KR20240034221A - 염증성 질환 및 자가면역 질환의 치료를 위한 변형된 il-2 폴리펩티드 - Google Patents

염증성 질환 및 자가면역 질환의 치료를 위한 변형된 il-2 폴리펩티드 Download PDF

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Abstract

본 개시 내용은 변형된 IL-2 폴리펩티드, 변형된 IL-2 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 그의 제조 방법, 및 자가면역 질환을 비롯한 질환의 치료를 위해 변형된 IL-2 폴리펩티드를 사용하는 방법에 관한 것이다. 한 측면에서, 본 개시 내용은 변형된 IL-2 폴리펩티드를 사용한 자가면역 질환의 치료에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 개시된 IL-2 폴리펩티드는 IL-2 수용체 α에 대해 향상된 결합 및/또는 IL-2 수용체 β에 대해 감소된 결합을 나타낸다. 또 다른 측면에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 T 이펙터 세포에 비해 T 조절 세포를 활성화하는 향상된 능력을 나타낸다.

Description

염증성 질환 및 자가면역 질환의 치료를 위한 변형된 IL-2 폴리펩티드
상호 참조
본 출원은 2021년 7월 9일에 출원된 미국 가출원 번호 63/219,995, 및 2021년 7월 9일에 출원된 미국 가출원 번호 63/219,989의 이익을 주장하며, 이 출원은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
배경
인터루킨-2(IL-2)는 면역계 조절에 중요한 사이토카인 신호전달 분자이다. IL-2는 면역계가 외래 세포 유형과 내인성 세포 유형을 구별하도록 돕는 것과 관련되어 있으며, 이를 통해 면역계가 대상체의 자신의 세포를 공격하는 것을 방지한다. IL-2는 림프구에서 발현되는 IL-2 수용체(IL-2R)와의 상호작용을 통해 활성을 달성한다. 이러한 결합 상호작용을 통해 IL-2는 대상체의 T 이펙터(Teff) 세포, 자연 살해(NK) 세포, 및 조절 T 세포(Treg) 집단을 조절할 수 있다.
면역계를 조절하는 IL-2의 능력은 IL-2R α 서브유닛(CD25)과 IL-2Rβ 서브유닛(CD122)에 대한 상이한 친화성에 의해 적어도 부분적으로 좌우된다. 천연 IL-2는 IL-2Rβ 및 IL-2Rγ 서브유닛으로 이루어진 중간 친화성 수용체를 통해 휴지 림프구에 작용한다. 활성화된 림프구와 Treg 세포는 추가로 IL-2Rα 서브유닛을 발현하며, 이는 β 및 γ 서브유닛과 결합하여 IL-2에 대해 친화성이 높은 수용체를 형성한다. IL-2는 고친화성 αβγ 수용체에 작용할 때 Treg 세포의 활성화 및 증식을 향상시켜 대상체의 면역 반응을 조절할 수 있다.
이러한 이유로, IL-2는 면역계와 관련된 다양한 질환의 치료에 단독으로 또는 다른 치료법과 함께 사용되어 왔다. 그러나 IL-2를 치료제로 사용하는 것은 생명을 위협하고 때로는 치명적인 혈관 누출 증후군을 포함하는 독성뿐만 아니라 8일에 걸쳐 하루 3회 투약해야 하는 짧은 반감기로 인해 제한되어왔다. 다양한 IL-2 수용체 서브유닛에 대해 상이한 선택성을 갖는 개선된 IL-2 폴리펩티드, 예를 들어 IL-2Rα의 향상된 결합을 통해 치료 잠재력을 상승시키고 IL-2 요법의 부작용 위험을 최소화할 필요가 있다.
간단한 요약
한 측면에서, 다음을 포함하는 변형된 인터루킨-2(IL-2) 폴리펩티드가 본원에서 제공된다: 변형된 IL-2 폴리펩티드로서, 최대 7개의 천연 아미노산 치환을 포함하며, 7개의 천연 아미노산 치환은 잔기 Y31, K35, 및 Q74에 아미노산 치환을 포함하고; 변형된 IL-2 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 하는 것인 변형된 IL-2 폴리펩티드.
또 다른 측면에서, 다음을 포함하는 변형된 인터루킨-2(IL-2) 폴리펩티드가 본원에서 제공된다: 변형된 IL-2 폴리펩티드로서, 약 0.1 nM 내지 약 100 nM인 IL-2 수용체 알파 서브유닛(IL-2Rα)에 대한 결합 친화도를 나타내고 적어도 약 1000 nM인 IL-2 수용체 베타 서브유닛(IL-2Rβ)에 대한 결합 친화도를 나타내는 변형된 IL-2.
본 개시 내용의 추가적인 측면 및 이점은 본 개시 내용의 단지 예시적인 실시양태가 제시되고 설명되는 다음의 상세한 설명으로부터 당업자에게 쉽게 명백해질 것이다. 이해되는 바와 같이, 본 개시 내용은 다른 상이한 실시양태가 가능하며, 그 여러 세부 사항은 모두 본 개시 내용에서 벗어나지 않고 다양하고 명백한 측면에서 변형될 수 있다. 따라서, 도면 및 설명은 본질적으로 예시적인 것으로 간주해야 하며 제한적인 것으로 간주해서는 안 된다.
참고에 의한 포함
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허, 또는 특허 출원이 참고로 포함되도록 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다. 참고로 포함된 간행물, 특허, 또는 특허 출원이 명세서에 포함된 개시 내용과 모순되는 경우, 명세서는 그러한 모순되는 자료를 대체하거나 우선시하도록 의도된다.
본 개시 내용의 신규 특징은 첨부된 청구범위에서 구체적으로 설명된다. 본 개시 내용의 원리가 활용되는 예시적인 실시양태를 설명하는 다음의 상세한 설명과 첨부 도면(또한, 본원에서 "그림" 및 "도")을 참조하여 본 개시 내용의 특징 및 이점을 더 잘 이해할 수 있을 것이며, 그 중
[도 1]은 본원에 제공된 바와 같은 변형된 IL-2 폴리펩티드를 선형 뎁시펩티드로서 합성하는 데 사용된 합성 개략도를 보여준다.
[도 2]는 선형 뎁시펩티드를 재배열 및 폴딩하여 본원에 제공된 바와 같이 폴딩된 변형된 IL-2 폴리펩티드를 제공하는 개략도를 보여준다.
[도 3]은 본원에 제공된 바와 같은 PEG화 변형된 IL-2 폴리펩티드를 생산하기 위한 개략도를 보여준다.
[도 4a]는 다양한 농도의 알데스류킨, 조성물 A, 및 조성물 A1에 의한 Teff 세포에서의 STAT5 인산화의 평균 형광 강도(MFI)를 보여준다.
[도 4b]는 다양한 농도의 알데스류킨, 조성물 A, 및 조성물 A1에 의한 Treg 세포에서의 STAT5 인산화의 MFI를 보여준다.
[도 4c]는 본원에 제공된 변형된 IL-2 폴리펩티드에 의한 다양한 T 세포 하위유형의 STAT5 인산화의 EC50 값을 보여준다.
[도 5]는 생물층 간섭계(BLI)에 의해 측정된 IL-2Rα 및 IL-2Rβ 서브유닛에 대한 조성물 A1 및 알데스류킨의 결합 친화도를 보여준다.
[도 6]은 0.1 mg/kg 또는 0.3 mg/kg으로 마우스에게 피하 투여된 조성물 A1의 약동학을 보여준다.
[도 7]은 표시된 용량을 투여한 후 다양한 시점에서 다양한 림프구 집단에 대한 조성물 A1 또는 알데스류킨의 면역약력학적 효과를 보여준다. 왼쪽 상단 그래프는 Treg %pSTAT5 양성 세포를 보여준다. 중앙 상단 그래프는 Teff %pSTAT5 양성 세포를 보여준다. 오른쪽 상단 그래프는 NK %pSTAT5 양성 세포를 보여준다. 왼쪽 중간 그래프는 Treg %Ki67 양성 세포를 보여준다. 중앙 중간 그래프는 Teff %Ki67 양성 세포를 보여준다. 오른쪽 중간 그래프는 NK %Ki67 양성 세포를 보여준다. 왼쪽 하단 그래프는 기준선 대비 Treg 카운트 변화 배수를 보여준다. 중앙 하단 그래프는 기준선 대비 Teff 카운트 변화 배수를 보여준다. 오른쪽 하단 그래프는 기준선 대비 NK 카운트 변화 배수를 보여준다.
[도 8a]는 마우스에서 키홀 림펫 헤모시아닌에 대한 과민성을 지연시키는 조성물 A1의 능력을 평가하기 위한 실험 설계를 보여준다.
[도 8b]는 24, 48, 72 및 96시간에 부종의 척도로서 mm 단위로 보고된 오른쪽 귀(KLH 투여)와 반대편 귀(식염수 주사) 사이의 귀 두께 차이를 보여준다. 이원 분산 분석을 수행하여 시간(F(4, 216)= 48.16; p<0.0001)과 처리(F(5, 54) = 13.74; p<0.0001)의 유의한 효과가 나타났으며, 이는 조성물 A1에 의한 처리에 의해 조절된 시간에 따른 변화를 시사한다. 데이터는 평균 ± SEM(실험 그룹당 n=10)으로 보고되어 있다.
[도 8c]는 투여 후 전체 부종의 척도로서 곡선하 면적(AUC)으로 보고된 오른쪽 귀(KLH 투여)와 반대편 귀(식염수 주사) 사이의 귀 두께 차이를 보여준다. 일원 분산 분석을 수행하여 처리의 유의한 효과(F(5, 54) = 12.59; p<0.0001)가 나타났으며, 이는 이 매개변수가 처리에 의해 조절되었음을 시사한다. Dunnet 검정을 이용한 비히클에 대한 다중 비교에서 조성물 A1이 모든 요법에서 귀 부종을 유의하게 감소시켰음이 나타났다(** p<0.01, **** p<0.0001). 데이터는 평균 ± SEM(실험 그룹당 n=10)으로 보고되어 있다.
상세한 설명
본 개시 내용은 치료제로서 유용한 변형된 인터루킨-2(IL-2) 폴리펩티드에 관한 것이다. 본원에 제공된 변형된 IL-2 폴리펩티드는 염증성 질환 또는 기타 자가면역 질환을 비롯한 다양한 질환 및 장애에 대한 치료제로 사용될 수 있다. 이러한 변형된 IL-2 폴리펩티드는 야생형 IL-2(서열 번호 1) 또는 알데스류킨(서열 번호 2)과 상이한 IL-2 수용체(IL-2R)에 대한 결합 특성을 나타낼 수 있다. 한 측면에서, 본원에 기재된 변형된 IL-2 폴리펩티드는 IL-2R α 복합체에 대해 증가된 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 IL-2R βγ 복합체에 대해 조절되지 않는 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 IL-2R βγ 복합체에 대해 감소된 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2 폴리펩티드는 IL-2Rα 수용체 서브유닛에 대한 결합 친화도를 향상시키는 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2 폴리펩티드는 IL-2Rβ 수용체 서브유닛에 대한 변형된 IL-2 폴리펩티드 친화도를 낮추는 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 생체 내 투여 시 야생형 IL-2 또는 알데스류킨과 비교하여 더 적은 T-이펙터(Teff) 세포를 유도하는 생물학적 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2 폴리펩티드는 생체 내 투여 시 야생형 IL-2 또는 알데스류킨과 비교하여 조절 T 세포(Treg)를 유도하는 비슷한 능력을 갖는다(예를 들어, EC50가 10배 이하, 100배 이하 더 큼).
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 IL-2 폴리펩티드는 변형된 아미노산 잔기를 함유한다. 이러한 변형은 서열 번호 1의 아미노산 서열과 같은 야생형 IL-2 폴리펩티드의 아미노산 치환, 서열 번호 1의 서열로부터 아미노산의 첨가 또는 결실, 또는 아미노산 잔기에 모이어티의 첨가의 형태를 취할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호 1의 서열로부터 첫 번째 아미노산의 결실을 함유한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 IL-2 폴리펩티드는 참조 서열로서 서열 번호 1을 사용하여 C125S 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Y31, K35, Q74, 및/또는 N88로부터 선택된 하나 이상의 잔기에 치환을 포함하며, 여기서 변형된 IL-2 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 이러한 치환은 C125S 치환 및/또는 N-말단 결실, 예를 들어 서열 번호 1의 서열로부터 첫 번째 아미노산의 결실과 조합될 수 있다. 일부 실시양태에서, Y31 치환은 Y31H 치환이다. 일부 실시양태에서, K35 치환은 K35R 치환이다. 일부 실시양태에서, Q74 치환은 Q74P 치환이다. 일부 실시양태에서, N88 치환은 N88D 치환이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Y31H 치환, K35R 치환, 및 Q74P 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Y31H 치환, K35R 치환, Q74P 치환, 및 N88D 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Y31H 치환, K35S 치환, Q74P 치환, 및 C125S 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Y31H 치환, K35S 치환, Q74P 치환, N88D, 치환, 및 C125S 치환을 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 합성 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 α-케토산-히드록실아민(KAHA) 아미드 형성 결찰에 의해 합성된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 전체 길이의 변형된 IL-2 폴리펩티드를 합성하기 위해 다수의 폴리펩티드 단편을 연결하는 KAHA 결찰 반응 동안 사용되는 비천연 아미노산, 예컨대 호모세린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이들은 변형된 IL-2 폴리펩티드 내의 유일한 비천연 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 야생형 IL-2 또는 알데스류킨에 존재하는 하나 이상의 메티오닌 잔기에 노르류신(Nle) 잔기 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 위치 23, 39, 및 46에 노르류신 잔기를 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 변형된 IL-2 폴리펩티드는 하나 이상의 비표준 아미노산(본원에서 "비천연 아미노산"으로도 지칭됨)을 포함할 수 있다. "비표준" 아미노산은 자연 발생 단백질에 일반적으로 포함되는 20개의 표준 아미노산에 속하지 않는 D- 또는 L-형태의 아미노산 잔기를 의미할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산은 하나 이상의 비표준 아미노산으로 치환된다. 비표준 아미노산에는 N-알파-(9-플루오레닐메틸옥시카르보닐)-L-아지도리신(Fmoc-L-Lys(N3)-OH), N-알파-(9-플루오레닐메틸옥시카르보닐)-L-비페닐알라닌(Fmoc-L-Bip-OH), 및 N-알파-(9-플루오레닐메틸옥시카르보닐)-O-벤질-L-티로신(Fmoc-L-Tyr(Bzl)-OH, 또는 이들의 보호되지 않은 유사체가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
추가로, 변형된 IL-2 폴리펩티드에 중합체가 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체는 폴리펩티드의 반감기를 증가시키기 위해 첨가된다. 이러한 반감기 연장 중합체는 변형된 IL-2 폴리펩티드의 N-말단에 첨가될 수 있다. 반감기 연장 중합체는 최대 약 6 kDa, 최대 약 30 kDa, 또는 최대 약 50 kDa를 포함하는 임의의 크기일 수 있다. 일부 실시양태에서, 반감기 연장 중합체는 PEG 중합체이다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 표 1로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실을 포함한다.
[표 1]
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2 폴리펩티드는 표 2로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
[표 2]
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2 폴리펩티드는 표 3으로부터 선택된 하나 이상의 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 중합체는 변형된 IL-2 폴리펩티드의 N-말단에 공유적으로 부착된다.
[표 3]
본원에 기재된 변형된 IL-2 폴리펩티드는 또한 재조합 폴리펩티드로서 발현되기보다는 화학적으로 합성될 수 있다. 변형된 IL-2 폴리펩티드는 전체 길이의 변형된 IL-2 폴리펩티드의 하나 이상의 단편을 합성하는 단계, 단편을 함께 결찰시키는 단계, 및 결찰된 전체 길이의 폴리펩티드를 폴딩하는 단계에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Y31H, K35R, Q74P, 및 C125S 치환을 포함하고, 선택적으로 변형된 IL-2 폴리펩티드의 N-말단에 공유적으로 부착된 PEG 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Y31H, K35R, Q74P, N88D, 및 C125S 치환을 포함하고, 선택적으로 변형된 IL-2 폴리펩티드의 N-말단에 공유적으로 부착된 PEG 중합체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 대상체에게 투여될 때 조절 T 세포(Treg) 세포 증식 또는 활성화를 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 대상체에게 투여될 때 T 이펙터 세포(Teff) 및/또는 자연 살해(NK) 세포를 사용하지 않으면서 Treg 증식 또는 활성화를 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 대상체에게 투여될 때 CD8+ T 세포 및 NK 세포를 실질적으로 증가시키지 않으면서 Treg 세포를 증가시킨다.
다음의 설명 및 실시예는 본 개시 내용의 실시양태를 상세히 예시한다. 본 개시 내용은 본원에 기재된 특정 실시양태에 제한되지 않고 다양할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 당업자는 본 개시 내용의 범위 내에 포함되는 본 개시 내용의 수많은 변화 및 변형이 있음을 인식할 것이다.
본 개시 내용의 다양한 특징이 단일 실시양태의 맥락에서 설명될 수 있지만, 특징은 별도로 또는 임의의 적절한 조합으로 제공될 수도 있다. 역으로, 본원에서는 명확성을 위해 별도의 실시양태의 맥락에서 본 개시 내용을 설명할 수 있지만, 본 개시 내용은 단일 실시양태로 구현될 수도 있다.
본원에 사용된 섹션 제목은 단지 구성의 목적을 위한 것이며 설명된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
모든 용어는 당업자가 이해하는 대로 이해되도록 의도된다. 다르게 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시 내용이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
다음의 정의는 해당 분야의 정의를 보완하고 현재 출원에 관한 것이며 관련되거나 관련되지 않은 어떠한 사례, 예를 들어 공동 소유된 어떠한 특허 또는 출원에도 귀속되어서는 안 된다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 개시 내용의 테스트를 위한 실행에 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에 기재되어 있다. 따라서, 본원에 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 설명하기 위해 사용된 것이며 한정하려는 의도는 아니다.
I. 정의
본원에서 사용된 용어는 단지 특정한 경우를 설명하기 위해 사용된 것이며 제한하려는 의도는 아니다. 본 출원에서, 단수형의 사용은 달리 구체적으로 명시하지 않는 한 복수형을 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이 단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수형도 포함하도록 의도된다.
본 출원에서 "또는"의 사용은 달리 명시되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 본원에 사용되는 바와 같이 용어 "및/또는" 및 "이들의 임의의 조합" 및 이들의 문법적 상당 어구는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 이러한 용어는 임의의 조합이 구체적으로 고려된다는 것을 전달할 수 있다. 단지 설명의 목적으로, 다음 문구 "A, B, 및/또는 C" 또는 "A, B, C, 또는 이들의 임의의 조합"은 "A 개별적으로; B 개별적으로; C 개별적으로; A와 B; B와 C; A와 C; 및 A, B, 및 C"를 의미할 수 있다. "또는"이라는 용어는 문맥에서 구체적으로 분리적 사용을 언급하지 않는 한 결합적으로 또는 분리적으로 사용될 수 있다.
약" 또는 "대략"이라는 용어는 당업자에 의해 결정된 특정 값에 대해 허용 가능한 오차 범위 내를 의미할 수 있으며, 이는 부분적으로 값이 측정되거나 결정되는 방법, 즉 측정 시스템의 한계에 따라 결정될 것이다. 예를 들어, "약"은 당 업계의 관례에 따라 1 또는 1 초과의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 20%, 최대 15%, 최대 10%, 최대 5%, 또는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 과정과 관련하여, 이 용어는 값의 10배 크기 이내, 5배 이내, 또는 2배 이내를 의미할 수 있다. 출원 및 청구범위에 특정 값이 기술되어 있는 경우, 달리 명시하지 않는 한 용어 "약"은 특정 값에 대해 허용 가능한 오류 범위 내에 있음을 의미하는 것으로 가정되어야 한다.
본 명세서 및 청구항(들)에 사용되는 바와 같이, 단어 "포함하는(comprising)" (및 "comprise" 및 "comprises와 같은 comprising의 임의의 형태), 갖는(having)" (및 "have" 및 "has"와 같은 having의 임의의 형태), 포함하는(including)" (및 "includes" 및 "include"와 같은 including의 임의의 형태) 또는 함유하는(containing)(및 "contains" 및 "contain"와 같은 containing의 임의의 형태)는 포괄적이거나 개방적이며, 인용되지 않은 추가 요소나 방법 단계를 배제하지 않는다. 본 명세서에서 논의된 임의의 실시양태는 본 개시 내용의 임의의 방법 또는 조성물로 또는 그 반대로 구현될 수 있음이 고려된다. 또한, 본 개시 내용의 조성물은 본 개시 내용의 방법을 달성하는데 사용될 수 있다.
명세서에서 "일부 실시양태", "한 실시양태", "일 실시양태" 또는 "다른 실시양태"에 대한 언급은 실시양태와 관련하여 설명된 특정한 특징, 구,조 또는 특성이 적어도 일부 실시양태에 포함되지만, 반드시 본 개시 내용의 모든 실시양태에 포함되는 것은 아님을 의미한다. 본 개시 내용의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어 및 문구가 아래에 정의된다.
본원에서는 IL-2 폴리펩티드의 잔기에 "부착된" 또는 "공유적으로 부착된" 중합체가 언급된다. 본원에 사용되는 바와 같이 "부착된" 또는 "공유적으로 부착된"은 중합체가 표시된 잔기에 결속되어 있고 이러한 결속은 연결기(즉, 링커)를 포함할 수 있음을 의미한다. 따라서, 잔기에 "부착된" 또는 "공유적으로 부착된" 중합체의 경우, 그러한 연결기도 포함되는 것이 명백히 고려된다.
결합 친화도는 단일 분자와 그 리간드/결합 파트너 사이의 결합 상호작용의 강도를 의미한다. 더 높은 결합 친화도는 더 낮은 결합 친화도보다 더 높은 결합 강도를 의미한다. 일부 경우에, 결합 친화도는 두 관련 분자 사이의 해리 상수(KD)로 측정된다. KD 값을 비교할 때, 더 낮은 값의 결합 상호작용은 더 높은 값의 결합 상호작용보다 더 높은 결합 친화도를 갖게 된다. 단백질-리간드 상호작용의 경우, KD는 다음 공식에 따라 계산된다:
여기서 [L]은 리간드의 농도이고, [P]는 단백질의 농도이고, [LP]는 리간드/단백질 복합체의 농도이다.
참조 서열에 대해 특정 퍼센트 서열 동일성을 갖거나 참조 서열의 위치에 상응하는 위치의 잔기를 지칭하는 특정 아미노산 서열(예를 들어, 폴리펩티드 서열)이 본원에서 언급된다. 서열 동일성은 매트릭스: BLOSUM62; 갭 코스트(Gap Costs) 존재(Existence): 11, 연장(Extension): 1; 조성 조절(Compositional Adjustments) 조건화된 조성 점수 매트릭스 조절(Conditional Compositional Score Matrix Adjustment)의 매개변수를 사용하는 단백질-단백질 BLAST 알고리즘으로 측정된다. 이 정렬 알고리즘은 비교되는 두 서열의 정렬 분석을 통해 잔기가 "상응하는" 위치에 있는 지를 평가하는 데에도 사용된다.
"약학적으로 허용 가능한"이라는 용어는 인간을 포함한 동물에 사용하기 위해 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 승인될 수 있거나 미국 약전 또는 일반적으로 인정되는 기타 약전에 등재된 것을 의미한다.
"약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제"는 작용제와 함께 대상체에게 투여될 수 있고 치료량의 작용제를 전달하기에 충분한 용량으로 투여 시 그의 약리학적 활성을 파괴하지 않고 무독성인 부형제, 담체 또는 희석제를 의미한다.
본 개시 내용에 적합한 "약학적으로 허용 가능한 염"은 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 기타 문제 또는 합병증 없이 인간 또는 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 것으로 당 업계에서 일반적으로 고려되는 산 또는 염기 염일 수 있다. 이러한 염에는 아민과 같은 염기성 잔기의 무기산염 및 유기산염뿐만 아니라 카르복실산과 같은 산성 잔기의 알칼리염 또는 유기염도 포함된다. 구체적인 약학 염에는 염산, 인산, 브롬화수소산, 말산, 글리콜산, 푸마르산, 황산, 설팜산, 설파닐산, 포름산, 톨루엔설폰산, 메탄설폰산, 벤젠 설폰산, 에탄 디설폰산, 2-히드록시에틸 설폰산, 질산, 벤조산, 2-아세톡시벤조산, 시트르산, 타르타르산, 락트산, 스테아르산, 살리실산, 글루탐산, 아스코르브산, 파모산, 숙신산, 푸마르산, 말레산, 프로피온산, 히드록시말레산, 히드로요오드산, 페닐아세트산, 알칸산, 예컨대, 아세트산, HOOC-(CH2)n-COOH(여기서 n은 0-4임) 등의 염이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 유사하게, 약학적으로 허용 가능한 양이온에는 나트륨, 칼륨, 칼슘, 알루미늄, 리튬 및 암모늄이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 당업자는 본 개시 내용 및 당 업계의 지식으로부터 추가의 약학적으로 허용 가능한 염에는 문헌[Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, p. 1418 (1985)]에 열거된 것들이 포함된다는 것을 인식할 것이다. 일반적으로, 약학적으로 허용 가능한 산 또는 염기 염은 임의의 통상적인 화학적 방법에 의해 염기성 또는 산성 모이어티를 함유하는 모 화합물로부터 합성될 수 있다. 간략하게, 이러한 염은 이들 화합물의 유리 산 또는 염기 형태를 적절한 용매 중에서 화학량론적 양의 적절한 염기 또는 산과 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
본원에 제공된 범위는 범위 내의 모든 값을 약칭하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 수, 수의 조합, 또는 부분 범위, 및 예를 들어, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 및 1.9와 같이 앞서 언급한 정수 사이에 있는 모든 소수점 값을 포함하는 것으로 이해된다. 부분 범위와 관련하여, 범위의 양쪽 끝점에서 확장되는 "내포된 부분 범위"가 구체적으로 고려된다. 예를 들어, 1 내지 50의 예시적인 범위의 내포된 부분 범위는 한 방향으로 1 내지 10, 1 내지 20, 1 내지 30, 및 1 내지 40, 또는 다른 방향으로 50 내지 40, 50 내지 30, 50 내지 20, 및 50 내지 10을 포함할 수 있다.
"대상체"라는 용어는 치료, 관찰 또는 실험의 대상이 되는 동물을 의미한다. 단지 예로서, 대상체에는 인간 또는 비인간 포유동물, 예를 들어 비인간 영장류, 소, 말, 개, 양, 또는 고양이를 포함하나 이에 제한되지 않는 포유동물이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
본원에 제공된 특정 화학식 및 기타 예시는 아지드-알킨 고리화 첨가 반응으로부터 생성된 트리아졸 반응 생성물을 도시한다. 이러한 화학식은 일반적으로 반응에서 형성되는 생성된 트리아졸의 단일 위치 이성질체만을 도시하지만, 화학식은 생성된 위치 이성질체 둘 다를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 화학식은 단일 위치이성질체(예를 들어, )만을 도시하지만, 다른 위치 이성질체(예를 들어, )도 포함되도록 의도된다.
"선택적" 또는 "선택적으로"라는 용어는 이후에 설명되는 사건 또는 상황이 발생할 수 있지만 반드시 발생할 필요는 없으며, 설명에는 사건 또는 상황이 발생하는 경우와 발생하지 않는 경우가 포함된다는 것을 의미한다.
"모이어티"라는 용어는 분자의 특정 세그먼트 또는 작용기를 의미한다. 화학 모이어티는 종종 분자에 내장되거나 첨부된 화학 물질로 인식된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "글루타르산 및 0.5kDa 아지도 PEG를 갖는 N-말단"은 다음 구조를 갖는 본원에 제공된 IL-2 폴리펩티드의 N-말단 아민에 대한 변형을 의미한다:
.
아지드 작용성을 갖는 것으로 기술되어 있지만, 변형된 IL-2 폴리펩티드가 글루타르산 및 0.5kDa 아지도 PEG를 갖는 N-말단을 포함하는 각 경우에 아지드가 대안적인 접합 핸들로 대체될 수 있다는 것이 고려된다.
"조성물 A"는 글루타르산 및 0.5kDa 아지도 PEG를 갖는 N-말단을 포함하는 서열 번호 3의 변형된 IL-2 폴리펩티드를 의미한다.
"조성물 A1"은 조성물 A와 분자량이 약 30 kDa인 PEG를 함유하는 DBCO 사이에 형성된 반응 생성물을 의미한다.
"조성물 B"는 글루타르산 및 0.5kDa 아지도 PEG를 갖는 N-말단을 포함하는 서열 번호 4의 변형된 IL-2 폴리펩티드를 의미한다.
"조성물 B1"은 조성물 B와 분자량이 약 30 kDa인 PEG를 함유하는 DBCO 사이에 형성된 반응 생성물을 의미한다.
"조성물 C"는 글루타르산 및 0.5kDa 아지도 PEG를 갖는 N-말단을 포함하는 서열 번호 5의 변형된 IL-2 폴리펩티드를 의미한다.
"조성물 C1"은 조성물 B와 분자량이 약 30 kDa인 PEG를 함유하는 DBCO 사이에 형성된 반응 생성물을 의미한다.
"조성물 D"는 글루타르산 및 0.5kDa 아지도 PEG를 갖는 N-말단을 포함하는 서열 번호 6의 변형된 IL-2 폴리펩티드를 의미한다.
"조성물 D1"은 조성물 D와 분자량이 약 30 kDa인 PEG를 함유하는 DBCO 사이에 형성된 반응 생성물을 의미한다.
"조성물 E"는 글루타르산 및 0.5kDa 아지도 PEG를 갖는 N-말단을 포함하는 서열 번호 7의 변형된 IL-2 폴리펩티드를 의미한다.
"조성물 E1"은 조성물 E와 분자량이 약 30 kDa인 PEG를 함유하는 DBCO 사이에 형성된 반응 생성물을 의미한다.
"조성물 F"는 글루타르산 및 0.5kDa 아지도 PEG를 갖는 N-말단을 포함하는 서열 번호 8의 변형된 IL-2 폴리펩티드를 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "접합 핸들"은 상보적인 반응기와 접촉 시 결합을 형성할 수 있는 반응기를 지칭한다. 일부 경우에, 접합 핸들은 바람직하게는 의도된 상보적인 반응기를 포함하지 않는 다른 분자와 실질적인 반응성을 갖지 않는다. 접합 핸들, 그의 각각의 상보적인 접합 핸들, 및 해당 반응 생성물의 비제한적인 예는 아래 표에서 확인할 수 있다. 표 제목은 "접합 핸들" 또는 "상보적인 접합 핸들"이라는 제목 아래에 특정 반응기를 배치하지만, 접합 핸들에 대한 모든 언급은 대신에 표에 나열된 상보적인 접합 핸들을 포함할 수 있는 것으로 의도된다(예를 들어, 트랜스-사이클로옥텐은 접합 핸들이 될 수 있으며, 이 경우 테트라진은 상보적인 접합 핸들이 됨). 일부 경우에, 아민 접합 핸들 및 아민에 상보적인 접합 핸들은 생물학적 시스템에서 사용하기에 덜 바람직한데, 그 이유는 생물학적 시스템에서 아민이 어디에나 존재하고 표적을 벗어난 접합 가능성이 증가하기 때문이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "수 평균 분자량"(Mn)은 샘플 내 모든 개별 단위의 통계적 평균 분자량을 의미하며, 하기 식 (1)로 정의된다:
식 (1)
여기서 Mi는 단위의 분자량이고 Ni는 해당 분자량의 단위 수이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "중량 평균 분자량"(Mw)은 하기 식 (2)로 정의되는 수를 의미한다:
식 (2)
여기서 Mi는 단위의 분자량이고 Ni는 해당 분자량의 단위 수이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "피크 분자량"(Mp)은 주어진 분석 방법(예를 들어, 질량 분석법, 크기 배제 크로마토그래피, 동적 광산란, 분석 원심분리 등)에서 가장 높은 피크의 분자량을 의미한다.
II. 설명
한 측면에서, Teff 세포에 비해 Treg 세포의 활성화에 유리하게 편향된 변형된 IL-2 폴리펩티드가 본원에 기재된다. 한 측면에서, 변형된 인터루킨-2(IL-2) 폴리펩티드를 포함하는 변형된 폴리펩티드가 본원에 기재되며, 여기서 변형된 IL-2 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Y31, K35, Q74, 및 N88로부터 선택된 잔기에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 변형된 IL-2 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 잔기 Y31, K35, 및 Q74 각각에 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 변형된 IL-2 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Y31H, K35R, 및 Q74P의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 잔기 Y31, K35, Q74, 및 N88 각각에 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 변형된 IL-2 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Y31H, K35R, Q74P, 및 N88D의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 IL-2Rα 수용체에 대한 변형된 IL-2 폴리펩티드의 결합에 실질적인 영향을 미치는 어떠한 추가 치환도 포함하지 않는다.
또 다른 측면에서, 변형된 인터루킨-2(IL-2) 폴리펩티드를 포함하는 변형된 폴리펩티드가 본원에 기재되며, 여기서 변형된 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호 1 및/또는 서열 번호 2의 IL-2 폴리펩티드보다 Teff 세포를 활성화하는 실질적으로 더 낮은 능력을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Treg 세포를 활성화하는 능력을 유지한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호 1 및/또는 서열 번호 2의 IL-2 폴리펩티드에 비해 Treg 세포를 활성화하는 향상된 능력을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호 1 및/또는 서열 번호 2의 IL-2 폴리펩티드보다 IL-2Rα의 적어도 약 4배 더 낮은 해리 상수(Kd)를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호 1 및/또는 서열 번호 2의 IL-2 폴리펩티드보다 IL-2Rα의 2배 내지 10배 더 낮은 해리 상수(Kd)를 나타낸다.
결합 친화도
한 측면에서, 서열 번호 1 및/또는 서열 번호 2의 IL-2 폴리펩티드보다 IL-2 수용체 α 서브유닛에 대해 더 큰 친화도를 나타내는 변형된 IL-2 폴리펩티드가 본원에 기재된다. 일부 실시양태에서, IL-2 수용체 α 서브유닛에 대한 친화도는 해리 상수(Kd)에 의해 측정된다. 본원에 사용되는 바와 같이, "변형된 IL-2 폴리펩티드/IL-2 수용체 α 서브유닛의 Kd"라는 문구는 변형된 IL-2 폴리펩티드와 CD25의 결합 상호작용의 해리 상수를 의미한다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드/IL-2 수용체 α 서브유닛의 Kd는 10 nM 미만이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드/IL-2 수용체 α 서브유닛의 Kd는 10 nM 미만, 7.5 nM 미만, 5 nM 미만, 4 nM 미만, 또는 3 nM 미만이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드/IL-2 수용체 α 서브유닛의 Kd는 약 1 nM 내지 0.1 nM이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드/IL-2 수용체 α 서브유닛의 Kd는 약 10 nM 내지 약 0.1 nM이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드/IL-2 수용체 α 서브유닛의 Kd는 약 10 nM 내지 약 1 nM이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드/IL-2 수용체 α 서브유닛의 Kd는 약 7.5 nM 내지 약 0.1 nM이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드/IL-2 수용체 α 서브유닛의 Kd는 약 7.5 nM 내지 약 1 nM이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드/IL-2 수용체 α 서브유닛의 Kd는 약 5 nM 내지 약 0.1 nM이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드/IL-2 수용체 α 서브유닛의 Kd는 약 5 nM 내지 약 1 nM이다. 일부 실시양태에서, Kd는 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호 1 및/또는 서열 번호 2의 IL-2 폴리펩티드보다 IL-2 수용체 α 서브유닛에 대해 적어도 약 10%, 50%, 100%, 250%, 또는 500% 더 큰 친화도를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호 1 및/또는 서열 번호 2의 IL-2 폴리펩티드보다 IL-2 수용체 α 서브유닛에 대해 최대 약 500%, 750%, 또는 1000% 더 큰 친화도를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호 1 및/또는 서열 번호 2의 IL-2 폴리펩티드보다 IL-2 수용체 α 서브유닛에 대해 약 1.5배 내지 약 10배 더 큰 친화도를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호 1 및/또는 서열 번호 2의 IL-2 폴리펩티드와 비교하여 IL-2Rα에 대해 실질적으로 동일한 결합 친화도를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호 1 및/또는 서열 번호 2의 IL-2 폴리펩티드와 IL-2Rα 사이의 Kd의 약 2배, 약 4배, 약 6배, 약 8배, 또는 약 10배 이내인 IL-2Rα와의 Kd를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호 1 및/또는 서열 번호 2의 IL-2 폴리펩티드와 비교하여 IL-2 수용체 β 서브유닛(IL-2Rβ)에 대해 감소된 친화도를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 IL-2Rβ에 대해 적어도 약 10배, 적어도 약 25배, 적어도 약 50배, 적어도 약 100배, 또는 적어도 약 500배 더 낮은 친화도를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 IL-2Rβ에 대해 적어도 약 100배 더 낮은 친화도를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 실질적으로 IL-2Rβ에 대한 친화도를 나타내지 않는다. 일부 실시양태에서, 친화도는 해리 상수 Kd로서 측정된다(예를 들어, 더 낮은 친화도는 더 높은 해리 상수와 상관됨).
일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 적어도 500 nM, 적어도 1000 nM, 적어도 5000 nM, 적어도 10000 nM, 적어도 50000 nM, 또는 적어도 100000 nM인 IL-2Rβ에 대한 결합 친화도를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 실질적으로 IL-2Rβ에 대한 결합 친화도를 나타내지 않는다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 IL-2Rβ에 대한 친화도보다 적어도 약 30배 더 큰, 적어도 약 50배 더 큰, 적어도 약 75배 더 큰, 적어도 약 100배 더 큰, 적어도 약 500배 더 큰, 적어도 약 1000배 더 큰 IL-2Rα에 대한 친화도를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 IL-2Rβ에 대한 친화도보다 적어도 약 100배 더 큰 친화도를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 IL-2Rβ에 대한 친화도보다 적어도 약 1000배 더 큰 IL-2Rα에 대한 친화도를 나타낸다.
생물학적 활성
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 IL-2 폴리펩티드는 조절 T 세포(Treg) 세포 집단을 확장시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 IL-2 폴리펩티드는 이펙터 T 세포(Teff)의 확장을 방지한다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호 1 및/또는 서열 번호 2의 IL-2 폴리펩티드와 비교하여 Treg 세포의 활성화에 대한 유효 농도의 절반(EC50)이 최대 적당히 감소된다. 일부 실시양태에서, Treg 세포의 활성화는 변형된 IL-2 폴리펩티드와 접촉할 때 T 세포 집단에서 STAT5 인산화 변화를 평가함으로써 측정된다. 일부 실시양태에서, Treg 세포는 CD4+, CD25+ 및 FoxP3+인 것으로 식별된다. 일부 실시양태에서, Treg 세포는 또한 CD25의 상승된 발현(CD25Hi)을 나타냄으로써 식별된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Treg 세포 활성화에 대한 EC50이 최대 약 100 nM, 최대 약 75 nM, 최대 약 50 nM, 최대 약 40 nM, 최대 약 35 nM, 최대 약 30 nM, 또는 최대 약 25 nM이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Treg 세포 활성화에 대한 EC50이 최대 약 50 nM, 최대 약 40 nM, 최대 약 35 nM, 최대 약 30 nM, 또는 최대 약 25 nM, 최대 약 20 nM, 최대 약 15 nM, 최대 약 10 nM, 또는 최대 약 5 nM이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Treg 세포 활성화에 대한 EC50이 최대 약 100 nM이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Treg 세포 활성화에 대한 EC50이 최대 약 50 nM이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Treg 세포 활성화에 대한 EC50이 최대 약 25 nM이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Treg 세포 활성화에 대한 EC50이 약 0.1 nM 내지 약 100 nM, 약 1 nM 내지 약 100 nM, 약 0.1 nM 내지 약 50 nM, 약 1 nM 내지 약 50 nM, 약 0.1 nM 내지 약 25 nM, 약 1 nM 내지 약 25 nM, 약 0.1 nM 내지 약 10 nM, 또는 약 1 nM 내지 약 10 nM이다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호 1 및/또는 서열 번호 2의 IL-2 폴리펩티드와 비교하여 Treg 세포 활성화에 대한 EC50이 최대 2배, 최대 5배, 최대 10배, 최대 20배, 최대 50배, 최대 100배, 최대 200배, 최대 500배, 또는 최대 1000배 더 크다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Treg 세포 활성화에 대한 EC50이 최대 2배 더 크다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Treg 세포 활성화에 대한 EC50이 최대 5배 더 크다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Treg 세포 활성화에 대한 EC50이 최대 10배 더 크다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Treg 세포 활성화에 대한 EC50이 최대 50배 더 크다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Treg 세포 활성화에 대한 EC50이 최대 100배 더 크다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Treg 세포 활성화에 대한 EC50이 최대 200배 더 크다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Treg 세포 활성화에 대한 EC50이 최대 500배 더 크다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Treg 세포 활성화에 대한 EC50이 최대 1000배 더 크다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호 1 및/또는 서열 번호 1의 IL-2 폴리펩티드와 비교하여 Teff 세포 활성화에 대한 최대 유효 농도의 절반(EC50)이 실질적으로 더 크다. 일부 실시양태에서, Teff 세포는 CD8 Teff 세포(예를 들어, CD8+), 나이브 CD8 세포(예를 들어, CD8+, CD45RA+), 또는 CD4 Con 세포(예를 들어, CD4+, FoxP3-) 중 1, 2, 또는 3가지, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 실시양태에서, 세포의 활성화는 변형된 IL-2 폴리펩티드와 접촉할 때 T 세포 집단에서 STAT5 인산화 변화를 평가함으로써 측정된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Teff 세포 활성화에 대한 EC50이 적어도 약 10 nM, 적어도 약 50 nM, 적어도 약 100 nM, 적어도 약 500 nM, 적어도 약 1000 nM, 적어도 약 2000 nM, 적어도 약 3000 nM, 적어도 약 4000 nM, 또는 적어도 약 5000 nM이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Teff 세포 활성화에 대한 EC50이 적어도 약 100 nM이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Teff 세포 활성화에 대한 EC50이 적어도 약 500 nM이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Teff 세포 활성화에 대한 EC50이 적어도 약 1000 nM이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Teff 세포 활성화에 대한 EC50이 적어도 약 5000 nM이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호 1 및/또는 서열 번호 2의 IL-2 폴리펩티드와 비교하여 Teff 세포 활성화에 대한 EC50이 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 500배, 또는 적어도 1000배 더 크다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Teff 세포 활성화에 대한 EC50이 적어도 10배 더 크다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Teff 세포 활성화에 대한 EC50이 적어도 50배 더 크다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Teff 세포 활성화에 대한 EC50이 적어도 100배 더 크다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Teff 세포 활성화에 대한 EC50이 적어도 500배 더 크다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Teff 세포 활성화에 대한 EC50이 적어도 1000배 더 크다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Teff 세포와 비교하여 Treg 세포를 활성화하는 실질적으로 더 큰 능력을 나타낸다. 일부 실시양태에서, Treg 세포 유형의 활성화에 대한 EC50에 대한 Teff 세포 유형의 활성화에 대한 EC50의 비율은 적어도 10, 적어도 20, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 150, 또는 적어도 200이다. Treg 세포 유형의 활성화에 대한 EC50에 대한 Teff 세포 유형의 활성화에 대한 EC50의 비율은 적어도 100이다. 일부 실시양태에서, Treg 세포 유형의 활성화에 대한 EC50에 대한 Teff 세포 유형의 활성화에 대한 EC50의 비율은 적어도 200이다. 일부 실시양태에서, Treg 세포 유형의 활성화에 대한 EC50에 대한 Teff 세포 유형의 활성화에 대한 EC50의 비율은 적어도 300이다. 일부 실시양태에서, Treg 세포 유형의 활성화에 대한 EC50에 대한 Teff 세포 유형의 활성화에 대한 EC50의 비율은 적어도 500이다. 일부 실시양태에서, Treg 세포 유형의 활성화에 대한 EC50에 대한 Teff 세포 유형의 활성화에 대한 EC50의 비율은 적어도 1000이다.
일부 실시양태에서, 활성화 수준은 변형된 IL-2 폴리펩티드와 인큐베이션한 후 약 0.5시간 내지 약 1시간 후에 측정된다(예를 들어, 시험관 내 실험을 위해 세포를 고정하기 0.5시간 내지 1시간 전).
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 IL-2 폴리펩티드는 반감기 연장을 위해 공유적으로 부착된 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 혈장 또는 혈청 반감기 연장을 위해 공유적으로 부착된 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체가 부착된 변형된 IL-2 폴리펩티드의 혈장 또는 혈청 반감기는 중합체가 부착되지 않은 야생형 IL-2 폴리펩티드(서열 번호 1) 또는 알데스류킨(서열 번호 2)의 혈장 또는 혈청 반감기와 비교하여 적어도 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 또는 10배 더 길다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 IL-2 폴리펩티드의 혈장 또는 혈청 반감기는 반감기 연장 중합체가 없는 변형된 IL-2 폴리펩티드의 혈장 또는 혈청 반감기와 비교하여 적어도 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 또는 10배 더 길다.
부위 특이적 변형
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 IL-2 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 잔기에 하나 이상의 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 야생형 인간 IL-2 폴리펩티드를 기준으로 한다.
본원에 기재된 폴리펩티드에 대한 변형은 아미노산 치환, 다양한 작용성의 첨가, 아미노산의 결실, 아미노산의 첨가, 또는 단백질 또는 단백질 단편의 야생형 버전의 임의의 다른 변경을 포함한다. 폴리펩티드에 추가될 수 있는 작용기에는 중합체, 링커, 알킬기, 발색단 또는 형광단과 같은 검출 가능한 분자, 반응성 작용기, 또는 이들의 임의의 조합이 포함된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 개별 아미노산에 작용성이 추가된다. 일부 실시양태에서, 작용성은 폴리펩티드에 부위 특이적으로 추가된다.
한 측면에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변형된 IL-2 폴리펩티드가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 아미노산 치환은 IL-2 수용체 서브유닛(예를 들어, 알파, 베타 또는 감마 서브유닛) 또는 IL-2 수용체 복합체(예를 들어, IL-2 수용체 αβγ 복합체 또는 βγ 복합체)에 대한 변형된 IL-2 폴리펩티드의 결합 특성에 영향을 미친다. 일부 실시양태에서, 아미노산 치환은 변형된 IL-2 폴리펩티드와 IL-2 수용체 서브유닛 또는 IL-2 수용체 복합체 사이의 결합 상호작용 계면 상의 위치에 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 치환은 IL-2 수용체 αβγ 복합체 또는 알파 서브유닛에 대한 친화도의 증가를 야기한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 치환은 IL-2 수용체 βγ 복합체 또는 베타 서브유닛에 대한 친화도 감소를 야기한다.
한 측면에서, WT IL-2(서열 번호 1)에 비해 천연 아미노산 치환을 포함하는 변형된 IL-2 폴리펩티드를 포함하는 변형된 IL-2 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 최대 7개의 천연 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 최대 6개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 최대 5개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 최대 4개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 최대 3개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 3 내지 7, 3 내지 6, 3 내지 5, 3 내지 4, 4 내지 7, 4 내지 6, 4 내지 5, 5 내지 7, 5 내지 6, 또는 6 내지 7개의 천연 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 적어도 6개의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Y31, K35, Q74, 및 N88D 중 적어도 하나에 천연 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 변형된 IL-2 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Y31, K35, Q74, 및 N88 중 적어도 2개에 천연 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Y31, K35, Q74, 및 N88 중 적어도 3개에 천연 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Y31, K35, Q74, 및 N88 각각에 천연 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 아미노산 치환 Y31H, K35R, Q74P, 및 N88D를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 선택적인 C125 치환(예를 들어, C125S 또는 C125A)을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 선택적인 A1 결실 또는 잔기 A1의 치환을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 선택적인 A1 결실을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Y31 치환을 포함하며, 여기서 변형된 IL-2 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, Y31 치환은 방향족 아미노산에 대한 것이다. 일부 실시양태에서, Y31 치환은 염기성 아미노산에 대한 것이다. 일부 실시양태에서, 염기성 아미노산은 약염기성이다. 일부 실시양태에서, Y31 치환은 Y31F, Y31H, Y31W, Y31R, 및 Y31K로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, Y31 치환은 Y31H이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2 폴리펩티드는 K35 치환을 포함하며, 여기서 변형된 IL-2 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, K35 치환은 염기성 아미노산에 대한 것이다. 일부 실시양태에서, K35 치환은 양으로 하전된 아미노산에 대한 것이다. 일부 실시양태에서, K35 치환은 K35R, K35E, K35D, 또는 K35Q이다. 일부 실시양태에서, K35 치환은 K35R이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Q74 치환을 포함하며, 여기서 변형된 IL-2 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, Q74 치환은 고리형 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 고리형 아미노산은 알파 탄소에 공유적으로 부착된 고리기 및 알파 탄소에 부착된 질소를 포함한다. 일부 실시양태에서, Q74 치환은 Q74P이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2 폴리펩티드는 N88 치환을 포함하며, 여기서 변형된 IL-2 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, N88 치환은 하전된 아미노산 잔기이다. 일부 실시양태에서, N88 치환은 음으로 하전된 아미노산 잔기이다. 일부 실시양태에서, N88 치환은 N88D 또는 N88E이다. 일부 실시양태에서, N88 치환은 N88D 또는 N88E이다. 일부 실시양태에서, N88 치환은 N88D이다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 C125 치환을 포함하며, 여기서 변형된 IL-2 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, C125 치환은 변형된 IL-2 폴리펩티드를 안정화시킨다. 일부 실시양태에서, C125 치환은 변형된 IL-2 폴리펩티드의 활성을 실질적으로 변경하지 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 C125S 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 C125A 치환을 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 잔기 A1에 변형을 포함하며, 여기서 변형된 IL-2 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 변형은 A1 결실이다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 추가적인 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 IL-2 수용체 알파 서브유닛 또는 αβγ 복합체에 대한 결합에 영향을 미치는 추가적인 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 IL-2 수용체 베타 서브유닛 또는 βγ 복합체에 대한 결합에 영향을 미치는 추가적인 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 표 1로부터 선택된 적어도 하나의 추가적인 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 잔기 E15, N29, N30, T37, K48, V69, N71, N88, I89, 또는 I92에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 잔기 E15, N29, N30, T37, K48, V69, N71, I89, 또는 I92에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 E15, N29, N30, T37, K48, V69, N71, N88, I89, 또는 I92로부터 선택된 잔기에 1, 2, 3 또는 4개의 천연 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 E15, N29, N30, T37, K48, V69, N71, I89, 또는 I92로부터 선택된 잔기에 1, 2, 3 또는 4개의 천연 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 E15, N29, N30, T37, K48, V69, N71, N88, I89, 또는 I92로부터 선택된 잔기에 1개의 천연 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 2개를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 E15, N29, N30, T37, K48, V69, N71, N88, I89, 또는 I92로부터 선택된 잔기에 최대 2개의 천연 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 E15, N29, N30, T37, K48, V69, N71, N88, I89, 또는 I92로부터 선택된 잔기에 최대 3개의 천연 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가적인 아미노산 치환은 E15A, E15G, 또는 E15S를 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가적인 아미노산 치환은 N29S를 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가적인 아미노산 치환은 N30S를 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가적인 아미노산 치환은 T37A 또는 T37R을 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가적인 아미노산 치환은 K48E를 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가적인 아미노산 치환은 V69A를 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가적인 아미노산 치환은 N71R을 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가적인 아미노산 치환은 N88A, N88D, N88E, N88F, N88G, N88H, N88I, N88M, N88Q, N88R, N88S, N88T, N88V, 또는 N88W를 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가적인 아미노산 치환은 N88D를 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가적인 아미노산 치환은 I89V를 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가적인 아미노산 치환은 I92K 또는 I92R을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Y31, K35, Q74, 및 선택적으로 C125S에 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 IL-2 수용체 알파 서브유닛 또는 αβγ 복합체에 대한 결합에 실질적으로 영향을 미치는 어떠한 추가적인 치환도 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 IL-2 수용체 베타 서브유닛 또는 βγ 복합체에 대한 결합에 영향을 미치는 추가적인 아미노산 치환을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 표 1에서 확인된 위치로부터 선택된 어떠한 추가적인 천연 아미노산 치환도 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 표 1로부터 선택된 어떠한 추가적인 아미노산 치환도 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 잔기 E15, N29, N30, T37, K48, V69, N71, N88, I89, 또는 I92에 어떠한 추가적인 아미노산 치환도 포함하지 않는다.. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 잔기 E15, N29, N30, T37, K48, V69, N71, N88, I89, 또는 I92에 어떠한 추가적인 아미노산 치환도 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 V69 치환을 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 V69A 치환을 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 K48 치환을 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 K48E 치환을 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 V69 또는 K48에 치환을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 V69 또는 K48 중 어느 하나에 치환을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 V69A 또는 K48E 치환을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 V69A 또는 K48E 치환을 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Y31, K35, Q74, N88, 및 선택적으로 C125S에 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 IL-2 수용체 알파 서브유닛 또는 αβγ 복합체에 대한 결합에 실질적으로 영향을 미치는 어떠한 추가적인 치환도 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 IL-2 수용체 베타 서브유닛 또는 βγ 복합체에 대한 결합에 영향을 미치는 추가적인 아미노산 치환을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 표 1에서 확인된 위치로부터 선택된 어떠한 추가적인 천연 아미노산 치환도 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 표 1로부터 선택된 어떠한 추가적인 아미노산 치환을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 잔기 E15, N29, N30, T37, K48, V69, N71, I89, 또는 I92에 어떠한 추가적인 천연 아미노산 치환도 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 잔기 E15, N29, N30, T37, K48, V69, N71, I89, 또는 I92에 어떠한 추가적인 아미노산 치환도 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 V69 치환을 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 V69A 치환을 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 K48 치환을 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 K48E 치환을 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 V69 또는 K48에 치환을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 V69 또는 K48 중 어느 하나에 치환을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 V69A 또는 K48E 치환을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 V69A 또는 K48E 치환을 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2 폴리펩티드는 N-말단 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, N-말단 결실은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 아미노산에 대한 것이다. 일부 실시양태에서, N-말단 결실은 적어도 1개의 아미노산에 대한 것이다. 일부 실시양태에서, N-말단 결실은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산에 대한 것이다. 일부 실시양태에서, N-말단 결실은 1 내지 15개의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, N-말단 결실은 단일 아미노산의 결실(예를 들어, 서열 번호 1의 A1 결실)이다.
본원에 기재된 바와 같이, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. "비천연" 아미노산은 일반적으로 자연 발생 단백질에 포함되는 20가지 표준 아미노산에 속하지 않는 D- 또는 L-형태의 아미노산 잔기를 의미할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산은 하나 이상의 비천연 아미노산으로 치환된다. 비천연 아미노산에는 L-아지도리신 및 L-비페닐알라닌이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
예시적인 비천연 아미노산에는 또한 호모세린, 노르류신, p-아세틸-L-페닐알라닌, p-요오도-L-페닐알라닌, p-프로파르길옥시페닐알라닌, p-프로파르길-페닐알라닌, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, 트리-O-아세틸-GlcNAcp-세린, L-Dopa, 불소화 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, p-보로노페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L-페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, 티로신 아미노산 유사체; 글루타민 아미노산 유사체; 페닐알라닌 아미노산 유사체; 세린 아미노산 유사체; 트레오닌 아미노산 유사체; β-아미노산; 프롤린 또는 히스티딘 이외의 고리형 아미노산; 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판 이외의 방향족 아미노산; 또는 이들의 조합이 포함된다. 일부 실시양태에서, 비천연 아미노산은 β-아미노산, 호모아미노산, 및 고리형 아미노산으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 비천연 아미노산은 β-알라닌, β-아미노프로피온산, 피페리딘산, 아미노카프리온산, 아미노헵탄산, 아미노피멜산, 데스모신, 디아미노피멜산, Nα-에틸글리신, Nα-에틸아스파라긴, 이소데스모신, 알로-이소류신, Nα-메틸글리신, Nα-메틸이소류신, Nα-메틸발린, γ-카르복시글루타메이트, Nα-아세틸세린, Nα-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 및/또는 기타 유사한 아미노산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 비천연 아미노산 치환은 달리 명시되지 않는 한 본원에 제공된 천연 아미노산 치환의 임의의 조합에 더하여 IL-2 폴리펩티드에 포함될 수 있다. 예를 들어, Y31H, K35R, 및 Q74P 천연 아미노산 치환을 포함하는 변형된 IL-2 폴리펩티드가 기술되는 경우, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 비천연 아미노산 치환(예를 들어, Hse41, Hse71, Hse104, Nle23, Nle39, 및 Nle46))도 포함할 수 있다는 것이 명백히 고려된다. 또 다른 예로서, 본원에 제공된 변형된 IL-2 폴리펩티드가 Y31H, K35R, Q74P, 및 N88D 천연 아미노산 치환을 갖는 것으로 기술되는 경우, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 비천연 아미노산 치환(예를 들어, Hse41, Hse71, Hse104, Nle23, Nle39, 및 Nle46)을 추가로 포함할 수 있다. 특히, 본원에 제공된 재조합 변형된 IL-2 폴리펩티드에 존재하는 천연 아미노산 치환의 임의의 조합이 또한 변형된 IL-2 폴리펩티드의 합성 버전(예를 들어, Hse41, Hse71, Hse104, Nle23, Nle39, 및 Nle46을 포함하는 상응하는 변형된 IL-2 폴리펩티드)에 포함될 수 있다.
한 측면에서, 하나 이상의 비천연 아미노산 치환을 포함하는 변형된 IL-2 폴리펩티드가 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 적어도 2개의 비천연 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Y31, K35, Q74, 및 N88로부터 선택된 잔기에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 변형된 IL-2 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 잔기 36-45 중 어느 하나에 위치한 호모세린(Hse) 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 잔기 61-81 중 어느 하나에 위치한 Hse 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 잔기 94-114 중 어느 하나에 위치한 Hse 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 1, 2, 3개 이상의 Hse 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Hse41, Hse71, Hse104, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Hse41, Hse71, 및 Hse104를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 적어도 2개의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 적어도 2개의 아미노산 치환은 (a) 잔기 36-45 중 어느 하나에 위치한 호모세린(Hse) 잔기; (b) 잔기 61-81 중 어느 하나에 위치한 호모세린 잔기; 및 (c) 잔기 94-114 중 어느 하나에 위치한 호모세린 잔기로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Hse41 및 Hse71을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Hse41 및 Hse104를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Hse71 및 Hse104를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Hse41을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Hse71을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Hse104를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 1, 2, 3개 이상의 노르류신(Nle) 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 잔기 18-28 중 어느 하나에 위치한 Nle 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 잔기 34-50 중 어느 하나에 위치한 하나 이상의 Nle 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 잔기 20-60 중 어느 하나에 위치한 Nle 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 3개의 Nle 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 Nle23, Nle39, 및 Nle46을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호 3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 A1 결실을 갖는 서열 번호 3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2 폴리펩티드는 표 7에 제공된 서열 번호 3-43 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호 3-43 중 어느 하나의 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호 3-43 중 어느 하나의 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 1에 비해 치환된 참조 아미노산 서열의 각 잔기는 유지된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호 3의 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호 3의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 1에 비해 서열 번호 3에서 치환된 각 잔기는 유지된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호 4의 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 1에 비해 서열 번호 4에서 치환된 각 잔기는 유지된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호 3과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 IL-2 폴리펩티드는 서열 번호 4와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열 동일성은 매트릭스: BLOSUM62; 갭 코스트 존재: 11, 연장: 1 및 조성 조절 조건화된 조성 점수 매트릭스 조절의 매개변수를 사용하는 단백질-단백질 BLAST 알고리즘으로 측정된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 IL-2 폴리펩티드는 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 또는 적어도 9개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 3 내지 9개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 3개 또는 4개 아미노산 치환, 3개 내지 5개 아미노산 치환, 3개 내지 6개 아미노산 치환, 3개 내지 7개 아미노산 치환, 3개 내지 9개 아미노산 치환, 4개 또는 5개 아미노산 치환, 4개 내지 6개 아미노산 치환, 4개 내지 7개 아미노산 치환, 4개 내지 9개 아미노산 치환, 5개 또는 6개 아미노산 치환, 5개 내지 7개 아미노산 치환, 5개 내지 9개 아미노산 치환, 6개 또는 7개 아미노산 치환, 6개 내지 9개의 아미노산 치환, 또는 7개 내지 9개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 3개의 아미노산 치환, 4개의 아미노산 치환, 5개의 아미노산 치환, 6개의 아미노산 치환, 7개의 아미노산 치환, 또는 9개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 최대 4개의 아미노산 치환, 5개의 아미노산 치환, 6개의 아미노산 치환, 7개의 아미노산 치환, 또는 9개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 표 1로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 표 2로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 변형된 IL-2 폴리펩티드에 대한 다양한 페이로드(예를 들어, 중합체)의 부착 또는 접합 반응을 촉진하는 데 사용될 수 있는 추가 작용기의 부착에 사용될 수 있는 변형된 천연 아미노산 잔기에 대한 치환을 함유한다. 치환은 추가 작용기(예를 들어, 아스파르트산/아스파라긴 시스테인, 글루탐산/글루타민, 리신, 세린, 트레오닌, 또는 티로신)의 부착이 더 쉬운 자연 발생 아미노산, 임의의 자연 발생 아미노산의 변형된 버전의 유도체, 또는 임의의 비천연 아미노산(예를 들어, 아지드, 알킨 등과 같은 CLICK 화학 시약과 같은 원하는 반응기를 함유하는 아미노산)에 대한 것일 수 있다. 변형된 천연 아미노산 잔기의 비제한적인 예에는 아래 제공된 변형된 리신, 글루탐산, 아스파르트산, 및 시스테인이 포함되며:
및 , 여기서 각각의 n은 1-30의 정수이다. 유사하게 변형될 수 있는 천연 아미노산의 다른 예에는 중합체 기를 아미노산(예를 들어, 티로신, 세린, 트레오닌)에 연결하기 위해 적합한 기와 쉽게 결합을 형성할 수 있는 헤테로원자를 갖는 것이 포함된다. 변형된 아미노산 잔기의 이러한 비제한적 예는 변형된 IL-2 폴리펩티드에 추가적인 작용성(예를 들어, 중합체 또는 추가적인 폴리펩티드)을 추가하는 것이 바람직한 임의의 위치에서 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 중합체를 포함하는 말단 잔기(예를 들어, N-말단 잔기 또는 C-말단 잔기)의 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 말단 잔기에 대한 변형은 변형된 IL-2 폴리펩티드의 말단 잔기에 대한 접합 핸들의 부착을 포함한다. 일부 실시양태에서, 접합 핸들은 변형된 IL-2 폴리펩티드의 N-말단 아미노기 또는 C-말단 카르복실기를 통해 변형된 IL-2 폴리펩티드에 부착된다. 일부 실시양태에서, 접합 핸들은 변형된 IL-2 폴리펩티드의 N-말단 아미노기를 통해 변형된 IL-2 폴리펩티드에 부착된다. 일부 실시양태에서, 접합 핸들은 글루타릴-아미노-PEG 링커를 통해 변형된 IL-2 폴리펩티드의 N-말단 아미노기에 부착된다. 일부 실시양태에서, 접합 핸들은 다음 구조를 갖는 부가물을 통해 변형된 IL-2 폴리펩티드의 N-말단 아미노기에 부착된다:
여기서 각각의 n은 독립적으로 1-30의 정수(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30)이고, X는 접합 핸들(예를 들어, 아지드 또는 본원에 제공된 기타 접합 핸들, 예컨대 DBCO 기)이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 상기 부가물을 포함할 것이지만, 접합 핸들 X는 변형된 IL-2 폴리펩티드를 추가 모이어티(예를 들어, 더 큰 중합체 또는 추가 폴리펩티드)에 연결하는 접합 핸들과 상보적인 접합 핸들(예를 들어, 1,2,3 트리아졸)의 반응 생성물로 대체된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드의 N-말단 아미노기는 다음 구조를 갖는 부가물을 포함한다:
.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 추가 폴리펩티드와 연결된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드 및 추가 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드를 형성한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드 및 추가 폴리펩티드는 함께 접합된다. 일부 실시양태에서, 추가 폴리펩티드는 항체 또는 이의 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간화 항체, 뮤린 항체, 키메라 항체, 이중특이적 항체, 이들의 임의의 단편, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 단클론 항체 또는 이의 임의의 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)이다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 추가 폴리펩티드에 접합되지 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 항체에 접합되지 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 항-TNFα 항체에 접합되지 않는다.
중합체
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 IL-2 폴리펩티드는 그 위에 공유적으로 부착된 하나 이상의 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 기재된 변형된 IL-2 폴리펩티드는 변형된 IL-2 폴리펩티드에 공유적으로 부착된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 기재된 변형 IL-2 폴리펩티드는 IL-2 폴리펩티드의 N-말단에 공유적으로 부착된 중합체를 포함한다. 본원에서 제공된 중합체는 변형된 IL-2 폴리펩티드의 잔기에 직접 부착될 수 있거나, 작은 연결기를 통해 부착될 수 있다(예를 들어, 변형된 IL-2 폴리펩티드에 포함된 접합 핸들과의 반응을 통해 부착될 수 있다).
본원에 제공된 바와 같은 중합체는 IL-2 폴리펩티드의 임의의 원하는 잔기에 부착될 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체는 IL-2 폴리펩티드와 IL-2 수용체 또는 특정 IL-2 수용체 서브유닛(예를 들어, IL-2 수용체 알파 서브유닛)의 결합에 영향을 주지 않는 잔기에 부착되는 것이 바람직하다. 일부 실시양태에서, 중합체는 변형된 IL-2 폴리펩티드의 N-말단에 또는 그 근처에 부착된다. 일부 실시양태에서, 중합체는 변형된 IL-2 폴리펩티드의 N-말단에 부착된다. 일부 실시양태에서, N-말단은 IL-2 폴리펩티드의 잔기 A1이고, 여기서 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, N-말단은 IL-2 폴리펩티드의 잔기 P2이고, 여기서 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다(예를 들어, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 서열로부터 잔기 A1의 결실을 포함함). 일부 실시양태에서, 중합체는 변형된 IL-2 폴리펩티드와 IL-2 수용체 베타 서브유닛의 결합을 차단하거나 감소시키는 잔기 위치에 부착된다. 이러한 잔기 위치는 미국 특허 공개 번호 20200231644A1에 제공되며, 이는 그 전체 내용이 본원에 기재된 것처럼 본원에 참고로 포함되며, 예를 들어 잔기 위치 K8, K9, L12, E15, H16, L19, D20, Q22, M23, N26, D84, N88, E95, 및 Q126을 포함한다.
일부 실시양태에서, 중합체는 수용성 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 옥시드), 다당류, 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리옥사졸린, 폴리(아크릴로일모르폴린), 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 옥시드)이다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 다당류이다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 옥시드)이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 IL-2 폴리펩티드는 IL-2 폴리펩티드의 N-말단에 공유적으로 부착된 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 이에 공유적으로 부착된 제2 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 이에 공유적으로 부착된 제2 및 제3 중합체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 중합체와 같은 부착된 중합체는 약 6,000 달톤 내지 약 50,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 중합체는 약 6,000 달톤 내지 약 10,000 달톤, 약 6,000 달톤 내지 약 30,000 달톤, 약 6,000 달톤 내지 약 50,000 달톤, 약 10,000 달톤 내지 약 30,000 달톤, 약 10,000 달톤 내지 50,000 달톤, 또는 약 30,000 달톤 내지 약 50,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 중합체는 약 6,000 달톤, 약 10,000 달톤, 약 30,000 달톤, 또는 약 50,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 중합체는 적어도 약 6,000 달톤, 약 10,000 달톤, 또는 약 30,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 중합체는 최대 약 10,000 달톤, 약 30,000 달톤, 또는 약 50,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다.
일부 실시양태에서, N-말단에 부착된 중합체와 같은 부착된 중합체는 약 120 달톤 내지 약 1,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 중합체는 약 120 달톤 내지 약 250 달톤, 약 120 달톤 내지 약 300 달톤, 약 120 달톤 내지 약 400 달톤, 약 120 달톤 내지 약 500 달톤, 약 120 달톤 내지 1,000 달톤, 약 250 달톤 내지 약 300 달톤, 약 250 달톤 내지 약 400 달톤, 약 250 달톤 내지 약 500 달톤, 약 250 달톤 내지 약 1,000 달톤, 약 300 달톤 내지 약 400 달톤, 약 300 달톤 내지 약 500 달톤, 약 300 달톤 내지 약 1,000 달톤, 약 400 달톤 내지 약 500 달톤, 약 400 달톤 내지 약 1,000 달톤, 또는 약 500 달톤 내지 약 1,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 중합체는 약 120 달톤, 약 250 달톤, 약 300 달톤, 약 400 달톤, 약 500 달톤, 또는 약 1,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 중합체는 적어도 약 120 달톤, 약 250 달톤, 약 300 달톤, 약 400 달톤, 또는 약 500 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 중합체는 최대 약 250 달톤, 약 300 달톤, 약 400 달톤, 약 500 달톤, 또는 약 1,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다.
일부 실시양태에서, 부착된 중합체는 수용성 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 옥시드), 다당류, 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리옥사졸린, 폴리(아크릴로일모르폴린), 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(즉, 폴리에틸렌 옥시드)과 같은 폴리(알킬렌 옥시드)이다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜이다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 변형된 폴리(알킬렌 옥시드)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된 폴리(알킬렌 옥시드)는 하나 이상의 링커 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 링커 기는 아미드 기, 에스테르 기, 에테르 기, 티오에테르 기, 카르보닐 기 등과 같은 이작용성 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 링커 기는 아미드 링커 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리(알킬렌 옥시드)는 하나 이상의 스페이서 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스페이서 기는 치환 또는 비치환된 C1-C6 알킬렌 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스페이서 기는 -CH2-, -CH2CH2-, 또는 - CH2CH2CH2-를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커 기는 생체직교 반응(예를 들어, 생체적합성 및 선택적 반응)의 생성물이다. 일부 실시양태에서, 생체직교 반응은 Cu(I)-촉매화되거나 "구리가 없는" 알킨-아지드 트리아졸-형성 반응, 슈타우딩거 결찰, 역전자 요구형 디엘스-알더(IEDDA) 반응, "광-클릭" 화학, 또는 올레핀 복분해 및 Suzuki-Miyaura 또는 Sonogashira 교차 커플링과 같은 금속 매개 공정이다. 일부 실시양태에서, 중합체는 클릭 화학을 통해 IL-2 폴리펩티드에 부착된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2 폴리펩티드는 유도체화된 분자 또는 모이어티, 예를 들어 항체 및 중합체(예를 들어, 추가의 더 큰 중합체)와 변형된 IL-2 폴리펩티드의 접합을 촉진하는 반응기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 반응기는 카르복실산 유도 활성 에스테르, 혼합 무수물, 아실 할라이드, 아실 아지드, 알킬 할라이드, N-말레이미드, 이미노 에스테르, 이소시아네이트, 및 이소티오시아네이트 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 반응기는 아지드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 반응기는 알킨을 포함한다.
일부 실시양태에서, 중합체는 변형된 IL-2 폴리펩티드에 추가 모이어티를 추가로 부착하는 데(예를 들어 항체와 같은 추가 폴리펩티드의 추가에) 사용될 수 있는 접합 핸들을 포함한다. 다른 모이어티에 부착된 상보적인 반응기와 반응할 수 있는 임의의 적합한 반응기가 접합 핸들로서 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 중합체는 접합 핸들, 또는 상보적인 접합 핸들과 접합 핸들의 반응 생성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상보적인 접합 핸들과 접합 핸들의 반응 생성물은 KAT 결찰(칼륨 아실트리플루오로보레이트와 히드록실아민의 반응), Staudinger 결찰(아지드와 포스핀의 반응), 테트라진 고리화 첨가(테트라진과 트랜스-사이클로옥텐의 반응), 또는 Huisgen 고리화 첨가(알킨과 아지드의 반응)로부터 생성된다. 일부 실시양태에서, 중합체는 변형된 IL-2 폴리펩티드에 중합체를 부착하는 데 사용되는 상보적인 접합 핸들과 접합 핸들의 반응 생성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체는 아지드 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체는 알킨 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체는 아지드 모이어티, 알킨 모이어티, 또는 아지드-알킨 고리화 첨가 반응의 반응 생성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아지드-알킨 고리화 첨가 반응의 반응 생성물은 1,2,3-트리아졸이다.
일부 실시양태에서, 중합체는 이작용성 링커의 사용을 통해 변형된 IL-2 폴리펩티드에 부착된다. 일부 실시양태에서, 이작용성 링커는 변형된 IL-2 폴리펩티드 상의 아미노산 잔기의 반응기(예를 들어, 시스테인 설프히드릴)와 반응하여 공유 결합을 형성한다. 일부 실시양태에서, 두 번째 단계에서, 이작용성 링커(예를 들어, 아지드 또는 알킨과 같은 접합 핸들)의 두 번째 반응기를 사용하여 중합체와 같은 두 번째 모이어티를 부착한다.
일부 실시양태에서, 중합체는 화학식 (X)의 구조를 포함하는 링커를 포함한다:
여기서, L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7 , L8, 및 L9는 각각 독립적으로 -O-, -NRL-, -(C1-C6 알킬렌)NRL-, -NRL(C1-C6 알킬렌)-, -N(RL)2 +-, -(C1-C6 알킬렌)N(RL)2 +-, -N(RL)2 +-(C1-C6 알킬렌)-, -OP(=O)(ORL)O-, -S-, -(C1-C6 알킬렌)S-, -S(C1-C6 알킬렌)-, -S(=O)-, -S(=O)2-, -C(=O)-, -(C1-C6 알킬렌)C(=O)-, -C(=O) (C1-C6 알킬렌)-, -C(=O)O-, -OC(=O)-, -OC(=O)O-, -C(=O)NRL-, -C(=O)NRL(C1-C6 알킬렌)-, -(C1-C6 알킬렌)C(=O)NRL-, -NRLC(=O)-, -(C1-C6 알킬렌)NRLC(=O)-, -NRLC(=O)(C1-C6 알킬렌)-, -OC(=O)NRL-, -NRLC(=O)O-, -NRLC(=O)NRL-, -NRLC(=S)NRL-, -CRL=N-, -N=CRL, -NRLS(=O)2-, -S(=O)2NRL-, -C(=O)NRLS(=O)2-, -S(=O)2NRLC(=O)-, 치환 또는 비치환된 C1-C6 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C1-C6 헤테로알킬렌, 치환 또는 비치환된 C2-C6 알케닐렌, 치환 또는 비치환된 C2-C6 알키닐렌, 치환 또는 비치환된 C6-C20 아릴렌, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로아릴렌, -(CH2-CH2-O)qa-, -(O-CH2-CH2)qb-, -(CH2-CH(CH3)-O)qc-, -(O-CH(CH3)-CH2)qd-, 접합 핸들과 상보적인 접합 핸들의 반응 생성물 또는 부재; (C1-C6 알킬렌)이고
각각의 RL은 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환된 C1-C4 알킬, 치환 또는 비치환된 C1-C4 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C6 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C5 알키닐, 치환 또는 비치환된 C3-C8 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C7 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 또는 치환 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
qa, qb, qc 및 qd는 각각 독립적으로 1-100의 정수이고,
여기서 각각의 은 변형된 IL-2 폴리펩티드 또는 중합체의 중합체 부분에 대한 부착 지점이다.
일부 실시양태에서, 중합체는 화학식 (X')의 구조를 포함하는 링커를 포함한다:
여기서 각각의 L'은 독립적으로 -O-, -NRL-, -(C1-C6 알킬렌)NRL-, -NRL(C1-C6 알킬렌)-, -N(RL)2 +-, -(C1-C6 알킬렌)N(RL)2 +-, -N(RL)2 +-(C1-C6 알킬렌)-, -OP(=O)(ORL)O-, -S-, -(C1-C6 알킬렌)S-, -S(C1-C6 알킬렌)-, -S(=O)-, -S(=O)2-, -C(=O)-, -(C1-C6 알킬렌)C(=O)-, -C(=O)(C1-C6 알킬렌)-, -C(=O)O-, -OC(=O)-, -OC(=O)O-, -C(=O)NRL-, -C(=O)NRL(C1-C6 알킬렌)-, -(C1-C6 알킬렌)C(=O)NRL-, -NRLC(=O)-, -(C1-C6 알킬렌)NRLC(=O)-, -NRLC(=O)(C1-C6 알킬렌)-, -OC(=O)NRL-, -NRLC(=O)O-, -NRLC(=O)NRL-, -NRLC(=S)NRL-, -CRL=N-, -N=CRL, -NRLS(=O)2-, -S(=O)2NRL-, -C(=O)NRLS(=O)2-, -S(=O)2NRLC(=O)-, 치환 또는 비치환된 C1-C6 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C1-C6 헤테로알킬렌, 치환 또는 비치환된 C2-C6 알케닐렌, 치환 또는 비치환된 C2-C6 알키닐렌, 치환 또는 비치환된 C6-C20 아릴렌, 치환 또는 비치환된 C2-C20 헤테로아릴렌, -(CH2-CH2-O)qa-, -(O-CH2-CH2)qb-, -(CH2-CH(CH3)-O)qc-, -(O- CH(CH3)-CH2)qd-, 접합 핸들과 상보적인 접합 핸들의 반응 생성물, 또는 부재; (C1-C6 알킬렌)이고
각각의 RL은 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환된 C1-C4 알킬, 치환 또는 비치환된 C1-C4 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C6 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C5 알키닐, 치환 또는 비치환된 C3-C8 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C7 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 또는 치환 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
qa, qb, qc 및 qd는 각각 독립적으로 1-100의 정수이고;
g는 1-100의 정수이고,
여기서 각각의 은 변형된 IL-2 폴리펩티드 또는 중합체의 중합체 부분에 대한 부착 지점이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2 폴리펩티드는 표 4로부터 선택된 링커를 포함하는 중합체를 포함한다. 표 4에서, 각각의 은 변형된 IL-2 폴리펩티드(예를 들어, 변형된 IL-2 폴리펩티드의 아미노기) 또는 중합체의 중합체 부분에 대한 부착 지점이다.
[표 4]
일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 1 내지 10개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 1개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬 내지 10개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 수용성 중합체는 1개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬 내지 2개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 1개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬 내지 4개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 1개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬 내지 6개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 1개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬 내지 10개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 2개의 폴리에틸렌글리콜 사슬 내지 4개의 폴리에틸렌글리콜 사슬, 2개의 폴리에틸렌글리콜 사슬 내지 6개의 폴리에틸렌글리콜 사슬, 2개의 폴리에틸렌글리콜 사슬 내지 10개의 폴리에틸렌글리콜 사슬, 4개의 폴리에틸렌글리콜 사슬 내지 6개의 폴리에틸렌글리콜 사슬, 4개의 폴리에틸렌글리콜 사슬 내지 10개의 폴리에틸렌글리콜 사슬, 또는 6개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬 내지 10개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 1개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 2개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 4개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 6개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 또는 10개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 적어도 1개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 2개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 4개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 또는 6개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 수용성 중합체는 최대 2개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 4개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 6개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 또는 10개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 4개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 하기 화학식 (I)의 구조를 포함한다:
화학식 (I)
여기서, 각각의 m은 독립적으로 4-30의 정수이다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체의 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜 사슬은 하기 화학식 (II)의 구조를 포함한다:
화학식 (II)
여기서 각각의 m은 독립적으로 4-30의 정수이고, 각각의 n은 독립적으로 1-10의 정수이다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체의 각각의 폴리에틸렌 글리콜 사슬은 화학식 (II)의 구조를 포함한다. 화학식 (II)의 일부 실시양태에서, m은 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40이다. 화학식 (II)의 일부 실시양태에서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이다.
일부 실시양태에서, 각각의 폴리에틸렌 글리콜 사슬은 독립적으로 약 5개 내지 약 300개, 약 10개 내지 약 200개, 약 20개 내지 약 100개, 또는 약 25개 내지 약 50개의 에틸렌 글리콜 단위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 폴리에틸렌 글리콜 사슬은 독립적으로 5개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 300개의 에틸렌 글리콜 단위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 폴리에틸렌 글리콜 사슬은 독립적으로 5개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 10개의 에틸렌 글리콜 단위, 5개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 20개의 에틸렌 글리콜 단위, 5개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 25개의 에틸렌 글리콜 단위, 5개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 50개의 에틸렌 글리콜 단위, 5개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 100개의 에틸렌 글리콜 단위, 5개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 200개의 에틸렌 글리콜 단위, 5개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 300개의 에틸렌 글리콜 단위, 10개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 20개의 에틸렌 글리콜 단위, 10개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 25개의 에틸렌 글리콜 단위, 10개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 50개의 에틸렌 글리콜 단위, 10개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 100개의 에틸렌 글리콜 단위, 10개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 200개의 에틸렌 글리콜 단위, 10개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 300개의 에틸렌 글리콜 단위, 20개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 25개의 에틸렌 글리콜 단위, 20개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 50개의 에틸렌 글리콜 단위, 20개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 100개의 에틸렌 글리콜 단위, 20개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 200개의 에틸렌 글리콜 단위, 20개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 300개의 에틸렌 글리콜 단위, 25개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 50개의 에틸렌 글리콜 단위, 25개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 100개의 에틸렌 글리콜 단위, 25개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 200개의 에틸렌 글리콜 단위, 25개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 300개의 에틸렌 글리콜 단위, 50개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 100개의 에틸렌 글리콜 단위, 50개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 200개의 에틸렌 글리콜 단위, 50개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 300개의 에틸렌 글리콜 단위, 100개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 200개의 에틸렌 글리콜 단위, 100개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 300개의 에틸렌 글리콜 단위, 또는 200개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 300개의 에틸렌 글리콜 단위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜 사슬 각각은 독립적으로 5개의 에틸렌 글리콜 단위, 10개의 에틸렌 글리콜 단위, 20개의 에틸렌 글리콜 단위, 25개의 에틸렌 글리콜 단위, 50개의 에틸렌 글리콜 단위, 100개의 에틸렌 글리콜 단위, 200개의 에틸렌 글리콜 단위, 또는 300개의 에틸렌 글리콜 단위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜 사슬 각각은 독립적으로 적어도 5개의 에틸렌 글리콜 단위, 10개의 에틸렌 글리콜 단위, 20개의 에틸렌 글리콜 단위, 25개의 에틸렌 글리콜 단위, 50개의 에틸렌 글리콜 단위, 100개의 에틸렌 글리콜 단위, 또는 200개의 에틸렌 글리콜 단위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜 사슬 각각은 독립적으로 최대 10개의 에틸렌 글리콜 단위, 20개의 에틸렌 글리콜 단위, 25개의 에틸렌 글리콜 단위, 50개의 에틸렌 글리콜 단위, 100개의 에틸렌 글리콜 단위, 200개의 에틸렌 글리콜 단위, 또는 300개의 에틸렌 글리콜 단위를 포함한다.
일부 실시양태에서, 각각의 폴리에틸렌 글리콜 사슬은 독립적으로 선형 또는 분지형이다. 일부 실시양태에서, 각각의 폴리에틸렌 글리콜 사슬은 선형 폴리에틸렌 글리콜이다. 일부 실시양태에서, 각각의 폴리에틸렌 글리콜 사슬은 분지형 폴리에틸렌 글리콜이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제1 중합체와 제2 중합체 각각은 선형 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함한다.
일부 실시양태에서, 각각의 폴리에틸렌 글리콜 사슬은 독립적으로 말단이 히드록시, 알킬, 알콕시, 아미도, 또는 아미노 기로 캡핑된다. 일부 실시양태에서, 각각의 폴리에틸렌 글리콜 사슬은 독립적으로 말단이 아미노 기로 캡핑된다. 일부 실시양태에서, 각각의 폴리에틸렌 글리콜 사슬은 독립적으로 말단이 아미도 기로 캡핑된다. 일부 실시양태에서, 각각의 폴리에틸렌 글리콜 사슬은 독립적으로 말단이 알콕시 기로 캡핑된다. 일부 실시양태에서, 각각의 폴리에틸렌 글리콜 사슬은 독립적으로 말단이 알킬 기로 캡핑된다. 일부 실시양태에서, 각각의 폴리에틸렌 글리콜 사슬은 독립적으로 말단이 히드록시 기로 캡핑된다. 일부 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜 사슬 중 하나 이상은 독립적으로 구조 를 가지며, 여기서 n은 4-30의 정수이다. 일부 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜 사슬 중 하나 이상은 독립적으로 구조 을 가지며, 여기서 m은 4-30의 정수이다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 이에 공유적으로 부착된 다중 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 중합체는 수용성 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 옥시드), 다당류, 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리옥사졸린, 폴리(아크릴로일모르폴린), 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 옥시드)이다. 일부 실시양태에서, 각각의 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜이다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 1 내지 10개의 공유적으로 부착된 수용성 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 1 내지 10개의 공유적으로 부착된 수용성 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 1 또는 2개의 공유적으로 부착된 수용성 중합체, 1 내지 3개의 공유적으로 부착된 수용성 중합체, 1 내지 4개의 공유적으로 부착된 수용성 중합체, 1 내지 6개의 공유적으로 부착된 수용성 중합체, 1 내지 8개의 공유적으로 부착된 수용성 중합체, 1 내지 10개의 공유적으로 부착된 수용성 중합체, 2 또는 3개의 공유적으로 부착된 수용성 중합체, 2 내지 4개의 공유적으로 부착된 수용성 중합체, 2 내지 6개의 공유적으로 부착된 수용성 중합체, 2 내지 8개의 공유적으로 부착된 수용성 중합체, 2 내지 10개의 공유적으로 부착된 수용성 중합체, 3 또는 4개의 공유적으로 부착된 수용성 중합체, 3 내지 6개의 공유적으로 부착된 수용성 중합체, 3 내지 8개의 공유적으로 부착된 수용성 중합체, 3 내지 10개의 공유적으로 부착된 수용성 중합체, 4 내지 6개의 공유적으로 부착된 수용성 중합체, 4 내지 8개의 공유적으로 부착된 수용성 중합체, 4 내지 10개의 공유적으로 부착된 수용성 중합체, 6 내지 8개의 공유적으로 부착된 수용성 중합체, 6 내지 10개의 공유적으로 부착된 수용성 중합체, 또는 8 내지 10개의 공유적으로 부착된 수용성 중합체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드에 부착될 수 있는 수용성 중합체는 하기 화학식 (A)의 구조를 포함한다:
화학식 (A).
일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드에 부착될 수 있는 수용성 중합체는 하기 화학식 (B)의 구조를 포함한다:
화학식 (B).
일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드에 부착될 수 있는 수용성 중합체는 하기 화학식 (C)의 구조를 포함한다:
화학식 (C).
일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드에 부착될 수 있는 수용성 중합체는 하기 화학식 (D)의 구조를 포함한다:
화학식 (D).
일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드에 부착될 수 있는 수용성 중합체는 하기 화학식 (E)의 구조를 포함한다:
일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드에 부착된 수용성 중합체는 하나 이상의 링커 및/또는 스페이서를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 링커는 하나 이상의 아미드 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 링커는 하나 이상의 리신 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드에 부착된 수용성 중합체는 화학식 (I), 화학식 (II), 화학식 (III), 또는 이들의 조합의 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드에 부착된 수용성 중합체는 화학식 (A), 화학식 (B), 화학식 (C), 화학식 (D), 화학식 (E), 또는 이들의 조합의 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드에 부착된 수용성 중합체는 의 구조를 포함한다.
일부 실시양태에서, N-말단에 부착된 수용성 중합체는 하나 이상의 링커 및/또는 스페이서를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 링커는 하나 이상의 아미드 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 링커는 하나 이상의 리신 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, N-말단에 부착된 수용성 중합체는 화학식 (I), 화학식 (II), 화학식 (III), 또는 이들의 조합의 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, N-말단에 부착된 수용성 중합체는 화학식 (A), 화학식 (B), 화학식 (C), 화학식 (D), 화학식 (E), 또는 이들의 조합의 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 부착된 수용성 중합체는 의 구조를 포함한다.
일부 실시양태에서, 중합체는 적합한 전구체 물질로부터 합성된다. 일부 실시양태에서, 중합체는 구조 5, 구조 6, 구조 7, 또는 구조 8의 전구체 물질로부터 합성되며, 여기서 구조 5는
구조 5;
구조 6은
구조 6;
구조 7은
구조 7;
구조 8은
구조 8
이다.
III. 조성물 약학 제제
한 측면에서, 본원에 기재된 변형된 IL-2 폴리펩티드; 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 제제가 본원에 기재된다. 일부 실시양태에서, 약학 제제는 다수의 변형된 IL-2 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학 제제는 탄수화물, 무기염, 항산화제, 계면활성제, 또는 완충제로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 약학 제제는 탄수화물을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 탄수화물은 프룩토오스, 말토오스, 갈락토오스, 글루코오스, D-만노스, 소르보스, 락토스, 수크로오스, 트레할로스, 셀로비오스 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 자일리톨, 소르비톨(글루시톨), 피라노실 소르비톨, 미오이노시톨, 사이클로덱스트린, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 약학 제제는 무기염을 포함한다. 특정 실시양태에서, 무기염은 염화나트륨, 염화칼륨, 염화마그네슘, 염화칼슘, 인산나트륨, 인산칼륨, 황산나트륨, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 약학 제제는 항산화제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항산화제는 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔, 메타중아황산칼륨, 프로필 갈레이트, 메타중아황산나트륨, 티오황산나트륨, 비타민 E, 3,4-디히드록시벤조산, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 약학 제제는 계면활성제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트, 소르비탄 에스테르, 지질, 인지질, 포스파티딜에탄올아민, 지방산, 지방산 에스테르, 스테로이드, EDTA, 아연, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 약학 제제는 완충제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 완충제는 시트르산, 인산나트륨, 인산칼륨, 아세트산, 에탄올아민, 히스티딘, 아미노산, 타르타르산, 숙신산, 푸마르산, 락트산, 트리스, HEPES, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 약학 제제는 비경구 또는 장내 투여용으로 제조된다. 일부 실시양태에서, 약학 제제는 정맥내 또는 피하 투여용으로 제제화된다. 일부 실시양태에서, 약학 제제는 동결건조된 형태이다.
한 측면에서, 기재된 변형 IL-2 폴리펩티드를 포함하는 액체 또는 동결건조 제제가 본원에 기재된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 동결건조된 분말이다. 일부 실시양태에서, 동결건조된 분말은 완충 용액에 재현탁된다. 일부 실시양태에서, 완충 용액은 완충제, 당, 염, 계면활성제, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 완충 용액은 인산염을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인산염은 나트륨 Na2HPO4이다. 일부 실시양태에서, 염은 염화나트륨이다. 일부 실시양태에서, 완충 용액은 인산염 완충 식염수를 포함한다. 일부 실시양태에서, 완충 용액은 만니톨을 포함한다. 일부 실시양태에서, 동결건조된 분말은 10 mM Na2HPO4 완충제 pH 7.5, 0.022% SDS 및 50 mg/mL 만니톨을 포함하는 용액에 현탁된다.
제형
본원에 기재된 변형된 IL-2 폴리펩티드는 다양한 제형일 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 동결건조된 분말로 투여된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 현탁액으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 용액으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 주사액으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 IV 용액으로 투여된다.
IV. 치료 방법
한 측면에서, 자가면역 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법으로서, 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 변형된 IL-2 폴리펩티드 또는 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다. 한 측면에서, 염증성 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법으로서, 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 변형된 IL-2 폴리펩티드 또는 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다. 일부 실시양태에서, 자가면역 질환은 T 세포 매개 자가면역 질환이다. 일부 실시양태에서, 염증성 질환 또는 장애는 염증(예를 들어, 연골 염증), 자가면역 질환, 아토피성 질환, 부신생물 자가면역 질환, 관절염, 류마티스 관절염(예를 들어, 활성), 소아 관절염, 소아 특발성 관절염, 소아 류마티스 관절염, 소수관절성 류마티스 관절염, 소수관절성 소아 류마티스 관절염, 다관절성 소아 류마티스 관절염, 전신 발병 소아 류마티스 관절염, 소아 건선성 관절염, 건선성 관절염, 다관절성 류마티스 관절염, 전신 발병 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 소아 강직성 척추염, 소아 장병성 관절염, 반응성 관절염, 소아 반응성 관절염, 라이터 증후군, 소아 라이터 증후군, 소아 피부근염, 소아 경피증, 소아 혈관염, 장병성 관절염, SEA 증후군(혈청 음성, 골부착부 병증, 관절병증 증후군), 피부근염, 건선성 관절염, 경피증, 혈관염, 근염, 다발성 근염, 피부근염, 결절성 다발동맥염, 베게너 육아종증, 동맥염, 류마티스성 다발성 근육통, 사르코이드증, 경화증, 원발성 담즙성 경화증, 경화성 담관염, 쇼그렌 증후군, 건선, 판상 건선, 물방울 건선, 역위 건선, 농포성 건선, 홍피성 건선, 피부염, 아토피성 피부염, 포진성 피부염, 베체트병, 탈모증, 원형 탈모증, 전두 탈모증, 죽상경화증, 루푸스, 스틸병, 중증 근무력증, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 셀리악병, 천식, COPD, 비부비동염, 폴립을 동반한 비부비동염, 호산구성 식도염, 호산구성 기관지염, 길랭-바레병, 갑상선염(예를 들어, 그레이브스병), 애디슨병, 레이노 현상, 자가면역 간염, 이식편대숙주병, 스테로이드 불응성 만성 이식편대숙주병, 이식 거부(예를 들어, 신장, 폐, 심장, 피부 등), 신장 손상, C형 간염 유발 혈관염, 자연유산, 백반증, 국소분절 사구체경화증(FSGS), 미세변화 질환, 막성 신장병증, ANCA 관련 사구체신장병증, 막증식성 사구체신염, IgA 신장병증, 루푸스 신장염, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 염증성 질환 또는 장애는 신경염증성 장애이다. 일부 실시양태에서, 신경염증성 장애는 시신경척수염 스펙트럼 장애, 다발성 경화증, 항-수초 희돌기아교세포 당단백질 항체 장애, 자가면역 뇌염, 횡단 척수염, 시신경염, 또는 신경사르코이드증이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 근위축성 측삭 경화증이다.
V. 제조 방법
한 측면에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드를 제조하는 방법이 본원에 기재된다. 또 다른 측면에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드의 2개 이상의 단편을 합성하는 단계 및 단편을 결찰시키는 단계를 포함하는 변형된 IL-2 폴리펩티드를 제조하는 방법이 본원에 기재된다. 또 다른 측면에서, a. 변형된 IL-2 폴리펩티드의 2개 이상의 단편을 합성하는 단계, b. 단편을 결찰시키는 단계; 및 c. 결찰된 단편을 폴딩하는 단계를 포함하는 변형된 IL-2 폴리펩티드를 제조하는 방법이 본원에 기재된다. IL-2 폴리펩티드를 합성하는 방법의 예는 또한 예를 들어 적어도 PCT 공개 번호 WO2021140416A2, 미국 특허 출원 공개 번호 US20190023760A1 및 문헌[Asahina et al., Angew . Chem . Int . Ed. 2015, 54, 8226-8230]에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 제시된 것처럼 참고로 포함된다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드의 2개 이상의 단편은 화학적으로 합성된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드의 2개 이상의 단편은 고상 펩티드 합성에 의해 합성된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드의 2개 이상의 단편은 자동화 펩티드 합성기에서 합성된다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 펩티드 단편으로부터 결찰된다. 일부 실시양태에서, 변형된 펩티드는 2개의 펩티드 단편으로부터 결찰된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 3개의 펩티드 단편으로부터 결찰된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 4개의 펩티드 단편으로부터 결찰된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 2 내지 10개의 펩티드 단편으로 결찰된다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드의 2개 이상의 단편은 함께 결찰된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드의 3개 이상의 단편은 순차적 방식으로 결찰된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드의 3개 이상의 단편은 원포트(one-pot) 반응으로 결찰된다.
일부 실시형태에서, 결찰된 단편은 폴딩된다. 일부 실시양태에서, 폴딩은 변형된 IL-2 폴리펩티드 내에 하나 이상의 이황화 결합을 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결찰된 단편은 폴딩 과정을 거친다. 일부 실시양태에서, 결찰된 단편은 당 업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 폴딩된다. 일부 실시양태에서, 결찰된 폴리펩티드 또는 폴딩된 폴리펩티드는 이에 하나 이상의 중합체를 부착함으로써 추가로 변형된다. 일부 실시양태에서, 결찰된 폴리펩티드 또는 폴딩된 폴리펩티드는 PEG화에 의해 추가로 변형된다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 합성된 것이다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드는 재조합체이다. 한 측면에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드를 포함하는 숙주 세포가 본원에 기재된다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포, 조류 세포, 및 곤충 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 CHO 세포, COS 세포, 또는 효모 세포이다.
한 측면에서, 변형된 IL-2 폴리펩티드를 생산하는 방법이 본원에 기재되며, 여기서 상기 방법은 변형된 IL-2 폴리펩티드를 숙주 세포에서 발현시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포, 조류 세포, 및 곤충 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 CHO 세포, COS 세포, 또는 효모 세포이다.
III. 서열 번호
[표 5]
상기 표 5에서 Nle은 노르류신 잔기이고, Hse는 호모세린 잔기이다.
본 개시 내용 및 그 이점이 상세히 설명되었지만, 첨부된 청구범위에 정의된 바와 같이 본 개시 내용의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변화, 대체 및 변경이 본원에서 이루어질 수 있음을 이해해야 한다.
단지 예시 목적으로만 제공되며 어떤 방식으로든 본 개시 내용을 제한하려는 의도가 아닌 하기 실시예에서 본 개시 내용을 추가로 예시한다.
실시예 1: 변형된 IL-2 폴리펩티드의 합성 - 일반 절차
IL-2 선형 단백질 제조(대표 프로토콜)
일반적인 전략: 본원에 기재된 바와 같은 변형된 IL-2 폴리펩티드, 예를 들어 서열 번호 3, 또는 서열 번호 3-8 또는 40-43 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 변형된 IL-2 폴리펩티드, 또는 서열 번호 9-39 중 어느 하나의 합성 버전, 또는 본원에 달리 기재된 변형된 IL-2 폴리펩티드는 고상 펩티드 합성(SPPS)에 의해 제조된 개별 펩티드 세그먼트를 결찰시킴으로써 합성할 수 있다. 개별 펩티드는 아래 설명된 방법을 사용하여 자동화 펩티드 합성기에서 합성한다.
재료 및 용매: Fmoc-SPPS에 적합한 측쇄 보호기를 갖는 Fmoc-아미노산, 펩티드 작용화에 사용되는 수지 폴리에틸렌 글리콜 유도체 및 시약은 상업적으로 이용 가능하며 추가 정제 없이 사용하였다. 분석용 및 분취용 RP-HPLC 정제에는 HPLC 등급 CH3CN을 사용하였다.
아민계 수지 상에 보호 케토산 유도체( 세그먼트 1- 3)의 로딩: 5 g의 Rink-amide MBHA 또는 ChemMatrix 수지(1.8 mmol 규모)를 DMF에서 30분 동안 팽윤시켰다. 수지를 실온에서 10분 동안 DMF(v/v) 중 20% 피페리딘으로 2회 처리한 후 DMF로 여러 번 세척하여 Fmoc-탈보호를 수행하였다. Fmoc-AA-보호-α-케토산(1.8 mmol, 1.00 당량)을 20 ㎖ DMF에 용해시키고 HATU(650 mg, 1.71 mmol, 0.95 당량) 및 DIPEA(396 ㎕, 3.6 mmol, 2.00 당량)으로 사전 활성화시켰다. 반응 혼합물을 팽윤된 수지에 첨가하였다. 이를 실온에서 6시간 동안 부드러운 교반 하에 반응하도록 두었다. 수지를 DMF로 완전히 헹구었다. DMF(20 ㎖) 중의 아세트산 무수물(1.17 ㎖) 및 DIPEA(2.34 ㎖)의 용액을 첨가하여 수지 상의 미반응 아민의 캡핑을 수행하였다. 이를 실온에서 15분 동안 부드러운 교반 하에 반응하도록 두었다. 수지를 DCM으로 완전히 헹군 후 디에틸 에테르로 헹구고 건조시켰다. 수지의 로딩량은 디벤조풀벤의 UV 정량화에 의해 0.25 mmol/g인 것으로 결정되었다.
Wang 수지 상에 Fmoc - Thr ( tBu )-OH의 로딩( 세그먼트 4): Wang 수지 상에 Fmoc-Thr-OH의 사전 로딩을 수행하였다. 4 g의 수지(로딩: 0.56 mmol/g, 2.24 mmol 규모)를 DMF에서 15분 동안 팽윤시켰다. 수지를 실온에서 20분 동안 DMF 중 20%(v/v) 피페리딘으로 처리하였다. 수지를 DMF로 여러 번 세척하였다. Fmoc-Thr(tBu)-OH(638 mg, 1.68 mmol, 0.75 당량) 및 HATU(638 mg, 1.68 mmol, 0.75 당량)를 DMF(12 ㎖)에 용해시켰다. DIPEA(585 ㎕, 3.36 mmol, 1.5 당량)를 첨가하여 실온에서 3분 동안 사전 활성화를 수행하였다. 반응 혼합물을 팽윤된 수지에 첨가하였다. 이를 실온에서 밤새 부드러운 교반 하에 반응하도록 두었다. 수지를 DMF로 완전히 헹구었다. DMF(12 ㎖) 중 아세트산 무수물(1.27 ㎖) 및 DIPEA(2.34 ㎖)의 용액을 첨가하여 수지 상의 미반응 아민의 캡핑을 시작하였다. 이를 실온에서 15분 동안 부드러운 교반 하에 반응하도록 두었다. 수지를 DCM으로 완전히 헹구고 건조시켰다. 수지의 로딩양을 측정하였다(0.34 mmol/g).
고체상 펩티드 합성( SPPS ): Fmoc-SPPS 화학을 사용하여 자동화 펩티드 합성기에서 펩티드 세그먼트를 합성하였다. 측쇄 보호기를 갖는 다음 Fmoc-아미노산을 사용하였다: Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Cys(Acm)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc 또는 Boc-Opr-OH(Opr = 5-(S)-옥사프롤린). 필요한 경우 Fmoc-슈도프롤린 디펩티드를 합성에 포함시켰다. DMF 중 20% 피페리딘(2 x 8 min) 또는 0.1 M Cl-HOBt를 함유하는 DMF 중 25% 피페리딘(2 x 8 min) 또는 0.1 M Cl-HOBt를 함유하는 DMF 중 20% 피페리딘(2 x 8 min)으로 Fmoc 탈보호를 수행하고 완전한 Fmoc 제거를 보장하기 위해 피드백 루프를 사용하여 304 nm에서 UV로 모니터링하였다. DMF 중 Fmoc-아미노산(수지 치환에 대해 3.0 - 5.0 당량), 커플링 시약으로 HCTU 또는 HATU(2.9 - 4.9 당량) 및 DIPEA 또는 NMM(6 - 10 당량)을 사용하여 실온에서 또는 50℃에서 커플링을 수행하였다. 3분 동안 사전 활성화시킨 후, 시약을 함유한 용액을 수지에 첨가하고 아미노산에 따라 30분 또는 2시간 동안 반응하도록 두었다. 일부 경우에, 이중 커플링이 필요하였다. 일부 경우에, 미반응 유리 아민을 캡핑하기 위해 수지를 DMF 중 20% 아세트산 무수물로 처리하였다.
펩티드의 수지 절단 및 측쇄 탈보호: 펩티드 합성이 완료되면, 절단 칵테일을 사용하여 실온에서 2시간 동안 펩티드를 수지로부터 절단하였다. 수지를 여과 제거하고, 여과액을 농축하고 차가운 디에틸 에테르로 처리하고, 분쇄하고 원심분리하였다. 에테르 층을 조심스럽게 따라내고, 잔류물을 다시 디에틸 에테르에 현탁시키고, 분쇄하고 원심분리하였다. 에테르 세척을 2회 반복하였다. 생성된 조 펩티드를 진공 하에 건조시키고 -20℃에서 보관하였다. 얻은 고체의 분취량을 0.1% TFA(v/v)가 포함된 1:1 CH3CN/H2O에 용해시키고 60℃에서 C18 컬럼(4.6 x 150 mm)을 사용하는 분석용 RP-HPLC로 분석하였다. 생성물의 분자량은 MALDI-TOF 또는 LC-MS를 이용하여 확인하였다.
IL-2 세그먼트 1 및 2의 결찰 및 광탈보호: IL-2 Seg1(1.2 당량) 및 IL-2 Seg2(1 당량)를 0.1 M 옥살산을 함유한 DMSO:H2O(9:1, v/v)에 용해시키고(20 mM 펩티드 농도) 60℃에서 22시간 동안 반응하도록 두었다. 결찰 바이알을 알루미늄 호일로 포장하여 빛을 차단하였다. KAHA 결찰의 진행은 이동상으로 0.1% TFA를 함유한 CH3CN/H2O를 7분 내에 5%에서 95%까지의 CH3CN의 구배로 사용하여 60℃에서 C18 컬럼(4.6 x 150 mm)을 사용하는 HPLC로 모니터링하였다. 결찰이 완료된 후 혼합물을 0.1% TFA를 함유한 CH3CN/H2O(1:1)로 희석하고 365 nm의 파장에서 1시간 동안 조사하였다. 광분해 반응의 완료는 앞서 설명한 방법을 사용하여 HPLC에 샘플을 주입하여 확인하였다. 이어서, 용액을 분취용 HPLC로 정제하였다.
IL-2 세그먼트 3 및 4의 결찰 및 Fmoc 탈보호: IL2-Seg3(1.2 당량) 및 IL2-Seg4(1 당량)를 0.1 M 옥살산을 함유한 DMSO/H2O(9.8:0.2)에 용해시키고(15 mM) 60℃에서 20시간 동안 반응하도록 두었다. KAHA 결찰의 진행은 이동상으로 0.1% TFA를 함유한 CH3CN/H2O를 7분 내에 30%에서 70%까지의 CH3CN의 구배로 사용하여 60℃에서 C18 컬럼(4.6 x 150 mm)을 사용하는 HPLC로 모니터링하였다. 결찰이 완료된 후 반응 혼합물을 DMSO(6 ㎖)로 희석하고 5% 디에틸아민(300 ㎕)을 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 7분 동안 진탕시켰다. 분취용 샘플을 준비하기 위해, TFA(300 ㎕)를 함유한 DMSO(4 ㎖)로 희석하였다.
최종 결찰: IL2-Seg12(1.2 당량) 및 IL2-Seg34(1 당량)를 0.1 M 옥살산을 함유한 DMSO/H2O(9:1) 또는 (9.8:0.2)에 용해시키고(15 mM 펩티드 농도) 60℃에서 24시간 동안 결찰이 진행되도록 두었다. KAHA 결찰의 진행은 이동상으로 0.1% TFA를 함유하는 CH3CN/H2O를 14분 내에 30%에서 95%까지의 CH3CN의 구배로 60℃에서 C18 컬럼(4.6 x 250 mm)을 사용하는 분석용 HPLC로 모니터링하였다. 결찰이 완료된 후, 반응 혼합물을 DMSO로 희석한 후, 0.1% TFA를 함유하는 CH3CN:H2O(1:1) 혼합물(7 ㎖)로 추가로 희석하였다. 샘플을 분취용 HPLC에 주입하여 정제하였다.
Acm 탈보호: 2x Acm을 갖는 IL2 선형 단백질을 AcOH/H2O(1:1)에 용해시키고(0.25 mM 단백질 농도) AgOAc(1% m/v)를 용액에 첨가하였다. 혼합물을 빛을 차단시키면서 50℃에서 2.5시간 동안 진탕시켰다. HPLC로 확인된 반응 완료 후, 샘플을 0.1% TFA를 함유한 CH3CN:H2O(1:1)로 희석하고 분취용 HPLC로 정제하였다.
펩티드의 정제: 펩티드 세그먼트, 결찰된 펩티드 및 선형 단백질을 RP-HPLC로 정제하였다. 서로 다른 펩티드에 대해 서로 다른 구배를 적용하였다. 이동상은 0.1% TFA(v/v)를 포함한 MilliQ-H2O(완충액 A) 및 0.1% TFA(v/v)를 포함한 HPLC 등급 CH3CN(완충제 B)이었다. 분취용 HPLC는 40℃ 또는 60℃에서 40 ㎖/분의 유속으로 (50 x 250 mm) 또는 C18 컬럼(50 x 250 mm)에서 수행하였다.
펩티드의 특성화: 펩티드 세그먼트, 결찰된 펩티드 및 선형 단백질을 RP-HPLC로 분석하였다. 이동상은 0.1% TFA(v/v)를 포함한 MilliQ-H2O(완충액 A) 및 0.1% TFA(v/v)를 포함한 HPLC 등급 CH3CN(완충제 B)이었다. 분석용 HPLC는 실온에서 C4 컬럼(3.6 μm, 150 x 4.6 mm)에서 또는 60℃에서 C18 컬럼(3.6 μm, 150 x 4.6 mm)에서 1 ㎖/분의 유속으로 수행하였다. 펩티드와 단백질은 4-히드록시-α-시아노신남산(HCCA)을 매트릭스로 사용하여, 이중 ESI/MALDI-FTICR 소스가 장착된 SolariX(9.4T 자석) 분광계(Bruker, 미국 빌레리카 소재)를 사용하는 고해상도 푸리에 변환 질량 분석법(FTMS)으로 특성화하였다.
실시예 2 - IL-2(서열 번호 3) 의 조성물 A 및 A1 변이체의 합성
조성물 A의 IL-2(1-39)-Leu-α- 케토산(세그먼트 1A)의 합성
세그먼트 1A
펩티드 합성: IL2(1-39)-Leu-α-케토산 세그먼트 1A(서열 번호 3의 잔기 1-40 참조)는 ~0.25 mmol/g의 치환 용량을 갖는 Fmoc-Leu-보호-α-케토산(0.8 g)으로 사전 로딩된 Rink-Amide MBHA 수지에서 0.2 mmol 규모로 합성하였다. 세그먼트 1A의 자동화 Fmoc-SPPS는 일반 절차 "고상 펩티드 합성( SPPS )"에 따라 수행하였다. 접합 핸들의 삽입은 다음과 같이 수행하였다. 첫 번째 수동 커플링 반응은 DMF 중 글루타르산 무수물(CAS RN 108-55-4, 114.10 mg, 5 당량) 및 DIPEA(242 ㎕, 7 당량)를 수지에 첨가하여 실온에서 30분 동안 수행하였다. 둘째, DMF 중 시판되는 O-(2-아미노에틸)-O'-(2-아지도에틸) 노나에틸렌 글리콜(화합물 2, 421 mg, 당량)과의 커플링을 DMF 중 DIPEA(276 ㎕, 8 당량) 및 HATU(300 mg, 3.95 당량)를 수지에 첨가하여 실온에서 3시간 동안 수행하였다. 수지를 DCM으로 세척하고 진공하에 건조시켰다. 건조된 펩티딜 수지의 질량은 1.6 g이었다. 95:2.5:2.5 TFA/DODT/H2O v/v/v(10 ㎖/g 수지)의 칵테일을 사용하여 실온에서 2.0시간 동안 절차 "펩티드의 수지 절단 및 측쇄 탈보호"에 따라 조 펩티드를 침전시켰다.
정제: C18 컬럼(5 μm, 50 x 250 mm), 60℃에서 유속 40 ㎖/분, 구배: 25분 내에 30%에서 80%까지의 B. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조시켜 세그먼트 1A를 97% 순도의 흰색 고체로 얻었다. 수지 로딩량을 기준으로 한 단리 수율은 260 mg(25%)이었다. HRMS (ESI): C228H394N64O72; 평균 동위원소 계산치 5182.9193 Da [M+H]+; 실측치: 5182.9111 Da [M+H]+.
조성물 A의 Opr -IL2(42-69) 광보호 -Leu-α- 케토산(세그먼트 2A)의 합성
세그먼트 2A
펩티드 합성: Opr-IL2(42-69)-Leu-광보호-α-케토산 세그먼트 2A(서열 번호 3의 41-70 참조)를 ~0.25mmol/g의 치환 용량을 갖는 Fmoc-Leu-광보호-α-케토산(0.8 g)이 사전 로딩된 Rink-Amide MBHA 수지에서 0.2 mmol 규모로 합성하였다. 세그먼트 2A의 자동화 Fmoc-SPPS는 일반 절차 "고상 펩티드 합성( SPPS )"에 따라 수행하였다. 수지를 DCM으로 세척하고 진공하에 건조시켰다. 건조된 펩티딜 수지의 질량은 1.8 g이었다. 95:2.5:2.5 TFA/DODT/H2O v/v/v(15 ㎖/g 수지)의 칵테일을 사용하여 실온에서 2시간 동안 절차 "펩티드의 수지 절단 및 측쇄 탈보호"에 따라 조 펩티드를 침전시켰다.
정제: C18 컬럼(5 μm, 50 x 250 mm), 유속 60℃에서 40 ㎖/분, 구배: 30분 내에 10%에서 60%까지의 B. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 세그먼트 2A를 97% 순도의 흰색 고체로 동결건조시켰다. 수지 로딩량을 기준으로 한 단리 수율은 203 mg(20%)이었다. HRMS(ESI): C184H286N40O52S; 평균 동위원소 계산치: 3922.0742 Da [M+H]+; 실측치: 3922.0680 Da [M+H]+.
조성물 A의 Fmoc - Opr IL2(72-102)- Phe -α- 케토산(세그먼트 3A)의 합성
세그먼트 3A
펩티드 합성: Fmoc-Opr IL2(72-102)-Phe-α-케토산 세그먼트 3A(서열 번호 3의 잔기 71-103 참조)는 ~0.286 mmol/g의 치환 용량을 갖는 Fmoc-Phe-광보호된-α-케토산(0.8 g)이 사전 로딩된 Rink-Amide ChemMatrix 수지에서 0.2 mmol 규모로 합성하였다. 세그먼트 3A의 자동화 Fmoc-SPPS는 일반 절차 "고상 펩티드 합성( SPPS )"에 따라 수행하였다. 수지를 DCM으로 세척하고 진공하에 건조시켰다. 건조된 펩티딜 수지의 질량은 2.17 g이었다. 95:2.5:2.5 TFA/DODT/H2O v/v/v(10 ㎖/g 수지)의 칵테일을 사용하여 실온에서 2.0시간 동안 절차 "펩티드의 수지 절단 및 측쇄 탈보호"에 따라 조 펩티드를 침전시켰다.
정제: C18 컬럼(5 μm, 50 x 250 mm), 40℃에서 유속 40 ㎖/분, 2단계 구배: 10분 내에 10%에서 30%까지의 B, 이어서 30분 내에 30%에서 80%까지의 B. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 세그먼트 3A를 98% 순도의 흰색 고체로 동결건조시켰다. 수지 로딩량을 기준으로 한 단리 수율은 200 mg(17.6%)이었다. HRMS(ESI): HRMS (ESI): C184H283N45O53; 평균 동위원소 계산치 3973.0891 Da [M+H]+; 실측치: 3973.0995 Da [M+H]+.
조성물 A의 IL-2 Opr -IL2(105-133)( 세그먼트 4A)의 합성
세그먼트 4A
펩티드 합성: Opr-IL2(105-133) 세그먼트 4A(서열 번호 3의 잔기 104-133 참조)는 ~0.34 mmol/g의 치환 용량을 가진 Fmoc-Thr-OH(0.294 g)가 사전 로딩된 Wang 수지에서 0.1 mmol 규모로 합성하였다. 세그먼트 4A의 자동화 Fmoc-SPPS는 일반 절차 "고체상 펩티드 합성( SPPS )"에 따라 수행하였다. 수지를 DCM으로 세척하고 진공하에 건조시켰다. 건조된 펩티딜 수지의 질량은 725 mg이었다. 92.5:2.5:2.5:2.5 TFA/TIPS/DODT/H2O v/v/v/v(10 ㎖/g)의 칵테일을 사용하여 실온에서 2시간 동안 절차 "펩티드의 수지 절단 및 측쇄 탈보호"에 따라 조 펩티드를 침전시켰다.
정제: C18 컬럼(5 μm, 50 x 250 mm), 40℃에서 유속 40 ㎖/분, 구배: 40분 내에 10%에서 50%까지의 B. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 세그먼트 4A를 90.8% 순도의 흰색 고체로 동결건조시켰다. 수지 로딩량을 기준으로 한 단리 수율은 40 mg(8%)이었다. HRMS(ESI): C158H241N37O52S; 평균 동위원소 계산치 1175.2449 Da [M+H]+3; 실측치: 1175.2440 [M+H]+3.
조성물 A의 IL2- Seg12(세그먼트 12A)의 제조를 위한 KAHA 결찰
세그먼트 12A
결찰 및 광탈보호: 0.1M 옥살산을 함유한 9.5:0.5 v/v DMSO/H2O 용액 241 ㎕에 용해된 34 mg(6.56 μmol; 1.1 당량)의 세그먼트 1A 및 19 mg(4.9 μmol; 1.0 당량)의 세그먼트 2A를 사용하여 일반 절차 "IL-2 세그먼트 1 및 2의 결찰 및 광탈 보호"에 따라 세그먼트 12A를 얻었다.
정제: C18 컬럼(5 μm, 50 x 250 mm), 40℃에서 유속 40㎖/분, 2단계 구배: 5분 내에 10%에서 40%까지의 B, 이어서 30분 내에 40%에서 70%까지의 B. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조시켜 세그먼트 12A를 98% 순도의 흰색 고체로 얻었다. 단리 수율은 55%(25.5 mg)였다. HRMS(ESI): C400H667N103O119S; 평균 동위원소 계산치: 8855.2806 Da [M+H]+; 실측치: 8855.9008 Da [M+H]+.
조성물 A의 IL2- Seg34(세그먼트 34A)의 제조를 위한 KAHA 결찰
세그먼트 34A
결찰: 0.1 M 옥살산을 함유한 9.9:0.1 DMSO/H2O v/v 1100 ㎕에 용해된 69 mg(17.5 μmol; 1.1 당량)의 세그먼트 3A 및 59 mg(16.6 μmol; 1.0 당량)의 세그먼트 4A를 사용하여 일반 절차 "IL-2 세그먼트 3 및 4 및 Fmoc 탈보호의 결찰"에 따라 세그먼트 34A를 얻었다.
정제: C18 컬럼(5 μm, 50 x 250 mm), 40℃에서 유속 40 ㎖/분, 구배: 40분 내에 20%에서 60%까지의 B. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조시켜 세그먼트 34A를 95% 순도의 흰색 고체로 얻었다. 단리 수율은 33%(42.3 mg)였다. HRMS(ESI): C326H514N82O101S; 평균 동위원소 계산치 7229.7437 Da [M+ H]+; 실측치: 7229.7618 Da [M+ H]+.
조성물 A의 IL2 선형 단백질( 세그먼트 1234A)의 제조를 위한 최종 KAHA 결찰
세그먼트 1234A
결찰: 0.1M 옥살산을 함유한 9.5:0.5 DMSO/H2O v/v 220 ㎕에 용해된 45 mg(5.1 μmol; 1.2 당량)의 세그먼트 12A와 31 mg(16.6 μmol; 1.0 당량)의 세그먼트 34A를 사용하여 일반 절차 "최종 결찰"에 따라서 세그먼트 1234A를 얻었다.
정제: C18 컬럼(5 μm, 50 x 250 mm), 40℃에서 유속 40 ㎖/분, 구배: 30분 내에 30%에서 80%까지의 B. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조시켜 Acm 보호 세그먼트 1234A를 95% 순도의 흰색 고체로 얻었다. 단리 수율은 26%(18 mg)였다.
Acm 탈보호: 시스테인 잔기의 탈보호는 출발 물질로서 18 mg의 Acm 보호 세그먼트 1234A를 사용하여 일반 절차 "Acm 탈보호"에 따라 수행하였다.
정제: C18 컬럼(5μm, 20 x 250 mm), 유속 40℃에서 10 ㎖/분, 2단계 구배: 5분 내에 10%에서 30%까지의 B, 이어서 20분 내에 30%에서 95%까지의 B. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조시켜 세그먼트 1234A를 97% 순도의 흰색 고체로 얻었다. 단리 수율은 17%(11.6 mg)였다. HRMS(ESI): C719H1171N183O216S2; 평균 동위원소 계산치: 15898.5963 Da [M+H]+; 실측치: 15898.6118 Da [M+H]+.
조성물 A의 IL-2 선형 단백질의 폴딩
선형 단백질의 재배열: IL2-Seg1234-A 선형 단백질(11.7 mg, 0.736 μmol)을 0.1 M Tris 및 30 mM 환원 글루타티온을 함유한 수성 6M Gu·HCl에 용해시키고(15 μM 단백질 농도) 혼합물을 50℃에서 2시간 동안 부드럽게 진탕시켰다.
선형 재배열 단백질의 폴딩 (방법 1): 재배열 반응이 완료된 후, 샘플을 실온으로 냉각하고 0.1 M Tris 및 1.5 mM 산화 글루타티온, pH 8.0으로 희석하였다(5 μM 단백질 농도). 실온에서 20시간 동안 폴딩이 진행되도록 하였다. 그런 다음, 샘플을 TFA를 사용하여 pH 3으로 산성화하고 이동상으로 0.1% TFA(v/v)를 포함한 CH3CN/H2O를 사용하여 유속 10.0 ㎖/분으로 60분 내에 0.1% TFA를 포함한 아세토니트릴 5% ~ 40% ~ 95%의 2단계 구배로 실온에서 유지되는 C4 컬럼(20 x 250 mm)을 사용한 분취용 HPLC로 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조시켜 순수한 폴딩된 단백질 조성물 A를 98% 순도의 흰색 고체로 제공하였다(2.2 mg, 폴딩 및 정제 단계에 대해 19% 수율). 순수한 단백질의 순도 및 정체는 분석용 RP-HPLC, MALDI-TOF 및 분석용 크기 배제에 의해 확인하였다. HRMS(ESI): C719H1169N183O216S2; 평균 동위원소 계산치: 15896.5806 Da [M+ H]+; 실측치: 15896.6322 Da [M+ H]+
IL-2 단백질 조성물 A1의 합성
IL-2 조성물 폴딩된 단백질(39.76 mg, 1 당량)을 먼저 8 ㎖의 10 mM 아세트산 나트륨 완충액, 8.4% 수크로오스, 0.02% 폴리소르베이트80(pH 5.0)에 용해시켰다. 용액에 22 ㎖ 50 mM 아세트산 나트륨 완충제(pH 5.0) 및 30 kDa DBCO-폴리에틸렌 글리콜 중합체(392.05 mg, 5 당량)를 보충하고 반응물을 25℃에서 17시간 동안 부드럽게 혼합하였다. 반응 혼합물을 HiTrap Capto S ImpAct 컬럼(5 ㎖)에 한 번에 10 ㎖ 로딩하고 50 mM 아세트산나트륨 완충액(pH 5.0)에서 1M NaCl이 포함된 50 mM 아세트산나트륨 완충액까지 20CV의 구배를 사용하여 2.5 ㎖/분의 유속으로 정제하였다. IL-2 조성물 A1 PEG화 단백질을 함유하는 분획을 함께 모으고 10 mM 아세트산나트륨 완충액, 8.4% 수크로오스, 0.02% 폴리소르베이트80(pH 5.0)에 대해 투석하여 BCA에 의해 결정된 바와 같이 12.26 mg의 단백질 분획 IL-2 조성물 A1 PEG화 단백질을 얻었다(PEG화 및 정제 단계에 대해 31% 수율). 순수한 PEG화 단백질의 순도와 정체는 분석용 RP-HPLC, MALDI-TOF 및 분석용 크기 배제에 의해 확인하였다.
실시예 3 IL-2의 조성물 B 및 B1 변이체의 합성
이 변이체의 경우, 세그먼트 3을 제외한 다른 모든 세그먼트는 조성물 A에 사용된 세그먼트와 동일하다.
조성물 B의 Fmoc - Opr IL2(72-102)- Phe -α- 케토산(세그먼트 3B)의 합성
Fmoc-Opr IL2(72-102)-Phe-α-케토산 세그먼트 3B(서열 번호 4의 잔기 71-103 참조)는 세그먼트 3A에 대한 합성에 대해 설명된 절차와 유사하게 자동화 Fmoc-SPPS 합성에 의해 합성하여 세그먼트 3B를 >98% 순도의 흰색 고체로 생성하였다. 수지 로딩량을 기준으로 한 단리 수율은 18%(200 mg)였다. HRMS(ESI): C184H284N46O52; 평균 동위원소 계산치 3972.1051 Da [M+H]+; 실측치: 3972.1054 Da [M+H]+.
KAHA 결찰에 의한 조성물 B의 IL2- Seg34의 합성
결찰: 0.1 M 옥살산을 함유한 9.8:0.2 DMSO/H2O v/v 517 ㎕에 용해된 37 mg(9.3 μmol; 1.2 당량)의 세그먼트 3B 및 27 mg(7.8 μmol; 1.0 당량)의 세그먼트 4A를 사용하여 일반 절차 "IL-2 세그먼트 3 및 4의 결찰 및 Fmoc 탈보호"에 따라 세그먼트 34B를 얻었다.
정제: C18 컬럼(5 μm, 50 x 250 mm), 40℃에서 유속 40 ㎖/분, 2단계 구배: 5분 내에 10%에서 40%까지의 B, 이어서 35분 내에 40%에서 80%까지의 B. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조시켜 세그먼트 34B를 >99% 순도의 흰색 고체로 얻었다. 단리 수율은 22%(12.6 mg)였다. HRMS(ESI): C326H515N83O100S; 평균 동위원소 계산치 7228.7597 Da [M+ H]+; 실측치: 7228.7738 Da [M+ H]+.
조성물 B의 IL2 선형 단백질( 세그먼트 1234B)의 제조를 위한 최종 KAHA 결찰
결찰: 0.1 M 옥살산을 함유한 9.5:0.5 DMSO/H2O v/v 214 ㎕에 용해된 34 mg(3.8 μmol; 1.2 당량)의 세그먼트 12A 및 23 mg(3.2 μmol; 1.0 당량)의 세그먼트 34B를 사용하여 일반 절차 "최종 결찰"에 따라 세그먼트 1234B를 얻었다.
정제: C18 컬럼(5 μm, 50 x 250mm), 40℃에서 유속 40 ㎖/분, 2단계 구배: 5분 내에 10%에서 40%까지의 B, 이어서 35분 내에 40%에서 80%까지의 B. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조시켜 Acm 보호 세그먼트 1234B를 96% 순도의 흰색 고체로 얻었다. 단리 수율은 52%(26.8 mg)였다. HRMS(ESI): C725H1182N186O217S2; 평균 동위원소 계산치 16039.6865 Da [M+H]+; 실측치: 16039.6389 Da [M+H]+.
Acm 탈보호: 시스테인 잔기의 탈보호는 출발 물질로서 26.8 mg의 Acm 보호 세그먼트 1234B를 사용하여 일반 절차 "Acm 탈보호"에 따라 수행하였다.
정제: C18 컬럼(5 μm, 20 x 250 mm), 40℃에서 유속 10 ㎖/분, 2단계 구배: 5분 내에 10%에서 30%까지의 B, 이어서 30분 내에 30%에서 95%까지의 B. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조시켜 세그먼트 1234B를 97% 순도의 흰색 고체로 얻었다. 단리 수율은 55%(14.5 mg)였다. HRMS(ESI): C719H1172N184O215S2; 평균 동위원소 계산치: 15897.6117 Da [M+H]+; 실측치: 15897.6195 Da [M+H]+.
조성물 B의 IL-2 선형 단백질의 폴딩
선형 단백질의 재배열: IL2-Seg1234-B 선형 단백질(14.5 mg, 0.913 μmol)을 0.1 M Tris 및 30 mM 환원 글루타티온을 함유한 수성 6M Gu·HCl에 용해시키고(61 ㎖, 15 μM 단백질 농도) 혼합물을 50℃에서 2시간 동안 부드럽게 진탕시켰다.
선형 재배열 단백질의 폴딩: 재배열 반응이 완료된 후, 샘플을 실온으로 냉각하고 0.1 M Tris 및 1.5 mM 산화 글루타티온, pH 8.0으로 희석하였다(122 ㎖, 5 μM 단백질 농도). 실온에서 20시간 동안 폴딩이 진행되도록 하였다. 그런 다음 샘플을 TFA를 사용하여 pH 3으로 산성화하고 유속 10.0 ㎖/분에서 5분 내에 10%에서 30%까지의 B, 이어서 30분 내에 30%에서 95%까지의 B의 2단계 구배로 실온에서 유지되는 C4 컬럼(20 x 250 mm)을 사용한 분취용 HPLC로 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조시켜 순수한 폴딩된 IL2-Seg1234-B 단백질을 >98% 순도의 백색 분말로 얻었다(3.9 mg, 폴딩 및 정제 단계에 대해 27% 수율). HRMS(ESI): C719H1170N184O215S2; 평균 동위원소 계산치: 15895.5966 Da [M+H]+; 실측치: 15895.5669 Da [M+H]+.
IL-2 단백질 조성물 B1의 합성
1:1 CH3CN:H2O 중 IL2-Seg1234-B(2 mg, 0.126 μmol, 1 당량)의 용액(50 mM 단백질 농도)에 30 kDa DBCO-폴리에틸렌 글리콜 중합체(11.7 mg, 0.403 μmol, 3.2 당량)를 첨가하고 반응물을 25℃에서 20시간 동안 부드럽게 혼합하였다. 반응 혼합물을 1:1 CH3CN/H2O + 0.1% TFA로 희석하고 유속 10.0㎖/분에서 5분 내에 10%에서 30%까지의 B, 이어서 30분 내에 30%에서 95%까지의 B의 2단계 구배로 C4 컬럼(20 x 250 mm)을 사용하는 분취용 HPLC에서 정제하였다. PEG화 IL2-Seg1234-B1 단백질을 함유하는 분획을 함께 모으고 동결건조시켜 2.5 mg의 IL2-Seg1234-B1 PEG화 단백질을 98% 순도의 흰색 분말로 얻었다(PEG화 및 정제 단계에 대해 29% 수율). 순수한 PEG화 단백질의 순도와 정체는 분석용 RP-HPLC, MALDI-TOF, SEC-HPLC 및 SDS-page에 의해 확인하였다.
실시예 4 IL-2의 조성물 C 및 C1 변이체의 합성
이 변이체의 경우, 세그먼트 2를 제외한 다른 모든 세그먼트는 조성물 A에 사용된 세그먼트와 동일하다.
조성물 C의IL -2 Fmoc - Opr IL2(42-69)-Leu-α- 케토산(세그먼트 2C)의 합성
Opr-IL2(42-69)-Leu-광보호-α-케토산 세그먼트 2C(서열 번호 5의 잔기 41-70 참조)는 세그먼트 2A의 합성에 대해 설명된 절차와 유사하게 자동화 Fmoc-SPPS 합성에 의해 합성하여 세그먼트 2C를 94% 순도의 흰색 고체로 생성하였다. 수지 로딩량을 기준으로 한 단리 수율은 19.7%(153.7 mg)였다. MALDI-TOF를 사용하여 원하는 생성물 질량이 얻어졌는지 확인하였다.
KAHA 결찰에 의한 조성물 C의 IL2- Seg12(세그먼트 12C)의 합성
결찰 및 광탈보호: 0.1 M 옥살산을 함유한 9.5:0.5 v/v DMSO/H2O 용액 1157 ㎕에 용해된 90 mg의 세그먼트 1A(17.4 μmol; 1.1 당량) 및 56 mg(14.5 μmol; 1.0 당량)의 세그먼트 2C를 사용하여 일반 절차 "IL-2 세그먼트 1 및 2의 결찰 및 광탈보호"에 따라 세그먼트 12C를 얻었다.
정제: C18 컬럼(5 μm, 50 x 250 mm), 40℃에서 유속 40 ㎖/분, 2단계 구배: 5분 내에 10%에서 40%까지의 B, 이어서 30분 내에 40%에서 70%까지의 B. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조시켜 세그먼트 12C를 >99% 순도의 흰색 고체로 얻었다. 단리 수율은 36%(46.7 mg)였다.
조성물 C의 IL2 선형 단백질( 세그먼트 1234C)의 제조를 위한 최종 KAHA 결찰
결찰: 0.1 M 옥살산을 함유한 9.5:0.5 DMSO/H2O v/v의 683 ㎕에 용해된 46.7 mg(5.24 μmol; 1.2 당량)의 세그먼트 12C 및 32 mg(4.41 μmol; 1.0 당량)의 세그먼트 34A를 사용하여 일반 절차 "최종 결찰"에 따라 세그먼트 1234C를 얻었다.
정제: C18 컬럼(5 μm, 50 x 250 mm), 유속 60℃에서 40 ㎖/분, 구배: 30분 내에 30%에서 80%까지의 B. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조시켜 Acm 보호 세그먼트 1234C를 백색 고체로 얻었다. 단리 수율은 34%(24.5 mg)였다.
Acm 탈보호: 시스테인 잔기의 탈보호는 출발 물질로서 24.5 mg의 Acm 보호 세그먼트 1234C를 사용하여 일반 절차 "Acm 탈보호"에 따라 수행하였다.
정제: C18 컬럼(5 μm, 20 x 250 mm), 40℃에서 유속 10 ㎖/분, 2단계 구배: 5분 내에 10%에서 30%까지의 B, 이어서 30분 내에 30%에서 95%까지의 B. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조시켜 세그먼트 1234C를 94% 순도의 흰색 고체로 얻었다. 단리 수율은 69%(16.6 mg)였다. HRMS(ESI): C717H1167N183O216S2; 평균 동위원소 계산치: 15870.5650 Da [M+H]+; 실측치: 15870.6232 Da [M+H]+.
조성물 C의 IL-2 선형 단백질의 폴딩
선형 단백질의 재배열: IL2-Seg1234-C 선형 단백질(16.6 mg, 1.04 μmol)을 0.1 M Tris 및 30 mM 환원 글루타티온을 함유한 수성 6M Gu·HCl에 용해시키고(69 ㎖, 15 μM 단백질 농도) 혼합물을 50℃에서 2시간 동안 부드럽게 진탕시켰다.
선형 재배열 단백질의 폴딩: 재배열 반응이 완료된 후, 샘플을 실온으로 냉각하고 0.1 M Tris 및 1.5 mM 산화 글루타티온, pH 8.0으로 희석하였다(140 ㎖, 5 μM 단백질 농도). 실온에서 20시간 동안 폴딩이 진행되도록 하였다. 그런 다음 샘플을 TFA를 사용하여 pH 3으로 산성화하고 유속 10.0 ㎖/분에서 5분 내에 10%에서 30%까지의 B, 이어서 30분 내에 30%에서 95%까지의 B의 2단계 구배로 실온에서 유지되는 C4 컬럼(20 x 250 mm)을 사용하는 분취용 HPLC로 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조시켜 순수한 폴딩된 IL2-Seg1234-C 단백질을 >99% 순도의 흰색 분말로 제공하였다(3.4mg, 폴딩 및 정제 단계에 대해 20.5% 수율). HRMS(ESI): C717H1165N183O216S2; 평균 동위원소 계산치: 15868.5493 Da [M+H]+; 실측치: 15868.5979 Da [M+H]+.
IL-2 단백질 조성물 C1의 합성
1:1 CH3CN:H2O 중 IL2-Seg1234-C(2 mg, 1 당량)의 용액(50 μM 단백질 농도)에 30 kDa DBCO-폴리에틸렌 글리콜 중합체(11.0 mg, 3 당량)를 첨가하고 반응물을 25℃에서 20시간 동안 부드럽게 혼합하였다. 반응 혼합물을 1:1 CH3CN/H2O + 0.1% TFA로 희석하고 10.0 ㎖/분의 유속에서 5분 내에 10%에서 30%까지의 B, 이어서 30분 내에 30%에서 95%까지의 B의 2단계 구배로 C4 컬럼(20 x 250mm)을 사용하는 분취용 HPLC에서 정제하였다. PEG화 IL2-Seg1234-C1 단백질을 함유하는 분획을 함께 모으고 동결건조시켜 1.4 mg의 IL2-Seg1234-C1 PEG화 단백질을 >99% 순도의 흰색 분말로 얻었다(PEG화 및 정제 단계에 대해 25% 수율). 순수한 PEG화 단백질의 순도와 정체는 분석용 RP-HPLC 및 MALDI-TOF에 의해 확인하였다.
실시예 5: IL-2의 조성물 D 및 D1 변이체의 합성
이 변이체의 경우, 세그먼트 1을 제외하고 다른 모든 세그먼트는 조성물 B에 사용된 세그먼트와 동일하다.
조성물 D의 IL-2(1-39)-Leu-α- 케토산(세그먼트 1D)의 합성
IL2(1-39)-Leu-α-케토산 세그먼트 1D(서열 번호 6의 잔기 1-40 참조)는 세그먼트 1A의 합성에 대해 설명된 절차와 유사하게 자동화 Fmoc-SPPS 합성에 의해 합성하여 세그먼트 1D를 98% 순도의 흰색 고체로 생성하였다. 수지 로딩량을 기준으로 한 단리 수율은 20%(209 mg)였다. MALDI-TOF를 사용하여 원하는 생성물 질량이 얻어졌는지 확인하였다.
KAHA 결찰에 의한 조성물 D의 IL2- Seg12(세그먼트 12D)의 합성
결찰 및 광탈보호: 0.1 M 옥살산을 함유한 9.5:0.5 v/v DMSO/H2O 용액 780 ㎕에 용해된 60 mg(11.7 μmol; 1.1 당량)의 세그먼트 1D 및 38 mg(9.7 μmol; 1.0 당량)의 세그먼트 2A를 사용하여 "IL-2 세그먼트 1 및 2의 결찰 및 광탈보호"라는 일반 절차에 따라 세그먼트 12D를 얻었다.
정제: C18 컬럼(5 μm, 50 x 250 mm), 40℃에서 유속 40 ㎖/분, 2단계 구배: 5분 내에 10%에서 40%까지의 B, 이어서 30분 내에 40%에서 70%까지의 B. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조시켜 세그먼트 12D를 흰색 고체로 얻었다. 단리 수율은 54%(46.2 mg)였다. HRMS(ESI): C397H661N103O119S; m/z 계산치: 8812.8698 Da [M+H]+; 실측치: 8812.8833 Da [M+H]+.
조성물 D의 IL2 선형 단백질( 세그먼트 1234D)의 제조를 위한 최종 KAHA 결찰
결 찰 : 0.1 M 옥살산을 함유한 9.5:0.5 DMSO/H2O v/v 270 ㎕에 용해된 35.2 mg(5.24 μmol; 1.2 당량)의 세그먼트 12D 및 26 mg(3.62 μmol; 1.0 당량)의 세그먼트 34B를 사용하여 일반 절차 "최종 결찰"에 따라 세그먼트 1234D를 얻었다.
정제: C18 컬럼(5 μm, 50 x 250 mm), 유속 60℃에서 40 ㎖/분, 구배: 30분 내에 30%에서 80%까지의 B. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조시켜 Acm 보호 세그먼트 1234D를 백색 고체로 얻었다. 단리 수율은 26%(15 mg)였다.
Acm 탈보호: 시스테인 잔기의 탈보호는 출발 물질로서 15 mg(0.95 μmol)의 Acm 보호 세그먼트 1234D를 사용하여 일반 절차 "Acm 탈보호"에 따라 수행하였다.
정제: C18 컬럼(5 μm, 20 x 250 mm), 유속 40℃에서 10 ㎖/분, 2단계 구배: 5분 내에 10%에서 30%까지의 B, 이어서 30분 내에 30%에서 95%까지 B. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조시켜 세그먼트 1234D를 94% 순도의 흰색 고체로 얻었다. 단리 수율은 80%(12 mg)였다. HRMS(ESI): C716H1166N184O215S2; 평균 동위원소 계산치: 15855.5653 Da [M+H]+; 실측치: 15855.5300 Da [M+H]+.
조성물 D의 IL-2 선형 단백질의 폴딩
선형 단백질의 재배열: IL2-Seg1234-D 선형 단백질(9 mg, 0.568 μmol)을 0.1 M Tris 및 30 mM 환원 글루타티온을 함유한 수성 6M Gu·HCl에 용해시키고(38 ㎖, 15 μM 단백질 농도) 혼합물을 50℃에서 2시간 동안 부드럽게 진탕시켰다.
선형 재배열 단백질의 폴딩: 재배열 반응이 완료된 후, 샘플을 실온으로 냉각하고 0.1 M Tris 및 1.5 mM 산화 글루타티온, pH 8.0으로 희석하였다(76 ㎖, 5 μM 단백질 농도). 실온에서 44시간 동안 폴딩이 진행되도록 하였다. 그런 다음, 샘플을 TFA를 사용하여 pH 3으로 산성화하고 10.0 ㎖/분의 유속에서 5분 내에 10%에서 30%까지의 B, 이어서 30분 내에 30%에서 95%까지의 B의 2단계 구배로 실온에서 유지되는 Shiseido ProteonAvi C4 컬럼(20 x 250 mm)을 사용하는 분취용 HPLC로 정제하였다. 생성물을 함유한 분획을 모으고 동결건조시켜 폴딩된 IL2-Seg1234-D를 >98% 순도의 흰색 고체로 제공하였다(0.3 mg, 폴딩 및 정제 단계에 대해 3% 수율).
IL-2 단백질 조성물 D1의 합성
1:1 CH3CN:H2O 중 IL2-Seg1234-D(0.3 mg, 1 당량)의 용액(50 μM 단백질 농도)에 30 kDa DBCO-폴리에틸렌 글리콜 중합체(1.8 mg, 3.2 당량)를 첨가하고 반응물을 25℃에서 20시간 동안 부드럽게 혼합하였다. 반응 혼합물을 1:1 CH3CN/H2O + 0.1% TFA로 희석하고 10.0 ㎖/min의 유속에서 5분 내에 10%에서 30%까지의 B, 이어서 30분 내에 30%에서 95%까지의 B의 2단계 구배로 C4 컬럼(20 x 250 mm)을 사용하는 분취용 HPLC에서 정제하였다. PEG화 IL2-Seg1234-D1 단백질을 함유하는 분획을 함께 모으고 동결건조시켜 0.1 mg의 IL2-Seg1234-D1 PEG화 단백질을 >98% 순도의 흰색 분말로 얻었다(PEG화 및 정제 단계에 대해 11% 수율).
순수한 PEG화 단백질의 순도 및 정체는 분석용 RP-HPLC, MALDI-TOF에 의해 확인하였다.
실시예 6: IL-2의 조성물 E 및 E1 변이체의 합성
이 변이체의 경우, 세그먼트 1을 제외하고 다른 모든 세그먼트는 조성물 B에 사용된 세그먼트와 동일하다.
조성물 E의 IL-2(1-39)-Leu-α- 케토산(세그먼트 1E)의 합성
IL2(1-39)-Leu-α-케토산 세그먼트 1E(서열 번호 7의 잔기 1-40 참조)는 세그먼트 1A의 합성에 대해 설명된 절차와 유사하게 자동화 Fmoc-SPPS 합성에 의해 합성하여 세그먼트 1E를 97% 순도의 흰색 고체로 생성하였다. 수지 로딩량을 기준으로 한 단리 수율은 17%(180 mg)였다. HRMS(ESI): C225H388N64O72; 평균 동위원소 계산치 5140.87247 Da [M+H]+; 실측치: 5141.8699 Da [M+H]+.
KAHA 결찰에 의한 조성물 E의 IL2- Seg12(세그먼트 12E)의 합성
결찰 및 광탈보호: 0.1 M 옥살산을 함유한 9.5:0.5 v/v DMSO/H2O 용액 780 ㎕에 용해된 60 mg(11.7μ mol; 1.1 당량)의 세그먼트 1E 및 38 mg(9.7 μmol; 1.0 당량)의 세그먼트 2A를 사용하여 일반 절차 "IL-2 세그먼트 1 및 2의 결찰 및 광탈 보호"에 따라 세그먼트 12E를 얻었다.
정제: C18 컬럼(5 μm, 50 x 250 mm), 40℃에서 유속 40㎖/분, 2단계 구배: 5분 내에 10%에서 40%까지의 B, 이어서 30분 내에 40%에서 70%까지의 B. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조시켜 세그먼트 12E를 흰색 고체로 얻었다. 단리 수율은 55%(33.4 mg)였다. HRMS(ESI): C397H661N103O119S; m/z 계산치: 8812.8698 Da [M+H]+; 실측치: 8812.8833 Da [M+H]+.
조성물 E의 IL2 선형 단백질( 세그먼트 1234E)의 제조를 위한 최종 KAHA 결찰
결찰: 0.1 M 옥살산을 함유한 9.5:0.5 DMSO/H2O v/v 256 ㎕ 에 용해된 17.5 mg(1.98 μmol; 1.2 당량)의 세그먼트 12E 및 12 mg(1.66 μmol; 1.0 당량)의 세그먼트 34B를 사용하여 일반 절차 "최종 결찰"에 따라 세그먼트 1234E를 얻었다.
정제: C18 컬럼(5 μm, 50 x 250 mm), 유속 60℃에서 40 ㎖/분, 구배: 30분 내 30% 내지 80%까지의 B. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조시켜 Acm 보호 세그먼트 1234E를 흰색 고체로 얻었다. 단리 수율은 22%(6.6 mg)였다. MALDI-TOF를 사용하여 원하는 생성물 질량이 얻어졌는지 확인하였다.
Acm 탈보호: 시스테인 잔기의 탈보호는 출발 물질로서 6.6 mg(0.37 μmol)의 Acm 보호 세그먼트 1234E를 사용하여 일반 절차 "Acm 탈보호"에 따라 수행하였다.
정제: C18 컬럼(5 μm, 20 x 250 mm), 유속 40℃에서 10 ㎖/분, 2단계 구배: 5분 내에 10%에서 30%까지의 B, 이어서 30분 내에 30%에서 95%까지의 B. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조시켜 세그먼트 1234E를 94% 순도의 흰색 고체로 얻었다. 단리 수율은 98%(5.8 mg)였다. HRMS(ESI): C716H1166N184O215S2; 평균 동위원소 계산치: 15855.5653 Da [M+H]+; 실측치: 15855.5479 Da [M+H]+.
조성물 E의 IL-2 선형 단백질의 폴딩
선형 단백질의 재배열: IL2-Seg1234-E 선형 단백질(5.8 mg, 0.366 μmol)을 0.1 M Tris 및 30 mM 환원 글루타티온을 함유한 수성 6M Gu·HCl에 용해시키고(24 ㎖, 15 μM 단백질 농도) 혼합물을 50℃에서 2시간 동안 부드럽게 진탕시켰다.
선형 재배열 단백질의 폴딩: 재배열 반응이 완료된 후, 샘플을 실온으로 냉각하고 0.1 M Tris 및 1.5 mM 산화 글루타티온, pH 8.0으로 희석하였다(48 ㎖, 5 μM 단백질 농도). 실온에서 20시간 동안 폴딩이 진행되도록 하였다. 그런 다음 샘플을 TFA를 사용하여 pH 3으로 산성화하고 유속 10.0 ㎖/분에서 5분 내에 10%에서 30%까지의 B, 이어서 30분 내에 30%에서 95%까지의 2단계 구배로 실온에서 유지되는 C4 컬럼(20 x 250 mm)을 사용하는 분취용 HPLC로 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조시켜 폴딩된 IL2-Seg1234-E를 >98% 순도의 흰색 고체로 제공하였다(0.6 mg, 폴딩 및 정제 단계에 대해 10% 수율).
IL-2 단백질 조성물 E1의 합성
1:1 CH3CN:H2O 중 IL2-Seg1234-E(0.6 mg, 1 당량)의 용액(50 μM 단백질 농도)에 30 kDa DBCO-mPEG(3 mg, 2.7 당량)를 첨가하고 반응물을 25℃에서 20시간 동안 부드럽게 혼합하였다. 반응 혼합물을 1:1 CH3CN/H2O + 0.1% TFA로 희석하고 10.0 ㎖/min의 유속에서 5분 내에 10%에서 30%까지의 B 이어서 30분 내에 30%에서 95%까지의 B의 2단계 구배로 Shiseido Proteonavi C4 컬럼(20 x 250 mm)을 사용하는 분취용 HPLC에 의해 정제하였다. PEG화 IL2-Seg1234-E1 단백질을 함유하는 분획을 함께 모으고 동결건조시켜 0.2 mg의 IL2-Seg1234-E1 PEG화 단백질을 >98% 순도의 흰색 분말로 얻었다(PEG화 및 정제 단계에 대해 12% 수율). 순수한 PEG화 단백질의 순도와 정체는 분석용 RP-HPLC, MALDI-TOF에 의해 확인하였다.
실시예 7: 조성물 F의 합성
이 변이체의 경우, 세그먼트 2를 제외한 다른 모든 세그먼트는 조성물 B에 사용된 세그먼트와 동일하다.
조성물 F의 Opr -IL2(42-69)-Leu- 광보호 -α- 케토산(세그먼트 2F)의 합성
Opr-IL2(42-69)-Leu-광보호-α-케토산 세그먼트 2F(서열 번호 8의 잔기 1-40 참조)는 세그먼트 2A의 합성에 대해 설명된 절차와 유사하게 자동화 Fmoc-SPPS 합성에 의해 합성하여 세그먼트 2F를 99% 순도의 흰색 고체로 생성하였다. 수지 로딩량을 기준으로 한 단리 수율은 35%(269 mg)였다. HRMS(ESI): C181H280N40O52S; m/z 계산: 3880.0273 Da [M+H]+; 실측치: 3880.0207 Da [M+H]+.
KAHA 결찰에 의한 조성물 F의 IL2- Seg12(세그먼트 12F)의 합성
결찰 및 광탈보호: 0.1 M 옥살산을 함유한 9.5:0.5 v/v DMSO/H2O 용액 385 ㎕에 용해된 34 mg(6.6 μmol; 1.1 당량)의 세그먼트 1A 및 19 mg(4.9 μmol; 1.0 당량)의 세그먼트 2F를 사용하여 일반 절차 "IL-2 세그먼트 1 및 2의 결찰 및 광탈보호"에 따라 세그먼트 12F를 얻었다.
정제: C18 컬럼(5 μm, 50 x 250 mm), 40℃에서 유속 40㎖/분, 2단계 구배: 5분 내에 10%에서 40%까지의 B, 이어서 30분 내에 40%에서 70%까지의 B. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조시켜 세그먼트 12F를 96% 순도의 흰색 고체로 얻었다. 단리 수율은 59%(25.5 mg)였다. MALDI-TOF를 사용하여 원하는 생성물 질량이 얻어졌는지 확인하였다.
조성물 F의 IL2 선형 단백질( 세그먼트 1234F)의 제조를 위한 최종 KAHA 결찰
결찰: 0.1 M 옥살산을 함유한 9.5:0.5 DMSO/H2O v/v 373 ㎕에 용해된 25.5 mg(2.89 μmol; 1.2 당량)의 세그먼트 12F 및 17.5 mg(2.42 μmol; 1.0 당량)의 세그먼트 34B를 사용하여 일반 절차 "최종 결찰"에 따라 세그먼트 1234F를 얻었다.
정제: C18 컬럼(5 μm, 50 x 250 mm), 유속 60℃에서 40 ㎖/분, 구배: 30분 내에 30%에서 80%까지의 B. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조시켜 Acm 보호 세그먼트 1234F를 백색 고체로 얻었다. 단리 수율은 31%(12 mg)였다. MALDI-TOF를 사용하여 원하는 생성물 질량이 얻어졌는지 확인하였다.
Acm 탈보호: 시스테인 잔기의 탈보호는 출발 물질로서 12 mg(0.75 μmol)의 Acm 보호 세그먼트 1234F를 사용하여 일반 절차 "Acm 탈보호"에 따라 수행하였다.
정제: C18 컬럼(5 μm, 20 x 250 mm), 40℃에서 유속 10 ㎖/분, 2단계 구배: 5분 내에 10%에서 30%까지의 B, 이어서 30분 내에 30%에서 95%까지의 B. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조시켜 세그먼트 1234F를 94% 순도의 흰색 고체로 얻었다. 단리 수율은 73%(8.7 mg)였다. HRMS(ESI): C716H1166N184O215S2; 평균 동위원소 계산치: 15855.5653 Da [M+H]+; 실측치: 15855.6061 Da [M+H]+.
조성물 F의 IL-2 선형 단백질의 폴딩
선형 단백질의 재배열: IL2-Seg1234-F 선형 단백질(8.7 mg, 0.549 μmol)을 0.1 M Tris 및 30 mM 환원 글루타티온을 함유한 수성 6M Gu·HCl에 용해시키고(37 ㎖, 15 μM 단백질 농도) 혼합물을 50℃에서 2시간 동안 부드럽게 진탕시켰다.
선형 재배열 단백질의 폴딩: 재배열 반응이 완료된 후, 샘플을 실온으로 냉각하고 0.1 M Tris 및 1.5 mM 산화 글루타티온, pH 8.0으로 희석하였다(80 ㎖, 5 μM 단백질 농도). 실온에서 44시간 동안 폴딩이 진행되도록 하였다. 그런 다음 샘플을 TFA를 사용하여 pH 3으로 산성화하고 유속 10.0 ㎖/분에서 5분 내에 10%에서 30%까지의 B, 이어서 30분 내에 30%에서 95%까지의 2단계 구배로 실온에서 유지되는 C4 컬럼(20 x 250 mm)을 사용하는 분취용 HPLC로 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조시켜 순수한 폴딩된 IL2-Seg1234-F를 제공하였다(0.2 mg, 폴딩 및 정제 단계에 대해 2% 수율). 순수한 폴딩된 단백질의 순도와 정체는 분석용 RP-HPLC 및 MALDI-TOF에 의해 확인하였다.
실시예 8: 비접합 및 PEG화 IL-2 변이체에 의한 STAT5의 선택적 활성화
IL-2R의 결합은 신호 변환기 및 전사 활성화인자 5(STAT5)의 인산화를 초래하며 이를 T 세포 하위세트에 대한 선택성을 평가하기 위한 판독값으로 사용할 수 있다. 1차 범 T 세포는 피콜 구배 원심분리를 사용한 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 정제에 이어 자성 비드를 사용한 음성 단리에 의해 건강한 기증자 연막으로부터 얻은 다음 추가 사용 시까지 냉동보존하였다. 범 T 세포를 해동하고 T 세포 배지(RPMI 10% FCS, 1% 글루타민, 1% NEAA, 25 μM βMeoH, 1% 피루브산 나트륨)에서 밤새 인큐베이션한 후 PBS로 2회 세척하였다. 세포를 PBS에 재현탁하고 웰당 200,000개 세포로 분배한 후 알데스류킨, 비접합 IL-2 폴리펩티드(조성물 A), PEG화 IL-2 폴리펩티드(조성물 A1), 또는 본 문서에 제공된 표시된 또 다른 변이체와 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, Transcription Factor Phospho Buffer 키트를 사용하여 세포를 고정하고 투과화시킨 후 CD4, CD8, CD25, FoxP3 및 pSTAT5에 대한 표면 및 세포내 면역염색을 수행하여 세포 하위세트 식별 및 STAT5 인산화 수준 측정을 가능하게 하였다. FACS 측정은 Acea의 NovoCyte 또는 Quanteon 유세포 분석기를 사용하여 수행하였다. Treg는 CD4+CD25+FoxP3+ 세포로 분류되었고 Teff는 CD8+ T 세포로 분류되었다. 다양한 면역 세포 유형에서 표시된 변이체로부터의 STAT5 인산화 분석의 EC50 결과를 아래 표 6에 나타낸다.
[표 6]
비접합(조성물 A) 및 PEG화 IL-2 폴리펩티드(조성물 A1) 모두 Treg에서 STAT5를 선택적으로 활성화하였고(도 4b) Teff 세포에서 STAT5 활성화에 거의 영향을 미치지 않았다(도 4a). 반면, 알데스류킨은 Treg와 Teff 세포 모두에서 STAT5를 비선택적으로 활성화하였다. PEG화 IL-2 폴리펩티드(조성물 A1)에 대한 STAT5 활성화 효력은 비접합 IL-2 폴리펩티드(조성물 A)에 대한 것보다 낮았으며, 이는 PEG화로 인해 활성이 약간 감소한다는 것을 시사하였다.
추가로, 비접합 및 PEG화 IL-2 폴리펩티드는 모두 인간 Treg에 대한 것과 비슷한 효력으로 마우스 및 시노몰구스 원숭이의 Treg에서 STAT5를 활성화하였으며, 이는 마우스 및 시노몰구스 IL-2R에 대한 교차 반응성을 입증하였다(표 7).
[표 7]
실시예 9: IL-2 수용체의 α 및 β 서브유닛에 대한 PEG화 IL-2 폴리펩티드(조성물 A1)의 결합 친화도
IL-2R 알파 및 베타 서브유닛에 대한 PEG화 IL-2 폴리펩티드(조성물 A1) 및 서열 번호 2(알데스류킨)의 결합 친화도를 생물층 간섭계(BLI) 기술을 사용하여 측정하였다. 비오틴화 IL-R2α 및 β(R&D, cat AVI10305-050 및 AVI10459-050)를 Streptavidin Biosensors SAX2에 개별적으로 로드하고 센서를 1x Octet® 동역학 완충액에 담가 기준선을 설정하였다. 센서를 분석물 용액에서 300초 동안 인큐베이션한 후, 동역학 완충액에서 600초 동안 인큐베이션하여 해리를 측정하였다. Octet® Analysis studio를 사용하여 Kd 값을 계산하였다. 조성물 A1은 알데스류킨보다 알파 서브유닛에 대해 더 높은 친화도를 갖는 반면(각각 2.37 nM 대 12.23 nM), 베타 서브유닛에 대한 결합은 제거되었다(도 5). 따라서 조성물 A1은 α-상승 β-사멸 IL-2 폴리펩티드를 나타낸다.
실시예 10: 마우스에서 조성물 A1에 대한 약동학/ 약력학 연구
단일 용량 약동학/약력학(PK/PD) 연구는 0.3 mg/kg 단백질 등량의 알데스류킨의 5회의 매일의 피하(sc) 주사 또는 0.1 또는 0.3 mg/kg의 PEG화 IL-2 폴리펩티드 조성물 A1의 단일 피하 주사를 받은 C57BL/6 마우스에서 수행하였다. 다양한 시점에서 혈액을 K2EDTA에 샘플링하였고, 혈장을 원심분리에 의해 생성하고 PK 분석까지 -80℃에서 보관하고 세포 펠릿을 유세포 분석을 위해 새로이 염색을 거쳤다.
세포 펠렛을 1 x Lyse/Fix 완충액(BD Bioscience, 558050)으로 10분 동안 처리하였다. 세척 후, 세포를 4℃에서 30분 동안 항-CD3, 항-CD335, 및 항-CD25 항체로 염색하였다. 그런 다음 차가운 BD Perm 완충액 III을 사용하여 세포를 투과화시키고 Ki67, Siglec-F, CD4, CD8, FoxP3, CD62L, CD44 또는 pSTAT5에 대한 항체로 염색하였다. FACS(형광 활성화 세포 분류) 측정은 BD의 Fortessa X-20 유세포 분석기를 사용하여 수행하였다. 각 세포 하위세트에 대해 pSTAT5 양성 세포의 백분율, 및Ki67 양성 세포의 백분율, 세포 카운트 및 세포 빈도를 결정하였다.
혈장 내 조성물 A1의 농도는 적격 인간 IL-2 LegendPlex 비드 분석(Biolegend, #740717, #740368, #740758)을 사용하여 결정하였다. PK 데이터는 Phoenix WinNonlin 소프트웨어 버전 6.3을 사용하여 비구획 PK 분석을 거쳤다. PK 매개변수를 얻는 데 선형/로그 사다리꼴 규칙을 적용하였다. 변형된 IL-2 폴리펩티드의 PK 프로파일(도 6)은 6시간에 최고조에 달했고, PEG화 덕분에 농도는 26 내지 30시간 사이의 긴 반감기와 함께 감소하였다. PK 매개변수(표 8)는 노출 시 용량 비례적 증가를 보였다. 이 PK 프로파일은 마우스에서의 반감기가 수분 이내인 것으로 보고된 야생형 폴리펩티드에 비해 우수하다.
[표 8]
알데스류킨 및 PEG화 IL-2 폴리펩티드 조성물 A1의 면역 PD 프로파일을 동일한 연구에서 동시에 평가하고 14일 동안 모니터링하였다. PEG화 IL-2 폴리펩티드를 사용한 단일 용량 치료는 Treg 집단(CD3+, CD4+, CD25Hi, FoxP3+)에서 강력하고 지속적인 STAT5 인산화를 유도하였으며 CD8+ Teff 세포(CD3+, CD8+, CD4-) 및 NK 세포(CD3-, CD49b+)에는 효과가 없거나 최소였다(도 7). 대조적으로, 알데스류킨을 사용한 5회 용량 처리는 Treg 세포에서 보다 크지 않은 STAT5 인산화 프로파일을 유도하였고 CD8+ T eff 세포 및 NK 세포에는 역시 효과가 없었다(도 7). 조성물 A1로 처리 시 Treg 세포에서 IL-2 수용체 신호전달 경로의 활성화는 CD8+ Teff 세포 및 NK 세포에서는 관찰되지 않는 증식 마커 Ki67의 뚜렷하고 지속적인 상향 조절로 해석되었다. 대조적으로, 알데스류킨을 사용한 5회 용량 처리는 Treg에서 제한된 Ki67 상향 조절을 초래하였다(도 7). 조성물 A1로 처리 시 Treg 하위집단의 증가된 증식 활성은 기준선과 비교하여 Treg 세포 수의 매우 현저한 증가를 가져왔으며, 이는 알데스류킨의 5회의 매일 용량에서 관찰된 것보다 우수하다. 세포 확장은 Treg 하위집단에 대해 선택적이었고 CD8+ Teff 및 NK 세포는 비교적 변하지 않은 상태로 유지되었다(도 7).
실시예 11: 조성물 A1은 키홀 림펫 헤모시아닌 유발 지연형 과민증을 억제한다.
지연형 과민증(DTH)은 이전에 접한 항원에 대한 국소 T 이펙터 회상 반응을 나타낸다. 여기서, 마우스를 먼저 KLH로 s.c. 면역화에 의해 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)에 감작시킨 후 며칠 후 동일한 항원을 귀에 피내 주사로 재접종하여 국소 조직 염증과 부종을 유발하였다. 성체 Balb/c 마우스를 실험 그룹(n=10/그룹)에 무작위로 할당하고 1주 동안 적응하도록 하였다. 제0일에 완전 프로인트 보조제(CFA)중 100 μg KLH의 유제를 동물에게 견갑골 사이에 s.c. 주사에 의해 투여하였다. 조성물 A1은 제0일; 제0일 및 제3일; 제0일, 제3일 및 제5일 또는 제0일, 제3일, 제5일 및 제8일(도 8a 참조)에 0.3 mg/kg s.c.로 투여하였다. 비히클은 제0일, 제3일, 제5일 및 제8일에 s.c.로 투여하였다. 디지털 캘리퍼를 사용하여 오른쪽 및 왼쪽 귀 두께의 기준선을 측정한 후, 제7일에 모든 동물에게 0.9% 염화나트륨 중 10 μg KLH를 오른쪽 귀에 피내 주사로 접종하였다. 반대쪽(왼쪽) 귀에 동일한 양의 0.9% 염화나트륨을 투여하였다. 24, 48, 72 및 96시간에 디지털 캘리퍼를 사용하여 귀 두께를 측정하였다. 비히클 처리군에서, 귀 염증이 접종 후 48시간에 최고조에 달한 후 서서히 해소되었다(도 8a). 조성물 A1의 단일 투여는 비히클과 비교하여 모든 시점에서 귀 염증을 강력하게 억제하였다. 다중 투여로 인해 접종 후 24시간에 염증 피크가 더 일찍 그리고 더 얕게 나타난 후 빠르게 거의 다시 기준선으로 되었다. 조성물 A1 투여 각각의 경우에, 곡선하 면적(AUC)으로 측정된 귀 부종 차이는 비히클 대조군보다 유의하게 적었다(도 8b 및 도 8c 참조). 따라서 조성물 A1은 항원에 의한 조직 염증을 강력하게 억제한다.

Claims (58)

  1. 다음을 포함하는 변형된 인터루킨-2(IL-2) 폴리펩티드:
    변형된 IL-2 폴리펩티드로서, 최대 7개의 천연 아미노산 치환을 포함하며, 7개의 천연 아미노산 치환은 잔기 Y31, K35, 및 Q74에 아미노산 치환을 포함하고; 변형된 IL-2 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 하는 것인 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 1에 제시된 서열에 비해 3, 4, 5, 또는 6개의 천연 아미노산 치환을 포함하는 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 하나의 비천연 아미노산 치환을 포함하는 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  4. 제3항에 있어서, 적어도 하나의 비천연 아미노산 치환이
    a) 잔기 36-45 중 어느 하나에 위치한 호모세린(Hse) 잔기;
    b) 잔기 61-81 중 어느 하나에 위치한 호모세린 잔기; 및
    c) 잔기 94-114 중 어느 하나에 위치한 호모세린 잔기
    로부터 선택되는 것인 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  5. 다음을 포함하는 변형된 인터루킨-2(IL-2) 폴리펩티드:
    적어도 하나의 비천연 아미노산 치환을 포함하는 변형된 IL-2 폴리펩티드로서, 적어도 하나의 비천연 아미노산 치환은
    a) 잔기 36-45 중 어느 하나에 위치한 호모세린(Hse) 잔기;
    b) 잔기 61-81 중 어느 하나에 위치한 호모세린 잔기; 및
    c) 잔기 94-114 중 어느 하나에 위치한 호모세린 잔기
    로부터 선택되고,
    변형된 IL-2 폴리펩티드는 L18, Q22, N29, Y31, K35, T37, K48, V69, N71, Q74, L80, R81, L85, I86, N88, I89, I92, 및 Q126으로부터 선택된 잔기에 적어도 하나의 아미노산 치환을 추가로 포함하고; 변형된 IL-2 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 하는 것인 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, Hse41, Hse71, Hse104, 또는 이들의 조합을 포함하는 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, Hse41, Hse71, 및 Hse104 각각을 포함하는 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 잔기 23, 잔기 39, 또는 잔기 46, 또는 이들의 임의의 조합에 노르류신(Nle) 치환을 포함하는 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 잔기 23, 잔기 39, 및 잔기 46에 Nle 치환을 포함하는 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, Y31, K35, Q74, 및 N88로부터 선택된 잔기에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, Y31H, K35R, Q74P, 및 N88D로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, Y31H, K35R, Q74P, 및 N88D 아미노산 치환 중 2, 3 또는 4개를 포함하는 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, Y31H, K35R, 및 Q74P 아미노산 치환을 포함하는 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 잔기 N88에 아미노산 치환을 포함하는 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  15. 제14항에 있어서, 잔기 N88에서의 아미노산 치환은 N88D 치환인 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 잔기 C125에 치환을 추가로 포함하는 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, C125S 치환을 추가로 포함하는 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, N-말단 결실을 추가로 포함하는 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  19. 제18항에 있어서, N-말단 결실은 단일 아미노산의 결실인 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, V69A 치환을 포함하는 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 잔기 E15, N29, N30, T37, K48, V69, N71, I89, 또는 I92에 어떠한 천연 아미노산 치환도 포함하지 않는 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  22. 제1항 내지 제19항 또는 제21항 중 어느 한 항에 있어서, V69A 또는 K48E 치환을 포함하지 않는 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 어떠한 추가의 천연 아미노산 치환도 포함하지 않는 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 합성인 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  25. 다음을 포함하는 변형된 IL-2 폴리펩티드:
    약 0.1 nM 내지 약 100 nM인 IL-2 수용체 알파 서브유닛(IL-2Rα)에 대한 결합 친화도를 나타내고, 적어도 약 1000 n인 IL-2 수용체 베타 서브유닛(IL-2Rβ)에 대한 결합 친화도를 나타내는 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 약 1000 nM, 적어도 약 2000 nM, 적어도 약 3000 nM, 적어도 약 5000 nM, 또는 적어도 약 10000 nM인 IL-2Rβ에 대한 결합 친화도를 나타내는 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 최대 약 100 nM, 최대 약 75 nM, 최대 약 50 nM, 최대 약 40 nM, 최대 약 30 nM, 최대 약 20 nM, 최대 약 10 nM, 또는 최대 약 5 nM인 IL-2Rα에 대한 결합 친화도를 나타내는 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 약 0.1 nM 내지 약 100 nM, 약 0.1 nM 내지 약 50 nM, 약 0.1 nM 내지 약 20 nM, 약 1 nM 내지 약 100 nM, 약 1 nM 내지 약 50 nM, 또는 약 1 nM 내지 약 20 nM인 IL-2Rα에 대한 결합 친화도를 나타내는 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, Treg 세포 활성화에 대한 EC50이 최대 약 100 nM, 최대 약 75 nM, 최대 약 50 nM, 최대 약 40 nM, 최대 약 35 nM, 최대 약 30 nM, 또는 최대 약 25 nM인 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, Teff 세포 활성화에 대한 EC50이 적어도 약 1000 nM인 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  31. 서열 번호 3-43 중 어느 하나와 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산을 포함하는 변형된 IL-2 폴리펩티드로서, 서열 번호 1에 비해 치환된 참조 아미노산 서열의 각 잔기는 유지되는 것인 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  32. 제31항에 있어서, 서열 번호 3, 5, 8, 9, 10, 11, 13, 19, 22, 23, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 또는 42 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  33. 제31항에 있어서, 서열 번호 3에 제시된 서열과 적어도 약 95%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  34. 제31항에 있어서, 서열 번호 3에 제시된 서열을 포함하는 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 공유적으로 부착된 중합체를 추가로 포함하는 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  36. 제35항에 있어서, 중합체는 변형된 IL-2 폴리펩티드의 N-말단에 공유적으로 부착되는 것인 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 중합체는 수용성 중합체를 포함하는 것인 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체는 폴리(알킬렌 옥시드), 다당류, 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리옥사졸린, 폴리(아크릴로일모르폴린), 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  39. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체는 폴리(알킬렌 옥시드)를 포함하는 것인 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  40. 제35항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체는 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 것인 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  41. 제35항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체는 최대 약 50,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는 것인 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, N-말단 잔기에 부착된 접합 핸들을 포함하는 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  43. 제42항에 있어서, N-말단 잔기는 N-말단 아민에 부착된 하기 구조를 갖는 것인 변형된 IL-2 폴리펩티드:

    여기서 각각의 n은 독립적으로 1-30의 정수이고, X는 접합 핸들이다.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 추가 폴리펩티드에 부착되는 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  45. 제44항에 있어서, 추가 폴리펩티드는 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 변형된 IL-2 폴리펩티드.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 변형된 IL-2 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포.
  47. 변형된 IL-2 폴리펩티드를 숙주 세포에서 발현시키는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 변형된 IL-2 폴리펩티드를 생산하는 방법.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, 원핵 세포 또는 진핵 세포인 숙주 세포.
  49. 제46항 또는 제47항에 있어서, 포유동물 세포, 조류 세포, 또는 곤충 세포인 숙주 세포.
  50. 제49항에 있어서, CHO 세포, COS 세포, 또는 효모 세포인 숙주 세포.
  51. a) 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 변형된 IL-2 폴리펩티드; 및
    b) 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제
    를 포함하는 약학 조성물.
  52. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 변형된 IL-2 폴리펩티드, 또는 제50항의 약학 조성물의 약학적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 염증성 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 염증성 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 염증성 질환 또는 장애는 염증(예를 들어, 연골 염증), 자가면역 질환, 아토피성 질환, 부신생물 자가면역 질환, 관절염, 류마티스 관절염(예를 들어, 활성), 소아 관절염, 소아 특발성 관절염, 소아 류마티스 관절염, 소수관절성 류마티스 관절염, 소수관절성 소아 류마티스 관절염, 다관절성 소아 류마티스 관절염, 전신 발병 소아 류마티스 관절염, 소아 건선성 관절염, 건선성 관절염, 다관절성 류마티스 관절염, 전신 발병 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 소아 강직성 척추염, 소아 장병성 관절염, 반응성 관절염, 소아 반응성 관절염, 라이터 증후군, 소아 라이터 증후군, 소아 피부근염, 소아 경피증, 소아 혈관염, 장병성 관절염, SEA 증후군(혈청 음성, 골부착부 병증, 관절병증 증후군), 피부근염, 건선성 관절염, 경피증, 혈관염, 근염, 다발성 근염, 피부근염, 결절성 다발동맥염, 베게너 육아종증, 동맥염, 류마티스성 다발성 근육통, 사르코이드증, 경화증, 원발성 담즙성 경화증, 경화성 담관염, 쇼그렌 증후군, 건선, 판상 건선, 물방울 건선, 역위 건선, 농포성 건선, 홍피성 건선, 피부염, 아토피성 피부염, 포진성 피부염, 베체트병, 탈모증, 원형 탈모증, 전두 탈모증, 죽상경화증, 루푸스, 스틸병, 중증 근무력증, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 셀리악병, 천식, COPD, 비부비동염, 폴립을 동반한 비부비동염, 호산구성 식도염, 호산구성 기관지염, 길랭-바레병, 갑상선염(예를 들어, 그레이브스병), 애디슨병, 레이노 현상, 자가면역 간염, 이식편대숙주병, 스테로이드 불응성 만성 이식편대숙주병, 이식 거부(예를 들어, 신장, 폐, 심장, 피부 등), 신장 손상, C형 간염 유발 혈관염, 자연유산, 백반증, 국소분절 사구체경화증(FSGS), 미세변화 질환, 막성 신장병증, ANCA 관련 사구체신장병증, 막증식성 사구체신염, IgA 신장병증, 루푸스 신장염, 또는 이들의 조합을 포함하는 염증성 장애인 방법.
  54. 제52항에 있어서, 염증성 질환 또는 장애는 자가면역 질환인 방법.
  55. 제54항에 있어서, 자가면역 질환은 T 세포 매개 자가면역 질환인 방법.
  56. 제52항에 있어서, 염증성 질환은 신경염증성 질환인 방법.
  57. a) 변형된 IL-2 폴리펩티드의 2개 이상의 단편을 합성하는 단계;
    b) 단편을 결찰시키는 단계; 및
    c) 결찰된 단편을 폴딩하는 단계
    를 포함하는, 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 변형된 IL-2 폴리펩티드를 제조하는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 수용성 중합체를 폴딩된, 결찰된 단편에 부착시키는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
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