JP6948081B2 - エクソソーム回収方法 - Google Patents
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Description
三次元培養工程では、間葉系幹細胞に代謝される培地中の物質量を計測しながら、不織布を足場として、培地中で間葉系幹細胞を三次元培養する(なお本明細書では三次元を3Dと記載することがある。)。
プラトー状態後培養工程では、間葉系幹細胞の培地中の物質量がプラトーとなってから更に一定時間培養を行う。
最後に間葉系幹細胞からのエクソソームを回収する。前述のプラトー状態後培養工程の完了後は大量のエクソソームが産生しており、産生した大量のエクソソームの回収は通常用いられる手法を利用できる。エクソソームの回収法としては、特に限定されるものではなく、例えば超遠心法が挙げられる。超遠心法としては例えばペレットダウン法、スクロースクッション法、密度勾配遠心法等が挙げられる。
以下に、不織布(3D)を足場として培養してその後糖消費量がプラトー状態での培養後のエクソソーム大量回収にかかる実施例を記載する。
三次元培養工程では、細胞の糖消費量(本実施例では培地中のグルコース消費量)がプラトーになるまで不織布を足場として細胞を三次元培養した。
プラトー状態後培養工程では、細胞の糖消費量がプラトーになってから一定時間細胞を三次元培養した。
BMSC及びADSCにおいて48時間後の培養上清1.5 ml全量を回収した。回収した培養上清から超遠心法にてエクソソームを回収した。また足場から細胞を剥離して最終細胞数を計測した。
以下に、培養皿(2D)を足場として培養してその後糖消費量がプラトー状態での培養後のエクソソーム回収にかかる比較例を記載する。
以下に、糖消費量がプラトー前での培養後のエクソソーム回収にかかる比較例を記載する。
4-1. 三次元構造体である不織布を使用した効果
全量回収した培養上清1.5 mlの内、評価項目当り50 μlずつをExoCounter(JVCKENWOOD)にて測定(CD63及びCD81をエクソソームマーカーとして定量)した。
BMSC及びADSCともに、不織布足場(3D)及び培養皿足場(2D)において、細胞の糖消費量がプラトーになる前の段階であるDay7まで培養した場合、不織布足場では細胞数は1.11±0.04 x 105個であり、培養皿足場では1.43±0.12 x 105個であった。細胞数の比率は不織布足場(3D)/培養皿足場(2D)ratio = x 0.776であった。
Claims (8)
- 間葉系幹細胞からのエクソソームの回収方法であって、
前記間葉系幹細胞に代謝される培地中の物質量を計測しながら、不織布を足場として前記培地中で間葉系幹細胞を三次元培養する、三次元培養工程と、
前記培地中の前記物質量がプラトーになった後に更に一定時間培養する、プラトー状態後培養工程と、
前記一定時間培養の後に、前記間葉系幹細胞からエクソソームを回収する、エクソソーム回収工程と、
を有することを特徴とするエクソソーム回収方法。 - 前記間葉系幹細胞に代謝される前記培地中の物質は糖であり、
前記間葉系幹細胞の培養時間に対する糖消費量を計測し、
前記プラトー状態後培養工程は、前記糖消費量がプラトー状態となってから更に一定時間培養することを特徴とする請求項1に記載のエクソソーム回収方法。 - 前記プラトー状態後培養工程において、前記間葉系幹細胞の培養時間に対する糖消費量の計測ではグルコースの消費量を計測することを特徴とする請求項2に記載のエクソソーム回収方法。
- 前記プラトー状態後培養工程において、前記物質量がプラトー状態となってからの培養時間は、24時間以上72時間以下であることを特徴とする請求項1乃至3の何れか1項に記載のエクソソーム回収方法。
- 前記間葉系幹細胞は、脂肪由来間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項1乃至4の何れか1項に記載のエクソソーム回収方法。
- 前記間葉系幹細胞が脂肪由来間葉系幹細胞である場合、前記三次元培養工程における脂肪由来間葉系幹細胞の培養時間は7日以上9日以下であることを特徴とする請求項5に記載のエクソソーム回収方法。
- 前記間葉系幹細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項1乃至4の何れか1項に記載のエクソソーム回収方法。
- 前記間葉系幹細胞が骨髄由来間葉系幹細胞である場合、前記三次元培養工程における骨髄由来間葉系幹細胞の培養時間は9日以上11日以下であることを特徴とする請求項7に記載のエクソソーム回収方法。
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