CN110709518A - 携带纤维素结合域的重组载体和用该载体分离并纯化蛋白质的方法 - Google Patents

携带纤维素结合域的重组载体和用该载体分离并纯化蛋白质的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种携带有纤维素结合域3的重组载体，以及使用所述重组载体分离靶蛋白的方法。本发明的蛋白质分离方法可以利用重组载体将转化的植物体与纤维素结合，容易地分离出含有靶蛋白的融合蛋白，并通过用肠激酶处理融合蛋白，从纤维素结合域中有效地分离出靶蛋白，从而有望应用在工业的各种领域上。

Description

携带纤维素结合域的重组载体和用该载体分离并纯化蛋白质 的方法
技术领域
本发明涉及一种携带纤维素结合域的重组载体，以及利用该载体分离并纯化蛋白质的方法。
背景技术
纤维素是一种有机化合物，占到植物体的约30％及以上，是植物细胞膜和木质部的基本成分。纤维素是一种多糖，其化学结构由β-1，4-糖苷键聚合D型葡萄糖形成，天然状态下的分子量为几万到几十万。纤维素是一种无气味的白色固体，不溶于水、乙醇或***，对碱性有相当强的耐受力，但在酸或铜氨溶液中水解，从而生产大量纤维素二糖作为中间体，最后转化为葡萄糖。纤维素是自然界最丰富的自然资源之一，利用纤维素的各种研究也在开展着。
同时，用于降解纤维素的纤维素酶具有纤维素结合域(CBD)，并且特异性结合纤维素，从而有效地降解纤维素。通过与需要上述纤维素结合域的目标蛋白结合来创造一个特异性结合纤维素的重组蛋白这样的尝试已经屡见不鲜(韩国专利号10-0618563)。然而，这些尝试仅限于适用微生物制备重组蛋白，利用植物的实例还尚未知晓。
然而，近年来，随着人们越来越关注来源于植物的重组蛋白及疫苗的生产，迫切需要研制一种利用植物体来生产大量重组蛋白并快速、廉价地分离出大量高纯度重组蛋白的方法。
发明内容
技术问题
本发明的目的是解决上述常规技术问题，并在植物体内生产靶蛋白，然后快速并简单地大量分离产生出的靶蛋白。本发明旨在提供一种携带纤维素结合模块3(CBM3)的重组载体，以及利用该重组载体分离及纯化靶蛋白的方法。
然而，本发明要解决的技术问题不限于上述问题，本领域技术人员将从以下描述中充分理解在此未描述的其他问题。
技术方案
为了实现本发明的目的，本发明提供了一种重组载体，其包含编码纤维素结合模块3的SEQ ID No:1的碱基序列，重组载体的结构如图1所示。
在本发明的一个示例性实施方式中，在重组载体中，可循序连接纤维素结合模块3、连接肽、肠激酶切割位点和靶蛋白编码基因。
在本发明的另一示例性实施方式中，靶蛋白编码基因可由SEQ ID NO:3.的碱基序列组成。
在本发明的又一示例性实施方式中，连接肽可由SEQ ID NO:5.的碱基序列组成。
在本发明的又一示例性实施方式中，肠激酶切割位点可由SEQ ID NO:6的碱基序列组成。
在本发明的又一示例性实施方式中，将靶蛋白转移到植物细胞中的内质网的BiP(结合免疫球蛋白；binding immunoglobulin protein)编码基因进一步可操作地连接至重组载体上。
在本发明的又一示例性实施方式中，免疫球蛋白(BiP)编码基因可由SEQ ID NO:7.的碱基序列组成。
在本发明的又一示例性实施方式中，编码HDEL(His-Asp-Glu-Leu)肽的碱基序列可进一步能够操作地连接到重组载体上。
另外，本发明提供了一种分离并纯化靶蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
通过将利用重组载体转化的植物体与蛋白质提取缓冲溶液混合来制备植物体混合溶液的S1步骤；
通过将S1步骤的混合溶液注入充满纤维素的柱中，将融合了纤维素结合模块3和靶蛋白的融合蛋白吸附到纤维素上的S2步骤；以及
通过离心分离使S2步骤中的吸附了融合蛋白的纤维素沉淀并使沉淀物悬浮在肠激酶中，从而获得悬浮液的S3步骤。
在本发明的一个示例性实施方式中，在S3步骤之后，可进一步包括通过将悬浮液注入琼脂糖柱来去除肠激酶的步骤。
在本发明的另一示例性实施方式中，蛋白质提取缓冲溶液可包括10至100mM Tris缓冲溶液、100至200mM氯化钠(NaCl)溶液、0.01至0.5％Triton X-100以及蛋白酶抑制剂。
在本发明的又一示例性实施方式中，转化的植物体可通过以下方式制备：
a)通过将重组载体导入菌株来制备转化株；以及
b)利用所述转化株转化植物体。
在本发明的又一示例性实施方式中，该菌株可以是根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)。
在本发明的又一示例性实施方式中，植物体可以是双子叶植物，选自由拟南芥、大豆、烟草、茄子、辣椒、土豆、番茄、大白菜、萝卜、卷心菜、生菜、桃、梨、草莓、西瓜、甜瓜、黄瓜、胡萝卜和芹菜构成的组，或者是单子叶植物，选自由稻、大麦、小麦、黑麦、玉米、甘蔗、燕麦和洋葱构成的组。
在本发明的又一示例性实施方式中，纤维素可以是微晶纤维素(Microcrystalline cellulose)。
有益效果
本发明的重组载体分离蛋白质的方法，使用对纤维素具有高亲和力的纤维素结合模块3，防止非特异性蛋白质的结合，由此可以从混合了各种蛋白质的植物体的总提取物中快速分离出高纯度的所期望的蛋白，并且能够分离浓度较低的蛋白质。此外，可以用肠激酶处理靶蛋白和标记(tagging)蛋白的纤维素结合域，从而快速分离靶蛋白。因此，由于本发明的分离蛋白质的方法能够快速、廉价、有效地从植物体中分离出大量高纯度的靶蛋白，因此有望应用于各种工业领域。
附图说明
图1例示了本发明中使用的重组载体的结构。
图2例示了CBM3融合蛋白(CBM3:Ag85A)对微晶纤维素的吸附的确认结果。
图3例示了利用肠激酶从CBM3融合蛋白中分离靶蛋白(Ag85A)的获得结果。
图4例示了通过亲和色谱法去除肠激酶后的、靶蛋白(Ag85A)分离及纯化的获得结果。
具体实施方式
本发明的特征在于提供一种重组载体，其包含编码纤维素结合模块3(CBM3)的SEQID NO:1的碱基序列。
通过对快速、廉价地从植物体内大量分离高纯度靶蛋白的方法进行了研究，其结果是完成了本发明。即，在本发明的示例性实施方式中，经证实，靶蛋白可以通过以下方式进行分离：在靶蛋白编码基因的3'端方向结合由SEQ ID NO:1的碱基序列或SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的纤维素结合模块3(CBM3)，由此制造重组载体，使用该重组载体制备产生靶蛋白的转化的植物体，使用微晶纤维素(MCC)分离CBM3融合蛋白，并且用肠激酶处理所得蛋白(参见实施例1至4)。
根据上述结果，发明者知晓，利用携带纤维素结合域的重组载体可以从表达靶蛋白的植物体中采用纤维素有效纯化靶蛋白。
因此，本发明提供了使用重组载体分离靶蛋白的方法。
因此，本发明提供了一种分离并纯化靶蛋白的方法，包括以下步骤：
通过将利用重组载体转化的植物体与蛋白质提取缓冲溶液混合来制备植物体混合溶液的S1步骤；
通过将S1步骤的混合溶液注入充满纤维素的柱中，将纤维素结合模块3和靶蛋白融合的融合蛋白吸附到纤维素上的S2步骤；
通过离心分离使S2步骤中的吸附了融合蛋白的纤维素沉淀并使沉淀物悬浮在肠激酶中，从而获得悬浮液的S3步骤。
更具体地，在本发明中，纤维素优选使用MCC(微晶纤维素；Microcrystallinecellulose)。也可使用非晶纤维素(amorphous cellulose)，但考虑到分离效率，更优选使用MCC。
在本发明中，重组载体由顺次连接的纤维素结合模块3、连接肽、肠激酶切割位点和靶蛋白编码基因组成，在植物细胞内将靶蛋白转移到内质网中的结合免疫球蛋白(BiP)的信号肽，连接到纤维素结合域的3'端，而His-Asp-Glu-Leu(HDEL)可连接到靶蛋白编码基因的羧基端，使连接的载体保留(retention)在内质网中。纤维素结合模块3可由SEQ IDNO:1的碱基序列编码。在使用重组载体生产的蛋白质中，纤维素结合模块3由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。
本文使用的术语“靶蛋白(或蛋白质)”是指根据本发明的遗传工程方法生产的蛋白质，本发明并不特别限于本文中的蛋白。优选地，可以包括由于其被工业应用因此需要大量生产的蛋白质。
在本发明的示例性实施方式中，尽管靶蛋白编码基因可以是由SEQ ID NO:3的碱基序列编码的Ag85A，但可以如上所述的进行分离，并且可根据要生产的所期望的靶蛋白的类型而变化。靶蛋白可能由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成。
在本发明的另一示例性实施方式中，连接肽可由SEQ ID NO:5的碱基序列组成，肠激酶切割位点可由SEQ ID NO:6的碱基序列组成，BiP的信号肽可由SEQ ID NO:7的碱基序列组成。
本文中使用的术语“融合蛋白”是指其中融合了纤维素结合域和靶蛋白的蛋白质，并且在融合蛋白中，从靶蛋白中移除对应于标记(tag)的纤维素结合域对于分离和纯化靶蛋白至关重要。因此，在本发明中，可以通过肠激酶的处理容易地分离纤维素结合域。
在本发明的另一个示例性实施方式中，经肠激酶处理后，肠激酶可穿过琼脂糖柱(STI-琼脂糖亲和色谱)容易地被除去。
在本发明的又一个示例性实施方式中，制备植物体混合溶液时添加的蛋白质提取缓冲溶液可包括10至100mM Tris缓冲溶液、100至200mM氯化钠(NaCl)溶液、0.01至0.5％Triton X-100以及蛋白酶抑制剂，并且每1g重量的植物体优选使用1至10ml，且更优选为3至8ml。
在本发明的方法中，可通过包含以下步骤的方法制备转化的植物体：a)通过将重组载体导入菌株制备转化株；以及b)使用转化株转化植物体。
菌株可以是根癌农杆菌，但本发明不限于此。作为植物体，可以使用双子叶植物，选自由拟南芥、大豆、烟草、茄子、辣椒、土豆、番茄、大白菜、萝卜、卷心菜、生菜、桃、梨、草莓、西瓜、甜瓜、黄瓜、胡萝卜和芹菜构成的组，或单子叶植物，选自由水稻、大麦，小麦、黑麦、玉米、甘蔗、燕麦和洋葱构成的组。然而，本发明不限于此。
以下，为了帮助理解本发明，将提出示例性实施例。然而，以下实施例仅为例示的目的，并不旨在限制本发明。
实施例
实施例1.表达CBM3融合蛋白的转化植物体的制备
如图1所示，制造了用于转化植物体的载体，该载体被重组以在植物体内表达CBM3融合蛋白。为了将CBM3融合蛋白转移到内质网，使用与BiP的信号肽相对应的基因组DNA序列编码以将靶蛋白转移到内质网，并将His-Asp-Glu-Leu(HDEL)引入羧基端，使融合蛋白在内质网中积累并保留在内质网。分离融合蛋白所需的CBM3、连接肽(linker)和由肠激酶识别和切割的序列连接在编码靶蛋白(Ag85A)的基因上游，并***植物表达载体，即pCAMBIA1300中，从而制备重组载体。利用该载体转化了一株根癌农杆菌LBA-4404菌株。利用改良的农杆菌菌株转化拟南芥，培育出一株能生产靶蛋白的转化植物体，然后筛选出稳定生产CBM3融合蛋白的转化植物体。重组载体中使用的序列如下表1所示。
[表1]
Figure BDA0002267824650000071
Figure BDA0002267824650000081
Figure BDA0002267824650000101
实施例2.用MCC分离蛋白质
为了将CBM3融合蛋白吸附到MCC上，在1g MCC中加入蒸馏水进行水化。然后，将用实施例1所述方法制备的转化植株体在土壤中培养约3周，之后使用液氮将不包括根部分的所述植株体在臼中磨碎。将1g的磨碎的植物体转移到新的管上，加入5mL的蛋白质提取缓冲溶液(50mM Tris(pH 7.2)，150mM NaCl，0.2％Triton X-100，1X蛋白酶抑制剂)，并通过涡旋(vortexing)进行充分混合。以神奇滤布(Miracloth)为过滤器，去除植物碎屑，加入1gMCC，然后在4℃下充分混合生成的产物1小时，使CBM3融合蛋白吸附到MCC上。随后，通过离心分离(14,000rpm，4℃，10分钟)去除未与MCC结合的蛋白质，然后用5mL洗涤缓冲溶液(50mM tris(pH 7.2)，150mM NaCl)洗涤MCC两次。用CBM3抗体进行蛋白质印迹，证实了CBM3融合蛋白对MCC的吸附。
其结果如图2所示，可以确认的是在植物中表达的CBM3融合蛋白在几乎没有损失的情况下很好地吸附到了MCC上，且吸附到MCC上的CBM3融合蛋白即使在洗涤过程中也几乎没有洗脱。
实施例3.用肠激酶切割融合蛋白
通过离心分离(14,000rpm，4℃，10分钟)使得吸附着含有Ag85A的融合蛋白的纤维素沉淀，并在肠激酶反应溶液中(50mM Tris(pH 7.2)、150mM NaCl、1mM CaCl2)将沉淀重新悬浮。加入多达5个单位的肠激酶至悬浮液，并在28℃下反应，每小时获取一次悬浮液，且进行SDS-PAGE。通过用Ag85A抗体的免疫印迹，证实了根据肠激酶处理时间的融合蛋白的切割。
其结果如图3所示，经肠激酶处理的融合蛋白的切割反应非常高效，以至于70％的融合蛋白在处理1小时后被切割。4小时后，融合蛋白完全切割，分离为CBM3和Ag85A。
实施例4.通过亲和色谱法去除肠激酶以分离及纯化Ag85A
通过离心分离(14,000rpm，4℃，10分钟)从纤维素中分离出含有肠激酶和完全切割的Ag85A的反应溶液(图4的左侧)。为了从反应溶液中去除肠激酶，执行了亲和色谱法。将STI-琼脂糖加入反应溶液中，在4℃下反应1小时，然后放入空柱中得到一部分不与STI-琼脂糖结合的部分。如图4的右侧所示，可以看出通过STI-琼脂糖亲和色谱法从反应溶液中除去肠激酶，从而获得纯化和分离的Ag85A。
从上述结果可以证实，使用本发明重组载体的蛋白质分离方法在没有洗脱的情况下，可以轻易地从靶蛋白中分离肠激酶而，从而最终可以缩短分离蛋白质的时间。这意味着，当分离大量的蛋白质时，由于本发明使用的样品和消耗时间减少，可以最大化工作效率。
本领域普通技术人员应当理解，本发明的上述描述是示例性的，并且在不改变本发明的技术思想或基本特征的情况下，可以容易地将本文公开的示例性实施方式修改为其他特定形式。因此，应当理解的是，上述示例性实施方式在所有方面都是示例性的，并且不是限制性的。
工业适用性
根据本发明的一种利用重组载体分离蛋白质的方法，能够快速、廉价或有效地从植物体中高纯度地分离出大量的靶蛋白，因而有望应用于各种工业领域。
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1 5 10 15
Thr Thr Asn Ser Ile Asn Pro Gln Phe Lys Val Thr Asn Thr Gly Ser
20 25 30
Ser Ala Ile Asp Leu Ser Lys Leu Thr Leu Arg Tyr Tyr Tyr Thr Val
35 40 45
Asp Gly Gln Lys Asp Gln Thr Phe Trp Cys Asp His Ala Ala Ile Ile
50 55 60
Gly Ser Asn Gly Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Ser Asn Val Lys Gly Thr
65 70 75 80
Phe Val Lys Met Ser Ser Ser Thr Asn Asn Ala Asp Thr Tyr Leu Glu
85 90 95
Ile Ser Phe Thr Gly Gly Thr Leu Glu Pro Gly Ala His Val Gln Ile
100 105 110
Gln Gly Arg Phe Ala Lys Asn Asp Trp Ser Asn Tyr Thr Gln Ser Asn
115 120 125
Asp Tyr Ser Phe Lys Ser Ala Ser Gln Phe Val Glu Trp Asp Gln Val
130 135 140
Thr Ala Tyr Leu Asn Gly Val Leu Val Trp Gly Lys Glu Pro Gly
145 150 155
<210> 3
<211> 903
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ag85A
<400> 3
tttagccggc ctggcctgcc tgtggaatac ctgcaggtgc ctagccctag catgggccgg 60
gacatcaaag tgcagtttca gagcggcggg gctaatagcc ctgctctgta cctgctcgat 120
ggcctgcggg ctcaggatga ttttagcggc tgggacatca acacccctgc ttttgaatgg 180
tacgatcaga gcggcctgag cgtcgtgatg cctgtgggcg ggcagagcag cttctacagc 240
gattggtatc agcctgcttg cggcaaagct ggctgccaga cctacaagtg ggaaaccttt 300
ctgaccagcg aactgcctgg ctggctgcag gctaatcggc acgtgaaacc taccggcagc 360
gccgtggtgg gcctgagcat ggctgctagc tccgctctga ccctggctat ctaccaccct 420
cagcagtttg tgtacgctgg cgctatgagc ggcctgctcg atccctccca ggctatgggc 480
cctaccctga tcgggctcgc tatgggggat gctggggggt acaaagctag cgatatgtgg 540
ggccctaaag aagatcctgc ttggcagcgg aatgatcctc tgctcaacgt gggcaaactg 600
atcgctaata atacccgagt gtgggtgtac tgcggcaatg gcaaacctag cgatctgggc 660
gggaacaatc tgcctgctaa atttctggaa ggcttcgtgc ggaccagcaa catcaagttt 720
caggatgctt acaatgctgg cgggggccac aatggcgtat ttgattttcc tgatagcggc 780
acccacagct gggaatactg gggcgctcag ctgaatgcta tgaaacctga tctgcagcgg 840
gctctgggcg ctacccctaa taccggccct gctcctcagg gcgctggctc cggatctggt 900
agt 903
<210> 4
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ag85A
<400> 4
Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser Pro
1 5 10 15
Ser Met Gly Arg Asp Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Ala Asn
20 25 30
Ser Pro Ala Leu Tyr Leu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp Phe
35 40 45
Ser Gly Trp Asp Ile Asn Thr Pro Ala Phe Glu Trp Tyr Asp Gln Ser
50 55 60
Gly Leu Ser Val Val Met Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser
65 70 75 80
Asp Trp Tyr Gln Pro Ala Cys Gly Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr Lys
85 90 95
Trp Glu Thr Phe Leu Thr Ser Glu Leu Pro Gly Trp Leu Gln Ala Asn
100 105 110
Arg His Val Lys Pro Thr Gly Ser Ala Val Val Gly Leu Ser Met Ala
115 120 125
Ala Ser Ser Ala Leu Thr Leu Ala Ile Tyr His Pro Gln Gln Phe Val
130 135 140
Tyr Ala Gly Ala Met Ser Gly Leu Leu Asp Pro Ser Gln Ala Met Gly
145 150 155 160
Pro Thr Leu Ile Gly Leu Ala Met Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys Ala
165 170 175
Ser Asp Met Trp Gly Pro Lys Glu Asp Pro Ala Trp Gln Arg Asn Asp
180 185 190
Pro Leu Leu Asn Val Gly Lys Leu Ile Ala Asn Asn Thr Arg Val Trp
195 200 205
Val Tyr Cys Gly Asn Gly Lys Pro Ser Asp Leu Gly Gly Asn Asn Leu
210 215 220
Pro Ala Lys Phe Leu Glu Gly Phe Val Arg Thr Ser Asn Ile Lys Phe
225 230 235 240
Gln Asp Ala Tyr Asn Ala Gly Gly Gly His Asn Gly Val Phe Asp Phe
245 250 255
Pro Asp Ser Gly Thr His Ser Trp Glu Tyr Trp Gly Ala Gln Leu Asn
260 265 270
Ala Met Lys Pro Asp Leu Gln Arg Ala Leu Gly Ala Thr Pro Asn Thr
275 280 285
Gly Pro Ala Pro Gln Gly Ala Gly Ser Gly Ser Gly Ser
290 295 300
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Linker
<400> 5
gaggcagccg ctaaggaagc tgcagcgaaa 30
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EK
<400> 6
gatgacgacg ataaa 15
<210> 7
<211> 272
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BiP
<400> 7
atggctcgct cgtttggagc taacagtacc gttgtgttgg cgatcatctt cttcggtgag 60
tgattttccg atcttcttct ccgatttaga tctcctctac attgttgctt aatctcagaa 120
ccttttttcg ttgttcctgg atctgaatgt gtttgtttgc aatttcacga tcttaaaagg 180
ttagatctcg attggtattg acgattggaa tctttacgat ttcaggatgt ttatttgcgt 240
tgtcctctgc aatagaagag gctacgaagt ta 272
<210> 8
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HDEL
<400> 8
His Asp Glu Leu
1

Claims (15)

1.一种重组载体，其特征在于，
包含编码纤维素结合模块3的SEQ ID NO:1的碱基序列。
2.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，
所述重组载体包括循序连接的纤维素结合模块3、连接肽、肠激酶切割位点以及靶蛋白编码基因。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，
所述靶蛋白编码基因由SEQ ID NO: 3的碱基序列组成。
4.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，
所述连接肽由SEQ ID No:5的碱基序列组成。
5.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，
所述肠激酶切割位点由SEQ ID NO: 6.的碱基序列组成。
6.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，
在植物细胞中将靶蛋白转移到内质网的BiP（结合免疫球蛋白）的编码基因，进一步能够操作地连接到重组载体上。
7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于，
所述BiP的编码基因由SEQ ID NO:7的碱基序列组成。
8.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，
编码 HDEL（His-Asp-Glu-Leu）肽的碱基序列进一步能够操作地连接到重组载体。
9.一种分离和纯化靶蛋白的方法，其特征在于，包括：
混合通过使用权利要求1所述的重组载体转化的植物体与蛋白质提取缓冲溶液以制备植物体混合溶液的S1步骤；
通过将S1步骤的混合溶液注入充满纤维素的柱中，将融合了纤维素结合模块3和靶蛋白的融合蛋白吸附到纤维素上的S2步骤；以及
通过离心分离使S2步骤中的吸附了融合蛋白的纤维素沉淀，并使沉淀物悬浮在肠激酶中，从而获得悬浮液的S3步骤。
10.根据权利要求9所述的分离和纯化靶蛋白的方法，其特征在于，进一步包括：
在S3步骤后，通过将悬浮液注入琼脂糖柱而去除肠激酶的步骤。
11.根据权利要求9所述的分离和纯化靶蛋白的方法，其特征在于，
所述蛋白质提取缓冲溶液包括10至100 mM Tris缓冲液、100至200 mM氯化钠（NaCl）溶液、0.01至0.5% Triton X-100以及蛋白酶抑制剂（protease inhibitor）。
12.根据权利要求9所述的分离和纯化靶蛋白的方法，其特征在于，
所述转化的植物体通过以下方法制备，该方法包括：a）通过将权利要求1所述的重组载体引入菌株制备转化株的步骤；以及b）使用所述转化株转化植物体的步骤。
13.根据权利要求12所述的分离和纯化靶蛋白的方法，其特征在于，
所述菌株为根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）。
14.根据权利要求9所述的分离和纯化靶蛋白的方法，其特征在于，
所述植物体是双子叶植物，选自由拟南芥、大豆、烟草、茄子、辣椒、土豆、番茄、大白菜、萝卜、卷心菜、生菜、桃子、梨、草莓、西瓜、甜瓜、黄瓜、胡萝卜和芹菜构成的组中；或所述植物体是单子叶植物，选自由稻、大麦、小麦、黑麦、玉米、甘蔗、燕麦和洋葱构成的组中。
15.根据权利要求9所述的分离和纯化靶蛋白的方法，其特征在于，
所述纤维素为微晶纤维素（Microcrystalline cellulose）。
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