Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Phe Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 38
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ser Ile Tyr Pro Arg Asn Val Gln Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp His Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 39
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 VH 变体 h
<400> 39
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ser Ile Tyr Pro Arg Asp Val Gln Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp His Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 40
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 VH 变体 i
<400> 40
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 41
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 VH 变体 j
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Ala Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 42
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 VL 变体 k
<400> 42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Val His
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Gln Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 43
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 VL 变体 l
<400> 43
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Val Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 44
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 VL 变体 m
<400> 44
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Val Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 45
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 VL 变体 n
<400> 45
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 46
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 VL 变体 o
<400> 46
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Val Trp
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 47
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 VL 变体 p
<400> 47
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 48
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 VL 变体 q
<400> 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn His
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 49
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 VL 变体 r
<400> 49
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Tyr Val Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 50
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 VL 变体 s
<400> 50
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Ser Val Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 51
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 VL 变体 t
<400> 51
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Val Trp
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 52
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28（变体 8）CDR-H1
<400> 52
Ser Tyr Tyr Ile His
1 5
<210> 53
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28（变体 8）CDR-H2
<400> 53
Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Gln Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 54
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28（变体 8）CDR-H3
<400> 54
Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val
1 5 10
<210> 55
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28（变体 8）CDR-L1
<400> 55
His Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Val Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 56
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28（变体 8）CDR-L2
<400> 56
Lys Ala Ser Asn Leu His Thr
1 5
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28（变体 8）CDR-L3
<400> 57
Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 58
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28（变体 15）CDR-H1
<400> 58
Ser Tyr Tyr Ile His
1 5
<210> 59
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28（变体 15）CDR-H2
<400> 59
Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Gln Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 60
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28（变体 15）CDR-H3
<400> 60
Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val
1 5 10
<210> 61
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28（变体 15）CDR-L1
<400> 61
His Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Val Phe Leu Asn
1 5 10
<210> 62
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28（变体 15）CDR-L2
<400> 62
Lys Ala Ser Asn Leu His Thr
1 5
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28（变体 15）CDR-L3
<400> 63
Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 64
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28（变体 29）CDR-H1
<400> 64
Ser Tyr Tyr Ile His
1 5
<210> 65
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28（变体 29）CDR-H2
<400> 65
Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 66
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28（变体 29）CDR-H3
<400> 66
Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val
1 5 10
<210> 67
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28（变体 29）CDR-L1
<400> 67
His Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Val Trp Leu Asn
1 5 10
<210> 68
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28（变体 29）CDR-L2
<400> 68
Lys Ala Ser Asn Leu His Thr
1 5
<210> 69
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28（变体 29）CDR-L3
<400> 69
Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 70
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc 臼 PGLALA
<400> 70
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro
225
<210> 71
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc 杵 PGLALA
<400> 71
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
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Pro
225
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355 360 365
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<223> VL-CD28(SA)-CL"RK"
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Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 81
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL (CD28 变体 k)-CL (RK)
<400> 81
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Val His
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Gln Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 82
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL (CD28 变体 l)-CL (RK)
<400> 82
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Val Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 83
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL (CD28 变体 m)-CL (RK)
<400> 83
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Val Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 84
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL (CD28 变体 r)-CL (RK)
<400> 84
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Tyr Val Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 85
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL (CD28 变体 s)-CL (RK)
<400> 85
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Ser Val Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 86
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL (CD28 变体 t)-CL (RK)
<400> 86
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Val Trp
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 87
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc 臼 PGLALA, HYRF
<400> 87
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro
225
<210> 88
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Avi 标签
<400> 88
Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
1 5 10 15
<210> 89
<211> 437
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28(SA) VL-CH1 hu IgG1 Fc 杵 PGLALA
<400> 89
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Val Trp
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr
100 105 110
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
115 120 125
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
130 135 140
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
145 150 155 160
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
180 185 190
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
195 200 205
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
210 215 220
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
225 230 235 240
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
245 250 255
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
260 265 270
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
275 280 285
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
290 295 300
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
305 310 315 320
Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
325 330 335
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys
340 345 350
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
355 360 365
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
370 375 380
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
385 390 395 400
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
405 410 415
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
420 425 430
Leu Ser Leu Ser Pro
435
<210> 90
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28(SA) VH-Ckappa
<400> 90
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Cys Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val
115 120 125
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
130 135 140
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
145 150 155 160
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
165 170 175
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
180 185 190
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
195 200 205
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
210 215 220
Gly Glu Cys
225
<210> 91
<211> 437
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28(SA_变体 8) VL-CH1 hu IgG1 Fc 杵 PGLALA
<400> 91
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Val Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr
100 105 110
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
115 120 125
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
130 135 140
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
145 150 155 160
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
180 185 190
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
195 200 205
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
210 215 220
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
225 230 235 240
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
245 250 255
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
260 265 270
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
275 280 285
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
290 295 300
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
305 310 315 320
Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
325 330 335
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys
340 345 350
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
355 360 365
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
370 375 380
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
385 390 395 400
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
405 410 415
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
420 425 430
Leu Ser Leu Ser Pro
435
<210> 92
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28(SA_变体 8) VH-Ckappa
<400> 92
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Gln Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Phe Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val
115 120 125
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
130 135 140
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
145 150 155 160
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
165 170 175
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
180 185 190
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
195 200 205
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
210 215 220
Gly Glu Cys
225
<210> 93
<211> 437
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28(SA_变体 15) VL-CH1 hu IgG1 Fc 杵 PGLALA
<400> 93
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Val Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr
100 105 110
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
115 120 125
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
130 135 140
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
145 150 155 160
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
180 185 190
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
195 200 205
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
210 215 220
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
225 230 235 240
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
245 250 255
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
260 265 270
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
275 280 285
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
290 295 300
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
305 310 315 320
Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
325 330 335
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys
340 345 350
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
355 360 365
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
370 375 380
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
385 390 395 400
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
405 410 415
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
420 425 430
Leu Ser Leu Ser Pro
435
<210> 94
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28(SA_变体 15) VH-Ckappa
<400> 94
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Gln Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val
115 120 125
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
130 135 140
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
145 150 155 160
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
165 170 175
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
180 185 190
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
195 200 205
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
210 215 220
Gly Glu Cys
225
<210> 95
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28(SA_变体 29) VH-Ckappa
<400> 95
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val
115 120 125
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
130 135 140
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
145 150 155 160
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
165 170 175
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
180 185 190
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
195 200 205
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
210 215 220
Gly Glu Cys
225
<210> 96
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Her2 (帕妥珠单抗 CLC) hu IgG1 VH-CH1 "EE" Fc 臼野生型
<400> 96
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Val Asn Arg Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Phe Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser
355 360 365
Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Her2 (帕妥珠单抗 CLC) VL-Ckappa "RK"
<400> 97
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 98
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Her2 (帕妥珠单抗 CLC) hu IgG1 VH-CH1 "EE" Fc 臼 PGLALA
<400> 98
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Val Asn Arg Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Phe Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
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165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser
355 360 365
Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
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405 410 415
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Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 99
<211> 437
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Her2 (帕妥珠单抗 CLC) VL-CH1 hu IgG1 Fc 杵 PGLALA
<400> 99
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr
100 105 110
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
115 120 125
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
130 135 140
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
145 150 155 160
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
180 185 190
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
195 200 205
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
210 215 220
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
225 230 235 240
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
245 250 255
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
260 265 270
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
275 280 285
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
290 295 300
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
305 310 315 320
Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
325 330 335
Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
340 345 350
Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
355 360 365
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
370 375 380
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser
385 390 395 400
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
405 410 415
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
420 425 430
Leu Ser Leu Ser Pro
435
<210> 100
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Her2 (帕妥珠单抗 CLC) VH-Ckappa
<400> 100
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Val Asn Arg Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Phe Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe
115 120 125
Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val
130 135 140
Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp
145 150 155 160
Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr
165 170 175
Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
180 185 190
Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val
195 200 205
Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly
210 215 220
Glu Cys
225
<210> 101
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Her2 (曲妥珠单抗 CLC) hu IgG1 VH-CH1 "EE" Fc 臼 PGLALA
<400> 101
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Glu Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 102
<211> 437
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Her2 (曲妥珠单抗 CLC) VL-CH1 hu IgG1 Fc 杵 PGLALA
<400> 102
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr
100 105 110
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
115 120 125
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
130 135 140
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
145 150 155 160
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
180 185 190
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
195 200 205
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
210 215 220
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
225 230 235 240
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
245 250 255
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
260 265 270
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
275 280 285
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
290 295 300
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
305 310 315 320
Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
325 330 335
Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
340 345 350
Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
355 360 365
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
370 375 380
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser
385 390 395 400
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405 410 415
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
420 425 430
Leu Ser Leu Ser Pro
435
<210> 103
<211> 1245
<212> PRT
<213> 智人
<400> 103
Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu
1 5 10 15
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20 25 30
Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His
35 40 45
Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr
50 55 60
Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val
65 70 75 80
Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu
85 90 95
Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr
100 105 110
Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro
115 120 125
Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser
130 135 140
Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln
145 150 155 160
Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn
165 170 175
Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys
180 185 190
His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser
195 200 205
Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys
210 215 220
Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys
225 230 235 240
Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu
245 250 255
His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val
260 265 270
Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg
275 280 285
Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu
290 295 300
Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln
305 310 315 320
Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys
325 330 335
Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu
340 345 350
Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys
355 360 365
Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp
370 375 380
Pro Ala Ser Asn Thr Ala Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu
385 390 395 400
Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln
405 410 415
Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser
420 425 430
Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu
435 440 445
Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu
450 455 460
Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His
465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Glu Cys Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr
530 535 540
Val Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln
545 550 555 560
Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala
565 570 575
Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser
580 585 590
Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp
595 600 605
Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys
610 615 620
Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro
625 630 635 640
Leu Thr Ser Ile Ile Ser Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val
645 650 655
Leu Gly Val Val Phe Gly Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile
660 665 670
Arg Lys Tyr Thr Met Arg Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu
675 680 685
Pro Leu Thr Pro Ser Gly Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile
690 695 700
Leu Lys Glu Thr Glu Leu Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala
705 710 715 720
Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val
725 730 735
Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys
740 745 750
Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly
755 760 765
Ser Pro Tyr Val Ser Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val
770 775 780
Gln Leu Val Thr Gln Leu Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val
785 790 795 800
Arg Glu Asn Arg Gly Arg Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys
805 810 815
Met Gln Ile Ala Lys Gly Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val
820 825 830
His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His
835 840 845
Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu
850 855 860
Thr Glu Tyr His Ala Asp Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala
865 870 875 880
Leu Glu Ser Ile Leu Arg Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp
885 890 895
Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro
900 905 910
Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly
915 920 925
Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile
930 935 940
Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg
945 950 955 960
Glu Leu Val Ser Glu Phe Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe
965 970 975
Val Val Ile Gln Asn Glu Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser
980 985 990
Thr Phe Tyr Arg Ser Leu Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val
995 1000 1005
Asp Ala Glu Glu Tyr Leu Val Pro Gln Gln Gly Phe Phe Cys Pro
1010 1015 1020
Asp Pro Ala Pro Gly Ala Gly Gly Met Val His His Arg His Arg
1025 1030 1035
Ser Ser Ser Thr Arg Ser Gly Gly Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu
1040 1045 1050
Glu Pro Ser Glu Glu Glu Ala Pro Arg Ser Pro Leu Ala Pro Ser
1055 1060 1065
Glu Gly Ala Gly Ser Asp Val Phe Asp Gly Asp Leu Gly Met Gly
1070 1075 1080
Ala Ala Lys Gly Leu Gln Ser Leu Pro Thr His Asp Pro Ser Pro
1085 1090 1095
Leu Gln Arg Tyr Ser Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu Pro Ser Glu
1100 1105 1110
Thr Asp Gly Tyr Val Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln Pro Glu
1115 1120 1125
Tyr Val Asn Gln Pro Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro Arg
1130 1135 1140
Glu Gly Pro Leu Pro Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu
1145 1150 1155
Arg Pro Lys Thr Leu Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp
1160 1165 1170
Val Phe Ala Phe Gly Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr
1175 1180 1185
Pro Gln Gly Gly Ala Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe
1190 1195 1200
Ser Pro Ala Phe Asp Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro
1205 1210 1215
Glu Arg Gly Ala Pro Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala
1220 1225 1230
Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Gly Leu Asp Val Pro Val
1235 1240 1245
<210> 104
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 104
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val
<210> 105
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 105
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Trp Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
35 40 45
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
50 55 60
Glu Ser Thr Tyr Arg Trp Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
65 70 75 80
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
85 90 95
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
100 105
<210> 106
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<400> 106
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
100 105
<210> 107
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 107
Glu Pro Lys Ser Cys
1 5
<210> 108
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X 为 S 或 P
<400> 108
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Xaa Cys Pro
1 5 10
<210> 109
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X 为 S 或 P
<400> 109
His Thr Cys Pro Xaa Cys Pro
1 5
<210> 110
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X 为 S 或 P
<400> 110
Cys Pro Xaa Cys Pro
1 5
<210> 111
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 111
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 112
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 112
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 113
<211> 326
<212> PRT
<213> 智人
<400> 113
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 114
<211> 377
<212> PRT
<213> 智人
<400> 114
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro
100 105 110
Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
115 120 125
Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys
130 135 140
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
145 150 155 160
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
165 170 175
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
180 185 190
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
195 200 205
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
210 215 220
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
225 230 235 240
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
245 250 255
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
260 265 270
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
275 280 285
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
290 295 300
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn
305 310 315 320
Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
325 330 335
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile
340 345 350
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
355 360 365
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375
<210> 115
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人
<400> 115
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 116
<211> 254
<212> PRT
<213> 智人
<400> 116
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
1 5 10 15
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
20 25 30
Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
35 40 45
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
50 55 60
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
65 70 75 80
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
85 90 95
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
100 105 110
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
115 120 125
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
130 135 140
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
145 150 155 160
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Phe
165 170 175
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
180 185 190
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
195 200 205
Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp
225 230 235 240
Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys
245 250
<210> 117
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头 G4S
<400> 117
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 118
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头 (G4S)2
<400> 118
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 119
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头 (SG4)2
<400> 119
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 120
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头 G4(SG4)2
<400> 120
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 121
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 121
Gly Ser Pro Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser
1 5 10
<210> 122
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头 (G4S)3
<400> 122
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 123
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头 (G4S)4
<400> 123
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 124
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 124
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 125
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 125
Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser
1 5
<210> 126
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 126
Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 127
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 127
Gly Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 128
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 128
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 129
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 129
Gly Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly
1 5
<210> 130
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 130
Gly Gly Asn Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 131
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 131
Gly Gly Asn Gly Ser Gly
1 5
<210> 132
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H1, 帕妥珠单抗
<400> 132
Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met Asp
1 5 10
<210> 133
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H2, 帕妥珠单抗
<400> 133
Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 134
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3, 帕妥珠单抗
<400> 134
Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 135
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-L1, 帕妥珠单抗
<400> 135
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly Val Ala
1 5 10
<210> 136
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-L2, 帕妥珠单抗
<400> 136
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr
1 5
<210> 137
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-L3, 帕妥珠单抗
<400> 137
Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 138
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变结构域 VH, 帕妥珠单抗
<400> 138
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 139
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链可变结构域 VL, 帕妥珠单抗
<400> 139
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 140
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H1, 曲妥珠单抗
<400> 140
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His
1 5 10
<210> 141
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H2, 曲妥珠单抗
<400> 141
Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 142
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3, 曲妥珠单抗
<400> 142
Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 143
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-L1, 曲妥珠单抗
<400> 143
Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 144
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-L2, 曲妥珠单抗
<400> 144
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
1 5
<210> 145
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-L3, 曲妥珠单抗
<400> 145
Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
1 5
<210> 146
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变结构域 VH, 曲妥珠单抗
<400> 146
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 147
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链可变结构域 VL, 曲妥珠单抗
<400> 147
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 148
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H1, CD3
<400> 148
Asn Tyr Tyr Ile His
1 5
<210> 149
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H2, CD3
<400> 149
Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 150
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3, CD3
<400> 150
Asp Ser Tyr Ser Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 151
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-L1, CD3
<400> 151
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 152
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-L2, CD3
<400> 152
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 153
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-L3, CD3
<400> 153
Thr Gln Ser Phe Ile Leu Arg Thr
1 5
<210> 154
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变结构域 VH, CD3
<400> 154
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Tyr Ser Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 155
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链可变结构域 VL, CD3
<400> 155
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gln
85 90 95
Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 156
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H1, Her2 (7C2)
<400> 156
Gly Tyr Trp Met Asn
1 5
<210> 157
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H2, Her2 (7C2)
<400> 157
Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Ile Arg Ala Asn Gln Lys Phe Arg
1 5 10 15
Asp
<210> 158
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3, Her2 (7C2)
<400> 158
Gly Thr Tyr Asp Gly Gly Phe Glu Tyr
1 5
<210> 159
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-L1, Her2 (7C2)
<400> 159
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Gly Ser Arg Phe Thr Tyr Met His
1 5 10 15
<210> 160
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-L2, Her2 (7C2)
<400> 160
Tyr Ala Ser Ile Leu Glu Ser
1 5
<210> 161
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-L3, Her2 (7C2)
<400> 161
Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Pro Trp Thr
1 5 10
<210> 162
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变结构域 VH, Her2 (7C2)
<400> 162
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Leu Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Ile Arg Ala Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Tyr Asp Gly Gly Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 163
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链可变结构域 VL, Her2 (7C2)
<400> 163
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Val Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Gly Ser
20 25 30
Arg Phe Thr Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Ile Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85 90 95
Glu Ile Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 164
<211> 290
<212> PRT
<213> 智人
<400> 164
Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu
1 5 10 15
Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr
20 25 30
Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu
35 40 45
Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile
50 55 60
Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser
65 70 75 80
Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn
85 90 95
Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr
100 105 110
Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val
115 120 125
Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val
130 135 140
Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr
145 150 155 160
Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser
165 170 175
Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn
180 185 190
Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr
195 200 205
Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu
210 215 220
Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His
225 230 235 240
Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr
245 250 255
Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys
260 265 270
Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu
275 280 285
Glu Thr
290
<210> 165
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH (PD-L1)
<400> 165
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 166
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL (PD-L1)
<400> 166
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 167
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH (PD-L1) 2
<400> 167
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 168
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL (PD-L1) 2
<400> 168
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 169
<211> 288
<212> PRT
<213> 智人
<400> 169
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly
165 170 175
Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys
180 185 190
Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro
195 200 205
Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly
210 215 220
Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro
225 230 235 240
Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly
245 250 255
Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg
260 265 270
Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
275 280 285
<210> 170
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH (PD-1)
<400> 170
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 171
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL (PD-1)
<400> 171
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 172
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH (PD-1) 2
<400> 172
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 173
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL (PD-1) 2
<400> 173
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 174
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Her2-CD3 (4D5/40G5c) HC1 (Fc 杵)
<400> 174
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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165 170 175
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355 360 365
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370 375 380
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28(SA_变体 8) VL-Ckappa
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35 40 45
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
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195 200 205
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210
<210> 182
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<213> 人工序列
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<223> Her2 (2C4) hu IgG1 杵 N297G
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Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
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Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
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Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
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115 120 125
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130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
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130 135 140
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145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
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435 440 445
<210> 185
<211> 214
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<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 kappa 轻链
<400> 185
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Val Trp
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 186
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47 huIgG1 PGLALA 重链
<400> 186
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Ser Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440
<210> 187
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47 huIgG1 PGLALA 轻链
<400> 187
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 188
<211> 207
<212> PRT
<213> 智人
<400> 188
Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr
20 25 30
Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
35 40 45
Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys
50 55 60
Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp
65 70 75 80
His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr
85 90 95
Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu
100 105 110
Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met
115 120 125
Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu
130 135 140
Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys
145 150 155 160
Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn
165 170 175
Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg
180 185 190
Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile
195 200 205
<210> 189
<211> 198
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<400> 189
Met Gln Ser Gly Thr Arg Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Ile Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr
20 25 30
Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
35 40 45
Cys Ser Gln His Leu Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys
50 55 60
Asn Lys Glu Asp Ser Gly Asp Arg Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu
65 70 75 80
Met Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro
85 90 95
Glu Asp Ala Ser His His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn
100 105 110
Cys Met Glu Met Asp Val Met Ala Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp
115 120 125
Ile Cys Ile Thr Leu Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys
130 135 140
Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly
145 150 155 160
Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn
165 170 175
Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Gln Asp Leu Tyr Ser Gly
180 185 190
Leu Asn Gln Arg Arg Ile
195

Claims (46)

1.一种双特异性激动性CD28抗原结合分子，其特征在于与CD28单价结合，所述双特异性激动性CD28抗原结合分子包含
(a)能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域，
(b)能够与抗原结合结构域特异性结合的第二抗原结合结构域，所述抗原结合结构域能够与人表皮生长因子受体-2(Her2)特异性结合，以及
(c)由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域，所述第一亚基和第二亚基包含一个或多个氨基酸取代，该一个或多个氨基酸取代降低抗原结合分子与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能，
其中能够与Her2特异性结合的所述第二抗原结合结构域包含
(i)重链可变区(VHHer2)和轻链可变区(VLHer2)，所述重链可变区包含以下的重链互补决定区：SEQ ID NO:2的CDR-H1、SEQ ID NO:3的CDR-H2和SEQ ID NO:4的CDR-H3，所述轻链可变区包含以下的轻链互补决定区：SEQ ID NO:5的CDR-L1、SEQ ID NO:6的CDR-L2和SEQID NO:7的CDR-L3；或
(ii)重链可变区(VHHer2)和轻链可变区(VLHer2)，所述重链可变区包含以下的重链互补决定区：SEQ ID NO:10的CDR-H1、SEQ ID NO:11的CDR-H2和SEQ ID NO:12的CDR-H3，所述轻链可变区包含以下的轻链互补决定区：SEQ ID NO:13的CDR-L1、SEQ ID NO:14的CDR-L2和SEQ ID NO:15的CDR-L3；或
(iii)重链可变区(VHHer2)和轻链可变区(VLHer2)，所述重链可变区包含以下的重链互补决定区：SEQ ID NO:132的CDR-H1、SEQ ID NO:133的CDR-H2和SEQ ID NO:134的CDR-H3，所述轻链可变区包含以下的轻链互补决定区：SEQ ID NO:135的CDR-L1、SEQ ID NO:136的CDR-L2和SEQ ID NO:137的CDR-L3，或
(iv)重链可变区(VHHer2)和轻链可变区(VLHer2)，所述重链可变区包含以下的重链互补决定区：SEQ ID NO:140的CDR-H1、SEQ ID NO:141的CDR-H2和SEQ ID NO:142的CDR-H3，所述轻链可变区包含以下的轻链互补决定区：SEQ ID NO:143的CDR-L1、SEQ ID NO:144的CDR-L2和SEQ ID NO:145的CDR-L3。
2.根据权利要求1所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中所述Fc结构域属于人IgG1亚类并且包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G(根据Kabat EU索引编号)。
3.根据权利要求1或2所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中所述能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域包含
(i)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，所述重链可变区包含以下的重链互补决定区：SEQ ID NO:26的CDR-H1、SEQ ID NO:27的CDR-H2和SEQ ID NO:28的CDR-H3，所述轻链可变区包含以下的轻链互补决定区：SEQ ID NO:29的CDR-L1、SEQ ID NO:30的CDR-L2和SEQ ID NO:31的CDR-L3；或
(ii)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:18的CDR-H1、SEQ ID NO:19的CDR-H2和SEQ ID NO:20的CDR-H3，所述轻链可变区包含SEQ IDNO:21的CDR-L1、SEQ ID NO:22的CDR-L2和SEQ ID NO:23的CDR-L3。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中所述能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域包含
(i)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，所述重链可变区包含以下的重链互补决定区：SEQ ID NO:52的CDR-H1、SEQ ID NO:53的CDR-H2和SEQ ID NO:54的CDR-H3，所述轻链可变区包含以下的轻链互补决定区：SEQ ID NO:55的CDR-L1、SEQ ID NO:56的CDR-L2和SEQ ID NO:57的CDR-L3；或
(ii)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:58的CDR-H1、SEQ ID NO:59的CDR-H2和SEQ ID NO:60的CDR-H3，所述轻链可变区包含SEQ IDNO:61的CDR-L1、SEQ ID NO:62的CDR-L2和SEQ ID NO:63的CDR-L3；或
(ii)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:64的CDR-H1、SEQ ID NO:65的CDR-H2和SEQ ID NO:66的CDR-H3，所述轻链可变区包含SEQ IDNO:67的CDR-L1、SEQ ID NO:68的CDR-L2和SEQ ID NO:69的CDR-L3。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中所述能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中所述能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，所述重链可变区包含选自由SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41组成的组的氨基酸序列，所述轻链可变区包含选自由SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51组成的组的氨基酸序列。
7.根据权利要求1至4或6中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中所述能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域包含
(a)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，或
(b)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，或
(c)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，或
(d)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，或
(e)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，或
(f)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，或
(g)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，或
(h)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，或
(i)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，或
(j)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，或
(k)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
8.根据权利要求1至4中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中所述能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域包含
(i)重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)，所述重链可变区包含以下的重链互补决定区：SEQ ID NO:52的CDR-H1、SEQ ID NO:53的CDR-H2和SEQ ID NO:54的CDR-H3，所述轻链可变区包含以下的轻链互补决定区：SEQ ID NO:55的CDR-L1、SEQ ID NO:56的CDR-L2和SEQ ID NO:57的CDR-L3。
9.根据权利要求1至4或8中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中所述能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域包含所述重链可变区(VHCD28)的CDR和所述轻链可变区(VLCD28)的CDR，所述重链可变区包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，所述轻链可变区的包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区(VHHer2)的CDR和包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链可变区(VLHer2)的CDR。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区(VHHer2)和包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链可变区(VLHer2)。
12.根据权利要求1至9中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链可变区(VHHer2)的CDR和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链可变区(VLHer2)的CDR。
13.根据权利要求1至9或12中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链可变区(VHHer2)和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链可变区(VLHer2)。
14.根据权利要求1至9中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的重链可变区(VHHer2)的CDR和包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列的轻链可变区(VLHer2)的CDR。
15.根据权利要求1至9或14中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的重链可变区(VHHer2)和包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列的轻链可变区(VLHer2)。
16.根据权利要求1至9中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的重链可变区(VHHer2)的CDR和包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的轻链可变区(VLHer2)的CDR。
17.根据权利要求1至9或16中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与Her2特异性结合的抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的重链可变区(VHHer2)和包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的轻链可变区(VLHer2)。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中所述能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域和/或能够与Her2特异性结合的所述第二抗原结合结构域为Fab分子。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中所述能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域为Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换或恒定结构域CL和CH1彼此替换，特别是所述可变结构域VL和VH彼此替换。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与Her2特异性结合的所述第二抗原结合结构域为常规Fab分子。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与Her2特异性结合的所述第二抗原结合结构域为Fab分子，其中在所述恒定结构域CL中，第123位(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸被选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)的氨基酸取代，并且第124位(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代，并且其中在所述恒定结构域CH1中，第147位(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代，并且第213位(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)。
22.根据权利要求1所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其包含
(i)含有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的第一轻链、含有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的第二重链和含有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的第二轻链，或
(ii)含有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的第一轻链、含有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:98的氨基酸序列的第二重链和含有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的第二轻链，或
(iii)含有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的第一轻链、含有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:101的氨基酸序列的第二重链和含有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的第二轻链。
23.根据权利要求1所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其包含
(i)含有SEQ ID NO:179的氨基酸序列的第一轻链、含有SEQ ID NO:178的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:180的氨基酸序列的第二重链和含有SEQ ID NO:181的氨基酸序列的第二轻链，或
(ii)含有SEQ ID NO:179的氨基酸序列的第一轻链、含有SEQ ID NO:178的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:182的氨基酸序列的第二重链和含有SEQ ID NO:183的氨基酸序列的第二轻链。
24.根据权利要求1至18中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中能够与Her2特异性结合的所述第二抗原结合结构域为Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换或恒定结构域CL和CH1彼此替换，特别是所述可变结构域VL和VH彼此替换。
25.根据权利要求1至18或24中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中所述能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域为常规Fab分子。
26.根据权利要求1至18或24或25中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中所述能够与CD28特异性结合的第一抗原结合结构域为Fab分子，其中在所述恒定结构域CL中，第123位(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸被选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)的氨基酸取代，并且第124位(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代，并且其中在所述恒定结构域CH1中，第147位(根据KabatEU索引编号)处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代，并且第213位(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)。
27.根据权利要求1至13或24至26中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其包含
(i)含有SEQ ID NO:83的氨基酸序列的第一轻链、含有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:99的氨基酸序列的第二重链和含有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的第二轻链，或
(ii)含有SEQ ID NO:83的氨基酸序列的第一轻链、含有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的第二重链和含有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的第二轻链。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域各自为Fab分子，并且所述Fc结构域由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成；并且其中(i)所述第一抗原结合结构域在所述Fab重链的C末端与所述Fc结构域的第一亚基的N末端融合，并且所述第二抗原结合结构域在所述Fab重链的C末端与所述Fc结构域的第二亚基的N末端融合，或(ii)所述第二抗原结合结构域在所述Fab重链的C末端与所述Fc结构域的第一亚基的N末端融合，并且所述第一抗原结合结构域在所述Fab重链的C末端与所述Fc结构域的第二亚基的N末端融合。
29.根据权利要求1至22中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中所述Fc结构域包含促进所述Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的修饰。
30.根据权利要求1至23中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中所述Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和/或T366W(EU编号)，并且所述Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。
31.一种或多种分离的多核苷酸，其编码根据权利要求1至30中任一项所述的特异性激动性CD28抗原结合分子。
32.一种或多种载体，特别是表达载体，所述载体包含根据权利要求31所述的多核苷酸。
33.一种宿主细胞，其包含根据权利要求31所述的多核苷酸或根据权利要求32所述的载体。
34.一种生产双特异性激动性CD28抗原结合分子的方法，其包括以下步骤：a)在适合于所述双特异性激动性CD28抗原结合分子表达的条件下培养根据权利要求33所述的宿主细胞，和b)任选地回收所述双特异性激动性CD28抗原结合分子。
35.一种双特异性激动性CD28抗原结合分子，其通过根据权利要求34所述的方法来产生。
36.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至30中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子和至少一种药学上可接受的赋形剂。
37.根据权利要求1至30中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子或根据权利要求36所述的药物组合物，其用作药物。
38.根据权利要求1至30中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子或根据权利要求36所述的药物组合物，其用于增强(a)T细胞活化或(b)T细胞效应子功能。
39.根据权利要求1至30中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子或根据权利要求36所述的药物组合物，其用于在癌症的治疗中使用。
40.根据权利要求1至30中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子或根据权利要求36所述的药物组合物，其用于在癌症的治疗中使用，其中所述使用是用于与化疗剂、放射疗法和/或用于癌症免疫疗法的其他药剂联合施用。
41.根据权利要求1至30中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子或根据权利要求36所述的药物组合物，其用于在癌症的治疗中使用，其中所述使用是用于与T细胞活化抗CD3双特异性抗体联合施用。
42.根据权利要求41所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子或药物组合物，其中所述T细胞活化抗CD3双特异性抗体为抗Her2/抗CD3抗体。
43.根据权利要求1至30中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子或根据权利要求36所述的药物组合物，其在癌症的治疗中使用，其中所述使用是用于与抗PD-L1抗体或抗PD-1抗体联合施用。
44.根据权利要求1至30中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子或根据权利要求36所述的药物组合物在制造用于疾病的治疗，特别是用于癌症的治疗的药物中的用途。
45.一种治疗个体的疾病、特别是癌症的方法，其包括向所述个体施用有效量的根据权利要求1至30中任一项所述的双特异性激动性CD28抗原结合分子或根据权利要求36所述的药物组合物。
46.根据权利要求45所述的方法，其进一步包括与化疗剂、放射疗法和/或用于癌症免疫疗法的其他药剂联合施用，特别是与T细胞活化抗CD3双特异性抗体或抗PD-L1抗体或抗PD-1抗体联合施用。
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