CN112410292B

CN112410292B - 脐带间充质干细胞脂质囊泡体的制备方法及其在促进皮肤再生中的应用

Info

Publication number: CN112410292B
Application number: CN202011307065.2A
Authority: CN
Inventors: 张玲洁; 曾晓丽; 陈丽璇
Original assignee: Guangdong Xiangxue Stem Cell Regenerative Medicine Technology Co ltd
Current assignee: Guangdong Xiangxue Stem Cell Regenerative Medicine Technology Co ltd
Priority date: 2020-11-19
Filing date: 2020-11-19
Publication date: 2022-06-07
Anticipated expiration: 2040-11-19
Also published as: CN112410292A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及脐带间充质干细胞脂质囊泡体的制备方法及其在促进皮肤再生中的应用。本发明提供的外泌体的制备方法以切向流超滤技术进行提取，该方法提取获得的外泌体具有良好的产量和纯度，因此具有较高的生理活性，其对角质形成细胞具有良好的保护作用。使角质形成细胞即使在受损的条件下仍能获得良好的增殖效果。

Description

脐带间充质干细胞脂质囊泡体的制备方法及其在促进皮肤再生中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及脐带间充质干细胞脂质囊泡体的制备方法及其在促进皮肤再生中的应用。

背景技术

外泌体(exosome)是普遍存在的纳米膜囊泡，包含多种蛋白质、信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid，mRNA)及微小核糖核酸(micro-ribonucleic acid，miRNA)等，外泌体通过细胞膜表面信号分子的直接作用、膜融合内容物的胞内调节以及生物活性成分的释放调节等方式，在细胞间物质转运及信息传递过程中扮演重要角色。其在细胞微环境中的作用越来越被重视，具有广阔的发展前景，被视为许多生物功能的重要组成部分,具有安全性好、体积小、可工程化等特点，将可能作为细胞治疗的替代品。

目前外泌体制备的方法有聚合物沉淀、过滤、尺寸排除色谱、密度梯度离心和磁珠捕获等，然而这些方法普遍存在耗时长、处理体积小等缺点。作为该领域金标准的超速离心法也存在这样的问题，包括操作人员的不稳定性、囊泡的破碎和聚集、可扩展性差和纯度不足，这很大程度上阻碍了评估外泌体在动物临床前疗效的研究，限制了间充质干细胞在外泌体生产中的应用。在这种情况下，外泌体可扩展性、重现性、安全性和产品纯度成为关键问题。因此，目前急需一种易于扩展以支持大规模生产外泌体的分离方法。

切向流过滤(Tangential Flow Filtration，TFF)技术是一种可以从大量细胞培养基中浓缩蛋白质或病毒的技术，具有处理体积大、可扩展性强、回收率高等优势，成为了新近外泌体研究者的关注焦点。它的原理是基于液体在泵的驱动下沿着膜表面相切的方向流动，在膜上形成压力，使部分液体透过膜，而另一部分液体切向地流过膜的表面，将被膜截流的颗粒和大分子物质冲走，避免他们堆积在膜表面，造成膜的堵塞和流速下降。但现有技术中报道的通过切向流过滤方法制备得到的外泌体的生理活性不足，导致其应用受限。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供生理活性更高的外泌体的提取方法，从而使制备获得的外泌体可以在临床中应用于制备促进伤口愈合的产品。

本发明提供的脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，以切向流超滤技术进行提取，包括：

步骤1：细胞培养上清液经0～10℃，1000g～3000g离心5～15min；

步骤2：经离心的上清液经0.65μm滤膜过滤，取滤液；

步骤3：所述滤液以截留分子量为100kDa～500kDa的滤膜进行过滤，跨膜压为6～12psi，流速为6～10mL/min，剪切速率为1500～2500s^-1；

步骤4：液体体积浓缩至所述细胞培养上清液的0.5％～2％后，加入2倍体积的PBS缓冲液继续浓缩至液体体积为所述细胞培养上清液的1.5％～2.5％，再依次经0.45μm、0.22μm滤膜过滤后，收集含有外泌体的滤液。

本发明实施例中，所述细胞上清液由P3代脐带间充质干细胞培养获得，其培养方法包括：以DMEM高糖培养基为培养液，将脐带间充质干细胞以截留分子量为20kDa、材质为聚砜纤维的3D中空培养筒培养，糖消耗量稳定一周后，每隔2天收集细胞培养上清液。实验表明，与2D工厂培养法相比，由3D中空纤维培养法制备的TFF-exo具有更显著的促增殖活性作用。

一些实施例中，步骤1中所述的离心条件为4℃，2000g离心10min。

所述切向流超滤的装置型号为

M1；步骤3所述的滤膜材质为聚醚砜，型号为

2。

本发明中，所述滤膜的截留分子量为100kDa～500kDa，优选的，截留分子量为100～300kDa，或300～500kDa。在实施例中，分别对截留分子量为100kDa、跨膜压为6psi、流速为6mL/min、剪切速率为1500s^-1，截留分子量为300kDa、跨膜压为9psi、流速为8mL/min、剪切速率为2000s^-1，截留分子量为500kDa、跨膜压为12psi、流速为10mL/min、剪切速率为2500s^-1的切向流超滤条件下获得的外泌体的浓度、标志蛋白和外观进行了评估，结果表明，在截留分子量为500kDa，跨膜压为12psi、流速为10mL/min、剪切速率为2500s^-1的切向流超滤***条件下获得的外泌体的产量和纯度最佳。

步骤3中所述滤膜的截留分子量为500kDa，跨膜压为12psi，流速为10mL/min，剪切速率为2500s^-1。

步骤4中，液体体积浓缩至所述细胞培养上清液的1％后，加入2倍体积的PBS缓冲液继续浓缩至液体体积为所述细胞培养上清液的2％，再依次经0.45μm、0.22μm滤膜过滤后，收集含有外泌体的滤液。

所述0.45μm滤膜过滤的时间为2min，0.22μm滤膜过滤的时间为2min。

本发明所述制备方法制得的外泌体。

本发明所述制备方法制得的外泌体在制备提高损伤皮肤细胞增殖能力的制剂中的应用。

本发明所述制备方法制得的外泌体在制备提高损伤皮肤细胞抗凋亡能力的制剂中的应用。

本发明所述制备方法制得的外泌体在制备提高损伤皮肤细胞迁移能力的制剂中的应用。

本发明中，所述损伤为过氧化氢(H₂O₂)损伤和/或紫外线B(UVB)损伤。

具体实施例中，本发明提供了所述制备方法制得的外泌体在保护受损角质形成细胞中的应用。所述保护受损角质形成细胞包括维持和/或促进角质形成细胞的增殖、提高受损角质形成细胞的抗凋亡能力，以及提高受损角质形成细胞的迁移能力。在本发明中，所述角质形成细胞为UVB和/或H₂O₂诱发损伤的角质形成细胞。本发明中所述角质形成细胞为HaCaT细胞。

本发明还提供了一种促进伤口愈合的制剂，其包括本发明所述制备方法制得的外泌体。

一种治疗皮肤损伤的方法，其为给予本发明制备的制剂。所述给予的方式为外敷。

本发明提供的外泌体的制备方法以切向流超滤技术进行提取，该方法提取获得的外泌体具有良好的产量和纯度，通过体外建立角质细胞损伤模型来模拟体内皮肤细胞损伤后的微环境，通过实验证明，提取获得的外泌体具有较高的生理活性，其对角质形成细胞具有良好的保护作用。使角质形成细胞即使在受损的条件下仍能获得良好的增殖、迁移、抗凋亡的能力。

附图说明

图1示纳米粒径分析结果，比较分析实施例1～5制得的外泌体粒径大小分布及粒径浓度：其中，A示纳米粒径大小及浓度分布；B示比较各实施例的外泌体浓度的统计学分析；

图2示Western blot结果，比较分析实施例1-5的外泌体表面标志蛋白CD9、CD63、TSG101的表达量：其中，A示标志蛋白条带表达量；B示相对蛋白水平的灰度值统计学分析；

图3示透射电镜分析结果，比较分析实施例1-5的外泌体在电镜下的形态学外观；

图4示实施例1-5所得的hucMSC-Exo作用受损伤HaCaT 48h后的细胞增殖活性分析：其中，A示各实施例提取获得的hucMSC-Exo对UVB诱发的HaCaT的促增殖作用；B示各实施例提取获得的hucMSC-Exo对H₂O₂诱发的HaCaT的促增殖作用；#p<0.01，与Control组相比；*p<0.05，与UVB(或H₂O₂)相比；

图5示实施例1和4所得的hucMSC-Exo对损伤细胞HaCaT细胞抗凋亡活性分析：其中，A示实施例1和4获得的hucMSC-Exo对UVB诱发的HaCaT的抗凋亡作用；B示实施例1和4获得的hucMSC-Exo对H₂O₂诱发的HaCaT的抗凋亡作用；#p<0.01，与Control组相比；*p<0.05，与UVB组(或H₂O₂组)相比；

图6示实施例4所得的hucMSC-Exo对损伤细胞HaCaT细胞迁移能力分析：其中，A示hucMSC-Exo对UVB诱发的HaCaT的促愈合作用；B示hucMSC-Exo对H₂O₂诱发的HaCaT的促愈合作用，#p<0.01，与Control组相比；*p<0.05，与UVB组(或H₂O₂组)相比。

具体实施方式

本发明提供了脐带间充质干细胞脂质囊泡体的制备方法及其在促进皮肤再生中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

①2D细胞工厂培养法制备脐带间充质干细胞培养上清液：选择生长状态良好的P3代脐带间充质干细胞，以一定的密度接种到细胞工厂内，摇匀后加入完全培养基培养96h，待细胞融合至80％时，收集细胞上清,冻于-80℃备用。

②收集同一批次的脐带间充质干细胞培养上清约250ml，进行初步离心2000g 4℃离心10min，

③去沉淀后，取上清置于0.65μm滤膜上过滤，随后将上清转移到型号为

M1的切向流过滤的容器中，

④使用截留分子量为500kDa,材质为聚醚砜的

2膜包进行安装，打开泵，调整跨膜压为12psi、流速为10mL/min，剪切速率为2500s^-1，培养上清在泵的作用下以一定的速度经过膜包，实时记录培养上清的流速、跨膜压。

⑤当储液瓶中的液体体积大约为5ml时，打开储液瓶下面的阀门，收集完液体后关闭，然后加入10mlPBS，继续循环冲洗出膜包及管道中残留的上清，打开储液瓶上面的阀门收集液体，收集的总液体大约10ml，经0.45μm过滤后，再用0.22μm滤器过滤除菌，收集样品，总耗时84min。储存于-80℃备用。

实施例2

①3D中空纤维细胞培养法制备脐带间充质干细胞培养上清液：选择生长状态良好的P3代脐带间充质干细胞，接种到型号为P3202，截留分子量为20kDa、材质为聚砜纤维的3D中空培养筒内，以葡萄糖的消耗量作为细胞状态的监控值。当糖消耗量稳定一周后开始收集培养筒内纤维化空间的细胞上清，此后每隔2天收集细胞上清，冻于-80℃备用。

M1的切向流过滤的容器中，

④使用截留分子量为100kDa,材质为聚醚砜的

2膜包进行安装，打开泵，调整跨膜压为6psi、流速为6mL/min，剪切速率为1500s^-1，培养上清在泵的作用下以一定的速度经过膜包，实时记录培养上清的流速、跨膜压。

⑤当储液瓶中的液体体积大约为5ml时，打开储液瓶下面的阀门，收集完液体后关闭，然后加入10ml PBS，继续循环冲洗出膜包及管道中残留的上清，打开储液瓶上面的阀门收集液体，收集的总液体大约10ml，经0.45μm过滤后，再用0.22μm滤器过滤除菌，收集样品，总耗时84min。储存于-80℃备用。

实施例3

M1的切向流过滤的容器中，

④使用截留分子量为300kDa,材质为聚醚砜的

2膜包进行安装，打开泵，调整跨膜压为9psi、流速为8mL/min，剪切速率为2000s^-1，培养上清在泵的作用下以一定的速度经过膜包，实时记录培养上清的流速、跨膜压。

实施例4

M1的切向流过滤的容器中，

④使用截留分子量为500kDa,材质为聚醚砜的

实施例5

3D中空纤维细胞培养法制备脐带间充质干细胞培养上清液：选择生长状态良好的P3代脐带间充质干细胞，接种到型号为P3202，截留分子量为20kDa、材质为聚砜纤维的3D中空培养筒内，以葡萄糖的消耗量作为细胞状态的监控值。当糖消耗量稳定一周后开始收集培养筒内纤维化空间的细胞上清，此后每隔2天收集细胞上清，冻于-80℃备用。

收集同一批次的P3代脐带间充质干细胞培养上清约250ml,接着进行600g 4℃离心10min以去除活细胞。然后取上清后进行2000g 4℃离心10min以除去死细胞；继续取上清后进行10000g 4℃离心30min以除去细胞碎片。紧接着，将上清液转移到型号为326823的超速离心管内，使用SW32Ti的水平转头，离心力设置为700,000g，4℃下进行超速离心70min。随后，弃上清用PBS重悬并清洗沉淀，然后进行700,000g 4℃超速离心70min。最后，用1ml的PBS重悬并收集管底的白色沉淀，用0.22μm过滤除菌，总耗时192min，样品保存在-80℃备用。

效果验证

验证一：外泌体表征鉴定

采用纳米颗粒跟踪分析仪检测外泌体的粒径分布和颗粒浓度；提取外泌体总蛋白，通过BCA试剂盒进行蛋白定量以及Western blot实验检测外泌体标志蛋白CD9、CD63、TSG101的表达；通过透射电子显微镜观察外泌体的形态是否呈现典型的杯状或囊泡状外观，及电镜视野下的具有典型形态的数量。比较分析不同分离方法提纯的外泌体的颗粒浓度、标志蛋白表达含量、以及电镜下的外观。

验证二：各实施例制备获得外泌体对损伤细胞HaCaT的活性验证

2.1、各实施例制备的外泌体对细胞增殖活性的影响

将角质形成细胞HaCaT以1×10⁴cells/孔的细胞数量接种到96孔板，给予细胞浓度为0.6-0.8mM的过氧化氢(H₂O₂)溶液和辐照剂量为20-40mJ/cm²的紫外线B(UVB)构建体外细胞烧晒伤模型。造模成功后，实验组细胞分别加入浓度一致的实施例1-5所得的外泌体溶液作用48h。按照CCK-8试剂盒说明操作，加入CCK-8试剂，另外孵育2h，在波长为450nm的酶标仪上测其吸光度值，评估细胞增殖能力。

2.2、各实施例制备的外泌体对细胞抗凋亡能力的影响

将角质形成细胞HaCaT以5×10⁵/孔接种于6孔板，采用H₂O₂溶液和UVB诱导损伤构建角质形成细胞HaCaT创伤模型，向实验组加入浓度一致的实施例1和4所得的外泌体溶液作用48h后，按照Annexin-V FITC/PI双染细胞凋亡试剂盒说明进行操作。简述如下：消化并离心收集细胞，以PBS清洗细胞2遍，细胞沉淀加入500μL结合缓冲液，混匀后加入5μL的AnnexinV-FITC和5μL的PI，混匀后室温下避光反应15min；最后上流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

2.3、各实施例制备的外泌体对细胞迁移能力的影响

将角质形成细胞HaCaT以5×10⁵/孔接种于6孔板，待细胞融合80％以上时，取200μL无菌枪头进行划痕，用PBS冲洗3次以去除脱壁细胞，随后给予细胞H₂O₂溶液和UVB辐射构建细胞损伤模型。然后加入上述浓度一致的实施例4所得的外泌体溶液，实时监测伤口愈合情况，0、24和48h在倒置相差显微镜下观察划痕变化，通过Image J软件对细胞创伤面积进行量化评估，以此分析其迁移能力。

验证结果：

实施例1～5提取获得的外泌体特征各不相同。纳米粒径分析结果所示(图1)，不同实验条件探索下，其获得的外泌体的粒径大小不同，其中实施例1～4在30～150nm范围内，而实例5在范围外，即实施例1～4符合对外泌体的定义,而实施例5不符合文献对外泌体的定义。此外，实施例4制得的外泌体浓度显著高于实施例1～3及5制得的外泌体，其浓度是实施例1、2、5所得产物的3倍，是实施例3所得产物的2倍。Western blot结果(图2)提示，除实施例1外，其余实施例均表达外泌体表面标志蛋白CD9、CD63、TSG101，其中实施例4所指的外泌体表面标志蛋白CD9和CD63的相对表达量最高，显著高于其他实施例。这两项结果表明实施例4提纯制备的外泌体的产量显著比其他四个实施例的高。另外如电镜分析结果(图3)所示，除实例2外，其余实施例均能呈现出一个典型的外泌体外观，其中实施例4在电镜视野下表现为更多囊泡状或杯状的外泌体，且背景较为清晰可见。提示实施例4制备的外泌体的纯度相对其他实施例制得的外泌体更高。

不同实施例所得的外泌体作用UVB/H₂O₂诱发的受损伤的HaCaT的活性结果各不相同。细胞增殖活性结果提示(图4)，实例1-5所得的外泌体均具有促进受损伤细胞的增殖活性(p<0.05)，其中不论是在紫外线B(图4中的A所示)，还是H₂O₂(图4中的B所示)损伤的条件下，实施例4组的OD₄₅₀值显著高于其他实施例组，提示实施例4的促增殖活性最高，而实施例2和实施例5的促增殖活性相对较差。细胞凋亡结果提示(图5所示)，实施例1和实施例4组的凋亡率均比UVB组(图5中的A所示)或H₂O₂组(图5中的B所示)更低，提示实施例1和4均具有抗凋亡活性。且与实施例1相比，实施例4的凋亡率更低，提示实施例4的抗凋亡活性最佳。此外，我们进一步评估了实施例4在48h内的促迁移能力，如图6所示，给予受损伤细胞一定浓度的外泌体作用后，细胞的划痕创伤面积明显减小，与模型组(UVB/H₂O₂)相比，外泌体组(UVB-exo、H₂O₂-exo)的创伤面积在作用48h后显著变小。结果显示，外泌体改善了受损伤细胞的迁移能力，这进一步明确了实施例4所得的外泌体具有促使损伤皮肤细胞快速愈合的能力。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，以切向流超滤技术进行提取，包括：

步骤1：细胞培养上清液经0~10℃，1000 g~3000 g离心5~15 min；

步骤2：经离心的上清液经0.65 μm滤膜过滤，取滤液；

步骤3：所述滤液以截留分子量为500 kDa的滤膜进行过滤，跨膜压为12 psi，流速为10mL/min，剪切速率为2500 s^-1；

步骤4：液体体积浓缩至所述细胞培养上清液的0.5%~2%后，加入2倍体积的PBS缓冲液继续浓缩至液体体积为所述细胞培养上清液的1.5%~2.5%，再依次经0.45 μm、0.22 μm滤膜过滤后，收集含有外泌体的滤液；

所述切向流超滤的装置型号为Cogent® M1；步骤3所述的滤膜材质为聚醚砜，型号为Pellicon® 2;

步骤1所述细胞培养上清液由P3代脐带间充质干细胞培养获得，其培养方法包括：以DMEM高糖培养基为培养液，将脐带间充质干细胞以截留分子量为20 kDa、材质为聚砜纤维的3D中空培养筒培养，糖消耗量稳定一周后，每隔2天收集细胞培养上清液。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述的离心条件为4℃，2000g离心10 min。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中，所述液体体积浓缩至所述细胞培养上清液的1%后，加入2倍体积的PBS缓冲液继续浓缩至液体体积为所述细胞培养上清液的2%。