CN110777107B - 一种马血清去除脂蛋白的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种马血清去除脂蛋白的生产方法，包括以下步骤：马血清通过无菌纱布粗过滤；滤液A通过过滤柱进行初滤；将上述滤液B通过孔径为0.05～1um改性醋酸纤维素过滤膜；将得到的滤液C再通过截留分子量低于100kD的中空纤维超滤柱进行超滤；将超滤得到的滤液C置于C18树脂中进行层析；层析流出液置于反应罐中，加乙醇沉淀；在上清液A中加入Celite503吸附剂；在上清液B中加入多糖微球吸附剂,制得去除脂蛋白的马血清成品。本发明的方法简便快捷，工艺稳定且适于大批量生产，通过层层过滤以及分离有效去除马血清中的脂蛋白和含纤维蛋白。

Description

一种马血清去除脂蛋白的生产方法

技术领域

本发明涉及脂蛋白的分离方法，具体涉及马血清去除脂蛋白的生产方法。

背景技术

人和动物血液中富含蛋白质和酶，能够治疗和挽救生命。有些蛋白质在红细胞中，有些蛋白质存在于血清中。从上世纪中叶，蛋白质的提纯和分离已经成为研究的重要方向。迄今为止，可实现分离的蛋白质有：白蛋白、脂蛋白、纤维蛋白、免疫球蛋白G等。

马血清是细胞及微生物培养中用量较大的天然培养基，含有丰富的细胞及微生物生长必须的营养成份，常用于动物细胞的体外培养和细菌、支原体等培养，具有极为重要的功能。但目前市售的马血清均来源于成年马，常含有一定量不利于细胞及微生物生长的物质，例如脂蛋白，既增大了血清的粘稠度，降低了澄清度，同时在使用时常会影响细胞及微生物生长，目前资料显示，没有马血清去除脂蛋白的工业化生产方法。

而血浆和血清中含有蛋白质以及其他例如酶等化合物，当血液从动物身上流出暴露在空气或容器中，会变得很不稳定。即使添加柠檬酸钠等化学试剂，也仅能够在一定程度上增加其稳定性，防止凝结。从血清中分离蛋白所用的任何方法都要考虑血清和蛋白质自身的不稳定性。因此，规模化从血清中去除蛋白质是一个重大的挑战。

血清脂蛋白具有特殊的颗粒结构，组成复杂且不均一，在代谢过程中不断进行物质交换。现有的分离血清脂蛋白的方法有超速离心法(ultracentrifugation，UC)、电泳法(electrophoresis，EP)和非对称场流分离技术(asymmetrical flow field-flowfractionation，AF4)。超速离心法是通过使用一种密度能形成连续增高或降低的梯度的溶剂***，例如盐溶液，使离心后的血清脂蛋白颗粒能按照各自的密度比重平衡在溶剂***中，从而达到分离的目的；电泳法是根据血清脂蛋白颗粒在电场中迁移速率的差异达到分离的目的；非对称场流分离技术是基于血清脂蛋白颗粒尺寸的差异达到分离样品组分的目的。然而，超速离心法分离血清脂蛋白时，分析时间长，操作过程复杂，实施难度高，不能获得脂蛋白的粒径分布；电泳法分离血清脂蛋白时，分辨率低、重现性差，且不能获得脂蛋白的粒径分布信息；非对称场流分离技术分离血清脂蛋白时，由于蛋白质的干扰，不能达到样品组分的完全分离，且染色后的血清脂蛋白膜吸附严重。

发明内容

为解决现有技术中马血清中去除脂蛋白不能实现工业化生产的技术问题。本发明提供一种马血清去除脂蛋白的生产方法。

本发明提供一种马血清去除脂蛋白的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)粗过滤，马血清通过多层无菌纱布粗过滤，滤除部分高密度纤维蛋白，得滤液A；

2)初滤，将滤液A通过过滤柱进行初滤，进一步滤除的高密度纤维蛋白和少量高密度脂蛋白，收集滤液B；

3)将上述滤液B通过孔径为0.05～1um改性醋酸纤维素过滤膜，滤除小分子脂蛋白，收集滤液C；

4)超滤，将得到的滤液C再通过截留分子量低于100kD的中空纤维超滤柱进行超滤，滤除大分子脂蛋白，将透过液回收无菌保存；

5)层析，将超滤得到的透过液置于C18树脂中进行层析，流速为60cm/小时，得层析流出液；

6)乙醇沉淀，层析流出液置于反应罐中，加乙醇沉淀，调pH，控制温度，控制反应时间，然后进行离心分离，得上清液A；

7)在上清液A中加入Celite503吸附剂，在设定温度下搅拌一定时间，过滤，去除血清中不稳定的纤维蛋白原和凝血因子，离心，得上清液B；

8)在上清液B中加入多糖微球吸附剂，通过流速至少为3cm/min的吸附柱，以吸附和去除血清中的低密度脂蛋白，得到上清液C，制得去除脂蛋白的马血清成品。

优选的，步骤2)中的初滤利用20英寸孔径为0.45um的过滤柱进行。

进一步优选的，在步骤6)中，离心分离过程中将温度控制在3～5℃，控制离心速度为10000r/min，离心时间为8-10min。

进一步优选的，在步骤6)乙醇沉淀过程中，将乙醇分为10份批量加入，先加入5份乙醇，反应1h，再加入3份乙醇，反应0.5h，最后加入2份乙醇反应1h。

进一步优选的，调节乙醇沉淀的pH为5-6，将反应温度逐渐降低为零下4℃，控制反应时间为2-3h。

进一步优选的，所述Celite503吸附剂用量为上清液体积量的3％-4％，在3-5℃温度下搅拌1-3小时。

进一步优选的，加入Celite503吸附剂，在设定温度为3℃下，搅拌2h。

进一步优选的，所述Celite503吸附剂颗粒密度为4g/ml-10g/ml，加入Celite503吸附剂搅拌后，通过流速至少为3cm/min的吸附柱。

进一步优选的，步骤8)中还包括除菌操作，将上清液C通过γ射线照射，然后装入连续流血浆灭菌器内并以45°角度采用紫外线照射，最终得到去除脂蛋白的无菌马血清成品。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明所述去除马血清中脂蛋白的方法简便快捷，工艺稳定且适于大批量生产，通过层层过滤以及分离、提纯，先过滤柱初滤去除少量高密度脂蛋白，然后改性醋酸纤维素过滤膜滤除小分子脂蛋白，再通过中空纤维超滤柱滤除大分子量脂蛋白，乙醇沉淀离心进一步去除脂蛋白，最后通过多糖微球吸附剂去除低密度脂蛋白，大大提高脂蛋白的去除率，将脂蛋白去除率提高至95％以上，且有效去除纤维蛋白等。本发明采取的血清去除脂蛋白的方法，简便快捷，工艺稳定且适于大批量生产，且有效去除马血清中的脂蛋白和含纤维蛋白，葡萄糖含量低，能够彻底杜绝病毒、病菌和支原体的污染，所得的马血清能够用于含血清细胞培养液。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好的理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例来对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请的一部分实施例，基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。

选未进食的成年马，并检查马体档案：包括马匹体重、年龄、健康状况、近1年有无疫情、近1年的疫苗注射等情况，并将上述内容登记入待采血马的血液档案中。

将选好的待采血马匹剃毛，并进行清洁消毒处理，依次采用碘酒和酒精进行全身消毒处理。使用无菌采血针从清洁消毒后马匹的静脉进行全血采集，采血量不超过其体重的1.1％，并将采集到的全血存放在离心瓶中并于4℃温度下静置8-20h。待自然出清后，以5000转离心处理50-60min，静置，待瓶中血清与红细胞明显分层后，离心分离，吸取上层血清(取为样品1)至无菌容器中，将分离好的血清于-20℃温度下保存。

将处理得到的马血清进行处理，首先，将得到的冷冻血清置于冰箱中解冻，并将解冻后的马血清通过多层无菌纱布粗过滤，滤除部分高密度纤维蛋白，得滤液A。将滤液A通过过滤柱进行初滤，进一步滤除的高密度纤维蛋白和少量高密度脂蛋白，收集滤液B(取滤液B为样品2)。具体的，利用20英寸孔径为0.45um的过滤柱进行初滤，直径较大的纤维蛋白和较少的高密度脂蛋白被滤除。

将上述滤液B通过孔径为0.05～1um改性醋酸纤维素过滤膜，滤除小分子脂蛋白，收集滤液C(取滤液C为样品3)。

改性醋酸纤维素过滤膜原料为磺酸基改性醋酸纤维素和两亲性壳聚糖，制备方法为：在醋酸纤维素中引入磺酸基改性阴离子聚合物，将两亲性壳聚糖、聚2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱和油酸钠混合溶液，预先混合好的磺酸基改性醋酸纤维素丙酮溶液，分别喷丝卷绕，成膜、烘干，制得孔径为0.05～1um的改性醋酸纤维素过滤膜。改性醋酸纤维素过滤膜的亲水基和疏水基，利用其疏水和位阻作用，有效滤除小分子量的脂蛋白，由于加入少量的聚2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱，可改善过滤膜生物相容性，根据生物仿生的原理，聚2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱可降低过滤膜对高密度脂蛋白的影响，即不能将高密度脂蛋白滤除，因此还需要采取进一步处理以分离大分子脂蛋白。

将得到的滤液C再通过截留分子量低于100kD的中空纤维超滤柱进行超滤，滤除大分子脂蛋白，将透过液回收无菌保存(取透过液为样品4)。

将超滤得到的透过液置于C18树脂中进行层析，流速为60cm/小时，得层析流出液；流出液置于反应罐中，加乙醇沉淀，调pH，控制温度，控制反应时间，然后进行离心分离，得上清液A(取上清液A为样品5)。

在乙醇沉淀步骤中，将乙醇分为10份批量加入，先加入5份乙醇，反应1h，再加入3份乙醇，反应0.5h，最后加入2份反应1h。调节乙醇沉淀的pH为5-6，将反应温度逐渐降低为零下4℃，控制反应时间为2-3h。沉淀后的离心提取上清液A，离心时间为8-10min。

离心分离过程中，将温度控制在3-5℃，控制离心速度为10000r/min，离心时间为8-10min。

往血清中添加水溶性的乙醇等有机溶剂可使得脂蛋白变性，即乙醇溶液对水有较大亲和力，通过降低血清中的介电常数，可使得蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化，从而使得蛋白分子之间通过极性基团的相互作用，在范德华力作用下，发生凝聚，即将脂蛋白从血清中沉淀分离。

在上清液A中加入Celite503吸附剂，在设定温度下搅拌一定时间，过滤，去除血清中不稳定的纤维蛋白原和凝血因子，离心，得上清液B。

所述Celite503吸附剂用量为上清液A体积比的3％-4％，在3-5℃温度下搅拌1-3小时，优选温度3℃、反应时间2h。吸附去除血清中不稳定的纤维蛋白原和凝血因子等。所述Celite503吸附剂颗粒密度为4g/ml-10g/ml，加入Celite503吸附剂搅拌后，通过流速至少为3cm/min的吸附柱。残留的纤维蛋白、凝血因子等被结合到吸附剂上，通过逐步洗提的方式，去除马血清中不稳定蛋白。

在上清液B中加入多糖微球吸附剂，通过流速至少为3cm/min的吸附柱，以吸附和去除血清中的低密度脂蛋白，得到上清液C，制得去除脂蛋白的马血清成品。

所述多糖微球吸附剂以多糖微球为载体，多糖配基固载在载体表面。其中多糖微球选自纤维素微球、琼脂糖微球、葡聚糖微球。多糖配基选自多糖为环糊精、葡聚糖、魔芋多糖，多糖配基上偶联有疏水链和阴离子基团。具体制备方法为：将多糖微球加入三氯乙腈和碳酸钾，二氯甲烷中室温反应，经洗涤、抽滤、干燥，制得活化多糖微球；在多糖配基上偶联疏水链和阴离子基团；将月桂酸、硬脂酸、聚乳酸或聚(乳酸-羟基乙酸)、多糖配基共聚物在催化剂作用下制备偶联疏水链的多糖配基制备；偶联有疏水链的多糖配基与三氧化硫吡啶复合物反应制备偶联疏水链和阴离子基团的多糖配基；将活化多糖微球载体与偶联疏水链和阴离子基团的多糖配基在路易斯酸催化剂作用下反应，制得多糖微球吸附剂。多糖微球吸附剂可有效吸附去除低密度脂蛋白，彻底出去马血清中的脂蛋白。

此外，还包括除菌操作，将吸附、离心所得的上清液通过γ射线照射，然后装入连续流血浆灭菌器内并以45°角度采用紫外线照射，最终得到去除脂蛋白的无菌马血清成品(取血清成品为样品6)。

对上述收集到的马血清样品脂蛋白蛋白质含量检测、纤维蛋白含量检测、细菌检测及病毒检测，所采用的检测方法为本领域技术人员使用的常规检测方法，计算样品1-5的脂蛋白和纤维蛋白去除情况，检测结果参见表1所述。

表1

综上所述，本发明提供马血清去除脂蛋白的生产方法，通过层层过滤以及分离、提纯，先过滤柱初滤去除少量高密度脂蛋白，然后改性醋酸纤维素过滤膜滤除小分子脂蛋白，再通过中空纤维超滤柱滤除大分子量脂蛋白，乙醇沉淀离心进一步去除脂蛋白，最后通过多糖微球吸附剂去除低密度脂蛋白，大大提高脂蛋白的去除率，将脂蛋白去除率提高至95％以上，且有效去除纤维蛋白等。本发明采取的血清去除脂蛋白的方法，简便快捷，工艺稳定且适于大批量生产，且有效去除马血清中的脂蛋白和含纤维蛋白，葡萄糖含量低，能够彻底杜绝病毒、病菌和支原体的污染，所得的马血清能够用于含血清细胞培养液。

应当理解，虽然本说明书是按照各个实施例描述的，但并非每个实施例仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.本发明提供一种马血清去除脂蛋白的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)粗过滤，马血清通过多层无菌纱布粗过滤，滤除部分高密度纤维蛋白，

得滤液A；

2)初滤，将滤液A通过过滤柱进行初滤，进一步滤除的高密度纤维蛋白和少量高密度脂蛋白，收集滤液B；

3)将上述滤液B通过孔径为0.05～1um改性醋酸纤维素过滤膜，滤除小分子脂蛋白，收集滤液C；

4)超滤，将得到的滤液C再通过截留分子量低于100kD的中空纤维超滤柱进行超滤，滤除大分子脂蛋白，将透过液回收无菌保存；

5)层析，将超滤得到的透过液置于C18树脂中进行层析，流速为60cm/小时，得层析流出液；

6)乙醇沉淀，层析流出液置于反应罐中，加乙醇沉淀，将乙醇分为10份批量加入，先加入5份乙醇，反应1h，再加入3份乙醇，反应0.5h，最后加入2份乙醇反应1h，调pH，控制温度，控制反应时间，然后进行离心分离，得上清液A；

7)在上清液A中加入Celite503吸附剂，在3-5℃温度下搅拌1-3小时，过滤，去除血清中不稳定的纤维蛋白原和凝血因子，离心，得上清液B，所述Celite503吸附剂用量为上清液体积比的3％-4％，所述Celite503吸附剂颗粒密度为4g/ml-10g/ml，加入Celite503吸附剂搅拌后，通过流速至少为3cm/min的吸附柱；

8)在上清液B中加入多糖微球吸附剂，通过流速至少为3cm/min的吸附柱，以吸附和去除血清中的低密度脂蛋白，得到上清液C，制得去除脂蛋白的马血清成品。

2.根据权利要求1所述的一种马血清去除脂蛋白的生产方法，其特征在于，步骤2)中的初滤利用20英寸孔径为0.45um的过滤柱进行。

3.根据权利要求1所述的一种马血清去除脂蛋白的生产方法，其特征在于，在步骤6)中，离心分离过程中，将温度控制在3-5℃，控制离心速度为10000r/min，离心时间为8-10min。

4.根据权利要求1所述的一种马血清去除脂蛋白的生产方法，其特征在于，调节乙醇沉淀的pH为5-6，将反应温度逐渐降低为零下4℃，控制反应时间为2-3h。

5.根据权利要求1或4所述的一种马血清去除脂蛋白的生产方法，其特征在于，加入Celite503吸附剂，在设定温度为3℃下，搅拌2h。

6.根据权利要求1所述的一种马血清去除脂蛋白的生产方法，其特征在于，步骤6)中还包括除菌操作，将上清液C通过γ射线照射，然后装入连续流血浆灭菌器内并以45°角度采用紫外线照射，最终得到去除脂蛋白的无菌马血清成品。