CN114929734A - 新型含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含至少一个能够与PD‑L1特异性结合的抗原结合结构域的含有4‑1BBL三聚体的抗原结合分子，以及它们在治疗癌症中的用途。

Description

新型含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子
技术领域
本发明涉及包含能够与PD-L1特异性结合的抗原结合结构域的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，以及它们在治疗癌症中的用途。本发明进一步涉及生产这些分子的方法和使用它们的方法。
背景技术
4-1BB(CD137)是TNF受体超家族的成员，其最先被鉴定为由T细胞活化表达的诱导型分子(Kwon和Weissman,1989,Proc Natl Acad Sci USA 86,1963-1967)。随后的研究表明，许多其他免疫细胞也表达4-1BB，包括NK细胞、B细胞、NKT细胞、单核细胞、中性粒细胞、肥大细胞、树突细胞(DC)和非造血来源的细胞，诸如内皮细胞和平滑肌细胞(Vinay和Kwon,2011,Cell Mol Immunol 8,281-284)。4-1BB在不同细胞类型中的表达大多数是可诱导的，并且受各种刺激信号(诸如T细胞受体(TCR)或B细胞受体触发以及通过共刺激分子或促炎细胞因子的受体诱导的信号传导)驱动(Diehl等人，2002,J Immunol 168,3755-3762；Zhang等人，2010,Clin Cancer Res 13,2758-2767)。
1993年鉴定出了4-1BB配体(4-1BBL或CD137L)(Goodwin等人，1993，Eur JImmunol 23,2631-2641)。已经表明，4-1BBL的表达仅限于专职抗原呈递细胞(APC)诸如B细胞、DC和巨噬细胞上。4-1BBL的可诱导表达是T细胞(包括αβ和γδ两种T细胞亚群)和内皮细胞的特征(Shao和Schwarz,2011,J Leukoc Biol 89,21-29)。
通过4-1BB受体进行的共刺激(例如通过4-1BBL连接)活化了T细胞(CD4+和CD8+两个亚群)内的多个信号传导级联，有力地增强了T细胞的活化(Bartkowiak和Curran,2015)。与TCR触发相结合，激动性4-1BB特异性抗体增强T细胞增殖、刺激淋巴因子分泌并且降低T淋巴细胞对活化诱导的细胞死亡的敏感性(Snell等人,2011,Immunol Rev 244,197-217)。这种机制被进一步推进，作为癌症免疫疗法概念的第一个证明。在对荷瘤小鼠施用抗4-1BB的激动性抗体的临床前模型中，产生了有效的抗肿瘤作用(Melero等人，1997，Nat Med 3,682-685)。后来，越来越多的证据表明，4-1BB通常只有在与其他免疫调节化合物、化学治疗剂、肿瘤特异性疫苗接种或放射疗法组合施用时才能表现出其作为抗肿瘤剂的效力(Bartkowiak和Curran，2015，Front Oncol 5,117)。
TNFR超家族的信号传导需要三聚配体的交联以与受体接合，需要野生型Fc结合的4-1BB激动性抗体也是如此(Li和Ravetch,2011,Science 333,1030-1034)。但是，全身施用具有功能活性Fc结构域的4-1BB特异性激动性抗体导致与肝毒性相关联的CD8+T细胞的流入(Dubrot等人,2010,Cancer Immunol Immunother 59,1223-1233)，所述肝毒性在小鼠体内不存在功能性Fc受体的情况下减弱或明显改善。在临床中，Fc感受态4-1BB激动性Ab(BMS-663513)(NCT00612664)引起4级肝炎，导致试验终止(Simeone和Ascierto,2012,JImmunotoxicol 9,241-247)。因此，需要有效且更安全的4-1BB激动剂。
程序性死亡配体1(PD-L1)是一种蛋白质，它牵涉到在慢性感染、妊娠、组织同种异体移植、自身免疫性疾病和癌症期间对免疫***应答的抑制中。PD-L1通过与抑制性受体(称为程序性死亡1(PD-1))结合来调节免疫应答，该受体在T细胞、B细胞和单核细胞的表面表达。PD-L1还通过与另一种受体B7-1相互作用，对T细胞功能产生负调节。PD-L1/PD-1与PD-L1/B7-1复合物的形成对T细胞受体信号传导产生负调节，从而导致T细胞活化的下调以及抗肿瘤免疫活性的抑制。目前，几种PD-1和PD-L1抗体在临床上用于治疗多种实体癌和淋巴瘤，并且经证实阻断PD-1通路在广泛的肿瘤类型中诱导令人印象深刻的应答率。上市的PD-L1抗体阿特珠单抗(Tecentriq)、阿维单抗(Bavencio)和德瓦鲁单抗(Imfinzi)同时被批准用于不同类型的癌症，诸如尿路上皮癌、非小细胞肺癌和Merkel细胞癌。尽管靶向PD-1或PD-L1的免疫治疗在癌症方面取得了实质性的临床进展，但仍有相当一部分患者对治疗无应答。因此，仍然需要将PD-L1与共刺激靶标相结合的新型候选药物，以克服肿瘤环境中的免疫抗性。
发明内容
本发明的新型抗原结合分子将抗PD-L1抗原结合结构域与能够形成共刺激4-1BBL三聚体并且足够稳定以在药学上可用的部分组合。本发明的抗原结合分子提供了三聚体的并因此具有生物活性的人4-1BB配体，尽管三聚化4-1BBL胞外域中的一个位于与该分子的其他两个4-1BBL胞外域不同的另一多肽上。以抗PD-L1抗原结合结构域为靶标，本发明的抗原结合分子对肿瘤部位具有增强的活性，包含天然的人4-1BB配体，并因此与传统的4-1BB激动性抗体或人工成分更高的融合蛋白相比，安全性问题应该更少。
在一个方面，本发明提供了一种含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其包含
(a)能够与PD-L1特异性结合的抗原结合结构域，
(b)第一多肽和第二多肽，所述第一多肽和所述第二多肽通过二硫键彼此连接，
其中所述抗原结合分子的特征在于，所述第一多肽包含通过肽接头彼此连结的两个4-1BBL胞外域或其片段，并且特征在于，所述第二多肽包含一个4-1BBL胞外域或其片段，和
(c)Fc结构域，所述Fc结构域包含能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基。
在特定方面，本发明提供了含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中该4-1BBL胞外域或其片段包含选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列，特别是SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
在进一步方面，本发明提供了一种含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其包含
(a)能够与PD-L1特异性结合的抗原结合结构域，
(b)第一多肽和第二多肽，所述第一多肽和所述第二多肽通过二硫键彼此连接，
其中所述抗原结合分子的特征在于，所述第一多肽包含选自由SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12组成的组的氨基酸序列，并且特征在于，所述第二多肽包含选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成的组的氨基酸序列，和
(c)Fc结构域，所述Fc结构域包含能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基。
在一个方面，Fc结构域是IgG，特别是IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc结构域。更具体地，Fc结构域是IgG1 Fc结构域。在一个特定方面，所述Fc结构域包含促进所述Fc结构域的所述第一亚基和所述第二亚基缔合的修饰。在一个特定方面，本发明提供了一种含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中Fc结构域包含促进该Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的杵臼结构(knob-into-hole)修饰。在一个具体方面，本发明提供了一种含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W(根据Kabat EU索引进行编号)，并且Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S、L368A和Y407V(根据Kabat EU索引进行编号)。
在另一方面，本发明涉及如上文所定义的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其包含(c)Fc结构域，其包括能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基，其中Fc结构域包含降低与Fc受体，特别是与Fcγ受体的结合的一个或多个氨基酸取代。具体地，Fc结构域包含IgG重链的位置234和235(根据Kabat的EU编号)和/或329(根据Kabat的EU编号)处的氨基酸取代。特别地，提供了一种含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中Fc结构域为人IgG1 Fc结构域，其包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(根据Kabat EU索引进行编号)。
在一个方面，含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子为下述抗原结合分子，其中能够与PD-L1特异性结合的抗原结合结构域为能够与PD-L1特异性结合的Fab分子。在另一方面，能够与PD-L1特异性结合的抗原结合结构域为能够与PD-L1特异性结合的交叉Fab分子或scFV分子。
在一个方面，本发明提供了一种如前文所述的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中该含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子包含一个能够与PD-L1特异性结合的Fab结构域，这意味着它包含与PD-L1的单价结合。
在进一步方面，提供了一种含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中能够与PD-L1特异性结合的抗原结合结构域包含
重链可变区(VHPD-L1)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLPD-L1)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
在进一步方面，本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子包含：重链可变区(VHPD-L1)，其包含与SEQ ID NO:19的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLPD-L1)，其包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一个特定方面，本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子包含：重链可变区(VHPD-L1)，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸，以及轻链可变区(VLPD-L1)，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
在进一步方面，提供了一种含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含
第一重链和第一轻链，两者均包含能够与PD-L1特异性结合的Fab分子；
第二重链，其包含恒定结构域和通过第一肽接头彼此连结的两个4-1BBL胞外域或其片段，在其C末端通过第二肽接头与第二重链或第二轻链融合，
和第二轻链，其包含恒定结构域和一个4-1BBL胞外域或其片段，在其C末端通过第三肽接头与第二轻链或第二重链融合。更特别地，提供了含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连接的两个4-1BBL胞外域或其片段的第一肽在其C末端通过第二肽接头与作为重链的部分的CL结构域融合，并且包含一个所述4-1BBL胞外域或其片段的第二肽在其C端通过第三肽接头与作为轻链的部分的CH1结构域融合。
在特定方面，本发明涉及如上定义的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中肽接头是(G4S)2，即SEQ ID NO:36的肽接头。在一个方面，肽接头在所有情况下都是(G4S)2。
本发明进一步提供了一种含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中在与4-1BBL相邻的CL结构域中，位置123(EU编号)处的氨基酸已被精氨酸(R)取代并且位置124(EU编号)处的氨基酸已被赖氨酸(K)取代；并且其中在与4-1BBL相邻的CH1结构域中，位置147(EU编号)处和位置213(EU编号)处的氨基酸已被谷氨酸(E)取代。
在另一方面，提供了一种含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含
(i)第一重链，其包含VH结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；和第一轻链，其包含VL结构域，所述VL结构域包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；
(ii)第二重链，其包含选自由SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25和SEQID NO:27组成的组的氨基酸序列；和
(iii)第二轻链，其包含选自由SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26和SEQID NO:28组成的组的氨基酸序列。
在一个特定方面，提供了含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其包含：第一重链，其包含与SEQ ID NO:29的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；第一轻链，其包含与SEQ ID NO:30的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；第二重链，其包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和第二轻链，其包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在进一步的特定方面，提供了含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其包含：第一重链，其包含SEQ IDNO:29的氨基酸序列；第一轻链，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；第二重链，其包含SEQID NO:21的氨基酸序列；和第二轻链，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
根据本发明的另一方面，提供了一种编码如上文所定义的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的分离的核酸分子。本发明进一步提供了一种载体，特别是表达载体，其包含本发明的分离的核酸分子；并且提供了一种宿主细胞，其包含本发明的分离的核酸或载体。在一些实施例中，宿主细胞为真核细胞，特别是哺乳动物细胞。
在另一方面，提供了一种用于生产本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的方法，所述方法包括在适合于表达含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的条件下培养本发明的宿主细胞，以及分离含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子。本发明还涵盖一种通过本发明的方法生产的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子。
本发明进一步提供了包含本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子和至少一种药用赋形剂的药物组合物。在另一方面，提供了一种药物组合物，其包含本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子和至少一种药用赋形剂，进一步包含另外的治疗剂，例如用于癌症免疫疗法中的化疗剂和/或其他药剂。在进一步方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物进一步包含T细胞活化性抗CD3双特异性抗体。
本发明还涵盖本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，或者本发明的药物组合物，其用作药物。在一个方面，提供了本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子或本发明的药物组合物，其用于治疗有此需要的个体的疾病。在具体实施例中，提供了本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，或者本发明的药物组合物，其用于治疗癌症。在另一方面，提供了本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子或本发明的药物组合物，其用于上调或延长细胞毒性T细胞活性。在另一方面，提供了本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子或本发明的药物组合物，其用于治疗癌症，其中含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子与另一种治疗剂，例如化学治疗剂和/或其他用于癌症免疫疗法的药剂、或T细胞活化性抗CD3双特异性抗体联合使用。在一个方面，在含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子同时、之前或之后施用其他治疗剂。
而且，提供了本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子用于制备用于治疗有此需要的个体的疾病的药物的用途，特别是用于制备用于治疗癌症的药物的用途，以及一种治疗个体的疾病的方法，其包括向所述个体施用治疗有效量的包含如本文所公开的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的组合物，所述组合物呈药用形式。在具体方面，疾病为癌症。本发明进一步提供了本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子用于制备用于治疗癌症的药物的用途，其中含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子与另一种治疗剂联合使用。此外，提供了一种用于治疗患有癌症的个体的方法，该方法包括向受试者施用有效量的本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子。还提供了一种上调或延长患有癌症的个体中的细胞毒性T细胞活性的方法，其包括向所述个体施用有效量的本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子或本发明的药物组合物。在上述实施例中的任一项中，个体优选为哺乳动物，特别是人。
附图说明
图1示出了用于组装单价的靶向PD-L1的***三聚4-1BB配体Fc融合抗原结合分子的成分。图1A示出了二聚4-1BB配体，它在C端与具有突变E123R和Q124K(带电变体)的人IgG1-CL结构域融合，而图1B显示了单体4-1BB配体，它在C端与具有突变K147E和K213E(带电变体)的人IgG1-CH1结构域融合。
图2A示意性地说明了单价的靶向PD-L1的***三聚4-1BB配体Fc(kih)融合抗原结合分子的结构，其包含与带电残基交叉的CH-CL。粗黑点代表旋杵臼结构修饰。*代表CH1和CL结构域中的氨基酸修饰(所谓的带电变体)。该分子被命名为PD-L1-4-1BBL。图2B示意性地说明了单价PD-L1和二价4-1BB(克隆20H4.9)靶向分子的结构，称为进一步的2+1形式。粗黑点代表旋杵臼结构修饰。该分子被命名为4-1BB x PD-L1 2+1。图2C示意性地说明了单价PD-L1和4-1BB(克隆20H4.9)靶向分子的结构，称为进一步的1+1形式。粗黑点代表旋杵臼结构修饰。该分子因此被命名为4-1BB x PD-L1 1+1。
图3A示出了用于同时结合本发明的靶向PD-L1的***三聚体的含有4-1BB配体的抗原结合分子的SPR实验的设置。PD-L1-4-1BBL(分析物1)与固定的人4-1BB和人PD-L1-Fc(分析物2)的同时结合如图3B所示。
图4A和4B示出了在两个独立实验中测量的，靶向PD-L1的4-1BB***三聚配体Fc融合抗原结合分子或4-1BB x PD-L1双特异性抗体与亲代细胞系MKN45(图4A)或表达PD-L1的细胞系MKN45-PD-L1(图4B)的结合。将PD-L1-4-1BBL或对照分子的浓度与PE缀合的二级检测抗体的荧光强度的地理平均值进行印迹。通过扣除空白对照(例如，无一级检测抗体，仅包含二级检测抗体)的基线值，对所有值进行基线校正。只有PD-L1-4-1BBL或4-1BB-PDL1双特异性抗体与表达人PD-L1的MKN45-huPD-L1细胞(图4B)有效结合，但不与亲本细胞系MKN45(图4A)有效结合。
图5A、5B、5C、5D和5E示出在表达4-1BB的报告细胞系Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2中的NFκB介导的荧光素酶表达活性。为了测试PD-L1-4-1BBL与对照的功能，分子与报告细胞系Jurkat-hu4-1BB-NFkB-luc2在不存在或存在MKN45或表达人PD-L1的MKN45细胞系的情况下以1:5比例孵育6小时。然后将细胞洗涤、裂解并在检测缓冲液中与荧光素一起孵育。荧光素酶催化的荧光素氧化经由光发射作为释放光的单位被检测(y轴)。将PD-L1-4-1BBL分子或其对照的浓度与孵育6小时并添加荧光素酶检测溶液后测量的释放光的单位(RLU)进行印迹。通过扣除空白对照(例如，未添加抗体)的基线值，对所有值进行基线校正。
具体实施方式
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数，反之亦然。
如本文所用，术语“抗原结合分子”在其最广义上是指特异性结合抗原决定簇的分子。抗原结合分子的示例是抗体、抗体片段和支架抗原结合蛋白。
术语“抗原结合结构域”是指抗原结合分子的一部分，其包含与抗原的一部分或全部特异性结合并互补的区域。在抗原很大的情况下，抗原结合分子可以仅结合抗原的特定部分，该部分称为表位。抗原结合结构域可以由例如一个或多个可变结构域(也称为可变区)提供。优选地，抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
如本文所用，术语“能够与PD-L1特异性结合的抗原结合结构域”或“能够与PD-L1特异性结合的部分”是指与PD-L1特异性结合的多肽分子。在一个方面，抗原结合结构域能够通过PD-L1抑制信号传导。在特定方面，抗原结合结构域能够将与其连接的实体(例如4-1BBL三聚体)引导至靶位点，例如引导至携带PD-L1的特定类型的T细胞。能够与PD-L1特异性结合的抗原结合结构域包括如本文进一步定义的抗体及其片段。关于抗体或其片段，术语“能够与PD-L1特异性结合的部分”是指分子的一部分，其包含与抗原的一部分或全部特异性结合并且与之互补的区域。可通过例如一种或多种抗体可变结构域(也称为抗体可变区)来提供能够特异性抗原结合的部分。特别地，能够特异性抗原结合的部分包括抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
本文的术语“抗体”以最广义使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，以及抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变异抗体(例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少量存在)之外，包含所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。
如本文所用，术语“单特异性”抗体表示具有一个或多个结合位点的抗体，每个结合位点与相同抗原的相同表位结合。术语“双特异性”意指抗原结合分子能够特异性结合到至少两种独特的抗原决定簇。通常，双特异性抗原结合分子包含两个抗原结合位点，这两个抗原结合位点中的每个抗原结合位点对不同的抗原决定簇具有特异性。在某些实施例中，双特异性抗原结合分子能够同时结合两种抗原决定簇，特别是在两种独特细胞上表达的两种抗原决定簇。
如在本申请中所用的术语“价”表示抗原结合分子中存在指定数目的结合位点。因此，术语“单价”、“二价”“四价”和“六价”分别表示抗原结合分子中存在一个结合位点、两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。
术语“全长抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用地指代具有与天然抗体结构基本上相似的结构的抗体。“天然抗体”是指具有不同结构的天然免疫球蛋白分子。例如，天然IgG类抗体为约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由二硫键键合的两条轻链和两条重链组成。从N末端到C末端，每条重链具有可变区(VH)(也称为可变重结构域或重链可变结构域)，后接三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)(也称为重链恒定区)。类似地，从N末端到C末端，每条轻链具有可变区(VL)(也称为可变轻结构域或轻链可变结构域)，后接轻链恒定结构域(CL)(也称为轻链恒定区)。抗体的重链可以分配为五种类型中的一种，所述五种类型被称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，它们中的一些可以进一步分为亚型，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以归属于两种类型中的一种，这两种类型称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。
“抗体片段”是指完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分，所述部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的示例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双体抗体、三体抗体、四体抗体、交叉Fab片段；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；以及单结构域抗体。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Plückthun，载于The Pharmacology of MonoclonalAntibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag,New York，第269至第315页(1994)；还可参见WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。对于包含挽救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的Fab片段和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，该双体抗体可以是二价的或双特异性的，参见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)；以及Hollinger等人，Proc Natl Acad Sci USA 90,6444-6448(1993)。三体抗体和四体抗体在Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)中也有所描述。单结构域抗体为包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施例中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.，Waltham，MA；参见例如美国专利号6,248,516B1)。抗体片段可以通过各种技术制备，这些技术包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化，以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌(E.coli)或噬菌体)产生，如本文所述。
木瓜蛋白酶消化完整抗体产生两个称为“Fab”片段的相同的抗原结合片段，每个“Fab”片段含有重链可变结构域和轻链可变结构域以及轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。因此，如本文所用，术语“Fab片段”是指包含轻链片段以及重链的VH结构域和第一恒定结构域(CH1)的抗体片段，所述轻链片段包含VL结构域和轻链恒定结构域(CL)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于Fab'片段在重链CH1结构域的羧基末端添加了一些残基，这些残基包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是Fab'片段，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离巯基。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，其具有两个抗原结合位点(两个Fab片段)和Fc区的一部分。
术语“交叉Fab片段”或“xFab片段”或“交换型Fab片段”是指这样的Fab片段，其中重链和轻链的可变区或恒定区被交换。交换型Fab分子的两种不同链组成是可能的，并且包含在本发明的双特异性抗体中：在一个方面，Fab重链和轻链的可变区被交换，即交换型Fab分子包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)组成的肽链，以及由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的肽链。该交换型Fab分子也称为CrossFab(VLVH)。在另一方面，当Fab重链和轻链的恒定区被交换时，交换型Fab分子包含由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的肽链，以及由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)组成的肽链。该交换型Fab分子也称为CrossFab(CLCH1)。
“单链Fab片段”或“scFab”是由抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定结构域1(CH1)、抗体轻链可变结构域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成的多肽，其中所述抗体结构域和所述接头在N-末端至C-末端方向上具有以下顺序中的一种：a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CH1，或d)VL-CH1-接头-VH-CL；并且其中所述接头是至少30个氨基酸，优选是32个至50个氨基酸的多肽。所述单链Fab片段经由CL结构域与CH1结构域之间的天然二硫键而稳定化。此外，这些单链Fab分子可以通过经由***半胱氨酸残基(例如根据Kabat编号的可变重链中的44位和可变轻链中的100位)产生链间二硫键，而进一步稳定化。
“交换型单链Fab片段”或“x-scFab”是由抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定结构域1(CH1)、抗体轻链可变结构域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成的多肽，其中所述抗体结构域和所述接头在N末端至C末端方向上具有以下顺序中的一种：a)VH-CL-接头-VL-CH1和b)VL-CH1-接头-VH-CL；其中VH和VL一起形成与抗原特异性结合的抗原结合位点，并且其中所述接头是至少30个氨基酸的多肽。此外，这些x-scFab分子可以通过经由***半胱氨酸残基(例如根据Kabat编号的可变重链中的44位和可变轻链中的100位)产生链间二硫键，而进一步稳定化。
“单链可变片段(scFv)”是抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的融合蛋白，通过10至约25个氨基酸的短接头肽连接。接头通常富含甘氨酸以获得柔性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以获得溶解度，并且可以将VH的N末端与VL的C末端连接，或反之亦然。尽管去除了恒定区并引入了接头，但该蛋白保留了原始抗体的特异性。scFv抗体例如描述于Houston,J.S.,Methods in Enzymol.203(1991)46-96)中。另外，抗体片段包含单链多肽，所述单链多肽的特征在于具有VH结构域，即能够与VL结构域一起装配到功能性抗原结合位点；或具有VL结构域的特征，即能够与VH结构域一起装配到功能性抗原结合位点，从而提供全长抗体的抗原结合特性。
作为参考分子的“结合相同表位的抗原结合分子”是指这样的抗原结合分子，在竞争测定中所述抗原结合分子使参考分子与其抗原的结合被阻断50％或更多，并且相反地，在竞争测定中参考分子使抗原结合分子与其抗原的结合被阻断50％或更多。
如本文所用，术语“抗原决定簇”与“抗原”和“表位”同义，并且是指多肽大分子上的位点(例如一段连续的氨基酸或由非连续氨基酸的不同区域组成的构象构型)，抗原结合部分与所述位点结合，从而形成抗原结合部分-抗原复合物。有用的抗原决定簇可以在例如肿瘤细胞的表面上、病毒感染细胞的表面上、其他患病细胞的表面上、免疫细胞的表面上、血清中的游离物和/或细胞外基质(ECM)中找到。除非另有说明，否则本文中用作抗原的蛋白质可以是来自任何脊椎动物来源的任何天然形式的蛋白质，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人类)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在一个具体实施例中，抗原是人蛋白质。当提及本文中的特定蛋白质时，该术语涵盖“全长”、未加工的蛋白质，以及由细胞内加工而产生的任何形式的蛋白质。该术语还涵盖天然存在的蛋白质变体，例如剪接变体或等位基因变体。
术语“能够特异性结合到PD-L1”是指能够以足够的亲和力结合到PD-L1的抗原结合分子，使得所述抗原结合分子可用作靶向PD-L1的诊断和/或治疗剂。抗原结合分子包括但不限于抗体、多特异性抗体、Fab分子、交换型Fab分子、单链Fab分子、Fv分子、scFv分子、单结构域抗体和融合蛋白。在一个方面，如例如通过表面等离子体共振(SPR)测量的，抗PD-L1抗原结合分子与不相关的、非PD-L1蛋白的结合程度小于抗原结合分子与PD-L1的结合的约10％。具体地，能够特异性结合到PD-L1的抗原结合分子具有以下解离常数(Kd)：≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在某些方面，抗PD-L1抗原结合分子结合到来自不同物种的PD-L1。具体地，抗PD-L1抗原结合分子结合到人和食蟹猴PD-L1。
“特异性结合”是指结合对于抗原具有选择性，并且可以与不需要的或非特异性的相互作用区分开。抗原结合分子与特定抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术(例如表面等离子体共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等人，Glyco J 17,323-329(2000))以及传统的结合测定(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))来测量。在一个实施例中，例如如通过SPR所测得的，抗原结合分子与不相关蛋白的结合程度小于所述抗原结合分子与抗原的结合程度的约10％。在某些实施例中，与抗原结合的分子的解离常数(Kd)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。
“亲和力”或“结合亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映了结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)来表示，该解离常数为解离速率常数与缔合速率常数(分别为koff和kon)之比。因此，等效亲和力可以包括不同的速率常数，只要速率常数之比保持相同即可。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些方法。用于测量亲和力的特定方法为表面等离子体共振(SPR)。
如本文所用的“靶细胞抗原”是指呈递在靶细胞表面上的抗原决定簇，该靶细胞为例如T细胞、B细胞、肿瘤中的细胞诸如癌细胞或肿瘤基质的细胞。在某些方面，靶细胞抗原为癌细胞表面上的抗原。在一个方面，靶细胞抗原为PD-L1。
术语“PD-L1”也称为CD274或B7-H1，是指来自任何脊椎动物来源的任何天然PD-L1，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，特别是指“人PD-L1”。完整人PD-L1的氨基酸序列示出于UniProt(www.uniprot.org)登录号Q9NZQ7(SEQ ID NO:37)中。术语“抗PD-L1抗体”或“与人PD-L1结合的抗体”或“与人PD-L1特异性结合的抗体”或“拮抗性抗PD-L1”是指与人PD-L1抗原特异性结合的抗体，其结合亲和力KD值为1.0×10-8mol/L或更低，并且在一个方面，KD值为1.0×10-9mol/L或更低。使用标准结合测定(诸如表面等离子体共振技术(
Figure BDA0003735632450000151
GE-Healthcare Uppsala，瑞典))来确定结合亲和力。
如本文所用，“T细胞抗原”是指存在于T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞表面上的抗原决定簇。
如本文所用，“T细胞活化性治疗剂”是指能够在受试者中诱导T细胞活化的治疗剂，特别是设计用于在受试者中诱导T细胞活化的治疗剂。T细胞活化性治疗剂的实例包括特异性结合活化性T细胞抗原，诸如CD3和靶细胞抗原诸如CEA或叶酸受体的双特异性抗体。
如本文所用，“活化性T细胞抗原”是指通过T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞表达的抗原决定簇，其在与抗原结合分子相互作用时能够诱导或增强T细胞活化。具体而言，抗原结合分子与活化性T细胞抗原的相互作用可通过触发T细胞受体复合物的信号传导级联来诱导T细胞活化。示例性的活化性T细胞抗原是CD3。
除非另外指明，否则术语“CD3”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然CD3，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长”的未加工CD3，以及由细胞中的加工所产生的任何形式的CD3。该术语还涵盖CD3的天然存在的变体，例如剪接变体或等位基因变体。在一个实施例中，CD3是人CD3，特别是人CD3的ε亚基(CD3ε)。人CD3ε的氨基酸序列以UniProt(www.uniprot.org)登录号P07766(144版)或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_000724.1示出。还可参见SEQ ID NO:59。食蟹猴[Macaca fascicularis]CD3ε的氨基酸序列示出于UniProt(www.uniprot.org)登录号Q95LI5中。还可参见SEQ ID NO:60。
术语“可变结构域”或“可变区”是指参与抗原结合分子与抗原的结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如，Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指抗原结合可变结构域中在序列上高变并确定抗原结合特异性的各个区域，例如“互补决定区”(“CDR”)。通常，抗原结合结构域包含六个CDR；三个在VH中(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，并且三个在VL中的(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。本文中的示例性CDR包括：
(a)出现在以下氨基酸残基处的高可变环：26至32(L1)、50至52(L2)、91至96(L3)、26至32(H1)、53至55(H2)和96至101(H3)(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)出现在以下氨基酸残基处的CDR：24至34(L1)、50至56(L2)、89至97(L3)、31至35b(H1)、50至65(H2)和95至102(H3)(Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991))；以及
(c)出现在以下氨基酸残基处的抗原接触点：27c至36(L1)、46至55(L2)、89至96(L3)、30至35b(H1)、47至58(H2)，以及93至101(H3)(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996))。
除非另外指明，否则CDR根据出处同上的Kabat等人所述的方法确定。本领域的技术人员将理解，CDR名称也可以根据出处同上的Chothia所述的方法、出处同上的McCallum所述的方法或者任何其他在科学上接受的命名法来确定。Kabat等人还定义了适用于任何抗体的可变区序列的编号***。本领域普通技术人员可以明确地将该“Kabat编号”***分配给任何可变区序列，而不依赖于序列本身之外的任何实验数据。如本文所用，“Kabat编号”是指由Kabat等人，U.S.Dept.of Health and Human Services,"Sequence ofProteins of Immunological Interest"(1983)所述的编号***。除非另有说明，否则提及抗体可变区中特定氨基酸残基位置的编号是根据Kabat编号***。
如本文所用，术语“亲和力成熟的”在抗原结合分子(例如抗体)的上下文中是指源自参考抗原结合分子的抗原结合分子，例如通过突变，结合与参考抗体相同的抗原，优选结合相同的表位；并且具有比参考抗原结合分子更高的对抗原的亲和力。亲和力成熟通常涉及抗原结合分子的一个或多个CDR中的一个或多个氨基酸残基的修饰。通常，亲和力成熟的抗原结合分子结合与初始参考抗原结合分子相同的表位。
“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常在VH(或VL)中以如下序列出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
出于本文目的的“受体人框架”是这样的框架，其包含来源于如下所定义的人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列。“来源于”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含与所述人免疫球蛋白框架或人共有框架相同的氨基酸序列，或者其可以包含氨基酸序列变化。在一些实施例中，氨基酸变化的数量为10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少，或2个或更少。在一些实施例中，VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。
术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，在所述抗体中重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同的来源或物种。
抗体的“类别”是指抗体的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的若干可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
术语“衍生自人源的恒定区”或“人恒定区”表示亚类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的人抗体的恒定重链区和/或恒定轻链κ或λ区。此类恒定区在现有技术中是众所周知的并且例如，通过以下描述的：Kabat，E.A.，等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)(还参见，例如Johnson，G.，和Wu，T.T.，Nucleic Acids Res.28(2000)214-218；Kabat，E.A.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72(1975)2785-2788)。除非本文另外规定，否则恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号***，EU编号***也称为Kabat的EU索引，如在Kabat，E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)，NIHPublication 91-3242中所述。
“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施例中，人源化抗体将基本上包含所有的至少一个，通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的HVR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。“人源化形式”的抗体，例如非人抗体，是指已经经历进行过人源化的抗体。本发明涵盖的其他形式的“人源化抗体”是这样的抗体，相对于原始抗体，所述抗体中的恒定区已经经过了另外修饰或改变，以产生根据本发明的性质，特别是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合的性质。
“人”抗体是这样的抗体，其具有的氨基酸序列与由人或人细胞产生的或来源于利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列相对应。人抗体的该定义特别地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
本文中的术语“Fc结构域”或“Fc区”用于定义含有恒定区的至少一部分的抗体重链C-末端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施例中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，由宿主细胞产生的抗体可以经历对来自重链C端的一个或更多个(特别是一个或两个)氨基酸的翻译后切割。因此，由宿主细胞通过表达编码全长重链的特定核酸分子所产生的抗体可以包括全长重链，或者该抗体可以包括全长重链的经切割变体。这可能是重链的最后两个C端氨基酸为甘氨酸(G446)和赖氨酸(K447，根据Kabat EU索引编号)时的情况。因此，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)或者C端甘氨酸(Gly446)和赖氨酸(Lys447)可能存在，也可能不存在。如果没有另外指明，则包含Fc区的重链的氨基酸序列在本文中被表示为没有C末端甘氨酸-赖氨酸二肽。在一个实施例中，包括如本文所指定的Fc区的重链包含在根据本发明的抗体中，该重链包含另外的C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat的EU索引编号)。在一个实施例中，包括如本文所指定的Fc区的重链包含在根据本发明的抗体中，该重链包含另外的C末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat的EU索引编号)。除非本文另外规定，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号***，EU编号***也称为EU索引，如在Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1991中所述。IgG Fc区包含IgG CH2结构域和IgG CH3结构域。人IgGFc区的“CH2结构域”通常从大致231位的氨基酸残基延伸至大致340位的氨基酸残基。在一个实施例中，碳水化合物链附接至CH2结构域。本文的CH2结构域可以是天然序列CH2结构域或变体CH2结构域。“CH3结构域”包含Fc区中CH2结构域C末端的一段残基(即，从IgG的约341位的氨基酸残基到约447位的氨基酸残基)。本文的CH3区可以是天然序列CH3结构域或变体CH3结构域(例如在一条链中具有引入的“凸起”(“杵”)而在其另一条链中具有相应的引入的“空腔”(“臼”)的CH3结构域；参见美国专利号5,821,333，其以引用方式明确并入本文)。此类变体CH3结构域可用于促进如本文所述的两条不相同的抗体重链的异源二聚化。
“杵臼(knob-into-hole)”技术描述于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng 9,617-621(1996)和Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)中。一般来讲，该方法涉及在第一多肽的界面处引入凸起(“杵”)并且在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“臼”)，使得所述凸起可以定位在所述空腔中，以便促进异源二聚体的形成并且阻碍同源二聚体的形成。凸起是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建的。具有与凸起相同或相似大小的补偿空腔是通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链而在第二多肽的界面中创建的。凸起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸(例如通过位点特异性诱变或通过肽合成)来制备。在一个具体实施例中，杵修饰包含Fc结构域的两个亚基中的一个中的氨基酸取代T366W，而臼修饰包含Fc结构域的两个亚基中的另一个中的氨基酸取代T366S、L368A和Y407V。在另一个具体实施例中，包含杵修饰的Fc结构域的亚基另外包含氨基酸取代S354C，而包含臼修饰的Fc结构域的亚基另外包含氨基酸取代Y349C。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc区的两个亚基之间形成二硫桥，从而进一步稳定化二聚体(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。编号是根据Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD，1991的EU索引。
“与免疫球蛋白的Fc区等同的区域”旨在包括免疫球蛋白的Fc区的天然存在的等位基因变体，以及具有产生取代、添加或缺失但基本上不降低免疫球蛋白介导效应子功能(诸如抗体依赖性细胞毒性)的能力的修改的变体。例如，可以使一个或多个氨基酸从免疫球蛋白的Fc区的N末端或C末端缺失，而基本上不丧失生物学功能。可以根据本领域中已知的一般规则来选择此类变体，以便对活性具有最小的影响(参见例如Bowie，J.U.等人，Science 247:1306-10(1990))。
术语“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区、随着抗体同种型的变化而变化的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)，以及B细胞活化。
“活化Fc受体”是这样的Fc受体，其在抗体的Fc区接合后，引起刺激携带受体的细胞执行效应子功能的信号传导事件。活化Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。特定的活化Fc受体是人FcγRIIIa(参见UniProt登录号P08637，版本141)。
术语“TNF配体家族成员”或“TNF家族配体”是指促炎细胞因子。一般而言，细胞因子，且特别是TNF配体家族的成员，在免疫***的刺激和协调中起着至关重要的作用。目前，基于序列、功能和结构的相似性，已将十九种细胞因子鉴定为TNF(肿瘤坏死因子)配体超家族的成员。所有这些配体都是II型跨膜蛋白，具有C端细胞外结构域(胞外域)、N端细胞内结构域和单个跨膜结构域。C端细胞外结构域，称为TNF同源结构域(THD)，在超家族成员之间具有20-30％的氨基酸同一性，并且负责与受体结合。TNF胞外域还负责使TNF配体形成被其特定受体识别的三聚复合物。TNF配体家族的成员选自由以下所组成的组：淋巴毒素α(也称为LTA或TNFSF1)、TNF(也称为TNFSF2)、LTβ(也称为TNFSF3)、OX40L(也称为TNFSF4)、CD40L(也称为CD154或TNFSF5)、FasL(也称为CD95L、CD178或TNFSF6)、CD27L(也称为CD70或TNFSF7)、CD30L(也称为CD153或TNFSF8)、4-1BBL(也称为TNFSF9)、TRAIL(也称为APO2L、CD253或TNFSF10)、RANKL(也称为CD254或TNFSF11)、TWEAK(也称为TNFSF12)、APRIL(也称为CD256或TNFSF13)、BAFF(也称为CD257或TNFSF13B)、LIGHT(也称为CD258或TNFSF14)、TL1A(也称为VEGI或TNFSF15)、GITRL(也称为TNFSF18)、EDA-A1(也称为外异蛋白A1)和EDA-A2(也称为外异蛋白A2)。除非另有说明，否则该术语是指来自任何脊椎动物来源的任何天然TNF家族配体，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。术语“共刺激TNF配体家族成员”或“共刺激TNF家族配体”是指TNF配体家族成员的一个亚组，其能够协同刺激T细胞的增殖和细胞因子产生。这些TNF家族配体可以在与其相应的TNF受体相互作用后共同刺激TCR信号，并且与其受体的相互作用导致TNFR相关因子(TRAF)的募集，从而启动导致T细胞活化的信号级联反应。共刺激TNF家族配体选自由4-1BBL、OX40L、GITRL、CD70、CD30L和LIGHT组成的组，更特别地，共刺激TNF配体家族成员为4-1BBL。
如前文所述，4-1BBL为一种II型跨膜蛋白，并且是TNF配体家族的一个成员。已经描述了具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的完整或全长4-1BBL在细胞表面形成三聚体。三聚体的形成是由4-1BBL胞外域的特异性基序促成的。所述基序在本文中被指定为“三聚化区域”。人4-1BBL序列(SEQ ID NO:39)的氨基酸50-254形成了4-1BBL的细胞外结构域，但即使是其片段也能够形成三聚体。在本发明的具体实施例中，术语“4-1BBL胞外域或其片段”是指具有选自SEQ ID NO:4(人4-1BBL的氨基酸52-254)、SEQ ID NO:1(人4-1BBL的氨基酸71-254)、SEQ ID NO:3(人4-1BBL的氨基酸80-254)和SEQ ID NO:2(人4-1BBL的氨基酸85-254)的氨基酸序列的多肽，或者具有选自SEQ ID NO:5(人4-1BBL的氨基酸71-248)、SEQ ID NO:8(人4-1BBL的氨基酸52-248)、SEQ ID NO:7(人4-1BBL的氨基酸80-248)和SEQ ID NO:6(人4-1BBL的氨基酸85-248)的氨基酸序列的多肽，但能够三聚化的胞外域的其他片段也包括在本文中。
“胞外域”是延伸到细胞外空间(即靶细胞外的空间)的膜蛋白的结构域。胞外域通常是蛋白质的启动与表面接触从而导致信号转导的部分。因此，本文定义的TNF配体家族成员的胞外域是指TNF配体蛋白的延伸到细胞外空间中的部分(细胞外结构域)，但也包括其负责三聚化和用于与相应的TNF受体结合的较短部分或片段。因此，术语“TNF配体家族成员的胞外域或其片段”是指形成细胞外结构域的TNF配体家族成员的细胞外结构域或其仍然能够与受体结合的部分(受体结合结构域)。
术语“肽接头”是指包含一个或多个氨基酸，通常约2至20个氨基酸的肽。肽接头是本领域中已知的或在本文中描述的。合适的非免疫原性连接肽是例如(G4S)n、(SG4)n或G4(SG4)n肽接头，其中“n”通常为介于1与10之间、通常介于1与4之间的数字，特别地是2，即选自由以下项组成的组的肽：GGGGS(SEQ ID NO:40)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:36)、SGGGGSGGGG(SEQ ID NO:41)、(G4S)3或GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:42)、GGGGSGGGGSGGGG或G4(SG4)2(SEQ ID NO:43)、和(G4S)4或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:44)，但是还包括序列GSPGSSSSGS(SEQ ID NO:45)、GSGSGSGS(SEQ ID NO:46)、GSGSGNGS(SEQ ID NO:47)、GGSGSGSG(SEQ ID NO:48)、GGSGSG(SEQ ID NO:49)、GGSG(SEQ ID NO:50)、GGSGNGSG(SEQID NO:51)、GGNGSGSG(SEQ ID No:52)和GGNGSG(SEQ ID NO:53)。特定目标肽接头为(G4S)1或GGGGS(SEQ ID NO:40)、(G4S)2或GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:36)、(G4S)3(SEQ ID NO:42)和(G4S)4(SEQ ID NO:44)。
如本申请中所用的术语“氨基酸”表示包括以下项的天然存在的羧基α-氨基酸的组：丙氨酸(三字母代码：ala，单字母代码：A)、精氨酸(arg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、赖氨酸(lys，K)、蛋氨酸(met，M)、苯丙氨酸(phe，F)、脯氨酸(pro，P)、丝氨酸(ser，S)、苏氨酸(thr，T)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸(tyr，Y)，以及缬氨酸(val，V)。
如本文所用，“融合多肽”或“融合蛋白”是指包括抗体片段和不源自抗体的肽的单链多肽。在一个方面，融合多肽由与抗原结合结构域的部分或Fc部分融合的一个或两个4-1BBL胞外域或其片段组成。融合可以通过将抗原结合部分的N或C端氨基酸经由肽接头直接与所述4-1BBL胞外域或其片段的C端或N端氨基酸连接而发生。
“融合”或“连接”意指组分(例如多肽和所述TNF配体家族成员的胞外域)通过肽键、直接或经由一个或多个肽接头连接。
相对于参考多肽(蛋白质)序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基并引入缺口(如果需要的话)以实现最大的序列同一性百分比后，并且在不将任何保守取代考虑为所述序列同一性的一部分的情况下，与所述参考多肽序列中的氨基酸残基相同的所述候选序列中的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用公众可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN.SAWI或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，为了本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2来生成氨基酸序列同一性％的值。ALIGN-2序列比较计算机程序由基因泰克公司(Genentech,Inc.)编写，并且源代码已经与用户文档一起提交到U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559，在那里以美国版权登记号TXU510087注册。ALIGN-2程序可从基因泰克公司(Genentech,Inc.,South San Francisco,California)公开获得，或者可以从所述源代码编译。ALIGN-2程序应经编译以在UNIX操作***上使用，所述UNIX操作***包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设置并且不变。在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(其可以替代地表达为给定氨基酸序列A具有或包含与给定氨基酸序列B的某一氨基酸序列同一性％)计算如下：
100乘以分数X/Y
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序对A和B的比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，而其中Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A与B的氨基酸序列同一性％将不等于B与A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别指明，否则本文所使用的所有氨基酸序列同一性％的值是如前一段中所述使用ALIGN-2计算机程序获得的。
在某些实施例中，考虑了本文所提供的含TNF配体三聚体的抗原结合分子的氨基酸序列变体。例如，可能需要改善含TNF配体三聚体的抗原结合分子的结合亲和力和/或其他生物学特性。含TNF配体三聚体的抗原结合分子的氨基酸序列变体可以通过向编码分子的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内残基的缺失、和/或***和/或取代。可以进行缺失、***和取代的任何组合以实现最终构建体，前提条件是最终构建体具有所需特征，例如抗原结合。用于取代诱变的目标位点包括HVR和框架(FR)。保守性取代在表B中表头“优选的取代”下提供，并在下文中参考氨基酸侧链类别(1)至(6)进一步描述。可以将氨基酸取代引入目标分子中，并对产物进行所需活性(例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC)筛选。
表A
Figure BDA0003735632450000251
可根据共同的侧链特性将氨基酸分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代将需要用这些类别中的一个的成员交换另一类别。
术语“氨基酸序列变体”包括实质性变体，其中在亲本抗原结合分子(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基中存在氨基酸取代。通常，相对于亲本抗原结合分子，选为用于进一步研究的一个或多个所得变体将在某些生物学特性方面(例如，亲和力增加、免疫原性降低)有改变(例如，改善)和/或将基本上保留亲本抗原结合分子的某些生物学特性。示例性取代变体是亲和力成熟抗体，其可例如使用诸如本文所述的那些基于噬菌体展示的亲和力成熟技术方便地生成。简而言之，将一个或多个CDR残基突变并且将变体抗原结合分子展示在噬菌体上并针对特定生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。在某些实施例中，取代、***或缺失可发生在一个或多个CDR内，只要此类改变基本上不降低抗原结合分子的结合抗原的能力即可。例如，可在CDR中进行基本上不降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文提供的保守性取代)。可用于鉴别可被靶向诱变的抗体残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述。在此方法中，鉴别残基或一组靶残基(例如，带电残基，诸如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并用中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)替换以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可在对初始取代展示功能敏感性的氨基酸位置引入其他取代。替代地或另外地，利用抗原-抗原结合分子复合物的晶体结构鉴别抗体与抗原之间的接触点。可靶向或消除作为取代的候选的此类接触残基和相邻残基。可筛选变体以确定它们是否具备期望的特性。
氨基酸序列***包括长度范围为一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及一个或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的实例包括具有N端甲硫氨酰残基的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子。分子的其他***变体包括与增加含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的血清半衰期的多肽的N端或C端融合。
在某些实施例中，改变本文提供的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子以增加或降低抗体糖基化的程度。可通过改变氨基酸序列，使得产生或去除一个或多个糖基化位点，从而便利地获得分子的糖基化变体。当含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子包含Fc区时，与其连接的碳水化合物可以被改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含支链的、双触角寡糖，所述双触角寡糖通常通过N-键结连接至Fc区的CH2结构域的Asn297。参见，例如，Wright等人TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及附接于双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施例中，可以对含有4-1BBL配体三聚体的抗原结合分子中的寡糖进行修饰，以产生具有某些改善的特性的变体。在一个方面，提供了含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的变体，其具有缺乏连接(直接地或间接地)至Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。此类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能，参见例如美国专利公开文本No.US 2003/0157108(Presta,L.)或US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的其他变体包括具有两分型寡糖的变体，例如其中连接至Fc区的双触角寡糖是通过GlcNAc两分的。此类变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能，参见例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利号6,602,684(Umana等人)；以及US2005/0123546(Umana等人)。还提供了在附接于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的变体。此类抗体变体可具有改善的CDC功能并描述于例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO1998/58964(Raju,S.)；以及WO 1999/22764(Raju,S.)中。
在某些实施例中，可期望产生本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的半胱氨酸工程化改造的变体，例如“thioMAb”，其中分子的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定实施例中，取代的残基存在于分子的可接近位点。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点，并且可用于将抗体与其他部分，诸如药物部分或接头-药物部分缀合，以产生免疫缀合物。在某些实施例中，可用半胱氨酸取代下列残基中的任何一个或多个：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；以及重链Fc区的S400(EU编号)。可如例如美国专利号7,521,541中所述形成半胱氨酸工程化改造的抗原结合分子。
在某些方面，可以进一步修饰本文提供的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，以使其含有本领域已知且易于获得的另外的非蛋白质部分。适合于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性示例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇以及它们的混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在制造中可具有优势。聚合物可具有任何分子量，并且可以具有支链或不具有支链。连接至抗体的聚合物的数目可变化，并且如果连接了多于一个聚合物，那么它们可以为相同或不同的分子。通常，可基于以下考虑因素确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体待改善的特定特性或功能、双特异性抗体衍生物是否将用于限定条件下的疗法等。在另一方面，提供可通过暴露于辐射而选择性加热的抗体和非蛋白质性部分的缀合物。在一个实施例中，非蛋白质性部分是碳纳米管(Kam,N.W.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA102(2005)11600-11605)。辐射可具有任何波长，并且包括但不限于对普通细胞没有伤害，但是将非蛋白质性部分加热至抗体-非蛋白质性部分附近的细胞被杀死的温度的波长。
在另一方面，可以获得本文提供的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的免疫缀合物。“免疫缀合物”是与一种或多种异源分子，包括但不限于细胞毒性剂缀合的抗体。
术语“核酸分子”或“多核苷酸”包括包含核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。每个核苷酸由碱基组成，特别是嘌呤或嘧啶碱基(即胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(即脱氧核糖或核糖)和磷酸酯基团。通常，核酸分子通过碱基序列进行描述，由此所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基序列通常表示为从5'至3'。在本文中，术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(DNA)(包括例如互补DNA(cDNA)和基因组DNA)、核糖核酸(RNA)(特别是信使RNA(mRNA))、DNA或RNA的合成形式，以及包含这些分子中的两种或更多种的混合聚合物。核酸分子可以是线性的或环状的。此外，术语核酸分子包括有义链和反义链，以及单链和双链形式。此外，本文所描述的核酸分子可含有天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的示例包括具有衍生化的糖或磷酸主链键或经化学修饰的残基的经修饰的核苷酸碱基。核酸分子还涵盖适合作为用于本发明的抗体的体外和/或体内(例如，在宿主或患者体内)直接表达的载体的DNA和RNA分子。此类DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)载体可以是未修饰的或经修饰的。例如，可以对mRNA进行化学修饰以增强RNA载体的稳定性和/或编码分子的表达，使得可以将mRNA注射到受试者体内以产生体内抗体(参见例如Stadler等人，Nature Medicine 2017，在线发表于2017年6月12日，doi:10.1038/nm.4356或EP 2 101 823B1)。
关于“分离的”核酸分子或多核苷酸，是指已经从其天然环境中移除的核酸分子，DNA或RNA。例如，编码包含在载体中的多肽的重组多核苷酸出于本发明的目的被视为分离的。分离的多核苷酸的另外的实施例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或处于溶液中的纯化的(部分地或基本上纯化的)多核苷酸。分离的多核苷酸包括多核苷酸分子，该多核苷酸分子含有在通常含有多核苷酸分子的细胞中，但该多核苷酸分子存在于染色体外或存在于与其天然染色***置不同的染色***置上。分离的RNA分子包括本发明的体内或体外RNA转录物，以及正链和负链形式和双链形式。根据本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括通过合成产生的此类分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可包括调控元件，诸如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
关于与本发明的参考核苷酸序列具有至少例如95％“一致”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸，是指除了多核苷酸序列可包括参考核苷酸序列的每100个核苷酸至多五个点突变之外，多核苷酸的核苷酸序列与参考序列是一致的。换句话讲，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95％一致的核苷酸序列的多核苷酸，参考序列中至多5％的核苷酸可缺失或被另外的核苷酸取代，或参考序列中总核苷酸的至多5％的数量的核苷酸可***到参考序列中。参考序列的这些改变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置或那些末端位置之间的任意位置，或单个地散布在参考序列的残基之中，或以一个或多个连续的组散布在参考序列内。作为一种实际情况，可以使用已知的计算机程序，诸如上文针对多肽所讨论的程序(例如ALIGN-2)，常规确定任何特定多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
术语“表达盒”是指通过重组或合成生成的多核苷酸，其具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列特定核酸元件。重组表达盒可以掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质粒DNA、病毒或核酸片段中。典型地，表达载体的重组表达盒部分除其他序列之外还包括待转录的核酸序列和启动子。在某些实施例中，本发明的表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
术语“载体”或“表达载体”与“表达构建体”是同义的并且是指用于将特定基因引入与其可操作地关联的靶细胞中并指导所述基因的表达的DNA分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及并入其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体允许大量稳定mRNA的转录。一旦表达载体处于靶细胞内部，即通过细胞转录和/或翻译机制产生由该基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。在一个实施例中，本发明的表达载体包含表达盒，所述表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
术语“宿主细胞”“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指外源核酸已被引入其中的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和来源于所述原代转化细胞的子代，不考虑传代次数。子代可能不与亲本细胞的核酸内容物完全一致，而是可能含有突变。本文包括如在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。宿主细胞是可以用于生成本发明的双特异性抗原结合分子的任何类型的细胞***。宿主细胞包括培养的细胞，举几个例子，例如培养的哺乳动物细胞，诸如CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞，以及包括在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中的细胞。
药剂的“有效量”是指在其所施用的细胞或组织中产生生理学变化所需的量。
药剂(例如药物组合物)的“治疗有效量”是指在必需的剂量和时段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。治疗有效量的药剂例如消除、减少、延迟、最小化或预防疾病的不良影响。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。具体地，个体或受试者是人。
术语“药物组合物”是指处于允许包含在其中的活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对于将被施用配制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外组分的制剂。
“药用赋形剂”是指药物组合物中除有效成分之外的成分，其对受试者无毒。药用赋形剂包括但不限于缓冲剂、稳定剂或防腐剂。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包括的说明书，其含有涉及此类治疗产品的使用的有关适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变型，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变所治疗个体的自然进程的临床干预，并且可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施例中，本发明的分子用于延迟疾病的发展或用于减缓疾病的进展。
如本文所用的术语“癌症”是指增生性疾病，诸如多种淋巴瘤、癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、白血病、淋巴细胞性白血病、肺癌、非小细胞肺(NSCL)癌、支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、结肠直肠癌(CRC)、胰腺癌、乳腺癌、阴性乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子***、***癌、外阴癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌***癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、***癌、***癌、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆管癌、中枢神经***(CNS)肿瘤、脊椎轴肿瘤、脑干胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、成髓细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤和尤文氏肉瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、B细胞癌症(淋巴瘤)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、毛细胞白血病、慢性骨髓性白血病，包括以上癌症中的任一种的难治性型式，或一种或多种以上癌症的组合。
“晚期”癌症是指由于局部侵袭或转移而扩散到原发部位或器官之外的癌症。因此，术语“晚期”癌症包括局部晚期和转移性疾病。
“复发性”癌症是指对初始疗法(例如手术)产生应答后，在初始部位或远处复发的癌症。“局部复发”癌症是指在治疗后与先前治疗过的癌症在同一位置复发的癌症。“可手术的”或“可切除的”癌症是局限于主要器官且适合手术(切除)的癌症。“非可切除的”或“不可切除的”癌症不能通过手术去除(切除)。
本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子
本发明提供了含有4-1BBL三聚体的新型抗原结合分子，其具有特别有利的特性，诸如可生产性、稳定性、结合亲和力、生物活性、靶向效率、降低的毒性和降低的免疫原性。
在第一方面，本发明提供了一种含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其包含
(a)能够与PD-L1特异性结合的抗原结合结构域，
(b)第一多肽和第二多肽，所述第一多肽和所述第二多肽通过二硫键彼此连接，
其中所述抗原结合分子的特征在于，所述第一多肽包含通过肽接头彼此连结的两个4-1BBL胞外域或其片段，并且特征在于，所述第二多肽包含一个4-1BBL胞外域或其片段，和
(c)Fc结构域，所述Fc结构域包含能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基。
在进一步方面，提供了如前文所定义的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其包含
(a)能够与PD-L1特异性结合的抗原结合结构域，和
(b)第一多肽和第二多肽，所述第一多肽和所述第二多肽通过二硫键彼此连接，
其中抗原结合分子的特征在于
(i)分别地，第一多肽含有CH1或CL结构域并且第二多肽含有CL或CH1结构域，其中第二多肽通过CH1和CL结构域之间的二硫键连接到第一多肽，并且其中第一多肽包含通过肽接头彼此连结并且连结至CH1或CL结构域的4-1BBL的两个胞外域或其片段，并且其中第二多肽包含经由肽接头连结至所述多肽的CL或CH1结构域的所述4-1BBL的一个胞外域或其片段，或
(ii)分别地，第一多肽含有CH3结构域并且第二多肽含有CH3结构域，并且其中第一多肽包含通过肽接头彼此连结并且连结至CH3结构域的C末端的4-1BBL的两个胞外域或其片段，并且其中第二多肽包含经由肽接头连结至所述多肽的CH3结构域的C末端的所述4-1BBL的仅一个胞外域或其片段，或
(iii)分别地，第一多肽含有VH-CL或VL-CH1结构域并且第二多肽含有VL-CH1结构域或VH-CL结构域，其中第二多肽通过CH1和CL结构域之间的二硫键连接到第一多肽，并且其中第一多肽包含通过肽接头彼此连结并且连结至VH或VL的4-1BBL的两个胞外域或其片段，并且其中第二多肽包含经由肽接头连结至所述多肽的VL或VH的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，和
(c)Fc结构域，所述Fc结构域包含能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基。
在另一方面，提供了如前文所定义的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其包含
(a)能够与PD-L1特异性结合的抗原结合结构域，和
(b)第一多肽和第二多肽，所述第一多肽和所述第二多肽通过二硫键彼此连接，
其中抗原结合分子的特征在于
(i)分别地，第一多肽含有CH1或CL结构域并且第二多肽含有CL或CH1结构域，其中第二多肽通过CH1和CL结构域之间的二硫键连接到第一多肽，并且其中第一多肽包含通过肽接头彼此连结并且连结至CH1或CL结构域的4-1BBL的两个胞外域或其片段，并且其中第二多肽包含经由肽接头连结至所述多肽的CL或CH1结构域的所述4-1BBL的一个胞外域或其片段，或
(ii)分别地，第一多肽含有CH3结构域并且第二多肽含有CH3结构域，并且其中第一多肽包含通过肽接头彼此连结并且连结至CH3结构域的C末端的4-1BBL的两个胞外域或其片段，并且其中第二多肽包含经由肽接头连结至所述多肽的CH3结构域的C末端的所述4-1BBL的仅一个胞外域或其片段，和
(c)Fc结构域，所述Fc结构域包含能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基。
在一个方面，4-1BBL胞外域包含选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的氨基酸序列。更特别地，4-1BBL胞外域包含SEQID NO:1或SEQ ID NO:5的氨基酸序列。最特别地，4-1BBL胞外域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。特别地，提供了如前文所定义的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中4-1BBL的所有三个胞外域或其片段是相同的。
因此，提供了一种含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其包含
(a)至少一个Fab分子，其能够与PD-L1特异性结合；
(b)第一多肽和第二多肽，所述第一多肽和所述第二多肽通过二硫键彼此连接，
其中抗原结合分子的特征在于
(i)分别地，第一多肽含有CH1或CL结构域并且第二多肽含有CL或CH1结构域，其中第二多肽通过CH1和CL结构域之间的二硫键连接到第一多肽，并且其中第一多肽包含通过肽接头彼此连结并且与CH1或CL结构域连结的4-1BBL的两个胞外域，该胞外域包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，并且其中第二多肽包含经由肽接头连结到所述多肽的CL或CH1结构域的所述4-1BBL的一个胞外域，该胞外域包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，或
(ii)分别地，第一多肽含有CH3结构域并且第二多肽含有CH3结构域，并且其中第一多肽包含通过肽接头彼此连结并且与CH3结构域的C末端连结的4-1BBL的两个胞外域，该胞外域包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，并且其中第二多肽包含经由肽接头连结到所述多肽的CH3结构域的C末端的所述4-1BBL的仅一个胞外域，该胞外域包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，或
(iii)分别地，第一多肽含有VH-CL或VL-CH1结构域并且第二多肽含有VL-CH1结构域或VH-CL结构域，其中第二多肽通过CH1和CL结构域之间的二硫键连接到第一多肽，并且其中第一多肽包含通过肽接头彼此连结并且与VH或VL连结的4-1BBL的两个胞外域，该胞外域包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，并且其中第二多肽包含经由肽接头连结到所述多肽的VL或VH的所述4-1BBL的一个胞外域，该胞外域包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，和
(c)Fc结构域，所述Fc结构域包含能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基。
在进一步方面，本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子包含
(a)能够与PD-L1特异性结合的抗原结合结构域，
(b)第一多肽和第二多肽，所述第一多肽和所述第二多肽通过二硫键彼此连接，
其中所述抗原结合分子的特征在于，所述第一多肽包含选自由SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12组成的组的氨基酸序列，并且特征在于，所述第二多肽包含选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成的组的氨基酸序列，和
(c)Fc结构域，所述Fc结构域包含能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基。
在一个方面，本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子包含
(a)能够与PD-L1特异性结合的抗原结合结构域，
(b)第一多肽和第二多肽，所述第一多肽和所述第二多肽通过二硫键彼此连接，
其中抗原结合分子的特征在于第一多肽包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列并且特征在于第二多肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，和
(c)Fc结构域，所述Fc结构域包含能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基。
在进一步方面，本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子包含
(a)能够与PD-L1特异性结合的抗原结合结构域，
(b)第一多肽和第二多肽，所述第一多肽和所述第二多肽通过二硫键彼此连接，
其中抗原结合分子的特征在于第一多肽包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列并且特征在于第二多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，和
(c)Fc结构域，所述Fc结构域包含能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基。
在另一方面，本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子包含
(a)能够与PD-L1特异性结合的抗原结合结构域，
(b)分别含有CH1或CL结构域的第一多肽和含有CL或CH1结构域的第二多肽，其中第二多肽通过CH1和CL结构域之间的二硫键与第一多肽连接，
并且其中该抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连结以及连结至CH1或CL结构域的两个4-1BBL胞外域或其片段，并且特征在于，第二多肽包含通过肽接头与所述多肽的CL或CH1结构域连结的仅一个4-1BBL胞外域或其片段。
在一个方面，提供了一种含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其包含
(a)能够与PD-L1特异性结合的抗原结合结构域，
(b)含有CH1结构域的第一多肽和含有CL结构域的第二多肽，其中第二多肽通过CH1和CL结构域之间的二硫键与第一多肽连接，并且其中该抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连结以及连结至CH1结构域的两个4-1BBL胞外域或其片段，并且特征在于，第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CL结构域连结的一个4-1BBL胞外域或其片段。
在另一方面，本发明提供了一种含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其包含
(a)一个抗原结合结构域，其能够与PD-L1特异性结合；和
(b)第一多肽和第二多肽，所述第一多肽和所述第二多肽通过二硫键彼此连接，
其中所述抗原结合分子的特征在于，所述第一多肽包含通过肽接头彼此连结的两个4-1BBL胞外域或其片段，并且特征在于，所述第二多肽包含一个4-1BBL胞外域或其片段，和
(c)Fc结构域，所述Fc结构域包含能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基。
在又另一方面，本发明提供了一种含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其包含
(a)多于一个抗原结合结构域，其能够与PD-L1特异性结合；和
(b)第一多肽和第二多肽，所述第一多肽和所述第二多肽通过二硫键彼此连接，
其中所述抗原结合分子的特征在于，所述第一多肽包含通过肽接头彼此连结的两个4-1BBL胞外域或其片段，并且特征在于，所述第二多肽包含一个4-1BBL胞外域或其片段，和
(c)Fc结构域，所述Fc结构域包含能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基。
在一个方面，本发明提供了一种含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其包含
(a)两个抗原结合结构域，其能够与PD-L1特异性结合；和
(b)第一多肽和第二多肽，所述第一多肽和所述第二多肽通过二硫键彼此连接，
其中所述抗原结合分子的特征在于，所述第一多肽包含通过肽接头彼此连结的两个4-1BBL胞外域或其片段，并且特征在于，所述第二多肽包含一个4-1BBL胞外域或其片段，和
(c)Fc结构域，所述Fc结构域包含能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基。
在进一步方面，本发明提供了一种如前文所定义的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中能够与PD-L1特异性结合的抗原结合结构域选自由抗体或抗体片段组成的组。
在一个方面，提供了一种如前文所述的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中能够与PD-L1特异性结合的抗原结合结构域选自由抗体片段、Fab分子、交叉Fab分子、单链Fab分子、Fv分子、scFv分子、单结构域抗体或aVH组成的组。在一个方面，能够与PD-L1 a VH和VL结构域特异性结合的抗原结合结构域。
在特定方面，提供了一种含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中能够与PD-L1特异性结合的抗原结合结构域为能够与PD-L1特异性结合的Fab分子或交叉Fab分子。特别地，能够与PD-L1特异性结合的抗原结合结构域为能够与PD-L1特异性结合的Fab。
在进一步方面，提供了一种根据本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连结的4-1BBL的两个胞外域或其片段的肽在其C末端与通过第二肽接头连结到重链的CH1结构域融合，并且其中所述4-1BBL的一个胞外域或其片段在其C末端通过第三肽接头与轻链上的CL结构域融合。
在另一方面，提供了一种根据本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连结的4-1BBL的两个胞外域或其片段的肽在其C末端与通过第二肽接头连结到重链的CL结构域融合，并且其中所述4-1BBL的一个胞外域或其片段在其C末端通过第三肽接头与轻链上的CH1结构域融合。
在进一步方面，本发明涉及一种根据本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连结的4-1BBL的两个胞外域或其片段的肽在其C末端与通过第二肽接头连结到轻链的CL结构域融合，并且其中所述4-1BBL的一个胞外域或其片段在其C末端通过第三肽接头与重链的CH1结构域融合。
在特定方面，本发明涉及如上定义的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中肽接头是(G4S)2。在一个方面，第一肽接头是(G4S)2(SEQ ID NO:41)，第二肽接头是(G4S)2(SEQ ID NO:41)并且第三肽接头是(G4S)2(SEQ ID NO:41)。
在另一方面，如前文所定义的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子包含Fc结构域，该Fc结构域包含能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基。
特别地，本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子包含：(a)能够与PD-L1特异性结合的Fab分子，其中Fab重链在C末端与Fc结构域中的CH2结构域的N末端融合，和(c)Fc结构域，该Fc结构域包含能够稳定缔合的第一和第二亚基。
在进一步方面，Fc结构域是IgG，特别是IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc结构域。更具体地，Fc结构域是IgG1 Fc结构域。在一个特定方面，所述Fc结构域包含促进所述Fc结构域的所述第一亚基和所述第二亚基缔合的修饰。
减少Fc受体结合和/或效应子功能的Fc结构域修饰
本发明的含有4-1BBL三聚体抗原结合分子的Fc结构域由包含免疫球蛋白分子的重链结构域的一对多肽链组成。例如，免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc结构域是二聚体，该二聚体的每个亚基包含CH2和CH3 IgG重链恒定结构域。Fc结构域的两个亚基能够彼此稳定缔合。
Fc结构域为本发明的抗原结合分子赋予有利的药代动力学特性，包括有助于靶组织中的良好积聚的长血清半衰期和有利的组织-血液分配比。然而，与此同时，可能导致本发明的双特异性抗体不期望地靶向表达Fc受体的细胞，而不是优选的抗原携带细胞。因此，在特定方面，与天然IgG1 Fc结构域相比，本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的Fc结构域表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在一个方面，Fc基本上不结合到Fc受体和/或不诱导效应子功能。在特定方面，Fc受体是Fcγ受体。在一个方面，Fc受体是人Fc受体。在一个具体方面，Fc受体为活化的人Fcγ受体，更具体地为人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具体地为人FcγRIIIa。在一个方面，Fc结构域不诱导效应子功能。降低的效应子功能可以包括但不限于以下中的一个或多个：降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)、降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、降低的抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)、减少的细胞因子分泌、减少的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、减少的与NK细胞的结合、减少的与巨噬细胞的结合、减少的与单核细胞的结合、减少的与多形核细胞的结合、减少的直接信号传导诱导性细胞凋亡、降低的树突细胞成熟或减少的T细胞引发。
在某些方面，可将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的Fc区中，从而生成Fc区变体。Fc区变体可包含人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，其在一个或多个氨基酸位置上包含氨基酸修饰(例如取代)。
在一个特定方面，本发明提供了一种含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其包含
(a)能够与PD-L1特异性结合的抗原结合结构域，
(b)第一多肽和第二多肽，所述第一多肽和所述第二多肽通过二硫键彼此连接，
其中所述抗原结合分子的特征在于，所述第一多肽包含通过肽接头彼此连结的两个4-1BBL胞外域或其片段，并且特征在于，所述第二多肽包含一个4-1BBL胞外域或其片段，和
(c)Fc结构域，该Fc结构域包含能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基，其中Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，该一个或多个氨基酸取代减少与Fc受体的结合，特别是与Fcγ受体的结合。
在一个方面，本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的Fc结构域包含降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸突变。典型地，相同的一个或多个氨基酸突变存在于Fc结构域的两个亚基中的每一个中。特别地，Fc结构域在E233、L234、L235、N297、P331和P329位(EU编号)处包含氨基酸取代。特别地，Fc结构域包含IgG重链234和235位(EU编号)和/或329位(EU编号)的氨基酸取代。更具体地，提供了根据本发明的包含三聚体TNF家族配体的抗原结合分子，其包含在IgG重链中具有氨基酸取代L234A、L235A和P329G(“P329G LALA”，EU编号)的Fc结构域。氨基酸取代L234A和L235A是指所谓的LALA突变。氨基酸取代的“P329G LALA”组合几乎完全消除人IgG1 Fc结构域的Fcγ受体结合，如国际专利申请公开号WO 2012/130831 A1所述，所述专利申请公开还描述制备这种突变Fc结构域的方法和用于确定其特性(诸如Fc受体结合或效应子功能)的方法。“EU编号”是指根据Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD，1991的EU索引进行的编号。
具有降低的Fc受体结合和/或效应子功能的Fc结构域还包括具有Fc结构域残基238、265、269、270、297、327和329中一个或多个的取代的那些(美国专利号6,737,056)。此类Fc突变体包括在第265、269、270、297和327位氨基酸中两个或更多个处具有取代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其残基265和297被取代为丙氨酸(美国专利号7,332,581)。
在另一方面，Fc结构域为IgG4 Fc结构域。与IgG1抗体相比，IgG4抗体表现出降低的与Fc受体的结合亲和力和降低的效应子功能。在一个更具体的方面，Fc结构域是在S228位处(Kabat编号)包含氨基酸取代，具体地是氨基酸取代S228P的IgG4 Fc结构域。在一个更具体的方面，Fc结构域是包含氨基酸取代L235E和S228P以及P329G(EU编号)的IgG4 Fc结构域。WO 2012/130831中也描述了此类IgG4 Fc结构域突变体及其Fcγ受体结合特性。
可以使用本领域熟知的遗传或化学方法，通过氨基酸缺失、取代、***或修饰来制备突变Fc结构域。遗传方法可包括对编码DNA序列的位点特异性诱变、PCR、基因合成等。可以例如通过测序来验证正确的核苷酸变化。
与Fc受体的结合可以例如通过ELISA或通过表面等离子体共振(SPR)使用标准仪器(诸如BIAcore仪器(GE Healthcare))容易地确定，并且Fc受体诸如可以通过重组表达获得。本文描述了合适的此类结合测定。替代地，可以使用已知表达特定Fc受体的细胞系(诸如表达FcγIIIa受体的人NK细胞)来评估Fc结构域或包含Fc结构域的细胞活化双特异性抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力。
Fc结构域的效应子功能，或本发明的包含Fc结构域的双特异性抗体，可以通过本领域已知的方法来测量。本文描述了用于测量ADCC的合适的测定法。用于评估目标分子的ADCC活性的体外测定的其他示例描述于美国专利号5,500,362；Hellstrom等人，Proc NatlAcad Sci USA 83,7059-7063(1986)和Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 82,1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337；Bruggemann等人，J Exp Med 166,1351-1361(1987)。替代地，可以采用非放射性测定方法(参见，例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；以及CytoTox
Figure BDA0003735632450000421
非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI))。用于此类测定的有用效应物细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。替代地或另外地，可例如在诸如在Clynes等人，ProcNatl Acad Sci USA 95,652-656(1998)中公开的动物模型中体内评定目标分子的ADCC活性。
在一些实施例中，Fc结构域与补体组分，特别是C1q的结合减少。因此，在一些实施例中，其中Fc结构域经工程化以具有降低的效应子功能，所述降低的效应子功能包括降低的CDC。可以进行C1q结合测定以确定本发明的双特异性抗体是否能够结合C1q并因此具有CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可以执行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人，J Immunol Methods 202,163(1996)；Cragg等人，Blood 101,1045-1052(2003)；以及Cragg和Glennie，Blood 103,2738-2743(2004))。
在一个特定方面，所述Fc结构域包含促进所述Fc结构域的所述第一亚基和所述第二亚基缔合的修饰。
促进异源二聚化的Fc结构域修饰
在一个方面，本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子包含(a)抗原结合结构域，该抗原结合结构域能够与PD-L1特异性结合，
(b)第一多肽和第二多肽，所述第一多肽和所述第二多肽通过二硫键彼此连接，
其中所述抗原结合分子的特征在于，所述第一多肽包含两个4-1BBL胞外域或其片段，所述两个胞外域或其片段通过肽接头彼此连结，并且在于，所述第二多肽包含一个4-1BBL胞外域或其片段，和(c)Fc结构域，所述Fc结构域与由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基组成。因此，它们包含不同的部分，与通常包含在两条不同多肽链(“重链”)中的Fc结构域的两个亚基中的一个或另一个融合。这些多肽的重组共表达和随后的二聚化导致了两种多肽的几种可能的组合。为了在重组生产中提高含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的产率和纯度，因此将有利的是在本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的Fc结构域中引入促进所需多肽的缔合的修饰。
因此，本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的Fc结构域包含促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰。人IgG Fc结构域的两个亚基之间最广泛的蛋白质间相互作用位点在Fc结构域的CH3结构域中。因此，所述修饰特别是在Fc结构域的CH3结构域中。
在一个具体方面，所述修饰是所谓的“杵臼结构”修饰，所述修饰包括Fc结构域的两个亚基中的一个中的“杵”修饰和Fc结构域的两个亚基中的另一个中的“臼”修饰。因此，在特定方面，本发明涉及如本文上文所述的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其包含IgG分子，其中第一重链的Fc部分包含第一二聚化模块并且第二重链的Fc部分包含允许IgG分子的两个重链异二聚化的第二二聚化模块，并且第一二聚化模块包含杵，并且第二二聚化模块包含根据杵臼技术的臼。
杵臼结构技术描述于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng9，617-621(1996)和Carter，J Immunol Meth 248，7-15(2001)中。一般来讲，该方法涉及在第一多肽的界面处引入凸起(“杵”)并且在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“臼”)，使得所述凸起可以定位在所述空腔中，以便促进异源二聚体的形成并且阻碍同源二聚体的形成。凸起是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建的。具有与凸起相同或相似大小的补偿空腔是通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链而在第二多肽的界面中创建的。
因此，在一个特定方面，在本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基取代，从而在第一亚基的CH3结构域内产生凸起，所述凸起可定位于第二亚基的CH3结构域内的空腔中；而在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基取代，从而在第二亚基的CH3结构域内产生空腔，该第一亚基的CH3结构域内的凸起可定位在该空腔内。
凸起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸(例如通过位点特异性诱变或通过肽合成)来制备。
在一个具体方面，在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，366位处的苏氨酸残基被色氨酸残基(T366W)取代，而在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中，407位处的酪氨酸残基被缬氨酸残基(Y407V)取代。更具体地，在Fc结构域的第二亚基中，另外地位置366处的苏氨酸残基被丝氨酸残基(T366S)替换，并且位置368处的亮氨酸残基被丙氨酸残基(L368A)替换。更具体地，在Fc结构域的第一亚基中，另外地位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基(S354C)替换，并且在Fc结构域的第二亚基中，另外地位置349处的酪氨酸残基被半胱氨酸残基(Y349C)替换。这两个半胱氨酸残基的引入导致在Fc结构域的两个亚基之间形成二硫桥。二硫桥进一步稳定二聚体(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
在替代方面，促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰包括介导静电转向效应的修饰，例如如在PCT公开WO 2009/089004中所述。通常，该方法涉及用带电荷的氨基酸残基取代两个Fc结构域亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基，使得同源二聚体形成变得在静电上不利，但异源二聚化在静电上有利。
CH1/CL结构域的修饰
为进一步改善正确配对，含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子可包含带有不同电荷的氨基酸取代(所谓“带电残基”)。将这些修饰引入交叉或非交叉的CH1和CL结构域中。在某一特定方面，本发明涉及一种含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中在CL结构域中的一个中，位置123(EU编号)处的氨基酸已被精氨酸(R)取代并且位置124(EU编号)处的氨基酸已被赖氨酸(K)取代；并且其中在CH1结构域中的一个中，位置147(EU编号)处和位置213(EU编号)处的氨基酸已被谷氨酸(E)取代。
更特别地，本发明涉及一种含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中在与TNF配体家族成员相邻的CL结构域中，位置123(EU编号)处的氨基酸已被精氨酸(R)取代并且位置124(EU编号)处的氨基酸已被赖氨酸(K)取代；并且其中在与TNF配体家族成员相邻的CH1结构域中，位置147(EU编号)处和位置213(EU编号)处的氨基酸已被谷氨酸(E)取代。
因此，在一个特定方面，提供了一种含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其包含
(a)能够与PD-L1特异性结合的抗原结合结构域，
(b)第一多肽，其含有包含氨基酸突变E123R和Q124K的CL结构域，以及第二多肽，其含有包含氨基酸突变K147E和K213E的CH1结构域，其中第二多肽通过位于CH1结构域与CL结构域之间的二硫键与第一多肽连接，
并且其中该抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连结以及连结至CL结构域的两个4-1BBL胞外域或其片段，并且特征在于，第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CH1结构域连结的一个4-1BBL或其片段；和
(c)Fc结构域，所述Fc结构域包含能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基。
在一个方面，本发明提供了一种含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中在与TNF配体家族成员相邻的CL结构域中，位置123(EU编号)处的氨基酸已被精氨酸(R)取代并且位置124(EU编号)处的氨基酸已被赖氨酸(K)取代；并且其中在与TNF配体家族成员相邻的CH1结构域中，位置147(EU编号)处和位置213(EU编号)处的氨基酸已被谷氨酸(E)取代。这些修饰导致所谓的带电残基，其具有避免不希望的效果例如错配的有利特性。
特别地，CL结构域包含氨基酸突变E123R和Q124K，并且CH1结构域包含氨基酸突变K147E和K213E。
特别的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子
本发明提供了一种含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，该抗原结合分子包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域能够与PD-L1特异性结合。在特定方面，含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子包含一个能够与PD-L1特异性结合的部分，这意味着含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子是单价的。在另一方面，本发明提供了一种含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其包含两个能够与PD-L1特异性结合的部分，这意味着含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子是二价的。
在一个方面，本发明提供了一种含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中能够与PD-L1特异性结合的抗原结合结构域包含重链可变区(VHPD-L1)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLPD-L1)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供了一种含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中能够与PD-L1特异性结合的抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，该VH结构域包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；该VL结构域包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
在进一步方面，能够与PD-L1特异性结合的抗原结合结构域包含：重链可变区，其包含与SEQ ID NO:19的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区，其包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在进一步方面，本发明提供了一种含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中能够与PD-L1特异性结合的抗原结合结构域包含：VH结构域，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，和VL结构域，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
在进一步方面，本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子包含：(i)第一重链，其包含VH结构域，该VH结构域包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；和第一轻链，其包含VL结构域，该VL结构域包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；
(ii)第二重链，其包含选自由SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25和SEQID NO:27组成的组的氨基酸序列；和
(iii)第二轻链，其包含选自由SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26和SEQID NO:28组成的组的氨基酸序列。
在特定方面，本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子包含
(a)与PD-L1特异性结合的抗原结合结构域，其包含：重链可变区，其包含SEQ IDNO:19的氨基酸序列，和轻链可变区，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；以及
(b)第一多肽和第二多肽，所述第一多肽和所述第二多肽通过二硫键彼此连接，
其中抗原结合分子的特征在于第一多肽包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列并且第二多肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
在特定方面，提供了一种含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含：第一重链，其包含与SEQ ID NO:29的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；第一轻链，其包含与SEQ ID NO:30的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；第二重链，其包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和第二轻链，其包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供了一种含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含：第一重链，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；第一轻链，其包含SEQ IDNO:30的氨基酸序列；第二重链，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；和第二轻链，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
多核苷酸
本发明进一步提供了编码如本文所述的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子或其片段的分离的核酸分子。
编码本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的分离的多核苷酸可以表达为编码完整抗原结合分子的单个多核苷酸，或表达为共表达的多个(例如两个或更多个)多核苷酸。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以经由例如二硫键或其他手段缔合以形成功能性抗原结合分子。例如，免疫球蛋白的轻链部分可以由来自免疫球蛋白的重链部分的单独多核苷酸编码。当共表达时，重链多肽将与轻链多肽缔合以形成免疫球蛋白。
在一些方面，分离的核酸编码如本文所述的根据本发明的含有4-1BBL三聚体的完整抗原结合分子。特别地，分离的多核苷酸编码包含在如本文所述的根据本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子中的多肽。
在一个方面，本发明涉及编码含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的分离的核酸分子，其中核酸分子包含(a)编码能够与PD-L1特异性结合的抗原结合结构域的序列，(b)编码包含通过肽接头彼此连结的两个4-1BBL胞外域或其片段的多肽的序列和(c)编码包含一个所述4-1BBL胞外域或其片段的多肽的序列。
在另一方面，提供了一种编码含有4-1BB配体三聚体的抗原结合分子的分离的多核苷酸，其中该多核苷酸包含(a)编码能够与PD-L1特异性结合的部分的序列，(b)编码包含通过肽接头彼此连结的两个4-1BBL胞外域或其两个片段的多肽的序列和(c)编码包含一个4-1BBL胞外域或其片段的多肽的序列。
在某些方面，多核苷酸或核酸是DNA。在其他实施例中，本发明的多核苷酸是RNA，例如以信使RNA(mRNA)的形式。本发明的RNA可以是单链或双链的。
重组方法
本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子可以例如通过固态肽合成(例如Merrifield固相合成)或重组生产获得。对于重组生产，将例如上述编码含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的一种或多种多核苷酸分离并***至一个或多个载体中，以用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类多核苷酸可使用常规方法容易地分离并且测序。在本发明的一个方面，提供了一种载体，优选为表达载体，该载体包含本发明的多核苷酸中的一种或多种多核苷酸。可以使用本领域技术人员熟知的方法来构建含有该含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子(片段)的编码序列以及适当的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。参见例如以下文献所述的技术：Maniatis等人，MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL，Cold SpringHarbor Laboratory，N.Y.(1989)；和Ausubel等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY，Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.(1989)。表达载体可以是质粒、病毒的一部分，或者可以是核酸片段。表达载体包括表达盒，与启动子和/或其他转录或翻译控制元件可操作缔合的编码含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸(即编码区)被克隆至所述表达盒中。如本文所用，“编码区”是核酸的一部分，该部分由翻译成氨基酸的密码子组成。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)未被翻译成氨基酸，但其(如果存在的话)可被认为是编码区的一部分，而任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5'和3'非翻译区等不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可存在于单个多核苷酸构建体中(例如在单个载体上)，或在单独的多核苷酸构建体中(例如在单独的(不同的)载体上)。此外，任何载体可含有单一编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如本发明的载体可以编码一种或多种多肽，该一种或多种多肽在翻译后或翻译时通过蛋白水解切割分离成最终的蛋白质。此外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可编码异源编码区，所述异源编码区与编码本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸或其变体或衍生物融合或不融合。异源编码区包括但不限于特化元件或基序，诸如分泌信号肽或异源功能结构域。可操作缔合是当基因产物(例如多肽)的编码区以某种方式与一个或多个调控序列缔合，以使基因产物的表达处于调控序列的影响或控制下。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mRNA的转录，并且如果两个DNA片段之间的连接性质不干扰表达调控序列指导基因产物表达的能力或干扰待转录的基因模板的能力，则该两个DNA片段(诸如多肽编码区和与其相关的启动子)是“可操作地缔合的”。因此，如果启动子能够影响该核酸的转录，则启动子区域将与编码多肽的核酸可操作地缔合。启动子可以是细胞特异性启动子，该细胞特异性启动子仅在预定细胞中指导DNA的实质转录。除启动子外，其他转录控制元件，例如增强子、操纵子、阻遏物和转录终止信号，可以与多核苷酸可操作地缔合以指导细胞特异性转录。
本文公开了合适的启动子和其他转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些转录控制区包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，诸如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子区段(例如立即早期启动子结合内含子-A)、猿猴病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(诸如例如劳氏肉瘤病毒)。其他转录控制区包括来源于脊椎动物基因(诸如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔
Figure BDA0003735632450000501
珠蛋白)的那些转录控制区，以及能够控制真核细胞中基因表达的其他序列。其他合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素可诱导启动子)。类似地，各种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些翻译控制元件包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子，以及来源于病毒***的元件(特别是内部核糖体进入位点，或IRES，也称为CITE序列)。表达盒还可以包括其他特征，诸如复制起点，和/或染色体整合元件，诸如逆转录病毒长末端重复序列(LTR)，或腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌肽或信号肽的附加编码区缔合，所述附加编码区指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如，如果需要分泌含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子或其多肽片段，则可以将编码信号序列的DNA置于编码本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的核酸的上游。根据信号假设，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦已经起始跨粗面内质网输出生长的蛋白质链，该信号肽或分泌前导序列就被从成熟蛋白质上切割下来。本领域普通技术人员知道由脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有与所述多肽的N末端融合的信号肽，所述信号肽被从翻译的多肽上切割下来以产生所述多肽的分泌或“成熟”形式。在某些实施例中，使用天然信号肽(例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽)，或保留指导与其可操作地缔合的多肽分泌的能力的该序列的功能性衍生物。可替代地，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可以被人组织纤溶酶原活化剂(TPA)或小鼠β葡糖醛酸酶的前导序列取代。
编码可用于促进后续纯化的短蛋白序列(例如组氨酸标签)或帮助标记融合蛋白的DNA可包含在编码本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸的内部或在末端。
在本发明的另一方面，提供了包含一种或多种本发明的多核苷酸的宿主细胞。在某些实施例中，提供了包含一种或多种本发明的载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可以单独或组合地渗入本文中分别关于多核苷酸和载体描述的任何特征。在一个方面，宿主细胞包含载体(例如，已使用载体转化或转染)，所述载体包含编码本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子(的部分)的多核苷酸。如本文所用，术语“宿主细胞”是指可以被工程化改造以产生本发明的融合蛋白或其片段的任何种类的细胞***。适于复制和支持抗原结合分子表达的宿主细胞是本领域中熟知的。此类细胞可以用特定的表达载体适当地转染或转导，并且可以生长大量含有载体的细胞以用于接种大规模发酵罐来获得足够量的抗原结合分子用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物，诸如大肠杆菌，或各种真核细胞，诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。例如，多肽可以在细菌中产生，特别是当不需要糖基化时。多肽在表达后可以在可溶性级分中从细菌细胞糊状物中分离，并可以进一步纯化。除原核生物外，诸如丝状真菌或酵母之类的真核微生物也是用于编码多肽的载体的合适克隆或表达宿主，包括这样的真菌和酵母菌株，该真菌和酵母菌株的糖基化途径已经被“人源化”，从而导致产生具有部分或完全人糖基化模式的多肽。参见Gerngross,Nat Biotech22,1409-1414(2004)和Li等人，Nat Biotech 24,210-215(2006)。
用于表达(糖基化)多肽的合适宿主细胞还来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定出了可以与昆虫细胞结合使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的许多杆状病毒株。植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例为由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293T细胞，如例如在Graham等人，J Gen Virol 36,59(1977)中所述)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠塞尔托利氏细胞(TM4细胞，如例如在Mather,Biol Reprod 23,243-251(1980)中所述)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人***细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT060562)、TRI细胞(如例如在Mather等人，Annals N.Y.Acad Sci 383,44-68(1982)中所述)、MRC 5细胞，以及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括dhfr-CHO细胞(Urlaub等人，Proc Natl Acad Sci USA 77,4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，诸如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。关于适用于蛋白质生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，请参见例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编辑，Humana Press,Totowa,NJ)，第255-268页(2003)。宿主细胞包括培养细胞，例如仅举几个例子而言哺乳动物培养细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞，还包括转基因动物、转基因植物或培养植物或动物组织中所包含的细胞。在一个实施例中，宿主细胞是真核细胞，优选哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞或淋巴细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。用于在这些***中表达外源基因的标准技术是本领域已知的。可以对表达包含免疫球蛋白的重链或轻链的多肽的细胞进行工程化改造，以便也表达另一条免疫球蛋白链，使得表达的产物为具有重链和轻链的免疫球蛋白。
在一个方面，提供了一种生产本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的方法，其中该方法包括在适于表达本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的条件下培养包含编码如本文提供的本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸的宿主细胞，以及从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子或其多肽片段。
在本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子中，组分(至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的部分、一个包含两个4-1BBL胞外域或其片段的多肽和包含一个所述4-1BBL胞外域或其片段的多肽)不与彼此基因地融合。多肽被设计成使得其组分(两个TNF配体家族成员胞外域或其片段和其他组分诸如CH或CL)直接或通过接头序列彼此融合。接头的组成和长度可以根据本领域熟知的方法测定，并且可以测试接头的功效。本发明的抗原结合分子的不同组分之间的接头序列的实例见于本文提供的序列中。如果需要的话，还可包括另外的序列(例如内肽酶识别序列)以掺入切割位点来分离融合蛋白的各个组分。
在某些实施例中，形成抗原结合分子的部分的能够与靶细胞抗原特异性结合的部分(例如Fab片段)至少包含一个能够与抗原结合的免疫球蛋白可变区。可变区可形成天然或非天然存在的抗体及其片段的一部分并由其衍生。产生多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域熟知的(参见例如Harlow和Lane，"Antibodies,a laboratory manual",ColdSpring Harbor Laboratory,1988)。非天然存在的抗体可以使用固相肽合成来构建，可以重组产生(例如，如在美国专利号4,186,567中所述)，或者可以例如通过筛选包含可变重链和可变轻链的组合文库来获得(参见例如McCafferty的美国专利号5,969,108)。
任何动物物种的免疫球蛋白均可用于本发明。用于本发明的非限制性免疫球蛋白可以是鼠、灵长类或人来源的免疫球蛋白。如果融合蛋白旨在用于人类使用，则可以使用嵌合形式的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白的恒定区来自人。也可以根据本领域熟知的方法来制备人源化或完全人形式的免疫球蛋白(参见例如Winter的美国专利号5,565,332)。人源化可通过各种方法实现，所述各种方法包括但不限于(a)将非人(例如供体抗体)CDR移植到人(例如受体抗体)架构和恒定区上，所述架构和恒定区有或没有保留关键架构残基(例如对于保持良好的抗原结合亲和力或抗体功能来说重要的关键架构残基)，(b)仅将非人特异性决定区(SDR或a-CDR；对抗体-抗原相互作用至关重要的残基)移植到人架构和恒定区上，或者(c)移植整个非人可变结构域，但通过替换表面残基而用人样区段“隐藏”它们。人源化抗体及其制备方法在例如Almagro and Fransson,Front Biosci 13,1619-1633(2008)中综述，并且进一步描述于例如Riechmann等人,Nature 332,323-329(1988)；Queen等人,Proc Natl Acad Sci USA 86,10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Jones等人,Nature 321,522-525(1986)；Morrison等人,ProcNatl Acad Sci 81,6851-6855(1984)；Morrison and Oi,Adv Immunol 44,65-92(1988)；Verhoeyen等人,Science 239,1534-1536(1988)；Padlan,Molec Immun 31(3),169-217(1994)；Kashmiri等人,Methods 36,25-34(2005)(描述了SDR(a-CDR)移植)；Padlan,MolImmunol 28,489-498(1991)(描述了“表面再塑”)；Dall’Acqua等人,Methods 36,43-60(2005)(描述了“FR改组”)；以及Osbourn等人,Methods 36,61-68(2005)和Klimka等人,BrJ Cancer 83,252-260(2000)(描述了用于FR改组的“指导选择”方法)中。根据本发明的特定免疫球蛋白是人免疫球蛋白。可以使用本领域已知的各种技术来产生人抗体和人可变区。人抗体一般描述于van Dijk和van de Winkel,Curr Opin Pharmacol 5,368-74(2001)和Lonberg,Curr Opin Immunol 20,450-459(2008)中。人可变区可以形成通过杂交瘤方法制备的人单克隆抗体的一部分并衍生自该抗体(参见，例如Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。也可以通过以下方式来制备人抗体和人可变区：将免疫原施用于转基因动物，所述转基因动物已被修饰以产生具有对抗原激发作出应答的人可变区的完整人抗体或完整抗体(参见例如Lonberg,Nat Biotech 23,1117-1125(2005))。也可通过以下方式来产生人抗体和人可变区：分离选自人来源的噬菌体展示文库的Fv克隆可变区序列(参见，例如Hoogenboom等人Methods in Molecular Biology 178,1-37(O’Brien等人,ed.,HumanPress,Totowa,NJ,2001)；以及McCafferty等人,Nature 348,552-554；Clackson等人,Nature 352,624-628(1991))。噬菌体通常将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或Fab片段。
在某些方面，包含在本发明的抗原结合分子中的能够与PD-L1特异性结合的部分(例如Fab片段)被工程化改造以具有增强的结合亲和力，例如根据PCT公开WO 2012/020006(参见与亲和力成熟相关的实例)或美国专利申请公开号2004/0132066中公开的方法。本发明的抗原结合分子与特定抗原决定簇结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术(例如表面等离子体共振技术(Liljeblad,等人,Glyco J17,323-329(2000))以及传统的结合测定(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))来测量。竞争测定可用于鉴定与参考抗体竞争结合特定抗原的抗原结合分子。在某些实施例中，此类竞争抗原结合分子与由参考抗原结合分子结合的同一表位(例如，线性或构象表位)结合。用于定位抗原结合分子结合与之结合的表位的详细示例性方法提供于：Morris(1996)，“Epitope Mapping Protocols”，出自Methods in Molecular Biology第66卷(HumanaPress,Totowa,NJ)。在示例性竞争测定中，将固定化抗原在包含与所述抗原结合的第一标记抗原结合分子和正在测试其与第一抗原结合分子竞争结合所述抗原的能力的第二未标记抗原结合分子的溶液中孵育。第二抗原结合分子可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定化抗原在包含第一标记抗原结合分子而非第二未标记抗原结合分子的溶液中孵育。在容许第一抗体与抗原结合的条件下孵育之后，去除过量未结合的抗体，并且测量与固定化抗原缔合的标记的量。若与固定化抗原缔合的标记的量相对于对照样品在测试样品中基本上减少，则表明第二抗原结合分子与第一抗原结合分子竞争结合抗原。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual第14章(Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor,NY)。
如本文所述制备的本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子可通过本领域已知的技术纯化，这些技术为诸如高效液相色谱法、离子交换色谱法、凝胶电泳法、亲和色谱法、尺寸排阻色谱法等。用于纯化特定蛋白质的实际条件将部分取决于诸如净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且对于本领域技术人员而言将是显而易见的。对于亲和色谱法纯化，可以使用含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子所结合的抗体、配体、受体或抗原。例如，对于本发明融合蛋白的亲和色谱纯化，可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。基本上如实例中所述，可使用顺序蛋白A或G亲和色谱和尺寸排阻色谱来分离抗原结合分子。含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子或其片段的纯度可以通过各种熟知的分析方法中任何一种来确定，所述熟知的分析方法包括凝胶电泳法、高压液相色谱法等。例如，如实例中所述表达的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子被显示为完整的并且适当组装的，如还原和非还原SDS-PAGE所示。
测定
本文所提供的抗原结合分子的物理/化学性质和/或生物学活性可通过本领域中已知的各种测定法进行鉴定、筛选或表征。生物活性可以包括诸如增强不同免疫细胞特别是T细胞的活化和/或增殖的能力。例如它们增强免疫调节细胞因子的分泌。其他可以增强或可以增强的免疫调节细胞因子是例如IL2、颗粒酶B等。生物活性还可以包括食蟹猴结合交叉反应性以及与不同细胞类型的结合。还提供了在体内和/或体外具有此类生物活性的抗原结合分子。
1.亲和力测定
本文提供的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子对4-1BB(CD137)的亲和力可以使用标准仪器诸如BIAcore仪器(GE Healthcare)和诸如可通过重组表达获得的受体或靶蛋白，根据实例中阐述的方法通过表面等离子体共振(SPR)来确定。含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子对PD-L1的亲和力也可以使用标准仪器诸如BIAcore仪器(GE Healthcare)以及可通过重组表达获得的受体或靶蛋白，通过表面等离子体共振(SPR)来确定。用于测量结合亲和力的特定说明性和示例性实施例描述于实例4中。根据一个方面，在25℃使用
Figure BDA0003735632450000561
T100仪器(GE Healthcare)通过表面等离子体共振来测量KD。
2.结合测定和其他测定
本文所提供的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子与表达相应受体的细胞的结合可使用表达特定受体或靶抗原的细胞系例如通过流式细胞术(FACS)来评价。在一个方面，表达4-1BB的新鲜外周血单核细胞(PBMC)可以用于结合测定。这些细胞在分离(初始态PMBC)或刺激(活化的PMBC)后直接使用。在另一方面，活化的小鼠脾细胞(表达4-1BB)可以用于证明本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子与表达4-1BB的细胞的结合。
在进一步方面，使用表达PD-L1的细胞系证明抗原结合分子与该靶细胞抗原的结合。
在另一方面，可使用竞争测定法鉴定分别与特定抗体或抗原结合分子竞争与PD-L1或4-1BB结合的抗原结合分子。在某些实施例中，此类竞争抗原结合分子与由特异性抗PD-L1抗体或特异性4-1BB抗体结合的同一表位(例如，线性或构象表位)结合。用于定位抗体与之结合的表位的详细示例性方法提供于：Morris(1996)，“Epitope MappingProtocols”，收录于Methods in Molecular Biology第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)。
3.活性测定
在一个方面，提供了用于鉴定与PD-L1结合以及与具有生物活性的4-1BB结合的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的测定法。生物活性可以包括，例如，通过4-1BB在表达PD-L1的细胞上的激动性信号传导。还提供了通过测定鉴定出的具有此类体外生物活性的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子。
在某些方面，测试本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的此类生物活性。用于检测本发明的分子的生物活性的测定法是实例3中描述的那些。此外，用于检测细胞裂解(例如，通过测量LDH释放)、诱导的细胞凋亡动力学(例如，通过测量胱天蛋白酶3/7活性)或细胞凋亡(例如，使用TUNEL测定)的方法是本领域中熟知的。另外，可通过评估此类复合物对各种淋巴细胞亚群诸如NK细胞、NKT细胞或γδT细胞的存活、增殖和淋巴因子分泌的影响，或通过评估其调节抗原呈递细胞诸如树突细胞、单核细胞/巨噬细胞或B细胞的表型和功能的能力，对此类复合物的生物活性进行评估。
药物组合物、制剂和施用途径
在进一步方面，本发明提供了包含本文提供的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子中的任一种的药物组合物，其例如用于以下治疗方法中的任一种中。在一个实施例中，药物组合物包含本文提供的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子中的任一种以及至少一种药用赋形剂。在另一实施例中，药物组合物包含本文提供的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子中的任一种以及如下文所述的至少一种另外的治疗剂。
本发明的药物组合物包含溶解于或分散于药用赋形剂中的治疗有效量的一种或多种含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子。术语“药学上或药理学上可接受的”是指分子实体和组合物在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，即当视情况而定施用于动物(例如人)时不产生不利的、过敏的或其他不良反应。含有至少一种含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子和任选的附加活性成分的药物组合物的制备将是鉴于本公开而为本领域的技术人员已知的，如由Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company,1990所示例的，该文献以引用方式并入本文。具体地，组合物为冻干制剂或水溶液。如本文所用，“药用赋形剂”包括任何和所有溶剂、缓冲剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、盐、稳定剂及它们的组合，如对本领域的普通技术人员所知。
肠胃外组合物包括设计用于注射(例如，皮下、皮内、病灶内、静脉内、动脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射)的那些组合物。为了注射，本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子可配制在水溶液中，优选配制在生理相容性缓冲剂诸如Hanks溶液、林格氏溶液或生理盐水中。溶液可含有配制剂(formulatory agent)，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。替代地，融合蛋白可以是粉末形式，用于在使用前用合适的媒介物(例如无菌无热原水)构建。根据需要，通过将本发明的融合蛋白以所需的量与下面列举的各种其他成分一起掺入适当的溶剂中，来制备无菌可注射溶液。例如，无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入含有基础分散介质和/或其他成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液、悬浮液或乳液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥或冻干技术，所述真空干燥或冻干技术产生来自先前无菌过滤的液体介质的活性成分加上任何附加所需成分的粉末。如果需要的话，液体介质应适当缓冲，并且在注射之前应首先使用足够的盐水或葡萄糖来使液体稀释剂等渗。该组合物必须是在制造和贮存条件下稳定的，并且保存为抗诸如细菌和真菌等微生物的污染作用。应当理解，内毒素污染应以例如低于0.5ng/mg蛋白质的安全水平保持最低。合适的药用赋形剂包括但不限于：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的化合物，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、葡聚糖等。任选地，悬浮液还可含有合适的稳定剂或增大化合物溶解度的试剂，以允许制备高浓度溶液。另外，活性化合物的悬浮液可以制备成适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，诸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，诸如油酸乙酯或甘油三酯；或脂质体。
活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中；包埋在胶体药物递送***(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中；或包埋在粗乳液中。此类技术在Remington's Pharmaceutical Sciences(第18版，Mack Printing Company,1990)中公开。可以制备缓释制备物。缓释制备物的合适示例包括含有多肽的固态疏水聚合物的半透性基质，所述基质是例如膜或微胶囊等成型制品的形式。在特定实施例中，可注射组合物的延长吸收可以通过在所述组合物中使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝、明胶或它们的组合)来实现。
本文的示例性药用赋形剂还包括间质药物分散剂，诸如可溶中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(
Figure BDA0003735632450000591
Baxter International,Inc.)。某些示例性sHASEGP和使用方法(包括rHuPH20)描述于美国专利公布号2005/0260186和2006/0104968中。在一个方面中，将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶(诸如软骨素酶)组合。
示例性的冻干抗体制剂描述于美国专利号6,267,958中。水性抗体制剂包括在美国专利号6,171,586和WO2006/044908中描述的那些，后一者中的制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
除了先前描述的组合物之外，融合蛋白也可以配制成长效制备物。此类长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内植入)或通过肌内注射施用。因此，例如，融合蛋白可以用合适的聚合或疏水材料(例如作为在可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂配制，或配制成微溶衍生物(例如配制成微溶盐)。
包含本发明的融合蛋白的药物组合物可通过常规的混合、溶解、乳化、包封、包埋或冻干工艺进行生产。药物组合物可以使用一种或多种生理上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂以常规方式配制，所述载体、稀释剂、赋形剂或助剂有助于将蛋白质加工成可以在药学上使用的制备物。合适的制剂取决于所选择的施用途径。
含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子可以配制成以游离酸或碱、中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐是基本上保留游离酸或游离碱的生物活性的盐。这些药用盐包括酸加成盐，例如用蛋白质性质组合物的游离氨基形成的酸加成盐，或用无机酸(诸如盐酸或磷酸)或有机酸(诸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸)形成的酸加成盐。用游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或者有机碱，诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因。与相应的游离碱形式相比，药用盐倾向于更易溶于水性和其他质子溶剂中。
本文的组合物还可含有多于一种对于所治疗的特定适应症是必需的活性成分，优选是具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性成分。此类活性成分适当地以对预期目的有效的量组合存在。
在一个方面，药物组合物可包含本文提供的任何含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子和至少一种另外的治疗剂。在一个方面，药物组合物可包含本文提供的任何含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子和T细胞活化抗CD3双特异性抗体。在一个方面，T细胞活化性抗CD3双特异性抗体包含与CD3结合的第一抗原结合结构域和与肿瘤相关抗原结合的第二抗原结合结构域。
待用于体内施用的制剂通常是无菌的。例如，无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。
治疗方法和组合物
本文提供的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子中任一者可用于治疗方法中。
为了用于治疗方法中，本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子可按照符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在这种情况下需要考虑的因素包括所治疗的特定疾患、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、疾患的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用的时间安排，以及执业医师已知的其他因素。
在一个方面，将本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子提供为用作药物。在进一步方面，提供了本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其用于治疗疾病特别是用于治疗癌症。在某些方面，提供了本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其用于治疗方法中。在一个方面，本发明提供了一种如本文所述的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其用于治疗有此需要的个体的疾病。在某些方面，本发明提供了一种含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其用于治疗患有疾病的个体的方法中，该方法包括向个体施用治疗有效量的融合蛋白。在某些方面，待治疗的疾病是癌症。癌症的实例包括乳腺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、唾液腺癌、子宫内膜癌、胰腺癌和非小细胞肺癌(NSCLC)。在一个方面，癌症是实体瘤。在一些方面，癌症已经是晚期癌症。因此，提供了用于治疗这些癌症的如本文所述的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子。需要治疗的受试者、患者或“个体”通常是哺乳动物，更特别地是人。
在另一方面，提供了如本文所述的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其用于治疗感染性疾病，特别是用于治疗病毒感染。在进一步方面，提供了如本文所述的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其用于治疗自身免疫疾病，诸如狼疮病。
在进一步方面，本发明涉及含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子在制造或制备用于治疗有此需要的个体的疾病的药物中的用途。在一个方面，药物用于治疗疾病的方法中，该方法包括向具有所述疾病的个体施用治疗有效量的所述药物。在某些实施例中，待治疗的疾病为增殖性疾患，特别是癌症。因此，在一个方面，本发明涉及本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子在制造或制备用于治疗癌症特别是癌症的药物中的用途。癌症的实例包括乳腺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、唾液腺癌、子宫内膜癌、胰腺癌和非小细胞肺癌(NSCLC)。本领域技术人员可认识到，在一些情况下，含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子可能无法提供治愈，而仅可以提供部分益处。在一些方面，具有某些益处的生理变化也被视为具有治疗益处。因此，在一些方面，提供生理变化的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的量被视为“有效量”或“治疗有效量”。
在另一方面，本发明提供了用于治疗个体疾病的方法，包括向所述个体施用治疗有效量的本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子。在一个方面，向所述个体施用组合物，所述组合物包含药用形式的本发明的融合蛋白。在某些方面，待治疗的疾病是增殖性疾患。在一个特定方面，疾病是癌症。在某些方面，如果待治疗的疾病是癌症，则所述方法还包括向所述个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如抗癌剂。根据上述实施例中的任一实施例的“个体”可以是哺乳动物，优选地是人。
为了预防或治疗疾病，本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他另外的治疗剂联合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、施用途径、患者体重、抗原结合分子的类型、疾病的严重程度和进程、融合蛋白是出于预防还是治疗目的施用、先前或同时进行的治疗性干预、患者的临床病史和对融合蛋白的应答以及主治医师的酌处权。在任何情况下，负责施用的执业者将针对个体受试者来确定组合物中活性成分的浓度和适当剂量。本文考虑了各种给药时间安排，包括但不限于在各个时间点处的单次或多次施用、推注施用，以及脉冲输注。
含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子适当地一次或在一系列治疗中施用于患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子可以是例如通过一次或多次单独施用或通过连续输注而施用于患者的初始候选剂量。取决于上述因素，一种典型的日剂量的范围可以为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于数天或更长时间的重复施用，取决于病症，治疗通常会持续直至发生期望的疾病症状抑制。融合蛋白的一个示例性剂量的范围为约0.005mg/kg至约10mg/kg。在其他示例中，剂量还可包括每次施用约1μg/kg体重、约5μg/kg体重、约10μg/kg体重、约50μg/kg体重、约100μg/kg体重、约200μg/kg体重、约350μg/kg体重、约500μg/kg体重、约1mg/kg体重、约5mg/kg体重、约10mg/kg体重、约50mg/kg体重、约100mg/kg体重、约200mg/kg体重、约350mg/kg体重、约500mg/kg体重至约1000mg/kg体重或更多，以及其中可推导出的任何范围。在从本文所列数字可推导出的范围的示例中，可以基于上述数字施用约5mg/kg体重至约100mg/kg体重、约5μg/kg体重至约500mg/kg体重等的范围。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg(或它们的任何组合)的一种或多种剂量。此类剂量可以间歇地施用，例如每周或每三周施用(例如，使得患者接受约2至约20或例如约6个剂量的融合蛋白)。可以施用初始较高的负荷剂量，之后施用一次或多次较低剂量。然而，其他剂量方案可能有用。这种疗法的进展易于通过常规的技术和测定法来监测。
本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子将通常以有效实现预期目的量使用。为用于治疗或预防病症，将本发明的含有4-1BBL三聚体抗原结合分子或其药物组合物以治疗有效量施用或施加。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是根据本文提供的详细公开内容。
对于全身施用，最初可以根据体外测定(诸如细胞培养测定)来估计治疗有效剂量。可以随后在动物模型中配制剂量，以实现包括如在细胞培养中测定的IC50循环浓度范围。此类信息可用于更准确地确定对人类的有用剂量。
还可以使用本领域熟知的技术来根据体内数据(例如动物模型)估计初始剂量。本领域的普通技术人员可以基于动物数据来容易地优化对人的施用。
剂量和间隔可以单独地调节，以提供足以维持疗效的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的血浆水平。通过注射施用的常用患者剂量的范围是约0.1至50mg/kg/天，通常约0.5至1mg/kg/天。通过每天施用多个剂量可以实现治疗有效的血浆水平。可以例如通过HPLC来测量血浆中的水平。
在局部施用或选择性摄入的情况下，含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。本领域的技术人员将能够在无需过多实验的情况下优化治疗有效的局部剂量。
本文所述的治疗有效剂量的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子通常将提供治疗益处而不会引起显著的毒性。融合蛋白的毒性和治疗功效可通过细胞培养或实验动物中的标准药学程序来测定。细胞培养测定和动物研究可以用于测定LD50(致死群体的50％的剂量)和ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)。毒性和疗效之间的剂量比是治疗指数，所述治疗指数可以表示为比率LD50/ED50。表现出大治疗指数的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子是优选的。在一个实施例中，根据本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子表现出高治疗指数。从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制适用于人类的一系列剂量。剂量优选在包括几乎没有毒性或没有毒性的ED50的循环浓度的范围内。剂量可以取决于多种因素而在该范围内变化，所述多种因素为例如所采用的剂型、所利用的施用途径、受试者的病症等。确切的配方、施用途径和剂量可以由个别医生根据患者的病症来选择(参见例如Fingl等人，1975，在：The Pharmacological Basis of Therapeutics，第1章，第1页中，该文献的全部内容以引用方式并入本文中)。
用本发明的融合蛋白治疗的患者的主治医师将知道如何以及何时由于毒性、器官功能障碍等终止、中断或调节施用。相反地，如果临床应答不充分(排除毒性)，则主治医师也会知道将治疗调整到更高水平。在目标病症的管理中施用的剂量的大小将随着待治疗病症的严重程度、施用途径等而变化。例如，可以部分地通过标准预后评估方法来评估病症的严重性。此外，剂量和可能的剂量频率也将根据个体患者的年龄、体重和应答而变化。
其他药剂和治疗
本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子可在治疗中与一种或多种其他药剂联合施用。例如，本发明的融合蛋白可以与至少一种另外的治疗剂共同施用。术语“治疗剂”包括可以施用用于治疗需要此类治疗的个体的症状或疾病的任何药剂。此类附加治疗剂可包含适合于所治疗的具体适应症的任何活性成分，优选地是具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性成分。在某些实施例中，另外的治疗剂为另一种抗癌剂。
此类其他药剂适当地以对预期目的有效的量组合存在。此类其他药剂的有效量取决于所用含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的量、疾患或治疗的类型，以及上面讨论的其他因素。含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子通常以与如本文所述相同的剂量和施用途径，或本文所述剂量的约1％至99％，或以任何剂量且通过经验/临床上确定为合适的途径使用。
上述此类联合疗法涵盖联合施用(其中两种或更多种治疗剂被包含在同一组合物或分开的组合物中)，以及分开施用，在分开施用的情况下，本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的施用可以在施用另外的治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后发生。
因此，在一个方面，提供了用于治疗癌症的如本文所述的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子与T细胞活化性抗CD3双特异性抗体联合使用。在一个方面，抗TA/抗CD3抗体包含与CD3结合的第一抗原结合结构域和与肿瘤相关抗原结合的第二抗原结合结构域。
在进一步方面，含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子与T细胞活化抗CD3双特异性抗体联合使用，并且T细胞活化抗CD3双特异性抗体与含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子同时施用或在所述抗原结合分子之前或之后施用。
在进一步方面，提供了含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子与T细胞活化性抗CD3双特异性抗体联合使用。癌症的实例包括乳腺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、唾液腺癌、子宫内膜癌、胰腺癌和非小细胞肺癌(NSCLC)。
在进一步方面，本发明提供了一种用于治疗个体癌症的方法，包括向所述个体施用治疗有效量的本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子和有效量的T细胞活化性抗CD3双特异性抗体。癌症的实例包括乳腺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、唾液腺癌、子宫内膜癌、胰腺癌和非小细胞肺癌(NSCLC)。
制品
在本发明的另一个方面中，提供了一种制品，其含有可用于治疗、预防和/或诊断上述病症的物质。该制品包括容器和在所述容器上或与所述容器相关的标签或包装插页(package insert)。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、静脉注射(IV)溶液袋，等等。所述容器可以由多种材料(诸如玻璃或塑料)形成。容器容纳组合物，该组合物单独或与另一种有效用于治疗、预防和/或诊断所述病症的组合物组合，并且容器可具有无菌入口(例如容器可以是静脉注射溶液袋或具有可用皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂为本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子。
标签或包装插页指示该组合物用于治疗所选择的病症。此外，制品可包括：(a)第一容器，所述第一容器具有容纳在其中的组合物，其中所述组合物包含本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子；以及(b)第二容器，所述第二容器具有容纳在其中的组合物，其中所述组合物包含另外的细胞毒性剂或其他治疗剂。本发明该实施例中的制品还可包含包装插页，该包装插页指示组合物可用于治疗特定病症。
可替代地或另外地，所述制品还可包括第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器包括药用缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。所述药盒可以还包括从商业和用户的角度所需的其他物质，包括其他缓冲液、稀释剂、滤器、针头和注射器。
表B(序列)：
Figure BDA0003735632450000661
Figure BDA0003735632450000671
Figure BDA0003735632450000681
Figure BDA0003735632450000691
Figure BDA0003735632450000701
Figure BDA0003735632450000711
Figure BDA0003735632450000721
Figure BDA0003735632450000731
Figure BDA0003735632450000741
Figure BDA0003735632450000751
Figure BDA0003735632450000761
关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息给出于：Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中。根据如上文所定义的根据Kabat(Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))的EU编号***来对抗体链的氨基酸进行编号和引用。
＊＊＊
实例
以下是本发明的方法和组合物的实例。应当理解，在给出以上提供的一般描述的情况下，可以实践各种其他实施例。
重组DNA技术
使用标准方法来操纵DNA，如在Sambrook等人，Molecular cloning:A laboratorymanual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中所述。根据制造商的说明来使用分子生物学试剂。关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息在以下参考文献中给出：Kabat,E.A.等人，(1991)Sequences of Proteinsof Immunological Interest，第五版，NIH Publication No 91-3242。
DNA测序
通过双链测序确定DNA序列。
基因合成
通过使用适当模板进行PCR生成所需的基因区段，或由Geneart AG(Regensburg,Germany)通过自动化基因合成从合成寡核苷酸和PCR产物合成所需的基因区段。在确切的基因序列不可用的情况下，基于最接近的同源物的序列设计寡核苷酸引物，并且通过RT-PCR从来源于合适的组织的RNA中分离出基因。将侧接有单个限制性内切酶切割位点的基因区段克隆到标准克隆/测序载体中。从转化的细菌中纯化出质粒DNA，并通过紫外光谱法确定浓度。通过DNA测序来确认亚克隆基因片段的DNA序列。设计具有合适限制性位点的基因区段，以允许亚克隆到相应的表达载体中。所有构建体均设计有5’端DNA序列，该序列编码前导肽，该前导肽靶向真核细胞分泌的蛋白。
细胞培养技术
使用如在Current Protocols in Cell Biology(2000),Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.和Yamada,K.M.(编辑)，John Wiley&Sons,Inc中所述的标准细胞培养技术。
蛋白质纯化
参照标准方案从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白质。简言之，将抗体施加至蛋白质A琼脂糖柱(GE healthcare)并用PBS洗涤。在pH 2.8下实现抗体的洗脱，之后立即中和样品。通过尺寸排阻色谱法(Superdex 200，GE Healthcare)在PBS中或在20mM组氨酸、150mM NaCl(pH 6.0)中将聚集蛋白质与单体抗体分离。将单体抗体级分合并，使用例如MILLIPORE Amicon Ultra(30MWCO)离心浓缩器浓缩(若需要)，冷冻并储存在-20℃或-80℃下。提供样品的部分以例如通过SDS-PAGE、尺寸排阻色谱(SEC)或质谱法来进行后续的蛋白质分析和分析表征。
SDS-PAGE
根据制造商的说明使用
Figure BDA0003735632450000782
预制凝胶***(Invitrogen)。具体地，使用10％或4-12％
Figure BDA0003735632450000781
Bis-TRIS预制凝胶(pH 6.4)和
Figure BDA0003735632450000784
MES(还原凝胶，具有
Figure BDA0003735632450000783
抗氧化剂电泳缓冲添加剂)或MOPS(非还原凝胶)电泳缓冲液。
分析尺寸排阻色谱法
用于测定抗体的聚集和低聚物状态的尺寸排阻色谱法(SEC)通过HPLC色谱法进行。简而言之，将蛋白A纯化的抗体施加至Agilent HPLC 1100***上的300mM NaCl、50mMKH2PO4/K2HPO4，pH 7.5中的Tosoh TSKgel G3000SW柱，或施加至Dionex HPLC***上的2×PBS中的Superdex 200柱(GE Healthcare)。通过UV吸光度和峰面积积分来定量洗脱的蛋白质。将BioRad凝胶过滤标准品151-1901用作标准品。
实例1
靶向PD-L1的含有4-1BB配体三聚体的抗原结合分子的产生和生产
1.1.靶向PD-L1的含有4-1BB配体三聚体的抗原结合分子的产生和生产
将编码对于PD-L1特异性的抗原结合结构域的重链和轻链DNA序列的可变区与臼的恒定重链或人IgG1的恒定轻链在框内一起进行亚克隆。
根据Uniprot数据库的P41273序列，合成了编码人4-1BB配体胞外域(氨基酸71-248)部分的DNA序列。
将含有通过(G4S)2接头隔开的两个4-1BB配体胞外域并且与人IgG1-CL结构域融合的多肽如图1A中所述进行克隆：人4-1BB配体、(G4S)2连结子、人4-1BB配体、(G4S)2连结子、人CL。
将含有一个4-1BB配体胞外域并且与人IgG1-CH结构域融合的多肽，如图1B中所述进行克隆：人4-1BB配体、(G4S)2连结子、人CH。
为了提高正确配对，在交叉CH-CL中引入了以下突变。在与二聚4-1BB配体融合的人CL结构域中，引入了突变E123R和Q124K。在与单体4-1BB配体融合的人CH1结构域中，将突变K147E和K213E克隆，如国际专利申请公开号WO 2015/150447中所述。
将编码能够与PD-L1特异性结合的抗原结合结构域的重链和轻链DNA序列的可变区与臼的恒定重链或人IgG1的恒定轻链在框内一起进行亚克隆。抗PD-L1克隆(克隆YW243.55.S70)公开于WO 2010/077634中。
根据国际专利申请公开号WO 2012/130831中所述的方法，在Fc结构域中，将P329G、L234A和L235A突变引入杵和臼重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。含有S354C/T366W突变的二聚配体-Fc杵链、单体CH1融合、所靶向的含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的抗PD-L1 Fc臼链和抗PD-L1轻链的组合允许产生异源二聚体，该异源二聚体包括组装的三聚4-1BB配体和PD-L1结合Fab(图2)。
表1示出了在与4-1BBL融合的CH1和CL结构域中的含有CH1-CL交叉和带电残基的单价的抗PD-L1的***三聚4-1BB配体Fc(kih)融合抗原结合分子的氨基酸序列。该分子称为PD-L1-4-1BBL。
表1：含有CH1-CL交叉和带电残基的PD-L1-4-1BBL的氨基酸序列(*表示带电残基)
Figure BDA0003735632450000791
Figure BDA0003735632450000801
表2示出非靶向对照分子DP47***三聚4-1BB配体Fc(kih)融合抗原结合分子的氨基酸序列。
表2：含有CH1-CL交叉和带电残基的DP47-4-1BBL的氨基酸序列(*表示带电残基)
Figure BDA0003735632450000811
通过使用聚乙烯亚胺将HEK293-EBNA细胞与哺乳动物表达载体共转染来产生双特异性构建体。用相应的表达载体以1:1:1:1(“载体4-1BBL Fc杵链”：“载体4-1BBL轻链”：“载体Fc臼链”：“载体轻链”)来转染细胞。
使用HEK293 EBNA细胞在摇瓶中进行生产。通过瞬时转染HEK293 EBNA细胞或CHOEBNA细胞，形成抗体和双特异性抗体。对细胞进行离心，然后用经过预热的CD CHO培养基(Thermo Fisher，目录号10743029)代替原培养基。将表达载体在CD CHO培养基中混合，加入PEI(聚乙烯亚胺，Polysciences，Inc，目录号23966-1)，将溶液涡旋混合，并且在室温下孵育10分钟。然后，将细胞(2Mio/ml)与载体/PEI溶液混合，将其转移至烧瓶中，并且置于振荡培养箱中，在5％CO2的气氛下于37℃下孵育3小时。孵育后，加入含有补充剂(占总体积的80％)的Excell培养基(W.Zhou和A.Kantardjieff，Mammalian Cell Cultures forBiologics Manufacturing，DOI：10.1007/978-3-642-54050-9；2014)。转染后1天，加入补充剂(饲料，占总体积的12％)。7天后，通过离心和随后的过滤(0.2μm过滤器)收获细胞上清液，并且使用如下所示的标准方法从收获的上清液中纯化蛋白质。
参照标准方案从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白质。简言之，利用Protein A亲和色谱法(平衡缓冲液：20mM柠檬酸钠，20mM磷酸钠，pH 7.5；洗脱缓冲液：20mM柠檬酸钠，pH 3.0)从细胞培养上清液中纯化含Fc的蛋白质。在pH 3.0下实现洗脱，随后立即中和样品的pH。通过离心(Millipore
Figure BDA0003735632450000821
ULTRA-15，产品号：UFC903096)浓缩蛋白质，然后利用尺寸排阻色谱法在20mM组氨酸、140mM氯化钠(pH 6.0)中将聚集蛋白质与单体蛋白质分离。
通过测量280nm处的吸光度来测定纯化的蛋白质的浓度，其中根据Pace等人(Protein Science,1995,4,2411-1423)所述的方法，使用基于氨基酸序列计算得出的质量消光系数。在存在和不存在还原剂的情况下，使用LabChipGXII(Perkin Elmer)，通过CE-SDS分析蛋白质的纯度和分子量。通过HPLC色谱法在25℃测定聚集体含量，该***使用分析型尺寸排阻色谱柱(TSKgel G3000 SW XL或UP-SW3000)，在运行缓冲液(分别为25mMK2HPO4、125mM NaCl、200mM L-精氨酸盐酸盐(pH 6.7)或200mM KH2PO4、250mM KCl(pH6.2))中平衡。
表3总结了靶向PD-L1的含有4-1BB配体三聚体的抗原结合分子的产量和最终单体含量。
表3：靶向PD-L1的含有4-1BB配体三聚体的抗原结合分子的生化分析
分子 单体[％](SEC) 产率[mg/l] CE-SDS(非红色)
PD-L1 4-1-BBL 98 13 93
1.2.与4-1BB二价结合和与PD-L1单价结合的双特异性抗体的产生和生产
为了比较，还制备了与4-1BB二价或单价结合以及与PD-L1单价结合的双特异性激动性4-1BB抗体。
如WO 2020/007817 A1中所述，已经以所谓的Head to Head(H2H)2+1形式生产了双特异性激动性4-1BB x PD-L1抗体，该抗体与4-1BB二价结合和与PD-L1单价结合。
该构建体的第一重链HC1由以下组分组成：抗4-1BB结合剂(克隆20H4.9)的VHCH1，后接Fc臼。第二重链HC2由后接抗4-1BB(克隆20H4.9)的VHCH1和Fc杵的抗PD-L1结合剂(克隆YW243.55.S70，呈交叉Fab的形式)的VLCH1以及组成。PD-L1结合剂YW243.55.S70描述于WO 2010/077634中。对于4-1BB结合剂，根据US 7,288,638 B2或US 7,659,384 B2获得克隆20H4.9的VH和VL序列。两条重链结合产生异二聚体，其包括一个PD-L1结合交叉Fab和两个4-1BB结合Fab(图2B)。与4-1BB单价结合的另一种异二聚体由包含抗4-1BB结合剂(克隆20H4.9)的VHCH1的第一重链HC1(后接Fc臼)以及包含抗PD-L1结合剂(克隆YW243.55.S70，呈交叉Fab形式)的VLCH1的第二重链HC2(后接Fc杵)形成(图2C)。
为改善正确配对，在抗4-1BB Fab分子的CH-CL中引入以下突变：CL中的E123R和Q124K以及CH1中的K147E和K213E。抗PD-L1结合剂的第二轻链LC2由VHCL(交叉Fab)组成。应用杵臼技术，通过在第一重链HC1(Fc臼重链)中引入Y349C/T366S/L368A/Y407V突变并且通过在第二重链HC2(Fc杵重链)中引入S354C/T366W突变以形成异二聚体。
此外，根据国际专利申请公开号WO2012/130831A1中所述的方法，将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入杵和臼重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。
2+1形式中的4-1BB x PD-L1抗体包含：包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的重链；包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的重链；两个轻链，其各自包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；和包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链。
1+1形式中的4-1BB x PD-L1抗体包含：包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的重链；包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的重链；包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的轻链；和包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链。
实例2
通过表面等离子体共振进行靶向PD-L1的含有4-1BB配体三聚体的抗原结合分子的功能表征
4-1BB Fc(kih)融合分子的制备
将编码人4-1BB胞外域的DNA序列(根据Q07011的人4-1BB的氨基酸24至186，SEQID NO:33)亚克隆到包含杵上的人IgG1重链CH2和CH3结构域的框架中。在抗原胞外域和人IgG1的Fc之间引入AcTEV蛋白酶切割位点。在抗原Fc杵的C末端引入用于定向生物素化的Avi标签。包含S354C/T366W突变的抗原Fc杵链与包含Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的Fc臼链结合，形成异二聚体，该异二聚体包括单个包含4-1BB胞外域链的单拷贝，从而形成单体形式的Fc连接抗原。表5示出抗原Fc融合构建体的氨基酸序列。
表4：单体人4-1BB Fc(kih)融合分子的氨基酸序列
Figure BDA0003735632450000841
将编码序列的所有4-1BB-Fc融合分子克隆到质粒载体中，该质粒载体驱动来自MPSV启动子且含有位于CDS 3’端的合成polyA信号序列的***物的表达。此外，载体含有用于质粒的游离体维持的EBV OriP序列。
为了制备生物素化的单体抗原/Fc融合分子，将指数生长的悬浮HEK293 EBNA细胞与三种编码融合蛋白两种组分(杵和臼链)的载体以及生物素化反应需要的酶BirA共转染。相应载体以2:1:0.05比率(“抗原ECD-AcTEV-Fc杵”：“Fc臼”：“BirA”)使用。
为了在500ml摇瓶中产生蛋白质，在转染前24小时播种4亿HEK293EBNA细胞。对于转染，将细胞以210g离心分离5分钟，并且用预热的CD CHO培养基替换上清液。将表达载体重新悬浮于20mL含200μg载体DNA的CD CHO培养基中。加入540μL聚乙烯亚胺(PEI)后，将溶液涡流15秒，并在室温孵育10分钟。然后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，将其转移至500mL摇瓶中，并且在培养箱中，在5％CO2的气氛下在37℃孵育3小时。培养后，加入160mL F17培养基，并且将细胞培养24小时。转染后一天，向培养物中加入具有补充物的1mM丙戊酸和7％进料1。培养7天后，通过在210g下旋转细胞15min收集细胞上清液。将溶液无菌过滤(0.22μm过滤器)，补充叠氮化钠至最终浓度0.01％(w/v)，并保持在4℃。
通过亲和色谱法、使用蛋白质A，然后进行尺寸排阻色谱法，从细胞培养上清液中纯化分泌蛋白。对于亲和色谱法，将上清液加载到用40mL 20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠pH7.5平衡的HiTrap ProteinA HP柱(CV＝5mL，GE Healthcare)上。通过用至少10个柱体积的含20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠、0.5M氯化钠的缓冲液(pH 7.5)洗涤，除去未结合的蛋白质。使用20个柱体积的20mM柠檬酸钠、pH 3.0的0.01％(v/v)Tween-20产生的氯化钠线性pH梯度(0至500mM)洗脱结合蛋白。然后用10个柱体积的20mM柠檬酸钠、500mM氯化钠、0.01％(v/v)Tween-20、pH 3.0洗涤柱。
通过加入1/40(v/v)的2M Tris、pH 8.0，调节收集级分的pH。将蛋白质浓缩并过滤，然后加载至用2mM MOPS、150mM氯化钠、pH 7.4的0.02％(w/v)叠氮化钠溶液平衡的HiLoad Superdex 200柱(GE Healthcare)。
人PD-L1-Fc(重组人PD-L1/B7-H1 Fc嵌合体蛋白，156-B7-100：R&D Systems)可商购获得并用于确定与PD-L1的结合。
同时结合的确定
通过表面等离子体共振(SPR)评估同时结合人4-1BB Fc(kih)和人PD-L1的能力。所有SPR实验均采用Biacore T200，在25℃下使用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20，Biacore，Freiburg/Germany)。通过胺偶联将人4-1BB-Fc(kih)蛋白直接偶联至CM5芯片的流通池。所用的固定水平为约900RU。
使靶向PD-L1的三聚***4-1BBL构建体在150nM的浓度范围以10μL/min的流速历经90秒通过流通池，并且将解离设置为0秒。将人PD-L1-Fc(重组人PD-L1/B7-H1 Fc嵌合体蛋白，156-B7-100：R&D Systems)作为第二分析物以200nM的浓度在30μL/min的流速在90秒内注入流通池(图3A)。监测解离240秒。通过扣除在蛋白质未固定化的参比流通池中获得的应答，校正本体折射率差异。
如图3B所示，PD-L1靶向4-1BBL可以同时结合人PD-L1和人4-1BB。
实例3
通过体外测定的靶向PD-L1的含有4-1BB配体三聚体的抗原结合分子的功能表征
3.1.与表达人PD-L1的细胞系的结合
形成表达人PD-L1的第一细胞系。将编码人PD-L1的全长cDNA亚克隆到哺乳动物表达载体中。使用Lipofectamine LTX试剂(Invitrogen,#15338100)，按照生产商的方案，将质粒转染到MKN45(DSMZ 409)细胞中。将稳定转染的PD-L1阳性PD-L1细胞维持在RPMI 1640培养基(由Life Technologies提供的GIBCO，目录号42401-042)中，其补充有10％胎牛血清(FBS，由Life Technologies提供的GIBCO，目录号16000-044，批号941273，经γ射线照射，无支原体，热灭活)、2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽(Gluta-MAX-I，由Life Technologies提供的GIBCO，目录号35050-038)以及可选的200μg/mL潮霉素B(Roche，目录号10843555001)和1.5μg/mL嘌呤霉素(由Life Technologies提供的GIBCO，目录号A11138-02)。在结合测定中，收获MKN45细胞和MKN45-huPD-L1，用DPBS(由Life Technologies提供的GIBCO，#14190-136)进行洗涤，在含有可固定活性染料eF450(eBioscience#65-0863-18)的DPBS中于4℃下染色30分钟。将细胞洗涤，并且以3×104细胞/孔的密度接种到384孔板(Corning#3830)中。对细胞进行离心(350xg,5min)，除去上清液，并且将细胞重悬于10μL/孔的FACS缓冲液(DPBS，补充有2％FBS、5nM EDTA、7.5mM叠氮化钠)，其含有滴定浓度的PD-L1-4-1BBL或对照(起始浓度300nM)。将细胞在4℃下孵育30min，然后用80μL/孔DPBS洗涤两次。在4℃，将细胞重悬于10μL/孔的FACS缓冲液中30分钟，该缓冲液含有2.5μg/mL的PE-缀合的AffiniPure抗人IgG Fcγ-片段特异性山羊F(ab')2片段(Jackson ImmunoResearch，目录号109--116--098)。将细胞用80μL/孔的DPBS洗涤两次，然后在含有1％的甲醛的30μL/孔的DPBS中固定至少15分钟。将同一天或第二天的细胞重悬于50μL孔的FACS缓冲液中，并且使用MACSQuant Analyzer X(Miltenyi Biotec)进行采集。
如图4A和图4B所示，PD-L1-4-1BBL构建体(黑色三角形和线)而不是非PD-L1靶向对照，有效地与表达人PD-L1的MKN45-huPD-L1细胞结合，但不与亲代细胞系MKN45结合。拟合EC50值和曲线下面积值列于表5中。
示出的是PD-L1-4-1BBL与亲代细胞系MKN45和表达PD-L1的细胞系MKN45-PD-L1的结合。将PD-L1-4-1BBL或对照分子的浓度与PE缀合的二级检测抗体的荧光强度的地理平均值进行印迹。通过扣除空白对照(例如，无一级检测抗体，仅包含二级检测抗体)的基线值，对所有值进行基线校正。PD-L1-4-1BBL有效地与表达人PD-L1的MKN45-huPD-L1细胞结合(图4B)，但不与亲本细胞系MKN45结合(图4A)。双特异性4-1BB x PDL1抗体示出了与表达人PD-L1的MKN45-huPD-L1细胞的结合甚至更强，如PD-L1-4-1BBL。
表5：图4B所示的与表达PD-L1的细胞系MKN45-PD-L1的结合曲线的EC50值
EC<sub>50</sub>[nM] AUC
PD-L1-4-1BBL 2.68 49223
DP47-4-1BBL n.d. 387
DP47huIgG1 P329G LALA n.d. 248
4-1BB x PDL1 2+1 1.95 66296
4-1BB x PDL1 1+1 1.54 63744
4-1BB huIgG1 P329G LALA n.d. 432
3.2在表达人4-1BB和NFκB-荧光素酶报告基因的报告细胞系Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2中的NF-κB活化
4-1BB(CD137)受体与其配体(4-1BBL)的激动性结合通过活化核因子kappa B(NFkB)诱导4-1BB下游信号传导，并且促进CD8 T细胞的存活和活性(Lee HW,Park SJ,ChoiBK,Kim HH,Nam KO,Kwon BS.4-1BB promotes the survival of CD8(+)T lymphocytesby increasing expression of Bcl-x(L)and Bfl-1.J Immunol 2002；169:4882-4888)。为监测由2+1H2H抗4-1BB x抗PD-L1 huIgG1 PGLALA双特异性抗体介导的NFκB活化，从Promega(Germany)购得Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2报告细胞系。细胞培养方法如上文所述。在测定中，收获细胞并将其重悬于补充有10％(v/v)FBS和1％(v/v)GlutaMAX-I的测定培养基RPMI 1640培养基中。将10μL含有2×103Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2的报告细胞转移至带顶盖的无菌白色384孔平底组织培养板的各个孔中(Corning，目录号3826)。添加10μL的含有滴定浓度的PD-L1-4-1BBL抗体或对照分子的测定培养基。最后，提供10μL单独的测定培养基或包含1×104个细胞的亲代MKN45或MKN45细胞(经人PD-L1转染)的测定培养基，并且将孔板置于细胞培养箱中在37℃和5％CO2下孵育6小时。向各个孔中加入6μl新鲜解冻的One-Glo荧光素酶测定检测溶液(Promega，目录号E6110)，并且使用Tecan酶标仪(积分时间为500ms，无滤光片，采集所有波长的信号)立即测量发光强度。
如图5A至图5D所示，在不存在表达PD-L1的细胞的情况下，PD-L1-4-1BBL不能够诱导Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2报告细胞系中强烈的人4-1BB受体活化，从而导致NFκB活化并因此导致两个独立实验中的荧光素酶表达。在表达人PD-L1的MKN45细胞的存在下，PD-L1-4-1BBL的交联导致Jurkat-hu4-1BB-NFkB-luc2报告细胞系中NFkB活化的荧光素酶活性显著增加，高于由非靶向对照DP47-4-1BBL介导的活化。双特异性4-1BB x PDL1抗体导致相似但仍略低的活性。此外，抗人4-1BB克隆20H4.9诱导为huIgG1 P329G LALA一些基线活性，显示出超激动活性，最近已对该克隆进行了描述(Sun K Ho等人Mol Cancer Ther.2020,19(4),1040-1051)。活化曲线的EC50值和曲线下面积(AUC)列于表6中。
表6：图5C中示出NFκB活化诱导的荧光素酶活性曲线的EC50值
Figure BDA0003735632450000891
***
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司
<120> 新型含有 4-1BBL 三聚体的抗原结合分子
<130> P35883-WO
<150> EP20151043.5
<151> 2020-01-09
<160> 60
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 184
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
180
<210> 2
<211> 170
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val
1 5 10 15
Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala
20 25 30
Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu
35 40 45
Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu
50 55 60
Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala
65 70 75 80
Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala
85 90 95
Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala
100 105 110
Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu
115 120 125
Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu
130 135 140
Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile
145 150 155 160
Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
165 170
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<211> 175
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu
1 5 10 15
Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser
20 25 30
Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys
35 40 45
Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val
50 55 60
Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly
65 70 75 80
Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly
85 90 95
Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu
100 105 110
Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser
115 120 125
Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg
130 135 140
His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg
145 150 155 160
Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
165 170 175
<210> 4
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser
1 5 10 15
Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly
20 25 30
Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn
35 40 45
Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu
50 55 60
Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys
65 70 75 80
Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu
85 90 95
Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu
100 105 110
Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu
115 120 125
Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser
130 135 140
Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg
145 150 155 160
Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln
165 170 175
Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu
180 185 190
Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
195 200
<210> 5
<211> 178
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu
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<211> 164
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val
1 5 10 15
Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala
20 25 30
Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu
35 40 45
Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu
50 55 60
Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala
65 70 75 80
Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala
85 90 95
Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala
100 105 110
Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu
115 120 125
Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu
130 135 140
Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile
145 150 155 160
Pro Ala Gly Leu
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<211> 169
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu
1 5 10 15
Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser
20 25 30
Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys
35 40 45
Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val
50 55 60
Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly
65 70 75 80
Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly
85 90 95
Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu
100 105 110
Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser
115 120 125
Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg
130 135 140
His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg
145 150 155 160
Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu
165
<210> 8
<211> 197
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser
1 5 10 15
Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly
20 25 30
Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn
35 40 45
Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu
50 55 60
Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys
65 70 75 80
Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu
85 90 95
Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu
100 105 110
Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu
115 120 125
Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser
130 135 140
Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg
145 150 155 160
Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln
165 170 175
Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu
180 185 190
Ile Pro Ala Gly Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 二聚 hu 4-1BBL (71-254)，通过 (G4S)2 接头连结
<400> 9
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu
195 200 205
Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val
210 215 220
Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala
225 230 235 240
Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu
245 250 255
Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu
260 265 270
Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala
275 280 285
Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala
290 295 300
Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala
305 310 315 320
Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu
325 330 335
Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu
340 345 350
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 二聚 hu 4-1BBL (71-248)，通过 (G4S)2 接头连结
<400> 10
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
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50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
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Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
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Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro
180 185 190
Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly
195 200 205
Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro
210 215 220
Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly
225 230 235 240
Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala
245 250 255
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260 265 270
Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu
275 280 285
Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 二聚 hu 4-1BBL (80-254)，通过 (G4S)2 接头连结
<400> 11
Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu
1 5 10 15
Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser
20 25 30
Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys
35 40 45
Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val
50 55 60
Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly
65 70 75 80
Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly
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Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu
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Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser
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Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg
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His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg
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Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
180 185 190
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
195 200 205
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
210 215 220
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
225 230 235 240
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
245 250 255
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
260 265 270
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
275 280 285
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
290 295 300
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
305 310 315 320
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
325 330 335
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
340 345 350
Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
355 360
<210> 12
<211> 416
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 二聚 hu 4-1BBL (52-254)，通过 (G4S)2 接头连结
<400> 12
Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser
1 5 10 15
Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly
20 25 30
Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn
35 40 45
Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu
50 55 60
Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys
65 70 75 80
Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu
85 90 95
Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu
100 105 110
Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu
115 120 125
Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser
130 135 140
Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg
145 150 155 160
Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln
165 170 175
Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu
180 185 190
Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser
195 200 205
Gly Gly Gly Gly Ser Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro
210 215 220
Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro
225 230 235 240
Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln
245 250 255
Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr
260 265 270
Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr
275 280 285
Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr
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Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala
325 330 335
Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser
340 345 350
Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu
355 360 365
Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala
370 375 380
Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe
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Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
405 410 415
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD-L1 CDR-H1
<400> 13
Asp Ser Trp Ile His
1 5
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD-L1 CDR-H2
<400> 14
Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD-L1 CDR-H3
<400> 15
Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr
1 5
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD-L1 CDR-L1
<400> 16
Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD-L1 CDR-L2
<400> 17
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
1 5
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50 55 60
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100 105 110
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Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala
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Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val
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Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala
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<220>
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Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu
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<211> 720
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 二聚 4-1BB 配体 (71-254) - CL Fc 杵链
<400> 27
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Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu
245 250 255
Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu
260 265 270
Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala
275 280 285
Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala
290 295 300
Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala
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Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu
325 330 335
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405 410 415
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
420 425 430
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
435 440 445
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
450 455 460
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
465 470 475 480
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp
485 490 495
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
500 505 510
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
515 520 525
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
530 535 540
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
545 550 555 560
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
565 570 575
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
580 585 590
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
595 600 605
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
610 615 620
Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
625 630 635 640
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
645 650 655
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
660 665 670
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
675 680 685
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
690 695 700
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
705 710 715 720
<210> 28
<211> 297
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体 4-1BB 配体 (71-254) -CH1
<400> 28
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
195 200 205
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
210 215 220
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
225 230 235 240
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
245 250 255
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
260 265 270
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
275 280 285
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
290 295
<210> 29
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 PD-L1 Fc 臼链
<400> 29
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
355 360 365
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 30
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 PD-L1 轻链
<400> 30
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 31
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47 Fc 臼链
<400> 31
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Ser Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440
<210> 32
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47 轻链
<400> 32
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 33
<211> 163
<212> PRT
<213> 智人
<400> 33
Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn
1 5 10 15
Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser
20 25 30
Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val
35 40 45
Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp
50 55 60
Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu
65 70 75 80
Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp
85 90 95
Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro
100 105 110
Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro
130 135 140
Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His
145 150 155 160
Ser Pro Gln
<210> 34
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc 臼链
<400> 34
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro
225
<210> 35
<211> 422
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人 4-1BB 抗原 Fc 杵链
<400> 35
Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn
1 5 10 15
Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser
20 25 30
Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val
35 40 45
Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp
50 55 60
Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu
65 70 75 80
Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp
85 90 95
Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro
100 105 110
Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro
130 135 140
Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His
145 150 155 160
Ser Pro Gln Val Asp Glu Gln Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Pro Lys
165 170 175
Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
180 185 190
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
195 200 205
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
210 215 220
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
225 230 235 240
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
245 250 255
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
260 265 270
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
275 280 285
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
290 295 300
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
305 310 315 320
Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
325 330 335
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
340 345 350
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
355 360 365
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
370 375 380
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
385 390 395 400
Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln
405 410 415
Lys Ile Glu Trp His Glu
420
<210> 36
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (G4S)2 肽接头
<400> 36
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 37
<211> 290
<212> PRT
<213> 智人
<400> 37
Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu
1 5 10 15
Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr
20 25 30
Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu
35 40 45
Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile
50 55 60
Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser
65 70 75 80
Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn
85 90 95
Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr
100 105 110
Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val
115 120 125
Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val
130 135 140
Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr
145 150 155 160
Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser
165 170 175
Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn
180 185 190
Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr
195 200 205
Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu
210 215 220
Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His
225 230 235 240
Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr
245 250 255
Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys
260 265 270
Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu
275 280 285
Glu Thr
290
<210> 38
<211> 254
<212> PRT
<213> 智人
<400> 38
Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro
1 5 10 15
Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val
20 25 30
Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe
35 40 45
Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser
50 55 60
Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp
65 70 75 80
Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val
85 90 95
Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp
100 105 110
Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu
115 120 125
Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe
130 135 140
Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser
145 150 155 160
Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala
165 170 175
Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala
180 185 190
Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala
195 200 205
Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His
210 215 220
Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val
225 230 235 240
Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
245 250
<210> 39
<211> 205
<212> PRT
<213> 智人
<400> 39
Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala
1 5 10 15
Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro
20 25 30
Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala
35 40 45
Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro
50 55 60
Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp
65 70 75 80
Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe
85 90 95
Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val
100 105 110
Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala
115 120 125
Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg
130 135 140
Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly
145 150 155 160
Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala
165 170 175
Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr
180 185 190
Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
195 200 205
<210> 40
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 40
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 41
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 41
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 42
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 42
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 43
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 43
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 44
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 44
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 45
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 45
Gly Ser Pro Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser
1 5 10
<210> 46
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 46
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 47
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 47
Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser
1 5
<210> 48
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 48
Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 49
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 49
Gly Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 50
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 50
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 51
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 51
Gly Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly
1 5
<210> 52
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 52
Gly Gly Asn Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 53
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 53
Gly Gly Asn Gly Ser Gly
1 5
<210> 54
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHCH1(EE) (20H4.9)-重链 HC1 (Fc 臼)
<400> 54
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro
<210> 55
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VLCH1 (PD-L1) VHCH1(EE) (20H4.9) -重链 HC2 (Fc 杵)
<400> 55
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr
100 105 110
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
115 120 125
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
130 135 140
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
145 150 155 160
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
180 185 190
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
195 200 205
Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
210 215 220
Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr
225 230 235 240
Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr
245 250 255
Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
260 265 270
Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Ser
275 280 285
Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys
290 295 300
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
305 310 315 320
Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg
325 330 335
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
340 345 350
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
355 360 365
Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
370 375 380
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
385 390 395 400
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
405 410 415
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
420 425 430
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
435 440 445
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
450 455 460
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
465 470 475 480
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
485 490 495
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
500 505 510
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
515 520 525
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
530 535 540
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
545 550 555 560
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
565 570 575
Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
580 585 590
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
595 600 605
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
610 615 620
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
625 630 635 640
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
645 650 655
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
660 665 670
<210> 56
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VLCL(RK)-轻链 (20H4.9)
<400> 56
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Ala Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 57
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHCL-轻链 (PD-L1)
<400> 57
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
115 120 125
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val
130 135 140
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys
145 150 155 160
Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
165 170 175
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
180 185 190
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
195 200 205
His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
210 215 220
Cys
225
<210> 58
<211> 437
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VLCH1 (PD-L1) -重链 HC2 (Fc 杵)
<400> 58
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr
100 105 110
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
115 120 125
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
130 135 140
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
145 150 155 160
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
180 185 190
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
195 200 205
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
210 215 220
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
225 230 235 240
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
245 250 255
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
260 265 270
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
275 280 285
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
290 295 300
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
305 310 315 320
Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
325 330 335
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys
340 345 350
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
355 360 365
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
370 375 380
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
385 390 395 400
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
405 410 415
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
420 425 430
Leu Ser Leu Ser Pro
435
<210> 59
<211> 207
<212> PRT
<213> 智人
<400> 59
Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr
20 25 30
Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
35 40 45
Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys
50 55 60
Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp
65 70 75 80
His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr
85 90 95
Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu
100 105 110
Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met
115 120 125
Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu
130 135 140
Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys
145 150 155 160
Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn
165 170 175
Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg
180 185 190
Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile
195 200 205
<210> 60
<211> 198
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<400> 60
Met Gln Ser Gly Thr Arg Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Ile Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr
20 25 30
Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
35 40 45
Cys Ser Gln His Leu Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys
50 55 60
Asn Lys Glu Asp Ser Gly Asp Arg Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu
65 70 75 80
Met Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro
85 90 95
Glu Asp Ala Ser His His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn
100 105 110
Cys Met Glu Met Asp Val Met Ala Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp
115 120 125
Ile Cys Ile Thr Leu Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys
130 135 140
Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly
145 150 155 160
Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn
165 170 175
Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Gln Asp Leu Tyr Ser Gly
180 185 190
Leu Asn Gln Arg Arg Ile
195

Claims (30)

1.一种含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其包含
(a)能够与PD-L1特异性结合的抗原结合结构域，
(b)第一多肽和第二多肽，所述第一多肽和所述第二多肽通过二硫键彼此连接，
其中所述抗原结合分子的特征在于，所述第一多肽包含通过肽接头彼此连结的两个4-1BBL胞外域或其片段，并且特征在于，所述第二多肽包含一个4-1BBL胞外域或其片段，和
(c)Fc结构域，所述Fc结构域包含能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基。
2.根据权利要求1所述的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中所述4-1BBL胞外域或其片段包含选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其包含
(a)能够与PD-L1特异性结合的抗原结合结构域，
(b)第一多肽和第二多肽，所述第一多肽和所述第二多肽通过二硫键彼此连接，
其中所述抗原结合分子的特征在于，所述第一多肽包含选自由SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12组成的组的氨基酸序列，并且特征在于，所述第二多肽包含选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成的组的氨基酸序列，和
(c)Fc结构域，所述Fc结构域包含能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中所述Fc结构域包含促进所述Fc结构域的所述第一亚基与所述第二亚基的缔合的杵臼修饰。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中所述Fc结构域包含降低与Fc受体，特别是与Fcγ受体的结合的一个或多个氨基酸取代。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中所述Fc结构域为包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(根据Kabat EU索引进行编号)的IgG1 Fc结构域。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中所述能够与PD-L1特异性结合的抗原结合结构域为能够与PD-L1特异性结合的Fab分子。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中所述能够与PD-L1特异性结合的抗原结合结构域包含重链可变区(VHPD-L1)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLPD-L1)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中所述能够与PD-L1特异性结合的抗原结合结构域包含：重链可变区(VHPD-L1)，其包含与SEQ IDNO:19的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLPD-L1)，其包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中所述能够与PD-L1特异性结合的抗原结合结构域包含：重链可变区(VHPD-L1)，其包含SEQ IDNO:19的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLPD-L1)，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子分别包含
第一重链和第一轻链，两者均包含能够与PD-L1特异性结合的Fab分子；
第二重链，其包含恒定结构域和通过第一肽接头彼此连结的两个4-1BBL胞外域或其片段，在其C末端通过第二肽接头与第二重链或第二轻链融合，
和第二轻链，其包含恒定结构域和一个所述4-1BBL胞外域或其片段，在其C末端通过第三肽接头与第二轻链或第二重链融合。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连结的两个4-1BBL胞外域或其片段的第一肽在其C末端通过第二肽接头与作为重链一部分的CL结构域融合，
并且包含一个所述4-1BBL胞外域或其片段的第二肽在其C末端通过第三肽接头与作为轻链一部分的CH1结构域融合。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包含
(i)第一重链，其包含VH结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；和第一轻链，其包含VL结构域，所述VL结构域包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；
(ii)第二重链，其包含选自由SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25和SEQ IDNO:27组成的组的氨基酸序列；和
(iii)第二轻链，其包含选自由SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26和SEQ IDNO:28组成的组的氨基酸序列。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包含：第一重链，其包含与SEQ ID NO:29的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；第一轻链，其包含与SEQ ID NO:30的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；第二重链，其包含与SEQID NO:21的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和第二轻链，其包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包含：第一重链，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；第一轻链，其包含SEQID NO:30的氨基酸序列；第二重链，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；和第二轻链，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
16.一种分离的核酸分子，其编码根据权利要求1至15中任一项所述的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子。
17.一种载体，特别是表达载体，其包含根据权利要求16所述的分离的核酸分子。
18.一种宿主细胞，其包含根据权利要求16所述的核酸或根据权利要求17所述的载体。
19.一种生产根据权利要求1至15中任一项所述的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的方法，其包括在适于表达所述含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的条件下培养根据权利要求18所述的宿主细胞。
20.根据权利要求19所述的方法，其进一步包括从所述宿主细胞回收抗体。
21.一种含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子，其通过根据权利要求19所述的方法来产生。
22.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至15或权利要求21中任一项所述的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子以及至少一种药用赋形剂。
23.根据权利要求22所述的药物组合物，其进一步包含另外的治疗剂。
24.根据权利要求1至15中任一项所述的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子或根据权利要求22或23所述的药物组合物，其用作药物。
25.根据权利要求1至15中任一项所述的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子或根据权利要求22或23所述的药物组合物，其用于治疗癌症。
26.根据权利要求1至15中任一项所述的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子或根据权利要求22或23所述的药物组合物，其用于根据权利要求25所述进行使用，其中所述含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子与另一治疗剂联合使用。
27.根据权利要求1至15中任一项所述的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子用于制备药物的用途，所述药物用于治疗癌症。
28.根据权利要求1至15中任一项所述的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子用于制备药物的用途，所述药物用于治疗癌症，其中所述含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子与另一治疗剂联合使用。
29.一种治疗患有癌症的个体的方法，其包括向所述个体施用有效量的根据权利要求1至15中任一项所述的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子或根据权利要求22或23所述的药物组合物。
30.一种上调或延长患有癌症的个体中的细胞毒性T细胞活性的方法，其包括向所述个体施用有效量的根据权利要求1至15中任一项所述的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子或根据权利要求22所述的药物组合物。
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