CN112458109A - 一种基于负压与暂时浸没的高效瞬时植物转基因方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种经由农杆菌介导的植物转基因方法，该方法是通过负压力与短时多次重复侵染，将外源基因高效瞬时导入植物外植体中。相比传统方法，本发明方法具有耗时短、效率高和操作简易等诸多优势。

Description

一种基于负压与暂时浸没的高效瞬时植物转基因方法

技术领域

本发明涉及植物生物技术与组织培养领域，尤其涉及一种经由农杆菌介导的植物转基因方法。

背景技术

农杆菌介导的转基因体系是获得转基因植物、研究植物基因功能、将优良农艺性状导入目标植物的关键现代生物学手段。目前主流的植物转基因体系通常以农杆菌为基因载体，以叶片、花粉、胚乳和子叶等植物外植体为对象，一般通过造伤或添加酚类物质乙酰丁香酮促使农杆菌侵染外植体，并在侵染过程中将携带外源抗生素和目标基因表达框的T-DNA区域导入植物细胞内部，进而整合在基因组上。

T-DNA导入植物细胞内部后，目标基因即可在短时间内利用植物本身的转录***进行转录、翻译、修饰和最终表达出有活性的蛋白质。这些表达出的蛋白质在短时间内可以在活体植物内行使其生物学功能，并表现出相应的表型。这种在短时间内利用农杆菌介导的侵染，验证目标基因功能的体系被称为瞬时表达体系。

瞬时表达体系是构建高效的稳定转基因体系的基础。稳定转基因植物的获得取决于带有外源基因的T-DNA区域能否顺利导入植物细胞内部，之后外源基因是否能成功整合在基因组上，在此基础上利用植物细胞全能性，再生出基因组带有外源基因的转基因植株。此过程中，瞬时表达体系的效率反映了农杆菌侵染外植体，以及将外源T-DNA导入植物内部的效率和能力。因此为获得稳定转基因的植株，应首先构建高效稳定的瞬时表达体系。目前在梨和苹果等果树上，常见的侵染方式是将无菌组培苗的叶片切伤后，在菌液中短时间浸沾，使带有外源基因的农杆菌通过伤口侵染植株达到转化的目的。但侵染时间过长会导致农杆菌大量侵入，造成叶片死亡；但侵染时间过短，农杆菌难以大面积侵染叶片，极大影响侵染效率。为解决这一问题，在其他植物上已有报道利用真空负压力，使菌液均匀、大面积侵染叶片等外植体，提高侵染效率。但同样的，负压处理时间较长，极易导致叶片死亡问题。

梨是我国栽培广泛的多年生木本果树，由于其生长周期长，利用常规的转基因技术获得转基因梨幼苗，验证目标基因功能需要半年至一年的时间。同时由于童期的存在，如果要验证和果实相关的目标基因功能则往往需要三年至五年以上的时间。

另外，包括GV3101、EHA105、LBA4404等常用转基因农杆菌菌株的适宜宿主均不包括梨，因此现有的梨瞬时转化体系和稳定转化体系的转化效率仍处于较低的水平。因此现有的转基因技术仍需要大量、重复的侵染工作以提高侵染的成功率。

因此，目前该领域需寻求一种耗时短、效率高且操作简单的转基因体系或方法，有鉴于此，提出本发明

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中转基因体系的耗时久、侵染率低和操作复杂等缺陷，提供一种高效侵染、短时间就可以在植物叶片中诱导目标基因表达的方法。

因此，本发明的第一目的是寻求一种基于农杆菌侵染的植物叶片瞬时转化体系和方法；

本发明的第二目的是寻求负压与暂时浸没技术结合在植物瞬时转化中的应用。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了一种基于农杆菌侵染的植物叶片瞬时转化方法，该方法能够将外源基因高效导入植物叶片中，具体包括如下步骤：

1)外植体构建；

2)农杆菌侵染液制备；

3)负压力施加外植体与农杆菌；

4)将步骤3)处理的外植体与农杆菌侵染液通过暂时多次浸没共培养与侵染。

在一些实施方式中，所述步骤4)的多次浸没为3-6次；

在一些实施方式中，所述步骤4)中单次共培养为1-3小时；

在一些实施方式中，所述步骤4)农杆菌侵染液的OD值为0.1-0.3。

在一些优选的实施方式中，所述步骤4)为：

A.将步骤3)处理的外植体叶片在吸干多余侵染液后，背面向上铺展；

B.缓慢加入农杆菌侵染液，充分接触但不没过叶背面，共培养；所述农杆菌侵染液的体积为3.5-5mL，OD值为0.1-0.3，共培养为1-3小时；

C.吸干侵染液，缓慢加入不含农杆菌侵染液，无菌培养20-24小时；

D.B和C步骤交替重复4-6次。

在一些实施方式中，所述步骤3)为常规的负压处理外植体。

在一些实施方式中，所述负压为0.1-0.4Mpa；

在一些实施方式中，所述步骤3)是所述步骤3)具体为将外植体叶片浸没于农杆菌侵染液中，并置于真空泵中维持压力0.1-0.4Mpa，2-4分钟后迅速释放压力。

在一些实施方式中，所述步骤1)为：无菌条件下，取继代培养的外植体，浸泡在无菌水中待用；优选的，所述外植体为15天左右叶龄的叶片。

在一些实施方式中，所述步骤2)为：

A.配制侵染液：NN69液体培养基+200μM乙酰丁香酮，灭菌后pH＝5.5；

B.选择农杆菌EHA105为侵染菌株，将带有报告基因的pBI121载体导入农杆菌细胞；

C.将带有目标载体的农杆菌接种至含卡那霉素和利福平的液体LB培养基中震荡培养，收集农杆菌菌体；

D.侵染液悬浮菌体至菌液浓度OD值等于0.3，制备含农杆菌的侵染液，备用；

在一些实施方式中，所述步骤2)中所述报告基因为GUS基因；优选的，所述报告基因为具有植物catalyze内含子的intGUS；

在一些实施方式中，所述步骤C具体为：将带有目标载体的农杆菌接种至含有50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的液体LB培养基中震荡培养3天后，再次重新接种至50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的液体LB培养基中震荡培养12小时；25℃，3000转离心15分钟收集培养好的农杆菌菌体；

在一些实施方式中，所述步骤D具体为：用侵染液润洗农杆菌菌体后，再次25℃，3000转离心15分钟收集，用侵染液悬浮菌体至菌液浓度0.3，震荡活化3小时，备用。

在一些实施方式中，上述基于农杆菌侵染的植物叶片瞬时转化方法进一步包括步骤5)：

5)外源基因转化效率检测：将侵染完成的叶片取出，浸泡在GUS染液中，避光染色后统计蓝色色斑计算侵染效率。

在一些实施方式中，上述外植体来源于双子叶植物；优选的，来源于蔷薇科植物；更优选的，来源于梨属植物。

本发明还提供一种负压与暂时浸没技术结合在植物瞬时转化中的应用，其特征在于，所述植物瞬时转化依次包含负压力施加外植体步骤和暂时多次浸没共培养与侵染的步骤；

在一些实施方式中，所述暂时浸没技术中，多次浸没为3-6次；优选的，所述共培养为1-3小时；更优选的，所述农杆菌侵染液的OD值为0.1-0.3。

在一些优选的实施方式中，所述暂时浸没包括如下步骤：

A.将负压力施加后的外植体叶片在吸干多余侵染液后，背面向上铺展；

B.缓慢加入农杆菌侵染液，充分接触但不没过叶背面，共培养；所述农杆菌侵染液的OD值为0.1-0.3，共培养为1-3小时；

C.吸干侵染液，缓慢加入不含农杆菌侵染液，无菌培养20-24小时；

D.B和C步骤交替重复4-6次。

在一些实施方式中，上述外植体来源于双子叶植物；优选的，来源于蔷薇科植物；更优选的，来源于梨属植物。

本发明的有益技术效果：

1)本发明创造性的将负压力与暂时浸没两种技术结合起来，一方面利用负压力大面积侵染植物叶片，另一方面在后续操作中多次、短时间、间断性地侵染梨组培苗叶片，保证侵染效率的同时保证了叶片的健康状态，最终获得了高效的瞬时转化体系。相比于传统的侵染手段，侵染效率提高了42.6倍(依据转化成功的外源GUS活性鉴定)。

2)利用本发明的基于负压与暂时浸没的高效瞬时转化方法，本发明具有耗时短和操作简易等优势。

耗时短：本发明利用暂时浸没的手段多次反复侵染外植体提高侵染效率，侵染过程持续7天后，外源基因即可有效表达(以外源GUS基因活性为例：提高42.6倍于常规侵染)。而常规的单次造伤侵染，无法获得良好的侵染效果。稳定转化体系则需要半年至一年时间才可完成验证外源基因生物学功能的验证。

操作简易：本发明实施过程简易，可重复性高。负压力抽真空设备容易获得，暂时浸没技术不需要特殊设备，对侵染菌液无特殊要求，无菌条件下利用实验室常见的设备(注射器)就可完成暂时浸没的核心操作流程。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1.采用不同侵染方式的基因转化效果：A：传统切伤、B：不造伤、C：负压力与暂时浸没***结合。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下术语或定义仅仅是为了帮助理解本发明而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。

除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。

如本发明中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。

在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。

本发明中的术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。

此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本发明描述或举例说明的其它顺序实施。

实施例1梨属植物的转化试验

1)选择离体培养的OHF333(Pyrus communis)组培苗，切取顶部2cm左右的顶芽，转移至NN69固体培养基上继代培养。

2)以GUS基因为检测转基因效率的报告基因，该实验重复两次验证其有效性，具体选择具有植物catalyze内含子的intGUS，构建至植物双元表达载体pBI 121中。选择农杆菌EHA105为侵染菌株，将带有报告基因的pBI121载体利用冻融法导入农杆菌细胞。

将带有目标载体的农杆菌接种至带有50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的液体LB培养基中震荡培养3天后，再次重新接种至50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的液体LB培养基中震荡培养12小时。25℃，3000转离心15分钟收集培养好的农杆菌菌体。配制侵染液(NN69液体培养基+200μM乙酰丁香酮，灭菌后PH＝5.5)。用侵染液润洗农杆菌菌体后，再次25℃，3000转离心15分钟收集，用侵染液悬浮菌体至菌液浓度0.3，震荡活化3小时。

3)无菌条件下，取继代培养28-35天内的OHF333外植体，从叶柄处迅速切下15天左右叶龄、完全展开的健康叶片，转移至无菌水中保水待用。所有叶片准备完成后，从无菌水中移除，在滤纸上吸取多余水分后，迅速浸没于带有已活化农杆菌的侵染液中，该实验重复两次，每次实验设计3个处理，每个处理取120片叶子。处理1放置于真空泵中，维持0.2Mpa压力3分钟后，迅速释放压力；处理2维持0.4Mpa压力3分钟后，迅速释放压力，在侵染液中浸没3分钟；处理3作为对照，不进行负压处理，仅在侵染液中浸泡3分钟。

4)暂时浸没方式实现流程如下：A.将完成侵染的叶片(处理1、处理2和处理3)在滤纸上静置1分钟，吸干多余液体后，叶背面向上铺展在90mm培养皿中，B.缓慢加入3.5-5mLOD为0.1的侵染液，以充分接触但并不没过叶背面为宜；在无菌条件下培养3小时；C.用无菌的带针头注射器吸干侵染液，缓慢加入3.5-5mL不含农杆菌的侵染液，在无菌条件下培养22小时。D.此时将处理1、处理2和处理3的叶片，再次将每个处理的叶片分为三组，每组40片叶子，分别为处理1a、处理1b和处理1c；处理2a、处理2b和处理2c；处理3a、处理3b和处理3c。处理1b、2b和3b的叶片将B和C步骤交替重复2次，处理1c、2c和3c的叶子将B和C步骤交替重复4次，处理1a、2a和3a的叶片作为对照不经多次的暂时浸没处理。

5)将侵染完成的叶片取出，用PH＝7.0的磷酸缓冲液润洗2-3次，吸干水分后浸泡在GUS染液中，37℃避光染色12小时，95％酒精褪色后统计GUS的蓝色色斑覆盖度，同时提取RNA测定GUS表达量，计算侵染效率。

结果表明(图1和表1)，多次浸没与负压力均能提高侵染效率。其中0.2Mpa侵染4次(处理1c)在达到最大的侵染面积的同时可以保证最高的GUS表达水平，其次为0.4Mpa侵染4次，0.2Mpa侵染4次等。

表1.不同处理的侵染效率(用GUS染色结果表示)

实施例2多次暂时浸没参数验证

该实施例进一步验证其他多次暂时浸没参数的有效性。

基于实施例1相同的步骤1)-2)。

3)无菌条件下，取继代培养28-35天内的OHF333外植体，从叶柄处迅速切下13天叶龄、完全展开的健康叶片，转移至无菌水中保水待用。所有叶片准备完成后，从无菌水中移除，在滤纸上吸取多余水分后，迅速浸没于带有已活化农杆菌的侵染液中，该实验重复两次，每次处理120片叶子，放置于真空泵中，维持0.2Mpa压力3分钟后，迅速释放压力。

4)暂时浸没方式实现流程如下：

A.将完成侵染的叶片在滤纸上静置1分钟，吸干多余液体后，叶背面向上铺展在90mm培养皿中；

B.缓慢加入3.5mL OD为0.1-0.6的侵染液，以充分接触但并不没过叶背面为宜；共培养0.5-6小时；

C.用无菌的带针头注射器吸干侵染液，缓慢加入3.5mL不含农杆菌的侵染液，在无菌条件下培养24小时。

D.将B和C步骤交替重复4次。

5)将侵染完成的叶片取出，用PH＝7.0的磷酸缓冲液润洗2次，吸干水分后浸泡在GUS染液中，37℃避光染色12小时，95％酒精褪色后统计GUS的蓝色色斑覆盖度，同时提取RNA测定GUS表达量，计算侵染效率。

结果表明，具体见表2，菌液浓度过低(OD＝0.01)，时间过短(小于0.5小时)显著降低侵染效率，菌液浓度过高(OD＝0.6)、培养时间过长(3小时以上)会大量引起叶片死亡。当侵染液浓度为OD＝0.1、培养时间为3小时，侵染效率最高且没有褐变产生。

表2.短时浸没时不同菌液浓度和侵染时间处理的侵染效率(用GUS结果表示)

在此基础上，对侵染浓度和侵染时间等进一步筛选，一方面证明本发明效果并非由特定参数值所导致，另一方面证明该方法学具有一定的普适性。具体见表3，当侵染浓度为OD＝0.1-0.3，共培养侵染时间为1-3小时，结果差异不明显，叶片的侵染效率都较高，没有或只有极少褐变发生。

表3.短时浸没不同菌液浓度和侵染时间的再次优化(用GUS结果表示)

以上对本申请具体实施方式的描述并不限制本申请，本领域技术人员可以根据本申请做出各种改变或变形，只要不脱离本申请的精神，均应属于本申请所附权利要求的范围。

Claims (10)

1.一种基于农杆菌侵染的植物外植体瞬时转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)外植体构建；

2)农杆菌侵染液制备；

3)负压力施加外植体与农杆菌；

4)将步骤3)处理的外植体与农杆菌侵染液通过暂时多次浸没共培养与侵染。

2.权利要求1所述的基于农杆菌侵染的植物外植体瞬时转化方法，其特征在于，所述步骤4)多次浸没为3-6次；优选的，所述农杆菌侵染液的OD值为0.1-0.3。

3.权利要求1-2任一所述的基于农杆菌侵染的植物外植体瞬时转化方法，其特征在于，所述步骤4)具体为：

A.将步骤3)处理的外植体叶片在吸干多余侵染液后，背面向上铺展；

B.缓慢加入农杆菌侵染液，充分接触但不没过叶背面，共培养；所述农杆菌侵染液OD值为0.1-0.3，共培养为1-3小时；

C.吸干侵染液，缓慢加入不含农杆菌的侵染液，无菌培养20-24小时；

D.B和C步骤交替重复3-6次。

4.权利要求2-3任一所述的基于农杆菌侵染的植物外植体瞬时转化方法，其特征在于，所述步骤3)的负压为0.1-0.4Mpa；优选的，所述步骤3)具体为将外植体叶片浸没于农杆菌侵染液中，并置于真空泵中维持压力0.1-0.4Mpa，2-4分钟后迅速释放压力。

5.权利要求2-4任一所述的基于农杆菌侵染的植物外植体瞬时转化方法，其特征在于，所述步骤1)为：无菌条件下，取继代培养的外植体叶片，浸泡在无菌水中待用；优选的，所述外植体为15天左右叶龄的叶片。

6.权利要求2-5任一所述的基于农杆菌侵染的植物外植体瞬时转化方法，其特征在于，所述步骤2)为：

A.配制侵染液：NN69液体培养基+200μM乙酰丁香酮，灭菌后pH＝5.5；

B.选择农杆菌EHA105为侵染菌株，将带有报告基因的pBI121载体导入农杆菌细胞；

C.将带有目标载体的农杆菌接种至含卡那霉素和利福平的液体LB培养基中震荡培养，收集农杆菌菌体；

D.侵染液悬浮菌体制备含农杆菌的侵染液，备用。

7.权利要求2-6任一所述的基于农杆菌侵染的植物外植体瞬时转化方法，其特征在于，所述方法进一步包括步骤5)：

5)外源基因转化效率检测：将侵染完成的叶片取出，浸泡在GUS染液中，避光染色后统计蓝色色斑计算侵染效率。

8.权利要求2-7任一所述的基于农杆菌侵染的植物外植体瞬时转化方法，其特征在于，所述外植体来源于双子叶植物；优选的，来源于蔷薇科植物；更优选的，来源于梨属植物。

9.一种负压与暂时浸没技术结合在植物瞬时转化中的应用，其特征在于，所述植物瞬时转化依次包含负压力施加外植体叶片步骤和暂时多次浸没共培养与侵染的步骤；

优选的，所述暂时浸没中多次浸没为3-6次；所述农杆菌侵染液的OD值为0.1-0.3。

更优选的，所述暂时浸没包括如下步骤：

A.将负压力施加后的外植体叶片在吸干多余侵染液后，背面向上铺展；

B.缓慢加入农杆菌侵染液，充分接触但不没过叶背面，共培养；所述农杆菌侵染液的OD值为0.1-0.3，共培养为1-3小时；

C.吸干侵染液，缓慢加入不含农杆菌侵染液，无菌培养20-24小时；

D.B和C步骤交替重复4-6次。

10.权利要求9所述的负压与暂时浸没技术结合在植物瞬时转化中的应用，其特征在于，所述外植体来源于双子叶植物；优选的，来源于蔷薇科植物；更有选的，来源于梨属植物。

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