CN110499287B - 简易制备胎盘间充质干细胞外泌体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及由胎盘间充质干细胞简易制备细胞因子的方法。简易制备胎盘间充质干细胞外泌体的方法。具体的，涉及从胎盘间充质干细胞中分离提取外泌体的方法，包括如下步骤：培养胎盘间充质干细胞获得培养上清；将培养上清经葡聚糖凝胶柱层析得到层析液；使用切向流超滤***对层析液进行浓缩，得到外泌体浓缩液；将外泌体浓缩液冷冻保存或者冷冻干燥。本发明方法呈现如说明书所述优异性质。

Description

简易制备胎盘间充质干细胞外泌体的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种获取参与细胞生物活动的膜泡的方法，尤其涉及一种由人胎盘间充质干细胞(MSC)分离并获取外泌体(Exosome，或记作Exosomes)的方法，以及其在细胞修复中的应用。特别地，本发明涉及人胎盘间充质干细胞源分离外泌体的方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是来源于中胚层的一类非造血***多能干细胞，现已证实MSCs除具有自我更新和多向分化潜能外，还具有很强的抗炎和抑制多种免疫细胞的能力，并能够诱导外周免疫耐受。研究表明MSCs通过分泌多种免疫调节因子，如IFN-γ、PGE2等(可参见：Polchert D,Sobinsky J,Douglas G,Kidd M,MoadsiriA,Reina E,et al.IFN-gamma activation of mesenchymal stem cells for treatmentand prevention of graft versus host disease.European journal ofimmunology.2008；38(6):1745-55.以及Spaggiari GM,Abdelrazik H,Becchetti F,Moretta L.MSCs inhibit monocyte-derived DC maturation and function byselectively interfering with the generation of immature DCs:central role ofMSC-derived prostaglandin E2.Blood.2009；113(26):6576-83.)，从而抑制免疫细胞(如T细胞、B细胞、NK细胞、抗原呈递细胞等)的功能(可参见：Corcione A,Benvenuto F,Ferretti E,Giunti D,Cappiello V,Cazzanti F,et al.Human mesenchymal stem cellsmodulate B-cell functions.Blood.2006；107(1):367-72.以及Di Nicola M,CarloStella C,Magni M,Milanesi M,Longoni PD,Matteucci P,et al.Human bonemarrow stromal cells suppress T-lymphocyte proliferation induced by cellularor nonspecific mitogenic stimuli.Blood.2002；99(10):3838-43.)。

外泌体(exosome)是一种由细胞分泌的直径约30～100nm，密度范围在1.13～1.19g/ml之间的膜性微囊泡。外泌体可携带多种与源细胞相似的蛋白质、mRNA、miRNA，参与免疫调节、细胞通讯、细胞迁移、血管新生等过程(可参见：Yanez-Mo M,Siljander PR,Andreu Z,Zavec AB,Borras FE,Buzas EI,et al.Biological properties ofextracellular vesicles and their physiological functions.Journal ofextracellular vesicles.2015；4:27066.)。Lai等发现MSCs来源的外泌体可减少心肌缺血再灌注损伤，并且证实外泌体的miRNA可以促进血管新生，因此外泌体可能成为治疗心血管疾病的一个新方向(可参见：Lai RC,Arslan F,Lee MM,Sze NS,Choo A,Chen TS,etal.Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusioninjury.Stem cell research.2010；4(3):214-22.)。Xin等发现MSCs来源的外泌体通过转移miR-133b到神经细胞，可促进神经轴突的生长(可参见：Xin H,Li Y,Buller B,Katakowski M,Zhang Y,Wang X,et al.Exosome mediated transfer of miR-133b frommultipotent mesenchymal stromal cells to neural cells contributes to neuriteoutgrowth.Stem cells.2012；30(7):1556-64.)。Filipazzi等发现肿瘤细胞来源的外泌体可通过NK细胞激活型受体NKG2D(naturalkiller group 2,member D)抑制T细胞和NK细胞的细胞毒性，从而影响宿主的免疫***(可参见：Filipazzi P,Burdek M,Villa A,Rivoltini L,Huber V.Recent advances on the role of tumor exosomes inimmunosuppression and disease progression.Seminars in cancer biology.2012；22(4):342-9.)。

外泌体(exosome)这种由活细胞分泌的膜泡，最早于1983年被发现。随着研究深入，发现其具有执行蛋白、核酸的运输，特异靶定受体细胞，交换蛋白和脂类或引发下游信号事件，参与细胞间的通讯等功能，而不断受到重视。外泌体携带蛋白质包括源细胞非特异性和源细胞特异性两类蛋白分子。前者可能与外泌体的生物发生和生物学作用有关，主要包括：细胞溶质蛋白、参与细胞内信号转导的蛋白、各种代谢酶、热休克蛋白和四跨膜蛋白；另一类是特殊蛋白质，这类蛋白质只存在于某种特殊的细胞分泌的外泌体，而这些特定细胞源的外泌体与其生物学功能有着密切联系，例如：分子来源的外泌体上含有MHCII类分子。因此，不同细胞源的外泌体所携带的信号分子不一样，发挥的功能也不尽相同。例如：肿瘤细胞分泌的外泌体能够介导血管再生肿瘤细胞增殖及免疫逃逸，而树突状细胞源性外泌体则能够引起机体有效的抗肿瘤免疫应答。目前研究发现，外泌体内含有与细胞来源相关的蛋白质rRNA和microRNA，并且外泌体能够通过生物屏障，在细胞间传递功能性核酸分子，从而发挥各种生物学功能，故外泌体有望成为一种新型给药途径及基因治疗载体。

目前研究发现，间充质干细胞例如脐带或胎盘来源的外泌体携带有多种有效的细胞因子、蛋白和小分子核酸物质，可有效介导细胞增殖、凋亡和功能调节作用。研究发现，外泌体中含有血管内皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板增殖因子、肿瘤坏死因子和肿瘤生长因子等，具有抑制细胞凋亡、细胞的纤维化程度，促进血管发生有丝***和介导免疫反应等功能。实验证明，在使用间充质干细胞所分泌的外泌体携带的***和血管内皮细胞生长因子是治疗急性肾损伤的关键主导因子。在免疫学方面，间充质干细胞分泌的外泌体脂膜表面表达有多种膜蛋白，如：凝血因子、肿瘤坏死因子、MHC I/II分子以及CCR5趋化因子受体等，这些脂膜表面蛋白对抵抗炎症具有重要的作用。

目前进行外泌体提取的方式和途径也多种多样，如：骨髓中提取、外周血中提取等，这些外泌体获取的途径均需要有创伤性的细胞或组织来源。外泌体提取方法主要采用超速离心法或昂贵的试剂盒过柱子法，然而超速离心法所获取的外泌体质量不均一、不能保证外泌体所获取量、逐级离心时间冗长，有时甚至离心时间或者离心速度原因而最终无法分离得到，浪费时间及成本。而试剂盒过柱子法通常只能适用于较小量的外泌体获取，并且成本昂贵。

现有技术已有一些关于外泌体的分离提取方法的报道。例如，CN106282107A(中国专利申请号201610779165.2)公开了一种人胎盘间充质干细胞源分离外泌体的方法，P2～P3胎盘间充质干细胞汇合率达85％～90％时，收集培养基，获取细胞培养上清液，并进行膜过滤后，收集滤液；再将滤液离心，收集离心上清液，按离心上清液体积1∶1比例加入10w/v％～12w/v％聚乙二醇的培养基上清液溶液，并充分混匀后第二次离心，最后所得沉淀即为外泌体。据信该发明的方法，取材方便，易于富集扩增培养，将P2～P3代胎盘间充质干细胞培养基上清再利用获取外泌体，不涉及医学伦理问题。外泌体分离过程中采用膜过滤、离心和加入聚乙二醇溶液等手段有效增加外泌体富集，耗时短，成本低。

CN105708861A(中国专利申请号201610149852.6)公开了间充质干细胞来源的外泌体在制备治疗强直性脊柱炎的药物中的应用，其中外泌体的提取方法为：培养足量的骨髓间充质干细胞，在提取干细胞外泌体前48h，用PBS清洗细胞，更换无血清培养基，继续培养48h；收集无血清培养基，300×g离心10min，取上清；2000×g离心10min，取上清；10000×g离心30min，取上清；100000×g离心70min，取沉淀；PBS重悬沉淀，100000×g离心70min，收集沉淀即得所述外泌体。

CN105267240A(中国专利申请号201410781765.3)公开了间充质干细胞来源的外泌体的用途，其中由包括如下步骤的方法制备得到：(1)间充质干细胞的分离培养：根据间充质干细胞来源不同，采用不同的分离培养方式，具体如下：①人脐带间充质干细胞的分离培养：取无菌新生儿新鲜脐带，经磷酸盐缓冲液(PBS)反复冲洗后，剪成直径约1-2mm的组织块；经2型胶原酶和胰酶消化依次后，将上清液离心，取细胞沉淀放入培养瓶，使用含10％胎牛血清DMEM/F12培养基，5％CO2、37℃饱和湿度培养；去除非贴壁细胞，在贴壁细胞80％融合后0.25％胰蛋白酶消化进行传代培养；②人胎盘间充质干细胞的分离培养：剪取胎盘绒毛膜面1-2cm厚的组织，剪成1-2mm的碎块，用磷酸盐缓冲液漂洗至无色，用DispaseII型酶和4型胶原酶37℃水浴消化1小时，振荡后静置，液体自然分为三层，吸取中间层悬液于离心管中，加入磷酸盐缓冲液混匀后离心，弃上清，取细胞沉淀放入培养瓶，使用含10％胎牛血清DMEM培养基，5％CO2、37℃饱和湿度培养；去除非贴壁细胞，在贴壁细胞80％融合后0.25％胰蛋白酶消化进行传代培养；③人脂肪间充质干细胞的分离培养：无菌吸取脂肪抽提液，用磷酸盐缓冲液冲洗数次。去除吸脂手术中所用药物及血细胞，用1型胶原酶37℃消化1小时，间或搅拌；离心后弃去上层脂肪，混匀，用200目筛网过滤，将所获得的细胞悬液离心，细胞沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤，用10％胎牛血清的α-MEM培养液悬浮，转移至培养瓶中，5％CO2、37℃饱和湿度培养；在贴壁细胞80％融合后0.25％胰蛋白酶消化进行传代培养。(2)间充质干细胞条件培养基的收集：取3-5代的间充质干细胞无血清培养48h；收集培养上清液；0.22μm无菌膜过滤得到间充质干细胞条件培养基。(3)外泌体分离纯化包括：收集过滤的间充质干细胞条件培养基4℃，1000g离心10min，收集上清；收集的上清液4℃，2000g离心20min，收集上清；收集的上清液4℃，10000g离心30min，收集上清；收集的上清液，110000g离心70min，弃上清，使用磷酸盐缓冲液重悬沉淀；再次110000g离心70min，弃上清，少量磷酸盐缓冲液重悬沉淀，0.22μm滤膜过滤除菌，得到间充质干细胞来源外泌体。

CN104382827A(中国专利申请号201410705462.3)公开了人羊膜间充质干细胞外泌体的用途，其中的外泌体制备方法如下：1、人羊膜间充质干细胞的培养：取生长良好的人羊膜间充质干细胞，用无血清培养基培养，0.25％胰酶消化传代，传至P2代，待其生长至融合度80％，弃培养上清，用PBS洗三遍，加入1640基础培养基，每天收集培养上清，并更换新鲜的1640培养基，连续收集培养3到5天后收集培养上清用于外泌体的提取。2、外泌体的提取(提取全过程除特别说明外，均在4℃下进行)：将收集的所有培养上清300g离心10min，保留上清液，弃沉淀，去除培养液中的细胞；上清液2000g～3000g离心20min～30min，保留上清液，弃沉淀，去除细胞碎片；上清液10000g离心60min～100min，保留上清液，弃沉淀，再次去除细胞碎片；上清液100000g离心60min～120min，弃上清，保留沉淀；沉淀加入PBS重悬后，100000g离心60min～120min弃上清，保留沉淀，去除培养基中蛋白质，所获即为纯化后的人羊膜间充质干细胞的外泌体，用PBS缓冲液重悬，用BCA试剂盒测蛋白浓度。

CN103767985A(中国专利申请号201210402915.6)公开了人源血液或间充质干细胞分泌外泌体的制备与应用，其中外泌体通过以下方法制得：1)采集血液→差速离心分离→低温超速纯化→获得高纯度血清含有的外泌体；2)提取间充质干细胞→体外培养、扩增→收集细胞培养上清液→融化培养上清液并混合→差速离心分离→低温超速纯化→获得高纯度干细胞分泌的外泌体；3)提取间充质干细胞→体外培养、扩增→收集细胞培养上清液→融化培养上清液并混合→低温离心、免疫吸附法纯化→获得高纯度间充质干细胞分泌的外泌体。

CN105861430A(中国专利申请号201610279473.9)公开的外泌体由以下方法制备：(1)分离培养人脐带间充质干细胞；(2)用IL-1β优化处理人脐带间充质干细胞；(3)收集步骤(2)中的培养基上清液，用差速离心的方法收集外泌体即得到IL-1β优化的人脐带间充质干细胞来源的外泌体。

然而，现有技术中从胎盘、脐带血、骨髓、脂肪培养间充质干细胞时，多采用这些MSC的培养基上清来提取外泌体，这些方法均存在产量偏低、工艺复杂等的不足。因此，本领域仍然期待有新的方法来分离提取外泌体，特别是以简单易得和高产量的方式通过间充质干细胞分泌提取外泌体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的方法来分离提取外泌体，特别是这种方法能够以简单易得和高产量的方式通过间充质干细胞分泌提取外泌体。已经出人意料的发现通过本发明方法能够有益的实现上述目的。本发明基于此发现而得以完成。

为此，本发明第一方面提供了一种从胎盘间充质干细胞中分离提取外泌体的方法，该方法包括如下步骤：

1)提供处于对数生长期的第2～5代人胎盘间充质干细胞，以5000～15000/cm²的密度接种至包含2mM的L-谷氨酰胺的DMEM/F12培养基中培养，培养3-4天后，收集上清，以20000g离心力离心20min除去细胞以及碎片，再经0.22μm滤膜过滤，得到培养上清；

2)将Pudex葡聚糖凝胶过滤介质Pudex G-25用玻璃棒引流导入层析柱中，边装边用玻璃棒搅拌；

3)装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再将步骤1)收集的培养上清加载到层析柱中；

4)盖上层析柱的上盖，将上盖的细管***到盛有双蒸水的烧杯中，打开恒流泵和收集器装置，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱并收集包含细胞分泌物的洗脱馏份，作为层析液；

5)使用切向流超滤***(例如仕必纯KR2i型切向流超滤***)对层析液进行浓缩，用超纯水冲洗管路，安装100kD 100cm²的MidiKros过滤器，对步骤4)所得层析液5L进行过滤浓缩，得到100ml浓缩50倍的回流液为外泌体浓缩液；任选的6)将外泌体浓缩液分装，在-80℃条件冷冻保存；或者向外泌体浓缩液中添加冻干赋形剂后冷冻干燥。

在本发明中，如未另外说明，所用切向流超滤***是仕必纯KR2i型切向流超滤***。当然其它品牌的切向流超滤***亦是可以使用的。

可以容易地从市购得例如购自千纯生物公司的Pudex系列葡聚糖凝胶过滤介质，其是一种基于交联葡聚糖微球开发的凝胶过滤介质，据信其具有良好的化学稳定性和较高的分辨率，具有多种分离范围和颗粒大小可供选择，广泛用于蛋白质的分离和蛋白质的脱盐。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤1)中，以10000/cm²的密度接种细胞。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤1)中，还包括向经0.22μm滤膜过滤所得滤液中添加甘露糖磷酸酯钠使溶解，作为培养上清；在一个实施方案中，甘露糖磷酸酯钠添加的质量/体积百分浓度为0.05～0.1％，例如0.08％。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤1)中，处于对数生长期的第2～5代人胎盘间充质干细胞是照本领域已知方法制备得到的。例如本申请人的中国专利申请号201210044648.X、201710653583.1、201811568552.7等。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤1)中，处于对数生长期的第2～5代人胎盘间充质干细胞是照包括如下步骤的方法得到的：

(1)处理胎盘组织

将人胎盘去除羊膜，剪取胎盘小叶表层膜样组织，用生理盐水清洗；

将胎盘小叶表层膜样组织剪碎至体积大小约0.2cm3的组织碎块；

将组织碎块置离心管中，加入0.9％生理盐水适量，使用300目滤网过滤，并使用0.9％生理盐水适量再清洗两次，至滤液清澈；

将清洗后的组织加入含有0.005％的Liberase MNP-S酶和0.05％的DNA I型酶的HBSS消化液中，充分混匀后，于摇床中振荡消化30min(37℃，100rpm)；

(2)获得胎盘原始细胞

消化结束后，在离心管中加入胎牛血清终止消化，混匀后使用含有5％右旋糖酐、2.5％人血清白蛋白、200U的DNase I的生理盐水50ml稀释，使用300目滤网过滤，再用100ml生理盐水多次洗涤组织，收集滤液；

使所得滤液以1400rpm离心5min(例如，加速度9、减速度7)，去上清收集沉淀，用生理盐水重悬后再次离心，收集沉淀；

用DMEM/F12重悬沉淀细胞，取样计数，得P0代细胞；

(3)纯化培养

培养条件：含10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺的DMEM/F12培养基，于37℃、5％CO₂的恒温湿培养箱中培养；

消化条件：0.25％的胰酶，37℃消化2分钟；

收获条件：用完全培养基(即10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺的DMEM/F12培养基)终止消化后1400rpm离心5分钟，收集沉淀；

以5000～15000/cm²的接种密度将胎盘P0代细胞接种于T75培养瓶中，第3-4天全换液；第6-7天有若干细胞克隆出现，第10-11天有成片的梭形呈旋涡状生长的细胞，即P1代胎盘间充质干细胞，收集后可进行传代；

以5000～15000/cm²的接种密度培养，与P0-P1相同的培养基成分和培养条件，3-4天后收获，得P2代细胞；以此类推，以同样接种密度、相同培养条件培养3-4天后收获，得P3、P4、P5代胎盘间充质干细胞；和任选的(4)对所得胎盘间充质干细胞进行检测。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤2)中，层析柱是葡聚糖凝胶G-25柱。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤4)中，还包括向所得洗脱馏份中添加氯化镁使溶解，作为层析液；在一个实施方案中，氯化镁添加量占洗脱馏份的质量/体积百分浓度为0.02～0.05％，例如0.04％。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤6)中，对外泌体浓缩液进行冷冻干燥是照如下方式进行的：

7.1)取外泌体浓缩液，或者取-80℃冷冻的外泌体浓缩液于37℃水浴使完全融化，加入5～15％冻干赋形剂，使赋形剂溶解；

7.2)加入赋形剂后的溶液用70μm滤器过滤，随后分装入玻璃瓶中，每瓶2～5ml，盖好分叉胶塞，置冷冻干燥机中，开启如下冻干程序：

在常压下预冷冻3.5小时，温度为-30～-40℃；

开启真空泵，使真空度值为0.04mbar，在-38～-40℃温度下冷冻1～3小时；

维持真空度不变，升温至-20～-25℃温度下冷冻干燥10～15小时；

维持真空度不变，升温至-2～2℃温度下冷冻干燥1～3小时；

维持真空度不变，升温至33～37℃温度下干燥2-5小时；

程序结束后，真空下压盖，即得外泌体冻干粉。

下面对本发明作进一步的说明。本发明所引用的文献，以及该文献中所引用的文献，它们的全部内容通过引用并入本文。

在本发明中，本发明任一方面的任一技术方案中，其任一技术特征同样适用于本发明的任一方面的任一实施方案，只要它们不会引起矛盾，并且这种相互适用在必要时可以作适当的修改。

在本发明中，术语“胎盘间充质干细胞”是指来源于胎盘的间充质干细胞。因此在本发明中，特别是涉及本发明的语境中，术语“胎盘间充质干细胞”可以与“胎盘干细胞”、“干细胞”、“间充质干细胞”互换使用，除非另有明确指明。

外泌体(Exosome)是细胞向胞外分泌的囊泡类小体，直径约为30-150纳米之间，具有典型的脂质双分子层膜结构，可存在于细胞培养上清液、血浆、血清、唾液、尿液、羊水和恶性腹水以及其它生物体液中；其携带有母细胞的多种蛋白质、脂类、DNA和RNA等重要信息，在细胞-细胞间的物质和信息传递中起重要作用。各种不同细胞来源的外泌体参与了重要的生理和病理过程，如抗原呈递、遗传物质交换、免疫反应、血管生成、炎症、肿瘤转移和处理，病原菌或癌基因传播。这些功能都依赖于外泌体的内容物，尤其是蛋白质和RNA。

现有研究已证明间充质干细胞分泌的外泌体在促进皮肤损伤修复、减轻炎症反应、促进血管再生等方面有重要作用。相关研究证明干细胞对皮肤修复是通过外泌体发挥作用的。解放军总医院的韩为东等用内毒素预处理间充质干细胞增强其旁分泌作用，增加了干细胞的营养支持和再生修复性能。研究发现，间充质干细胞通过释放大量的外泌体，来构建一个稳态的组织修复的微环境，从而消除炎症反应，促进伤口愈合。如果外泌体能作用于人的肌肤促进血管生成，就会对皮肤输送营养，运输代谢废物，使得皮肤年轻化。韩国科学家研究显示，脂肪干细胞及其分泌因子对紫外线诱导的皱纹具有除皱效果，并且除皱效果主要是通过减少中波紫外线B诱导的细胞凋亡和促进人成纤维细胞合成胶原蛋白达到的。

近年随着对皮肤美白的追求，越来越多的人使用美白护肤产品。皮肤中的黑色素由黑色素细胞合成，黑素通过渗透作用向相邻细胞扩散，在皮肤上形成颜色。颜色的深浅主要是由皮肤中黑色素的含量决定。黑素细胞内发生的生化反应过程：脂肪酸酪氨酸在酪氨酸酶的作用下，生成多巴醌，其在酶或非酶的氧化作用下，经红色素及无色色素转变为黑色素，此过程即为黑色素的主要成因。因此，阻碍或抑制该反应第一阶段中酪氨酸酶的作用，即可抑制黑素生成，探求能够阻碍或抑制酪氨酸酶作用的药物，对阻止或抑制因酪氨酸酶作用而生成的黑素而言极为重要。

本发明提供了一种简单易得和高产量的方式通过间充质干细胞分泌提取外泌体。

附图说明

图1：部分代次胎盘间充质干细胞形态观察图。

图2：P3代胎盘间充质干细胞流式检测结果。

图3：胎盘间充质干细胞成骨分化。

图4：Western Blotting鉴定外泌体。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细的描述。

实施例1：制备胎盘间充质干细胞

(1)处理胎盘组织

将一个新鲜的人胎盘去除羊膜，剪取胎盘小叶表层膜样组织，用生理盐水清洗；

将胎盘小叶表层膜样组织剪碎至体积大小约0.2cm3的组织碎块；

将组织碎块置离心管中，加入0.9％生理盐水适量(100ml)，使用300目滤网过滤，并使用0.9％生理盐水适量(100ml)再清洗两次，至滤液清澈；

将清洗后的组织加入含有0.005％的Liberase MNP-S酶和0.05％的DNA I型酶的HBSS消化液(100ml)中，充分混匀后，于摇床中振荡消化30min(37℃，100rpm)；

(2)获得胎盘原始细胞

消化结束后，在离心管中加入胎牛血清(2ml)终止消化，混匀后使用含有5％右旋糖酐、2.5％人血清白蛋白、200U的DNase I的生理盐水50ml稀释，使用300目滤网过滤，再用100ml生理盐水多次洗涤组织，收集滤液；

使所得滤液以1400rpm离心5min(加速度9、减速度7)，去上清收集沉淀，用生理盐水(100ml)重悬后再次离心，收集沉淀；

用DMEM/F12(100ml)重悬沉淀细胞，取样计数，得P0代细胞；

(3)纯化培养

培养条件：含10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺的DMEM/F12培养基，于37℃、5％CO₂的恒温湿培养箱中培养；

消化条件：0.25％的胰酶，37℃消化2分钟；

收获条件：用完全培养基(即10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺的DMEM/F12培养基)终止消化后1400rpm离心5分钟，收集沉淀；

以5000～15000/cm²的接种密度将胎盘P0代细胞接种于T75培养瓶中(实际接种密度：10000个细胞/cm²)，第3-4天全换液；第6-7天有若干细胞克隆出现，第10-11天有成片的梭形呈旋涡状生长的细胞，即P1代胎盘间充质干细胞，收集后可进行传代；

以5000～15000/cm²的接种密度培养，与P0-P1相同的培养基成分和培养条件，3-4天后收获，得P2代细胞；以此类推，以同样接种密度、相同培养条件培养3-4天后收获，得P3、P4、P5代胎盘间充质干细胞；

(4)对所得胎盘间充质干细胞进行检测：

(4.1)通过光学倒置显微镜观察细胞形态，根据标准化的胎盘间充质干细胞分离、纯化、培养和扩增的操作流程，获得了一致性及活性较好的细胞。部分代次的细胞呈长梭形旋涡状排列(见图1)。

(4.2)采用流式细胞分析技术对胎盘组织来源的MSCs进行检测，结果显示：胎盘MSCs的CD73、CD90、CDl05呈阳性，阳性率不低于95％；CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR呈阴性，阳性率不高于2％。通过分析从胎盘分离出来的原代P0细胞表型到P3细胞表型，可以发现表达阴性标志的细胞越来越少，而阳性标志的细胞含量越来越多。细胞经过三次传代培养，MSCs得到富集纯化(示例性的P3代结果见图2)。

(4.3)采用常规的成骨诱导培养基对胎盘间充质干细胞进行分化诱导，然后通过茜素红染色确定其分化潜能。经过体外传代培养，胎盘MSCs保持向成骨分化的潜能(部分代次的细胞的结果见图3)。

实施例2：从胎盘间充质干细胞中分离提取外泌体

1)提供处于对数生长期的第2～5代人胎盘间充质干细胞(本实施例以实施例1所得第3代为例)，以5000～15000/cm²的密度接种(本实施例的接种密度：10000/cm2)至包含2mM的L-谷氨酰胺的DMEM/F12培养基中培养，培养3-4天(本实施例培养4天)后，收集上清，以20000g离心力离心20min除去细胞以及碎片，再经0.22μm滤膜过滤，向其中添加甘露糖磷酸酯钠使溶解，得到培养上清；[本实施例中，甘露糖磷酸酯钠添加量占过滤液的质量/体积百分浓度为0.08％]

2)将Pudex葡聚糖凝胶过滤介质Pudex G-25用玻璃棒引流导入层析柱(本实施例为葡聚糖凝胶G-25柱)中，边装边用玻璃棒搅拌；

3)装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再将步骤1)收集的培养上清加载到层析柱中；

4)盖上层析柱的上盖，将上盖的细管***到盛有双蒸水的烧杯中，打开恒流泵和收集器装置，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱并收集包含细胞分泌物的洗脱馏份，向其中添加氯化镁使溶解，作为层析液；[本实施例中，氯化镁添加量占洗脱馏份的质量/体积百分浓度为0.04％]

5)使用切向流超滤***(本实施例使用仕必纯KR2i型切向流超滤***)对层析液进行浓缩，用超纯水冲洗管路，安装100kD 100cm²的MidiKros过滤器，对步骤4)所得层析液5L进行过滤浓缩，得到100ml浓缩50倍的回流液(被滤出去的过滤液中去除了外泌体，其可用于提取细胞因子)，为外泌体浓缩液；经测定，所得外泌体浓缩液中均无法检测到甘露糖磷酸酯钠和氯化镁，容易理解，前者通过柱层析除去，而后者已通过切向流超滤除去；根据实际需求对此外泌体浓缩液进行冷冻干燥处理或者低温冻存处理，或者可以直接使用；

6)将外泌体浓缩液分装，在-80℃条件冷冻保存；或者向外泌体浓缩液中添加冻干赋形剂后冷冻干燥。

添加冻干赋形剂将外泌体浓缩液进行冷冻干燥，其方法是本领域公知的，冻干赋形剂可以选自：乳糖、海藻糖、甘露醇、壳聚糖、右旋糖苷、甘氨酸、精氨酸、氨基乙酸等等。本发明在进行冷冻干燥时，可以采用如下方式进行：

7.1)取外泌体浓缩液，或者取-80℃冷冻的外泌体浓缩液于37℃水浴使完全融化，加入5～15％冻干赋形剂，使赋形剂溶解；

7.2)加入赋形剂后的溶液用70μm滤器过滤，随后分装入玻璃瓶中，每瓶2～5ml，盖好分叉胶塞，置冷冻干燥机中，开启如下冻干程序：

在常压下预冷冻3.5小时，温度为-30～-40℃；

开启真空泵，使真空度值为0.04mbar，在-38～-40℃温度下冷冻1～3小时；

维持真空度不变，升温至-20～-25℃温度下冷冻干燥10～15小时；

维持真空度不变，升温至-2～2℃温度下冷冻干燥1～3小时；

维持真空度不变，升温至33～37℃温度下干燥2-5小时；

程序结束后，真空下压盖，即得外泌体冻干粉。

对本实施例2各种物料进行检测：

(a)用Western Blotting方法，检测本实施所得二种液体[步骤5)所得外泌体浓缩液、步骤1)所得培养上清]中的外泌体阳性标志物CD63和CD81，并测定外泌体得率；WesternBlotting鉴定外泌体阳性标志物CD63和CD81结果见图4；结果显示本实例所得外泌体浓缩液具有优良的纯度并且显示呈现巨大的纯化率；另外，同法测定步骤5)所得去外泌体的过滤液，结果显示该过滤液中外泌体不存在(未检测到)；外泌体得率是指从本实施例2步骤1)所接种的胎盘间充质干细胞数量以10⁶个细胞计，在步骤5所得外泌体浓缩液中所含外泌体的质量；此外泌体得率反映的是，细胞经历培养后产生的外泌体量以及提取工艺对于外泌体产量的综合结果；

(b)根据上述步骤5)所得外泌体浓缩液、步骤1)所得培养上清两种液体中的外泌体含量，计算外泌体工艺回收率，结果表明从所获得的培养上清到外泌体浓缩液的整个过程中本发明方法具有优良的工艺回收率；工艺回收率的算法为：步骤5)所得外泌体浓缩液中外泌体量除以培养上清中外泌体量再乘以100％所得百分数；

(c)另外，测定步骤4)层析液、步骤5)外泌体浓缩液、步骤5)过滤液三种液体中的外泌体含量，结合三种液体的体积，计算浓缩液中外泌体量占层析液中外泌体量的百分数(简称为浓缩液外泌体占比)、过滤液中外泌体量占层析液中外泌体量的百分数(简称为过滤液外泌体占比)，理论上讲，两个百分数之和应为100％；结果表明，过滤液中基本上不存在外泌体，两个结果之和稍大或稍小于100％可能是由于测定误差造成的。

实施例3：从胎盘间充质干细胞中分离提取外泌体

参考实施例2进行。

1)提供处于对数生长期的第2代人胎盘间充质干细胞，以5000/cm²的密度接种至包含2mM的L-谷氨酰胺的DMEM/F12培养基中培养，培养3天后，收集上清，以20000g离心力离心20min除去细胞以及碎片，再经0.22μm滤膜过滤，向其中添加0.1％甘露糖磷酸酯钠使溶解，得到培养上清；

2)将Pudex葡聚糖凝胶过滤介质Pudex G-25用玻璃棒引流导入层析柱(葡聚糖凝胶G-25柱)中，边装边用玻璃棒搅拌；

3)装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再将步骤1)收集的培养上清加载到层析柱中；

4)盖上层析柱的上盖，将上盖的细管***到盛有双蒸水的烧杯中，打开恒流泵和收集器装置，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱并收集包含细胞分泌物的洗脱馏份，向其中添加0.02％氯化镁使溶解，作为层析液；

5)使用切向流超滤***对层析液进行浓缩，用超纯水冲洗管路，安装100kD100cm²的MidiKros过滤器，对步骤4)所得层析液5L进行过滤浓缩，得到100ml浓缩50倍的回流液为外泌体浓缩液；

6)将外泌体浓缩液分装，在-80℃条件冷冻保存；或者向外泌体浓缩液中添加冻干赋形剂后冷冻干燥。参照实施例2方法对各种物料进行检测。

实施例4：从胎盘间充质干细胞中分离提取外泌体

参考实施例2进行。

1)提供处于对数生长期的第5代人胎盘间充质干细胞，以15000/cm²的密度接种至包含2mM的L-谷氨酰胺的DMEM/F12培养基中培养，培养4天后，收集上清，以20000g离心力离心20min除去细胞以及碎片，再经0.22μm滤膜过滤，向其中添加0.05％甘露糖磷酸酯钠使溶解，得到培养上清；

2)将Pudex葡聚糖凝胶过滤介质Pudex G-25用玻璃棒引流导入层析柱(葡聚糖凝胶G-25柱)中，边装边用玻璃棒搅拌；

3)装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再将步骤1)收集的培养上清加载到层析柱中；

4)盖上层析柱的上盖，将上盖的细管***到盛有双蒸水的烧杯中，打开恒流泵和收集器装置，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱并收集包含细胞分泌物的洗脱馏份，向其中添加0.05％氯化镁使溶解，作为层析液；

5)使用切向流超滤***对层析液进行浓缩，用超纯水冲洗管路，安装100kD100cm²的MidiKros过滤器，对步骤4)所得层析液5L进行过滤浓缩，得到100ml浓缩50倍的回流液为外泌体浓缩液；

6)将外泌体浓缩液分装，在-80℃条件冷冻保存；或者向外泌体浓缩液中添加冻干赋形剂后冷冻干燥。参照实施例2方法对各种物料进行检测。

实施例5：照实施例2进行，不同的仅是在步骤1)中未添加甘露糖磷酸酯钠。

实施例6：照实施例2进行，不同的仅是在步骤4)中未添加氯化镁。

实施例7：照实施例2进行，不同的仅是在步骤1)中未添加甘露糖磷酸酯钠、且在步骤4)中未添加氯化镁。

实施例2～7各项检测结果(n＝5)见下表：

根据上述结果发现：在添加氯化镁时切向流超滤能够回收99％以上外泌体而有约1％外泌体过滤进入到滤液中，但是不添加氯化时切向流超滤只能回收约64％的外泌体而有约36％的外泌体过滤进入到滤液中，这表明在进行切向流超滤时添加氯化镁有助于回收外泌体；在添加甘露糖磷酸酯钠时能够使外泌体进入洗脱馏份中，但是若不添加甘露糖磷酸酯钠时进入洗脱馏份的外泌体大大减少，表明甘露糖磷酸酯钠有助于外泌体通过层析获得回收。虽然本发明方法可以通过简单的操作获得大量外泌体，然而在培养上清中添加甘露糖磷酸酯钠且在洗脱馏份中添加氯化镁是必须同时需要的。

本说明书引用的所有参考文献，包括而不限于所有的论文、出版物、专利、专利申请、简报、教科书、报告、底稿、小册子、书籍、互联网文章、杂志文章、期刊等，通过引用以其整体结合到本说明书中。本文的参考文献的讨论仅仅意在概括其作者所做出的断言，并非承认任何参考文献构成现有技术。申请人保留对所引用的参考文献的准确性和相关性提出异议的权利。

虽然使用特定术语、装置和方法描述了本公开的实施方案，但是这类描述只用于说明目的。所用词汇是描述词汇而不是限制词汇。应当理解在不偏离随附权利要求书中阐述的本公开的精神和范围的情况下，本领域普通技术人员可进行变动和改变。另外，应当理解各种实施方案的方面可全部或部分互换。因此，随附权利要求书的精神和范围不应限于其中所含优选形式的描述。

Claims (9)

1.从胎盘间充质干细胞中分离提取外泌体的方法，该方法包括如下步骤：

1)提供处于对数生长期的第2~5代人胎盘间充质干细胞，以5000~15000个/cm²的密度接种至包含2mM的L-谷氨酰胺的DMEM/F12培养基中培养，培养3-4天后，收集上清，以20000g离心力离心20min除去细胞以及碎片，再经0.22μm滤膜过滤，向所得滤液中添加甘露糖磷酸酯钠使溶解，得到培养上清；甘露糖磷酸酯钠添加的质量/体积百分浓度为0.05~0.1%；

2)将Pudex葡聚糖凝胶过滤介质Pudex G-25用玻璃棒引流导入层析柱中，边装边用玻璃棒搅拌；

3)装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再将步骤1)收集的培养上清加载到层析柱中；

4)盖上层析柱的上盖，将上盖的细管***到盛有双蒸水的烧杯中，打开恒流泵和收集器装置，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱并收集包含细胞分泌物的洗脱馏份，向所得洗脱馏份中添加氯化镁使溶解，作为层析液；氯化镁添加量占洗脱馏份的质量/体积百分浓度为0.02~0.05%；

5)使用切向流超滤***对层析液进行浓缩，用超纯水冲洗管路，安装100kD 100cm²的MidiKros过滤器，对步骤4)所得层析液5L进行过滤浓缩，得到100ml浓缩50倍的回流液为外泌体浓缩液；

6)将外泌体浓缩液分装，在-80℃条件冷冻保存；或者向外泌体浓缩液中添加冻干赋形剂后冷冻干燥。

2.根据权利要求1的方法，步骤1)中，以10000个/cm²的密度接种细胞。

3.根据权利要求1的方法，所述切向流超滤***是仕必纯KR2i型切向流超滤***。

4.根据权利要求1的方法，甘露糖磷酸酯钠添加的质量/体积百分浓度为0.08%。

5.根据权利要求1的方法，步骤1)中，处于对数生长期的第2~5代人胎盘间充质干细胞是按如下方法得到的：

(1)处理胎盘组织

将人胎盘去除羊膜，剪取胎盘小叶表层膜样组织，用生理盐水清洗；

将胎盘小叶表层膜样组织剪碎至体积大小为0.2cm³的组织碎块；

将组织碎块置离心管中，加入0.9%生理盐水适量，使用300目滤网过滤，并使用0.9%生理盐水适量再清洗两次，至滤液清澈；

将清洗后的组织加入含有0.005%的Liberase MNP-S酶和0.05%的DNA I型酶的HBSS消化液中，充分混匀后，于摇床中以37℃、100rpm振荡消化30min；

(2)获得胎盘原始细胞

消化结束后，在离心管中加入胎牛血清终止消化，混匀后使用含有5%右旋糖酐、2.5%人血清白蛋白、200U的DNase I的生理盐水50ml稀释，使用300目滤网过滤，再用100ml生理盐水多次洗涤组织，收集滤液；

使所得滤液以1400rpm离心5min，去上清收集沉淀，用生理盐水重悬后再次离心，收集沉淀；

用DMEM/F12重悬沉淀细胞，取样计数，得P0代细胞；

(3)纯化培养

培养条件：含10%胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺的DMEM/F12培养基，于37℃、5%CO₂的恒温湿培养箱中培养；

消化条件：0.25%的胰酶，37℃消化2分钟；

收获条件：用完全培养基终止消化后1400rpm离心5分钟，收集沉淀；

以5000~15000个/cm²的接种密度将胎盘P0代细胞接种于T75培养瓶中，第3-4天全换液；第6-7天有细胞克隆出现，第10-11天有成片的梭形呈旋涡状生长的细胞，即P1代胎盘间充质干细胞，收集后可进行传代；

以5000~15000个/cm²的接种密度培养，与P0-P1相同的培养基成分和培养条件，3-4天后收获，得P2代细胞；以此类推，以同样接种密度、相同培养条件培养3-4天后收获，得P3、P4、P5代胎盘间充质干细胞；和

(4)对所得胎盘间充质干细胞进行检测。

6.根据权利要求1的方法，步骤2)中，层析柱是葡聚糖凝胶G-25柱。

7.根据权利要求5的方法，步骤(3)所述完全培养基是含有10%胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺的DMEM/F12培养基。

8.根据权利要求1的方法，氯化镁添加量占洗脱馏份的质量/体积百分浓度为0.04%。

9.根据权利要求1的方法，其中步骤6)中，对外泌体浓缩液进行冷冻干燥是按照如下方式进行的：

6.1)取外泌体浓缩液，或者取-80℃冷冻的外泌体浓缩液于37℃水浴使完全融化，加入5~15%冻干赋形剂，使赋形剂溶解；

6.2)加入赋形剂后的溶液用70µm滤器过滤，随后分装入玻璃瓶中，每瓶2~5ml，盖好分叉胶塞，置冷冻干燥机中，开启如下冻干程序：

在常压下预冷冻3.5小时，温度为-30~-40℃；

开启真空泵，使真空度值为0.04mbar，在-38~-40℃温度下冷冻1~3小时；

维持真空度不变，升温至-20~-25℃温度下冷冻干燥10~15小时；

维持真空度不变，升温至-2~2℃温度下冷冻干燥1~3小时；

维持真空度不变，升温至33~37℃温度下干燥2-5小时；

程序结束后，真空下压盖，即得外泌体冻干粉。

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