CN112553149A - 一种外泌体的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种外泌体的制备方法，包括如下步骤：S1脐带间充质干细胞上清液的制备、S2脐带间充质干细胞外泌体的分离存化、S3外泌体的提取，本发明与常规外泌体的制备方法相比较，通过脐带间充质干细胞来源的外泌体，且具有较强的免疫调节作用，可用于***和硬皮病等自身免疫性疾病，降低细胞或器官移植后的免疫排斥反应，提高细胞或器官移植的成功率，而且通过将得到的外泌体浓缩液中加入乳酸钠、氯化钠和氯化钾盐溶液进行培养，然后在进行提取，使得增加其纯度。

Description

一种外泌体的制备方法
技术领域
本发明属于外泌体制备领域，更具体地说，尤其涉及一种外泌体的制备方法。
背景技术
外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡，多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中，由于外泌体为纳米级囊泡结构，现有技术大部分采用高速离心对其进行脱水处理后得到，且得到的纯度不够纯，对其后期处理应用有很大影响。
发明内容
本发明的目的在于提供一种外泌体的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种外泌体的制备方法，包括如下步骤：
S1、脐带间充质干细胞上清液的制备，将不含外泌体血清的培养基加入到脐带间充质干细胞中，将其稀释成细胞悬液接种于细胞培养瓶中培养，收取培养后的上清液；
S2、脐带间充质干细胞外泌体的分离存化，将步骤S1中得到的上清液进行处理，首先，将上清液中的细胞杂质、死细胞过滤，使用无菌滤膜过滤，并将所得的外泌体沉淀分装于无菌离心管中，保存备用，然后将其稀释成细胞悬液接种于25cm3的细胞培养瓶中，置于45℃、6％CO2、湿度饱和的培养箱中培养40-80h时收取细胞培养后的上清液，收集达到250ml以上，进行外泌体的提取；
S3、外泌体的提取，首先，将步骤S2中得到的液体进行离心，将上清液离心处理，转移上清液，去除其中的死细胞，然后在通过0.22μm的无菌滤膜过滤，去除其中的杂质，其次，在将得到的上清液超速离心沉淀外泌体，去除上清液后加入500μl PBS溶解收集外泌体沉淀，最后再使用0.22μm的无菌滤膜过滤，得到浓缩的外泌体浓缩液中加入乳酸钠、氯化钠和氯化钾进行溶解，得到外泌体盐溶液，在将外泌体提取液加入到外泌体盐溶液中培养，将培养后的溶液在4℃12000g、超速离心70min沉淀外泌体，并将所得外泌体沉淀分装于无菌离心管中，-80℃保存备用。
优选的，在步骤S2中，当样品浓度过大时，通过加入等体积的PBS缓冲液进行稀释。
优选的，在步骤S1中，将不含外泌体血清的培养基加入到脐带间充质干细胞中，培养24-48h，细胞融合度达到80％-95％左右时收取上清。
优选的，在步骤S3中，首先，上清液于4℃2000g、,离心10min去除死细胞，然后在于4℃10000g、超速离心60min沉淀外泌体。
优选的，在步骤S3中，过滤去除囊泡所用的滤网的孔径为0.20μm～0.24μm，还可以选择0.22μm。
优选的，在步骤S3中，低温离心为2℃～6℃下以1800g～2200g进行离心。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明与常规外泌体的制备方法相比较，通过脐带间充质干细胞来源的外泌体，且具有较强的免疫调节作用，可用于***和硬皮病等自身免疫性疾病，降低细胞或器官移植后的免疫排斥反应，提高细胞或器官移植的成功率，而且通过将得到的外泌体浓缩液中加入乳酸钠、氯化钠和氯化钾混合盐溶液溶液进行培养，然后在进行提取，使得增加其纯度。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一种外泌体的制备方法，包括如下步骤：
S1、脐带间充质干细胞上清液的制备，将不含外泌体血清的培养基加入到脐带间充质干细胞中，将其稀释成细胞悬液接种于细胞培养瓶中培养，收取培养后的上清液；
S2、脐带间充质干细胞外泌体的分离存化，将步骤S1中得到的上清液进行处理，首先，将上清液中的细胞杂质、死细胞过滤，使用无菌滤膜过滤，并将所得的外泌体沉淀分装于无菌离心管中，保存备用，然后将其稀释成细胞悬液接种于25cm3的细胞培养瓶中，置于45℃、6％CO2、湿度饱和的培养箱中培养40-80h时收取细胞培养后的上清液，收集达到250ml以上，进行外泌体的提取；
S3、外泌体的提取，首先，将步骤S2中得到的液体进行离心，将上清液离心处理，转移上清液，去除其中的死细胞，然后在通过0.22μm的无菌滤膜过滤，去除其中的杂质，其次，在将得到的上清液超速离心沉淀外泌体，去除上清液后加入500μl PBS溶解收集外泌体沉淀，最后再使用0.22μm的无菌滤膜过滤，得到浓缩的外泌体浓缩液中加入乳酸钠、氯化钠和氯化钾进行溶解，得到外泌体盐溶液，在将外泌体提取液加入到外泌体盐溶液中培养，将培养后的溶液在4℃12000g、超速离心70min沉淀外泌体，并将所得外泌体沉淀分装于无菌离心管中，-80℃保存备用。
具体的，在步骤S2中，当样品浓度过大时，通过加入等体积的PBS缓冲液进行稀释。
具体的，在步骤S1中，将不含外泌体血清的培养基加入到脐带间充质干细胞中，培养24-48h，细胞融合度达到80％-95％左右时收取上清。
具体的，在步骤S3中，首先，上清液于4℃2000g、,离心10min去除死细胞，然后在于4℃10000g、超速离心60min沉淀外泌体。
具体的，在步骤S3中，过滤去除囊泡所用的滤网的孔径为0.20μm～0.24μm，还可以选择0.22μm。
具体的，在步骤S3中，低温离心为2℃～6℃下以1800g～2200g进行离心。
本发明与常规外泌体的制备方法技术相比较，通过脐带间充质干细胞来源的外泌体，且具有较强的免疫调节作用，可用于***和硬皮病等自身免疫性疾病，降低细胞或器官移植后的免疫排斥反应，提高细胞或器官移植的成功率，而且通过将得到的外泌体浓缩液中加入乳酸钠、氯化钠和氯化钾盐溶液进行培养，然后在进行提取，使得增加其纯度。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、脐带间充质干细胞上清液的制备，将不含外泌体血清的培养基加入到脐带间充质干细胞中，将其稀释成细胞悬液接种于细胞培养瓶中培养，收取培养后的上清液；
S2、脐带间充质干细胞外泌体的分离存化，将步骤S1中得到的上清液进行处理，首先，将上清液中的细胞杂质、死细胞过滤，使用无菌滤膜过滤，并将所得的外泌体沉淀分装于无菌离心管中，保存备用，然后将其稀释成细胞悬液接种于25cm3的细胞培养瓶中，置于45℃、6％CO2、湿度饱和的培养箱中培养40-80h时收取细胞培养后的上清液，收集达到250ml以上，进行外泌体的提取；
S3、外泌体的提取，首先，将步骤S2中得到的液体进行离心，将上清液离心处理，转移上清液，去除其中的死细胞，然后在通过0.22μm的无菌滤膜过滤，去除其中的杂质，其次，在将得到的上清液超速离心沉淀外泌体，去除上清液后加入500μlPBS溶解收集外泌体沉淀，最后再使用0.22μm的无菌滤膜过滤，得到浓缩的外泌体浓缩液中加入乳酸钠、氯化钠和氯化钾进行溶解，得到外泌体盐溶液，在将外泌体提取液加入到外泌体盐溶液中培养，将培养后的溶液在4℃12000g、超速离心70min沉淀外泌体，并将所得外泌体沉淀分装于无菌离心管中，-80℃保存备用。
2.根据权利要求1所述的一种外泌体的制备方法，其特征在于：在步骤S2中，当样品浓度过大时，通过加入等体积的PBS缓冲液进行稀释。
3.根据权利要求1所述的一种外泌体的制备方法，其特征在于：在步骤S1中，将不含外泌体血清的培养基加入到脐带间充质干细胞中，培养24-48h，细胞融合度达到80％-95％左右时收取上清。
4.根据权利要求1所述的一种外泌体的制备方法，其特征在于：在步骤S3中，首先，上清液于4℃2000g、,离心10min去除死细胞，然后在于4℃10000g、超速离心60min沉淀外泌体。
5.根据权利要求1所述的一种外泌体的制备方法，其特征在于：在步骤S3中，过滤去除囊泡所用的滤网的孔径为0.20μm～0.24μm，还可以选择0.22μm。
6.根据权利要求1所述的一种外泌体的制备方法，其特征在于：在步骤S3中，低温离心为2℃～6℃下以1800g～2200g进行离心。
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