CN115747049A - 一种干细胞外泌体及旁分泌活性大分子的分离纯化装置及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种干细胞外泌体及旁分泌活性大分子的分离纯化装置及其使用方法，分离纯化装置包括主控面板装置、储液装置和储液挂架，主控面板装置包括超滤纯化装置，超滤纯化装置包括循环泵、中空纤维超滤膜固定架、磁力板、磁珠容器固定夹、电动压力调节器，中空纤维超滤膜固定架用于固定中空纤维超滤膜，磁力板和磁珠容器固定夹用于固定低吸附磁珠容器。本发明将切向流微滤、切向流超滤与磁珠吸附有机结合，整合成一套分离***，进行细胞培养液中外泌体及活性大分子的分离纯化，克服了单一方法的缺点，同时将单一方法的优点进一步强化，提高了产物的纯度及提取效率。

Description

一种干细胞外泌体及旁分泌活性大分子的分离纯化装置及其 使用方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种干细胞外泌体及旁分泌活性大分子的分离纯化装置及其使用方法。

背景技术

干细胞疗法作为近年来热门的研究方向，已被证明有着巨大的临床应用价值。其中，间充质干细胞因其来源广、再生能力强以及优异的免疫调节能力而广泛应用于多种疾病的临床研究。目前，人们普遍认为间充质干细胞通过旁分泌发挥其主要作用，干细胞旁分泌因子疗法，作为一种无细胞的治疗方式，大大降低了异体移植后的排异反应、异位分化等风险，已在创伤修复、缺血性疾病、COVID-19治疗以及医美、面部整形等诸多领域研究中取得显著的效果。用于治疗或医美用途的干细胞旁分泌因子主要包括外泌体，以及多种生长因子、营养因子等生物大分子。尽管干细胞旁分泌因子在上述研究领域已展现出了巨大潜力，但由于其成分复杂、产量低、分离纯化效率低，从而极大限制了其在临床方面的应用。

外泌体携带着来自母体细胞的重要生物分子，包括RNA、蛋白质、脂类、代谢物和其他分子，在细胞信号转导、细胞生理病理活动过程中发挥着至关重要的作用。近年来已成为干细胞治疗领域研究热点，在诸多疾病的治疗中表现出显著的治疗效果。但在细胞生理活动中伴随外泌体产生的还有许多结构相似但功能不同的生物结构，如微囊泡（100~1000nm）、凋亡小体（50~4000 nm）。因此，外泌体产品关键质量属性（如尺寸、纯度、分子组成、标志物等）的识别及控制将是影响其效力和稳定性的关键，也是决定其最终是否成功应用于临床实践的重要因素。当前，外泌体的提取主要包括差速超速离心法、密度梯度离心法、超滤法、聚合物沉淀法、免疫亲和分离法，分离原理各不相同，在产品提取效率、纯度、回收率、提取成本方面各不相同。而干细胞分泌的大分子活性因子的分离纯化，主要方法为超滤、透析等手段，主要实现产品脱盐、脱色等目的。

上述方法中，超滤法是最适合扩大生产的方法，目前采用最广泛的是切向流超滤法，可以大批量处理培养液，分离效率较高。但由于超滤法基于颗粒尺寸分离的原理限制，该方法存在颗粒“挤出效应”，会导致外泌体浓缩速度越来越慢，最终无法获得很高浓度的产品，一般需要再用超速离心法进一步浓缩，且总体回收率较低。免疫亲和分离法，典型方法为免疫磁珠分离法，是目前最适合实验室小批量提取外泌体的方法。其基于外泌体表面特异性标志蛋白或膜结构分子，用相应抗体交联磁珠直接吸附培养液中的外泌体，然后用洗脱液洗脱，从而获得纯度很高的外泌体，提取速度很快。并且可以通过选择不同抗体，分离外泌体亚型。但该方法处理量很低，需要磁珠和培养液以较高比例混合方能较好吸附。而磁珠价格昂贵，不适合用于大批量培养液的处理。

而干细胞分泌的大分子活性因子的分离纯化，尚无较完善方法。主要是细胞完全培养基，尤其是添加血清或血清替代物的培养基中也含有较多生物大分子，难以和细胞本身分泌的生物大分子完全区分开来。

发明内容

针对现有技术中尚无同时应用于分离干细胞外泌体和旁分泌活性大分子的分离纯化装置及分离提取速度慢的问题，本发明公开了一种干细胞外泌体及旁分泌活性大分子的分离纯化装置及其使用方法，获得较高的回收率以及较快的提取速度。

本发明通过以下技术方案实现：

一种干细胞外泌体及旁分泌活性大分子的分离纯化装置，包括主控面板装置、储液装置和储液挂架；

所述的主控面板装置包括触摸操作屏、预处理装置、超滤纯化装置和抽吸装置，储液装置包括原液缸底座和滤液缸底座，用于固定原液缸和滤液缸，储液挂架为“王”字形，横杆自上而下分别为挂架横杆、挂架管路电动夹横杆和挂架底座，立杆为挂架立柱，挂架横杆上安装有若干挂钩，用于固定缓冲液和洗脱液，挂架管路电动夹横杆上安装有若干挂架管路电动夹，控制缓冲液和洗脱液的流入，缓冲液和洗脱液选择性的与滤液缸管道连接；

所述的预处理装置包括过滤器固定架和预处理泵，过滤器固定架用于固定中空纤维微滤膜，原液缸与预处理泵、中空纤维微滤膜管道连接，中空纤维微滤膜与原液缸管道连接，中空纤维微滤膜与滤液缸管道连接，用于收集过滤液；

所述的超滤纯化装置包括循环泵、中空纤维超滤膜固定架、磁力板、磁珠容器固定夹、电动压力调节器，中空纤维超滤膜固定架用于固定中空纤维超滤膜，磁力板和磁珠容器固定夹用于固定低吸附磁珠容器，滤液缸与循环泵、中空纤维超滤膜管道连接，中空纤维超滤膜与电动压力调节器管道连接，中空纤维超滤膜与电动压力调节器之间选择性管道连接低吸附磁珠容器，电动压力调节器与滤液缸管道连接；

所述的抽吸装置包括抽吸桶下沿固定槽、抽吸桶电动推进器和抽吸桶下沿固定槽和电动推进滑轨，用于固定抽吸桶，抽吸桶与滤液缸、超滤纯化装置管道连接。

进一步地，所述的超滤纯化装置为1~3组，以串联或并联方式连接。

进一步地，所述的中空纤维微滤膜包括进液口、出液口，滤液口Ι，滤液口Ⅱ，滤液口Ι与滤液缸连接；所述的中空纤维超滤膜包括进液口Ⅱ、出液口Ⅱ，滤液口Ⅲ，滤液口Ⅳ；所述的低吸附磁珠容器包括容器盖，容器仓，进液口Ⅲ，出液口Ⅲ，容器仓内部由分液隔板，出液口Ⅲ设有出液筛网；所述的抽吸桶包括抽吸管，活塞推拉杆，吸液口。

进一步地，所述的超滤纯化装置中电动压力调节器通往抽吸桶和滤液缸的主管道上设有主管路电动液流检测夹，超滤纯化装置与滤液缸之间的回路管道上设有回路电动液流检测夹，超滤纯化装置与抽吸桶之间的管道上设有抽吸路液流检测夹。

进一步地，所述的原液缸和滤液缸内设置有液位检测器。

进一步地，各装置之间连接用的管道为硅胶管道。

本发明中，所述的干细胞外泌体及旁分泌活性大分子的分离纯化装置的使用方法，具体为：

分离纯化干细胞外泌体的方法为：

1）安装固定干细胞外泌体及旁分泌活性大分子的分离纯化装置，将原液缸、滤液缸、中空纤维微滤膜、中空纤维超滤膜、低吸附磁珠容器、和抽吸桶安装固定，并连通各管道，将富含干细胞外泌体培养液置于原液缸中，缓冲液和洗脱液分别固定于挂钩上，并分别采用挂架管路电动夹控制缓冲液和洗脱液流入滤液缸中；

2）开启预处理泵，原液缸中富含干细胞外泌体培养液经中空纤维微滤膜进行过滤处理，滤液收集至滤液缸；

3）步骤2）预处理完毕后，打开循环泵、调节压力调节器压力，使滤液缸内的液体依次经中空纤维超滤膜和低吸附磁珠容器进行超滤和亲和吸附，处理后的滤液进入滤液缸中，循环进行超滤和亲和吸附，通过控制缓冲液对应的挂架管路电动夹，在超滤和亲和吸附过程中，向滤液缸中补充缓冲液；

4）步骤3）超滤和亲和吸附处理完毕后，关闭循环泵，打开洗脱液对应的挂架管路电动夹，向滤液缸中加入洗脱液后关闭挂架管路电动夹，开启循环泵进行洗脱，将吸附于磁珠上的外泌体洗脱下来，洗脱完成后，关闭循环泵；

5）洗脱完毕后，电动推进器开启，将滤液缸以及管路***内的液体吸入抽吸桶，完成外泌体的分离纯化；

分离纯化旁分泌活性大分子的方法为：

1）安装固定干细胞外泌体及旁分泌活性大分子的分离纯化装置，将原液缸、滤液缸、中空纤维微滤膜、中空纤维超滤膜和抽吸桶安装固定，将富含旁分泌活性大分子培养液置于原液缸中，缓冲液固定于挂钩上，并采用挂架管路电动夹控制缓冲液流入滤液缸中；

2）开启预处理泵，原液缸中富含旁分泌活性大分子培养液经中空纤维微滤膜进行过滤处理，滤液收集至滤液缸；

3）步骤2）预处理完毕后，打开循环泵、调节压力调节器压力，使滤液缸内的液体经中空纤维超滤膜进行超滤，处理后的滤液进入滤液缸中，循环进行超滤，通过控制缓冲液对应的挂架管路电动夹，在超滤程中，向滤液缸中补充缓冲液；

4）超滤完毕后，电动推进器开启，将滤液缸以及管路***内的液体吸入抽吸桶，完成旁分泌活性大分子的分离纯化。

进一步地，所述的低吸附磁珠容器内的磁珠为链霉素亲和磁珠，并交联有生物素标记的Tim4抗体。

本发明中，所述的富含旁分泌活性大分子培养液和富含旁分泌活性大分子培养液通过连续化生产方法获得，采用中空纤维膜生物反应器3D培养细胞，一方面细胞的培养空间更接近生物体内的三维微环境，分泌的外泌体和活性大分子更接近其在生物体内的生理活性；另一方面细胞培养空间和培养基通过超滤膜进行分割，可使得细胞分泌的外泌体和培养基中自带的外泌体有效隔离，从而不需要限定使用去除外泌体的培养基；而培养基中的生物大分子或者细胞分泌的生物大分子可以透过超滤膜；该连续化生产方法，分阶段培养、富集不同产物，分阶段收获培养液，在细胞生长旺盛期进行外泌体生产，有效保障外泌体的正常生理功能，而3D培养，细胞成堆叠式生长，细胞扩增期远远高于2D培养，而在细胞数量达到饱和时进行旁分泌生物活性大分子生产，有效增加活性大分子的产量。

本发明所述的干细胞外泌体及旁分泌活性大分子连续化生产方法，具体包括以下步骤：

（1）中空纤维膜生物反应器3D培养：将体外传代培养的干细胞用完全培养基重悬，接种到中空纤维膜生物反应器外部空间，连接完全培养基储罐，开启循环泵，待葡萄糖消耗量大于80%时，更换培养基；

（2）待培养基消耗速度趋于稳定时，从中空纤维外部空间收获富含干细胞外泌体培养液，并用新完全培养基填充中空纤维外部空间，重复该步骤直至培养基消耗速度开始明显下降，中空纤维外部空间细胞密度饱和；

（3）更换无生物大分子的基础培养基进行培养，每隔一段时间从储罐收集一次富含干细胞旁分泌活性大分子培养液，并等量更换新的基础培养基，重复该步骤2~3次；

（4）分别从步骤（2）和步骤（3）中获得的干细胞外泌体培养液和干细胞旁分泌活性大分子培养液进行提取、分离纯化，获得干细胞外泌体和干细胞旁分泌活性大分子。

上述步骤（2）和获得的干细胞外泌体培养液经低温、离心分离处理后，除去细胞碎片及蛋白沉淀后得到的上清液，待用；步骤（3）中获得的干细胞旁分泌活性大分子培养液经离心除去细胞碎片得到上清液，待用。上述完全培养基为间充质干细胞无血清基础培养基+5%血清替代物，采用完全培养基进行培养时，培养条件为37℃，5%CO₂；基础培养基组成为DMEM/F12+1.5%D-葡萄糖+ 50μmol/L L-抗坏血酸，采用基础培养基培养时，培养条件为37℃，5%CO₂，5% O₂；步骤（2）中根据葡萄糖消耗速度，每次更换的完全培养基的体积逐渐增大。

本发明采用中空纤维超滤膜（超滤）和低吸附磁珠（亲和吸附）同步进行的方式进行外泌体提取，在分离前期可使分离液体积迅速降低，外泌体浓度不断升高，进而使得亲和吸附磁珠对外泌体的吸附越来越高效，而外泌体吸附于磁珠表面，有效降低了分离液中游离外泌体的含量，从而使得超滤过程“挤出效应”大大降低，进而有效避免了超滤膜堵塞以及外泌体的损失；且克服了超滤法分离速度越来越慢和产物损失的缺点，同时克服了亲和吸附磁珠法无法处理大体积样品，成本高昂的缺点，在提取速度及回收率上得到了明显提升。

本发明可明显降低耗材成本，本发明装置在使用时所用中空纤维超滤膜通过简单的自动化冲洗过程可重复利用十次以上而无需替换或反向冲洗，亲和磁珠可反复利用五次以上而无需重复装填。

本发明通过干细胞外泌体及旁分泌活性大分子的分离纯化装置为自动化装置，整合中空纤维膜微滤、中空纤维膜超滤、磁珠亲和吸附、产品清洗、产品洗脱、产品自动抽吸等功能，可实现外泌体和干细胞旁分泌活性大分子的自动化提取，模块化设计，并且可自主增加分离级数或组合方式，大大减少了人工操作步骤，提升了产品质量稳定性。

本发明干细胞外泌体提取时，采用低速高压，有效防止磁珠表面吸附的外泌体或交联抗体被液流冲掉，磁珠容器中的分液隔板设计可有效保障液体流过磁珠表面时的均一性，使磁珠吸附效率最大化。

有益效果

本发明将切向流微滤、切向流超滤与磁珠吸附有机结合，整合成一套分离***，进行细胞培养液中外泌体及活性大分子的分离纯化，实现了多种原理同步进行的提取策略，克服了单一方法的缺点，同时将单一方法的优点进一步强化，极大地提高了产物的纯度及提取效率。

附图说明

图1为干细胞外泌体及旁分泌活性大分子的分离纯化装置整体结构示意图；

图2为中空纤维微滤膜示意图；

图3为中空纤维超滤膜示意图；

图4为低吸附磁珠的容器主视图、侧视图和侧面剖视图；

图5为抽吸桶结构示意图；

图6为实施例2分离纯化干细胞外泌体时的管路***示意图；

图7为分离纯化干细胞外泌体的流程图；

图8为实施例3分离纯化干细胞旁分泌活性大分子的管路***示意图；

图9为分离纯化干细胞分泌活性大分子的流程图；

图10为实施例4分离纯化干细胞外泌体时的管路***示意图；

图11为实施例5分离纯化干细胞外泌体时的管路***示意图；

其中，1为触摸操作屏、2为过滤器固定架、3为预处理泵，4为循环泵，5为中空纤维超滤膜固定架，6为磁力板，7为磁珠容器固定夹，8为电动压力调节器，9为主管路电动液流检测夹，10为回路电动液流检测夹，11为产品抽吸路液流检测夹，12为抽吸桶下沿固定槽，13为产品抽吸桶电动推进器，13.1为产品抽吸桶上沿固定槽，13.2电动推进滑轨，14为原液缸底座，15为滤液缸底座，16为挂架横杆，16.1为挂钩，17为挂架立柱，18为挂架管路电动夹横杆，18.1为挂架管路电动夹，19为挂架底座，20为中空纤维微滤膜，20.1为进液口Ⅱ，20.2为出液口Ι，20.3为滤液口Ι，20.4为滤液口Ⅱ。21为中空纤维超滤膜，21.1为进液口Ⅱ，21.2为出液口Ⅱ，21.3为滤液口Ⅲ，21.4为滤液口Ⅳ，22为低吸附磁珠容器，22.1容器盖，22.2为容器仓，22.3为进液口Ⅲ，22.4为出液口Ⅲ，22.5为分液隔板，22.6为出液筛网，23为抽吸桶、23.1为抽吸管，23.2为活塞推拉杆，23.3为吸液口。

具体实施方式

以下结合具体实施例进行说明，本发明附图所展示的实施例仅为本发明的代表案例，并不是全部的实施例，基于本发明还可以进行各种变化和改进，这些变化和改进都属于本发明保护的范围。因此基于本发明中的实施例，本领域人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明中的干细胞外泌体及旁分泌活性大分子的分离纯化装置整体结构示意图如图1所示，包括主控面板装置、储液装置和储液挂架；

所述的主控面板装置包括触摸操作屏1、预处理装置、超滤纯化装置和抽吸装置，储液装置包括原液缸底座14和滤液缸底座15，用于固定原液缸和滤液缸，原液缸和滤液缸内设置有液位检测器；储液挂架为“王”字形，横杆自上而下分别为挂架横杆16、挂架管路电动夹横杆18和挂架底座19，立杆为挂架立柱17，挂架横杆16上安装有6个挂钩16.1，用于固定缓冲液和洗脱液，挂架管路电动夹横杆18上安装有6个挂架管路电动夹18.1，控制缓冲液和洗脱液流入滤液缸中；超滤纯化装置为3组，使用时通过管道串联或并联方式连接；

所述的预处理装置由过滤器固定架2和预处理泵3构成，过滤器固定架2用于固定中空纤维微滤膜20，原液缸通过预处理泵3与中空纤维微滤膜20的进液口Ι 20.1管道连接，中空纤维微滤膜20出液口Ι 20.2与原液缸连接，中空纤维微滤膜20滤液口Ι 20.3与滤液缸管道连接；

所述的超滤吸附装置由循环泵4、中空纤维超滤膜固定架5、磁力板6、磁珠容器固定夹7和电动压力调节器8构成，中空纤维超滤膜固定架5用于固定中空纤维超滤膜21，磁力板6和磁珠容器固定夹7用于固定低吸附磁珠容器22，滤液缸通过循环泵4与中空纤维超滤膜21管道连接，中空纤维超滤膜21与电动压力调节器8管道连接，中空纤维超滤膜21与电动压力调节器8之间选择性连接低吸附磁珠容器22，超滤纯化装置中电动压力调节器8通往抽吸桶23和滤液缸的主管道上设有主管路电动液流检测夹9，超滤纯化装置与滤液缸之间的回路管道上设有回路电动液流检测夹10，超滤纯化装置与抽吸桶23之间的管道上设有抽吸路液流检测夹11；

所述的抽吸装置由抽吸桶下沿固定槽12、抽吸桶电动推进器13、抽吸桶下沿固定槽13.1和电动推进滑轨13.2，用于固定抽吸桶23，抽吸桶23与滤液缸、分离纯化装置通过管道连接；超滤纯化装置与抽吸桶23之间的管道上设有抽吸路液流检测夹11。

本发明中所述的中空纤维微滤膜20和中空纤维超滤膜21示意图分别如图2和图3所示，中空纤维微滤膜20包括进液口Ι 20.1，出液口Ι 20.2，滤液口Ι 20.3，和滤液口Ⅱ20.4，进液口Ι20.1与预处理泵3通过管道连接，出液口Ι20.2与原液缸通过管道连接，滤液口Ι20.3连接滤液缸；中空纤维超滤膜21包括进液口П 21.1，出液口П21.2，滤液口Ш21.3，和滤液口Ⅳ 21.4，进液口Ι 21.1与循环泵4通过管道连接，出液口П21.2选择性的与低吸附磁珠容器22或电动压力调节器8通过管道连接，滤液口Ш 21.3与废液缸通过管道连接。

本发明中所述的低吸附磁珠容器22主视图和侧面剖视图如图4所示，低吸附磁珠容器23包括容器盖22.1、容器仓22.3、进液口Ш 22.3、出液口Ш 22.4，容器仓22.3为尖底状，便于磁珠的吸取，容器仓22.3内部设置有分液隔板22.5，出液口Ш 22.4位置设置有出液筛网22.6，防止磁珠被冲出，进液口Ш 22.3选择性的与中空纤维微滤膜20通过管道连接，出液口Ш 22.4选择性的与电动压力调节器8通过管道连接。

本发明中所述的抽吸桶23结构示意图如图5所示，包括抽吸管23.1，活塞推拉杆23.2，吸液口23.3，23.4为抽吸桶下沿，23.5为抽吸桶上沿，吸液口23.3与与滤液缸、分离纯化装置通过管道连接。

本发明中上述提及的连接用的管道均为硅胶管道。

结合附图和具体实施例，对本发明中干细胞外泌体及旁分泌活性大分子的分离纯化装置使用方法进行说明。

实施例1

完全培养基的组成为：间充质干细胞无血清基础培养基+5%血清替代物；

基础培养基的组成为： DMEM/F12+1.5%D-葡萄糖+ 50μmol/L L-抗坏血酸；

中空纤维膜生物反应器规格：截留分子量100kD(95%截留率）、膜表面积1.2m²、中空纤维外部空间容积70mL；中空纤维膜生物反应器按照说明书用PBS和培养基进行预处理；

（1）种子细胞2D培养：取新鲜脐带在无菌环境下分离华通胶，用完全培养基悬浮组织块铺瓶，细胞在倒置显微镜下观察细胞生长状况，当细胞长至80%愈合应进行消化、传代；按细胞密度1×10⁴/cm²重新铺瓶，每3天换液，当细胞长至80%愈合时重复以上传代过程，培养箱条件为37℃、5%CO₂；

（2）中空纤维膜生物反应器3D培养：取P3代细胞5*10⁸，用无血清完全培养基重悬，接种到中空纤维膜生物反应器外部空间，中空纤维内部空间连接完全培养基储罐，初始培养基量250mL，开启循环泵，设置泵速为中速，将装置置于37℃、5%CO₂培养箱中培养，每12h从培养基储罐中取样，用葡萄糖测定仪测定仪测定葡萄糖含量，待葡萄糖消耗80%时，更换新培养基，根据葡萄糖消耗速度，每次更换的新培养基体积要逐步增大，前10天控制在每2天换液一次，以后控制在每天换液一次；

（3）中空纤维膜生物反应器中培养至第10天时，培养基消耗速度趋于稳定，开始每日从中空纤维外部空间收获富含外泌体的培养液，每次收获约70mL，并用新的完全培养基充满中空纤维外部空间，约第40天左右，培养基消耗速度开始明显下降，此时中空纤维外部空间细胞密度已饱和，最后一次收集培养液，获得富含干细胞外泌体培养液，并用新的完全培养基充满中空纤维外部空间；获得的富含干细胞外泌体培养液经低温（4℃，24h）、离心（1200g，离心10min）分离处理后，除去细胞碎片及蛋白沉淀后得到的上清液，待用；

（4）干细胞旁分泌活性大分子收获：将培养基储罐中的培养基更换无生物大分子的基础培养基进行培养；将装置转移至三气培养箱，调整培养参数为37℃、5%CO₂、5%O₂；每24h从培养基储罐中收集全部旧培养基，用于提取干细胞旁分泌生物活性大分子，等量更换新基础培养基，48h及72h时重复收获步骤，72h后结束细胞培养过程，获得富含干细胞旁分泌活性大分子培养液，获得的干细胞旁分泌活性大分子培养液经离心（1200g，离心10min）除去细胞碎片得到上清液，待用。

实施例2

实施例2中分离纯化干细胞外泌体时的管路***示意图如图6所示，分离纯化干细胞外泌体的流程图如图7所示，每批次处理量为150mL；

分离纯化干细胞外泌体的具体方法为：

1）安装固定干细胞外泌体及旁分泌活性大分子的分离纯化装置，将原液缸、滤液缸、中空纤维微滤膜20（0.22μm孔径）、中空纤维超滤膜21（截留分子量为100kD）、低吸附磁珠容器22（内部填充商品化链霉素亲和磁珠，交联生物素标记Tim4抗体）和抽吸桶23安装固定，并按图6所示连接管道，其中中空纤维超滤膜21与电动压力调节器8之间连接低吸附磁珠容器22，将富含干细胞外泌体培养液置于原液缸中，缓冲液和洗脱液分别固定于挂架横杆16上安装的挂钩16.1上，并分别采用挂架管路电动夹18.1控制缓冲液和洗脱液的流动；

2）开启预处理泵3，泵速设定为中速，原液缸中富含干细胞外泌体培养液经中空纤维微滤膜20进行过滤处理，滤液全部收集至滤液缸滤，原液缸中的培养液耗尽后关闭预处理泵3，进入下一步骤；

3）自动开启循环泵4，泵速设定为低速，调节压力调节器8压力设定为高压，循环过滤至过滤液体积为原来的1/10时，暂停循环泵4，打开缓冲液对应的挂架管路电动夹18.1，缓冲液流入滤液缸中，待滤液缸内滤液体积达到150mL时，自动关闭挂架管路电动夹18.1，开启循环泵4、继续循环过滤至过滤液体积为原培养液体积的1/50时，暂停循环泵4，打开缓冲液对应的挂架管路电动夹18.1，缓冲液流入滤液缸中，待滤液缸内滤液体积达到150mL时，自动关闭挂架管路电动夹18.1，开启循环泵4、继续循环过滤至过滤液体积为原培养液体积的1/50时，暂停循环泵4，进入下一步骤；

4）步骤3）超滤和亲和吸附结束后，打开洗脱液对应的挂架管路电动夹18.1，洗脱液流入滤液缸，待滤液缸内液体体积增加至1/10时，自动关闭脱液对应的挂架管路电动夹18.1，开启循环泵4，压力调节器8完全开启，循环洗脱60s，洗脱完毕后，关闭循环泵4，进入下一步骤；

5）电动推进器13开启，将滤液缸以及管路***内的液体吸入抽吸桶23，，完成外泌体的分离纯化；主管路电动液流检测夹9、回路电动液流检测夹10、抽吸路液流检测夹11同时有液体连续流过时，夹持功能激活且为开启状态；当检测到管道无液体流过时，该夹子自动夹紧，当三个夹子均夹紧时自动停止抽吸，干细胞外泌体分离纯化过程完毕，于抽吸桶23中获得干细胞外泌体；

6）根据后续产品用途，若需置换洗脱液，可用透析袋进行缓冲液置换；若需除菌，可用0.22uM滤膜过滤除菌；

7）完成一次分离程序后，开启自动清洗程序，用缓冲液冲洗管路***，然后进行下一批分离；中空纤维膜在分离速度无明显下降的情况下可重复利用，免疫亲和磁珠可重复利用5次。

实施例3

实施例2中分离纯化干细胞旁分泌活性大分子的管路***示意图如图8所示，分离纯化干细胞外泌体的流程图如图9所示，每批次处理量为150mL；

分离纯化干细胞旁分泌活性大分子的具体方法为：

1）安装固定干细胞外泌体及旁分泌活性大分子的分离纯化装置，将原液缸、滤液缸、中空纤维微滤膜20（0.1μm孔径）、中空纤维超滤膜21（节流分子量为5kD）和抽吸桶23安装固定，并按图8所示连接管道，其中中空纤维超滤膜21与电动压力调节器8连接，将富含干细胞旁分泌活性大分子培养液置于原液缸中，缓冲液固定于挂架横杆16上安装的挂钩16.1上，采用挂架管路电动夹18.1控制缓冲液的流入；

2）开启预处理泵3，泵速设定为中速，原液缸中富含干细胞旁分泌活性大分子的培养液经中空纤维微滤膜20进行过滤处理，滤液全部收集至滤液缸滤，原液缸中的培养液耗尽后关闭预处理泵3，进入下一步骤；

3）自动开启循环泵4，泵速设定为低速，调节压力调节器8压力设定为高压，循环过滤至滤液体积为原来的1/10时，暂停循环泵4，打开缓冲液对应的挂架管路电动夹18.1，缓冲液流入滤液缸中，待滤液缸内滤液体积达到150mL时，自动关闭挂架管路电动夹18.1，开启循环泵4、继续循环过滤至滤液体积为原培养液体积的1/50时，暂停循环泵4，打开缓冲液对应的挂架管路电动夹18.1，缓冲液流入滤液缸中，待滤液缸内滤液体积达到150mL时，自动关闭挂架管路电动夹18.1，开启循环泵4、继续循环至滤液体积为原培养液体积的1/50时，暂停循环泵4，进入下一步骤；

4）电动推进器13开启，将滤液缸以及管路***内的液体吸入抽吸桶23，完成旁分泌活性大分子的分离纯化；主管路电动液流检测夹9、回路电动液流检测夹10、抽吸路液流检测夹11同时有液体连续流过时，夹持功能激活且为开启状态；当检测到管道无液体流过时，该夹子自动夹紧，当三个夹子均夹紧时自动停止抽吸，干细胞外泌体分离纯化过程完毕，于抽吸桶23中获得干细胞外泌体产品；

5）根据后续产品用途，若需除菌，可用0.22uM滤膜过滤除菌；

6）完成一次分离程序后，开启自动清洗程序，用缓冲液冲洗管路***，然后进行下一批分离；中控纤维膜在分离速度无明显下降的情况下可重复利用。

实施例4

实施例4分离纯化干细胞外泌体时的管路***示意图如图10所示，三组超滤纯化装置串联连接；其余操作与实施例1相同。

实施例5

实施例5分离纯化干细胞外泌体时的管路***示意图如图11所示，三组超滤纯化装置并联连接；其余操作与实施例1相同。

对比例1

按照图8连接管路***，采用超滤提取干细胞外泌体，其它操作同实施例2。

数据分析

总蛋白含量用BCA法检测，（50-150nm）粒子总数用NanoSight纳米颗粒分析仪检测，代表性生物大分子（VEGF、GDNF、bFGF）浓度用ELISA法检测。

对实施例2、实施例4~5和对比例1中的干细胞外泌体分离提纯前后的蛋白总量、外泌体粒子总数和分离纯化和时间进行检测、记录，结果如下表1所示，由表1可知，本发明分离纯化方法的分离速度明显优于对比例1（单独中空纤维超滤膜处理），且蛋白回收率及外泌体粒子的回收率也明显优于对比例1.

对实施例3分离纯化前后干细胞旁分泌活性大分子总蛋白含量、代表性生物大分子（VEGF、GDNF、bFGF）浓度进行检测，结果如下表2所示。

表1 干细胞外泌体分离纯化结果对比

表2干细胞外泌体活性大分子分离提纯结果

。

Claims (8)

1.一种干细胞外泌体及旁分泌活性大分子的分离纯化装置，其特征在于，包括主控面板装置、储液装置和储液挂架；

所述的主控面板装置包括触摸操作屏（1）、预处理装置、超滤纯化装置和抽吸装置，储液装置包括原液缸底座（14）和滤液缸底座（15），用于固定原液缸和滤液缸，储液挂架为“王”字形，横杆自上而下分别为挂架横杆（16）、挂架管路电动夹横杆（18）和挂架底座（19），立杆为挂架立柱（17），挂架横杆（16）上安装有若干挂钩（16.1），用于固定缓冲液和洗脱液，挂架管路电动夹横杆（18）上安装有若干挂架管路电动夹（18.1），控制缓冲液和洗脱液的流入，缓冲液和洗脱液选择性的与滤液缸管道连接；

所述的预处理装置包括过滤器固定架（2）和预处理泵（3），过滤器固定架（2）用于固定中空纤维微滤膜（20），原液缸与预处理泵（3）、中空纤维微滤膜（20）管道连接，中空纤维微滤膜（20）与原液缸管道连接，中空纤维微滤膜（20）与滤液缸管道连接，用于收集过滤液；

所述的超滤纯化装置包括循环泵（4）、中空纤维超滤膜固定架（5）、磁力板（6）、磁珠容器固定夹（7）、电动压力调节器（8），中空纤维超滤膜固定架（5）用于固定中空纤维超滤膜（21），磁力板（6）和磁珠容器固定夹（7）用于固定低吸附磁珠容器（22），滤液缸与循环泵（4）、中空纤维超滤膜（21）管道连接，中空纤维超滤膜（21）与电动压力调节器（8）管道连接，中空纤维超滤膜（21）与电动压力调节器（8）之间选择性管道连接低吸附磁珠容器（22），电动压力调节器（8）与滤液缸管道连接；

所述的抽吸装置包括抽吸桶下沿固定槽（12）、抽吸桶电动推进器（13）和抽吸桶下沿固定槽（13.1）和电动推进滑轨（13.2），用于固定抽吸桶（23），抽吸桶（23）与滤液缸、超滤纯化装置管道连接。

2.根据权利要求1所述的干细胞外泌体及旁分泌活性大分子的分离纯化装置，其特征在于，所述的超滤纯化装置为1~3组，以串联或并联方式连接。

3.根据权利要求1所述的干细胞外泌体及旁分泌活性大分子的分离纯化装置，其特征在于，所述的中空纤维微滤膜（20）包括进液口（20.1）、出液口（20.2），滤液口Ι（20.3），滤液口Ⅱ（20.4），滤液口Ι（20.3）与滤液缸连接；所述的中空纤维超滤膜（21）包括进液口Ⅱ（21.1）、出液口Ⅱ（21.2），滤液口Ⅲ（21.3），滤液口Ⅳ（21.4）；所述的低吸附磁珠容器（22）包括容器盖（22.1），容器仓（22.2），进液口Ⅲ（22.3），出液口Ⅲ（22.4），容器仓（22.2）内部由分液隔板（22.5），出液口Ⅲ（22.4）设有出液筛网（22.6）；所述的抽吸桶（23）包括抽吸管（23.1），活塞推拉杆（23.2），吸液口（23.3）。

4.根据权利要求1所述的干细胞外泌体及旁分泌活性大分子的分离纯化装置，其特征在于，所述的超滤纯化装置中电动压力调节器（8）通往抽吸桶（23）和滤液缸的主管道上设有主管路电动液流检测夹（9），超滤纯化装置与滤液缸之间的回路管道上设有回路电动液流检测夹（10），超滤纯化装置与抽吸桶（23）之间的管道上设有抽吸路液流检测夹（11）。

5.根据权利要求1所述的干细胞外泌体及旁分泌活性大分子的分离纯化装置，其特征在于，所述的原液缸和滤液缸内设置有液位检测器。

6.根据权利要求1所述的干细胞外泌体及旁分泌活性大分子的分离纯化装置，其特征在于，各装置之间连接用的管道为硅胶管道。

7.一种权利要求1~6任一项所述的干细胞外泌体及旁分泌活性大分子的分离纯化装置的使用方法，其特征在于，

分离纯化干细胞外泌体的方法为：

1）安装固定干细胞外泌体及旁分泌活性大分子的分离纯化装置，将原液缸、滤液缸、中空纤维微滤膜（20）、中空纤维超滤膜（21）、低吸附磁珠容器（22）、和抽吸桶（23）安装固定，并连通各管道，将富含干细胞外泌体培养液置于原液缸中，缓冲液和洗脱液分别固定于挂钩（16.1）上，并分别采用挂架管路电动夹（18.1）控制缓冲液和洗脱液流入滤液缸中；

2）开启预处理泵（3），原液缸中富含干细胞外泌体培养液经中空纤维微滤膜（20）进行过滤处理，滤液收集至滤液缸；

3）步骤2）预处理完毕后，打开循环泵（4）、调节压力调节器（8）压力，使滤液缸内的液体依次经中空纤维超滤膜（21）和低吸附磁珠容器（22）进行超滤和亲和吸附，处理后的滤液进入滤液缸中，循环进行超滤和亲和吸附，通过控制缓冲液对应的挂架管路电动夹（18.1），在超滤和亲和吸附过程中，向滤液缸中补充缓冲液；

4）步骤3）超滤和亲和吸附处理完毕后，关闭循环泵（4），打开洗脱液对应的挂架管路电动夹（18.1），向滤液缸中加入洗脱液后关闭挂架管路电动夹（18.1），开启循环泵（4）进行洗脱，将吸附于磁珠上的外泌体洗脱下来，洗脱完成后，关闭循环泵（4）；

5）洗脱完毕后，电动推进器（13）开启，将滤液缸以及管路***内的液体吸入抽吸桶（23），完成外泌体的分离纯化；

分离纯化旁分泌活性大分子的方法为：

1）安装固定干细胞外泌体及旁分泌活性大分子的分离纯化装置，将原液缸、滤液缸、中空纤维微滤膜（20）、中空纤维超滤膜（21）和抽吸桶（23）安装固定，将富含旁分泌活性大分子培养液置于原液缸中，缓冲液固定于挂钩（16.1）上，并采用挂架管路电动夹（18.1）控制缓冲液流入滤液缸中；

2）开启预处理泵（3），原液缸中富含旁分泌活性大分子培养液经中空纤维微滤膜（20）进行过滤处理，滤液收集至滤液缸；

3）步骤2）预处理完毕后，打开循环泵（4）、调节压力调节器（8）压力，使滤液缸内的液体经中空纤维超滤膜（21）进行超滤，处理后的滤液进入滤液缸中，循环进行超滤，通过控制缓冲液对应的挂架管路电动夹（18.1），在超滤程中，向滤液缸中补充缓冲液；

4）超滤完毕后，电动推进器（13）开启，将滤液缸以及管路***内的液体吸入抽吸桶（23），完成旁分泌活性大分子的分离纯化。

8.根据权利要求7所述的使用方法，其特征在于，所述的低吸附磁珠容器（22）内的磁珠为链霉素亲和磁珠，并交联有生物素标记的Tim4抗体。

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