CN111019927A

CN111019927A - 用于表达tev蛋白的重组质粒、重组工程菌，以及制备和纯化tev蛋白的方法

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Publication number: CN111019927A
Application number: CN201911392064.XA
Authority: CN
Inventors: 冯强; 郭刚; 张欣; 张娇娇; 萝莉; 卢文根; 杨念; 熊蜂
Original assignee: Chongqing Ailibi Biological Technology Co ltd
Current assignee: Chongqing Ailibi Biological Technology Co ltd
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2019-12-30
Publication date: 2020-04-17
Anticipated expiration: 2039-12-30
Also published as: CN111019927B

Abstract

本申请公开了一种用于表达TEV蛋白的重组质粒，所述重组质粒包含骨架质粒序列和TEV蛋白表达片段；所述TEV蛋白表达片段依次由上游限制性内切酶位点、蛋白酶酶切位点序列、His6、表达TEV的核苷酸序列、下游限制性内切酶位点组成。本明还提供了表达TEV蛋白的重组工程菌，及其发酵和纯化工艺。本发明的可以帮助生物工程制药企业及实验室研究人员快速、简便且廉价地获得工具酶，解决研究和生产上的难题。

Description

用于表达TEV蛋白的重组质粒、重组工程菌，以及制备和纯化 TEV蛋白的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种高效制备烟草蚀刻病毒蛋白酶的方法。

背景技术

在生物学研究及生物制药实践中，需要表达多种多样的蛋白或多肽。在用载体对这些蛋白或多肽进行重组表达的过程中，会出现诸如不能正确形成二硫键、不能正确折叠、表达量低甚至不能表达等现象。为了克服目的蛋白重组表达的困难，常将目的蛋白或多肽与合适的前导肽融合在一起，用前导肽协助目的蛋白形成正确结构及提高表达量等。然而，这样做又会导致如何去除融合蛋白中的前导肽以纯化重组蛋白的问题。蛋白酶法因其条件温和、无毒、特异性高而被广泛使用。常用的工具蛋白酶有凝血酶(识别位点：Leu-Val-Pro-Arg↓Gly--Ser)，PreScission protease(识别位点：Leu-Glu-Val-Phe-Gln↓Gly-Pro)，因子Xa(识别位点：Ile-Glu/Asp-Gly-Arg↓)和肠激酶(识别位点：Asp-Asp-Asp-Asp-Lys↓)等，后两者切割后不会在目的蛋白的氨基端留下多余氨基酸，对于在氨基端添加氨基酸敏感的多肽或蛋白质来说，此两种酶是首选。但要获得高活性的Xa因子或肠激酶，一般需要真核表达，生产工艺复杂，成本高昂。TEV蛋白酶可以识别一个七个氨基酸的序列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln↓Gly/Ser，切割发生在Gln和Gly/Ser之间，这样会使得目标蛋白的氨基端多一个Gly或Ser。TEV蛋白酶切割的最适温度为30℃，但该酶在4℃也有较好的活性，在很多蛋白酶抑制剂及2mol/L尿素存在的情况下都有活性，并且原核表达的TEV酶也具很好活性。因此，TEV蛋白酶是去除融合蛋白标签的理想选择,尤其是氨基端第一个氨基酸为Gly或Ser的目的蛋白。

当前技术中用大肠杆菌***直接表达TEV酶的方法大部分以包涵体形式表达，其产量不高且溶解度也低。为了提高其溶解度，人们考虑过从包涵体里复性以提高蛋白酶的产量，但其效果并不理想且费时费力。

发明内容

针对上述技术问题，本申请的目的在于通过选择合适的前导肽帮助TEV酶正确折叠且实现可溶表达，提供了制备高活性TEV酶的从上游构建到大规模发酵、纯化的一整套解决方案。

本发明公开了，一种用于表达TEV蛋白的重组质粒，所述重组质粒包含骨架质粒序列和TEV蛋白表达片段；所述TEV蛋白表达片段依次由上游限制性内切酶位点、蛋白酶酶切位点序列、His6、表达TEV的核苷酸序列、下游限制性内切酶位点组成，其中，所述蛋白酶酶切位点序列选自表达TEV酶酶切位点序列、表达EK酶酶切位点序列和表达Xa因子蛋白酶酶切位点序列中的一种；所述骨架质粒选自pCOLD-SUMO、pMal-c4X、pET32a、pET39b(+)和pGEX-6P-2中的一种。

在根据本发明的一个实施方案中，所述上游限制性内切酶位点为BamHI。

在根据本发明的一个实施方案中，所述下游限制性内切酶位点为HindIII或NotI。

在根据本发明的一个实施方案中，所述骨架质粒为pCOLD-SUMO，所述蛋白酶酶切位点序列为表达TEV酶酶切位点序列。

在根据本发明的一个实施方案中，所述骨架质粒为pGEX-6P-2，所述蛋白酶酶切位点序列为表达TEV酶酶切位点序列。

本发明还提供了一种用于表达TEV蛋白的重组工程菌，所述重组工程菌含有上述的重组质粒，所述宿主菌为XL1-Blue或BL21(DE3)。

在根据本发明的一个实施方案中，所述宿主菌为XL1-Blue，所述重组质粒为以pGEX-6P-2为骨架质粒，以表达TEV酶酶切位点序列为蛋白酶酶切位点序列的重组质粒。

在根据本发明的一个实施方案中，所述宿主菌为BL21(DE3)，所述重组质粒为以pCOLD-SUMO为骨架质粒，以表达TEV酶酶切位点序列为蛋白酶酶切位点序列的重组质粒。

本发明进一步提供了一种利用上述的重组工程菌制备TEV蛋白的发酵方法，包括：

将所述重组工程菌接种于动物源TB培养基中，摇菌扩繁至对数期时加入IPTG诱导表达。

优选地，所述TB培养基中蛋白胨和酵母提取物含量为正常TB培养基含量的一半，甘油含量是2ml/L；

优选地，发酵罐中重组工程菌的接种比例是8-12％，优选为10％，种子菌转种OD_600nm值在2.0-3.0；

优选地，所述培养基中甘油含量为1-4ml/L，优选为2ml/L；

优选地，所述培养基中溶解氧浓度为30％-50％，优选为40％；

优选地，所述培养基中诱导条件为在16-30℃温度，IPTG的终浓度为0.1-1mmol/L的条件下诱导2-12h，优选为25℃、IPTG的终浓度为0.2mmol/L条件下，诱导5h。

本发明还提供了一种重组TEV蛋白的纯化方法，包括依次进行的亲和层析、缓冲液置换。

1)将完成发酵的菌体与破菌缓冲液以1g：8ml的重量体积比混合，混匀悬浮，4℃预冷高压破碎；然后，高速离心，收集上清液备用；其中，所述破菌缓冲液由20mmol/L PB、150mmol/L氯化钠、10mmol/L咪唑以及pH7.0缓冲液制备而成；

2)Ni NTA亲和层析纯化；

按每升上清液加入100ml NI填料，20～25℃结合1h以上；以20mmol/L PB+150mmol/L氯化钠+25mmol/L咪唑，pH7.0洗涤除杂后，按每100ml GST填料加入100ml20mmol/L PB+150mmol/L氯化钠+500mmol/L咪唑重悬后转移入玻璃蛋白层析柱静止5min，使TEV蛋白酶充分洗脱；随后用100ml 20mmol/L PB+150mmol/L氯化钠+1mol/L咪唑继续洗脱，收集流穿即获得TEV蛋白酶。

优选地，还包括3)通过G25层析置换缓冲液进行脱盐处理；优选地，使用缓冲液为PBS缓冲液pH7.2；

4)阴离子交换层析或阳离子交换层析。

所述阴离子交换层析使用GE Q HP层析柱，使用缓冲液为缓冲液A：20mol/L PBpH7.1，缓冲液B：20mol/L PB+1mol/L氯化钠pH7.1；所述阳离子交换层析使用GE SP HP层析柱，使用缓冲液为缓冲液A：20mmol/L PB pH6.1，缓冲液B：20mmol/L PB+1mol/L氯化钠pH6.1。

本发明具有以下有益效果：

本发明将多种标签蛋白与目的蛋白融合，并进行了反复的筛选，最终获得了目的蛋白TEV蛋白酶大部分可溶表达的重组工程菌株。通过简单的纯化步骤即可获得纯度高，活性好的TEV蛋白酶。

本发明的重要意义在于可以帮助生物工程制药企业及实验室研究人员快速、简便且廉价地获得工具酶，解决研究和生产上的难题。

本发明的特色和创新之处在于：

本发明的重组质粒表达的融合蛋白中的TEV蛋白酶具有良好的酶切活性，在表达过程中将自身从融合蛋白上切割下来并以可溶形式表达。

本发明提供的发酵工艺可靠，表达量高，每升培养基至少可生产最终纯度超过99％的TEV蛋白酶达到130mg。

本发明的纯化工艺简单、成本低廉，所获最终产品纯度高、活性好。

附图说明

图1为pGEX-6P-2-TEV/XL1-Blue在0.6mmol/L IPTG诱导后不同温度条件下的表达情况示意图；其中，M：中分子量蛋白标准；1：0.6mmol/L IPTG诱导，25℃培养过夜；2：0.6mmol/L IPTG诱导，16℃培养过夜；3：0.6mmol/L IPTG诱导，20℃培养过夜；4：0.6mmol/LIPTG诱导,30℃培养6小时；5：0.6mmol/L IPTG诱导,35℃培养4小时；由图可见，目的蛋白在上清有很好的表达，且在表达过程中对融合蛋白进行了酶切，目的蛋白已经游离出来。

图2为pGEX-6P-2-TEV/XL1-Blue层析柱纯化效果图；其中，1：纯化后(10mmol/L咪唑破菌后25mmol/L咪唑洗去杂蛋白最后300mmol/L咪唑洗脱)；M：中分子量蛋白标准；2：超声破菌上清；

图3为pCOLD-SUMO-TEV/BL21(DE3)及pCOLD-SUMO(His6-)-TEV/BL21(DE3)表达及Ni-NTA初步层析结果图；其中，M：中分子量蛋白标准；1：pCOLD-SUMO/ML21(DE3)；2：pCOLD-SUMO-TEV/BL21(DE3)诱导前；3：pCOLD-SUMO-TEV/BL21(DE3)诱导后；4：500mmol/L咪唑洗脱；5：1mol/L咪唑洗脱；6：pCOLD-SUMO(His6-)-TEV/BL21(DE3)诱导前；7：pCOLD-SUMO(His6-)-TEV/BL21(DE3)诱导后；8：500mmol/L咪唑洗脱；9：1mol/L咪唑洗脱；实心箭头表示目的蛋白，空心箭头表达标签蛋白SUMO，由于去掉His6后，pCOLD-SUMO(His6-)-TEV/BL21(DE3)表达的SUMO不再结合于Ni-NTA填料。

图4为pGEX-6p-2-TEV/XL1-blue的发酵表达效果示意图；其中，M：中分子蛋白质标准；1：诱导前的pGEX-6p-2-TEV/XL1-blue；2：0.2mmol/L IPTG诱导1h；3：0.2mmol/L IPTG诱导2h；4：0.2mmol/L IPTG诱导3h；5：0.2mmol/L IPTG诱导4h；6：0.2mmol/L IPTG诱导5h；箭头表示目的蛋白TEV蛋白酶。

图5为发酵表达的TEV蛋白酶及其Ni-NTA纯化结果示意图；其中，M：中分子量蛋白标准；1：TEV破菌全菌；2：TEV破菌离心上清；3：TEV破菌离心沉淀；4：TEV Ni-NTA流穿；5：20mmol/L PB+150mmol/L氯化钠+25mmol/L咪唑洗脱液；6：20mmol/L PB+150mmol/L氯化钠+500mmol/L咪唑洗脱液；7：20mmol/L PB+150mmol/L氯化钠+1mol/L咪唑洗脱液；

图6为TEV蛋白酶Q HP层析纯化蛋白电泳图；其中，M：中分子量蛋白标准；1：Q HP上样；2：Q HP流穿；3：Q HP平衡峰；4：Q HP洗脱峰；

图7为在缓冲***pH6.1时，TEV蛋白酶通过SP HP纯化的色谱图；1：洗脱峰1#；2：洗脱峰2#；3：洗脱峰3#；

图8为在缓冲***pH6.1时，TEV蛋白酶在SP HP纯化过程中收集的各样品；M：中分子量蛋白标准；1：SP HP流穿；2：SP HP洗脱峰1#；3：SP HP洗脱峰2#；4：SP HP洗脱峰3#；

图9为TEV蛋白酶Q HP层析纯化流穿液HPLC结果图；其中，目的蛋白保留时间:16.949min，纯度87.236％

图10为TEV蛋白酶SP HP层析纯化洗脱峰3#HPLC；其中，目的蛋白保留时间:16.856min，纯度99.336％；

图11为TEV蛋白酶对融合蛋白的酶切活性检测结果图；其中，M：中分子量蛋白标准；1：37度，20mmol/L PB,100mmol/L氯化钠，2mol/L尿素，100mmol/L咪唑，TEV酶；2：4度，20mmol/L PB,100mmol/L氯化钠，2mol/L尿素，100mmol/L咪唑，TEV酶；3：20mmol/L PB,100mmol/L氯化钠，2mol/L尿素，100mmol/L咪唑；4：37度，20mmol/L PB,100mmol/L氯化钠，2mol/L尿素，300mmol/L咪唑，TEV酶；5：4度，20mmol/L PB,100mmol/L氯化钠，2mol/L尿素，300mmol/L咪唑，TEV酶；6：20mmol/L PB,100mmol/L氯化钠，2mol/L尿素，300mmol/L咪唑；7：TEV酶；箭头所示为目的蛋白PTH(1-34)；结果表明，融合蛋白能在比较宽松的条件被TEV酶切割。

具体实施方式

以下实施例用于说明本申请，但不用来限制本申请的范围。

下面将更详细地描述本申请的具体实施例。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。

如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

实验试剂与材料

1.菌株、质粒

菌株BL21(DE3)，DH5alpha大肠杆菌购于Novagen公司；菌株XL-1blue大肠杆菌为美国安捷伦公司产品；质粒pGEX-6p-2为美国GE Healthcare公司产品；质粒pET32a，pET39b(+)为美国Merck公司产品；pMal-c4X为NEB公司产品；pCOLD-SUMO购自索来宝公司。

2.试剂

TEV酶、EK酶购自碧云天生物技术有限公司，Xa因子蛋白酶北京百奥莱博科技有限公司。

primeSTAR HS DNA聚合酶、DNA分子量标准、限制性内切酶、蛋白分子量标准、DNA连接酶、点突变试剂盒(MutanBest)等为大连宝生物(TakaRa)公司产品；质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒为美国Omega公司产品；蛋白胨和酵母提取物购自英国Oxoid公司，培养基购自北京奥博星生物技术有限责任公司。

PBS(磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.2g(国产分析纯)，磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)2.9g(国产分析纯)，氯化钠(NaCl)8.0g(国产分析纯)，氯化钾(KCl)0.2g，加水至1000mL，pH7.4)；20mol/L PB缓冲液：磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.2g，磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)2.9g，氯化钾(KCl)0.2g，加水至1000mL，pH6.0；氨苄西林、卡那霉素(华北制药)；5×蛋白质上样缓冲液：250mmol/L Tris-HCl(pH6.8)、10％(W/V)SDS、0.5％(W/V)溴酚蓝、50％(V/V)甘油、5％(W/V)β-巯基乙醇；谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B(美国GE Healthcare公司)；Ni-NTA购自Novagen公司。琼脂粉、吐温-20等其余试剂均为市售分析纯。

实施例1重组TEV蛋白工程菌的构建有表达纯化初步研究

TEV酶选择SEQ ID NO:1的氨基酸序列，将编码DNA(SEQ ID NO:2)密码优化后委托上海生物工程有限公司在其(TEV)基础上合成如下片段：

上游限制性内切酶位点-TEV酶切位点(TEVs，EDLYFQS)-His6-TEV-下游限制性内切酶位点，命名为TEVsTEV，序列为SEQ ID NO：3。其中，上游酶切位点为BamHI，下游酶切位点为HindIII及NotI。

同时设计并交上海生物工程有限公司合成以前述片段为模板扩增如下片段的引物：

上游限制性内切酶位点-EKs(EK酶位点)-His6-TEV-下游限制性内切酶位点，片段命名为EKsTEV，

上游引物,PEKTEV1:5’GGTGGATCCGATGACGATGACAAACACCACCACCACCACCACCACGGTGA 3’(SEQ ID NO:4)

上游限制性内切酶位点-Xas(Xa位点)-His6-TEV-下游限制性内切酶位点，片段命名为XasTEV，

上游引物,PXATEV1:5’GGTGGATCCATCGAGGGTCGCCACC ACCACCACCACCACCACGGTGA3’(SEQ ID NO:5)

两片段共用下游引物，PTEV2：5'TAAGCGGCCGCGCCAAGCTTT CATTAGCGGCGGCGGCGACG3'(SEQ ID NO:6)

以TEVsTEV为模板，分别以PEKTEV1及PTEV2、PXATEV1及PTEV2为引物，用宝生物的PCR试剂盒扩增EKsTEV、XasTEV。

分别用BamHI+HindIII及BamHI+NotI双酶切片段TEVsTEV、EKsTEV及XasTEV，按表1的方式进行重组表达载体的构建。

表1重组TEV酶表达载体的构建

将通过完成表1实验而构建的重组质粒转化大肠杆菌DH5alpha；对在含氨苄青霉素的LB(LA)平板上筛选到的阳性克隆进行单菌落液体培养、收集细菌并用质粒提取试剂盒进行质粒提取，质粒用相应双酶切鉴定正确后分别转化大肠杆菌XL1-Blue(pGEX-TTEV、pGEX-ETEV及pGEX-XTEV)及BL21(DE3)(其余重组质粒)构建重组工程菌。

实施例2重组TEV蛋白工程菌的摇瓶表达

挑取重组工程菌单菌落进行摇瓶10ml表达的研究。即挑各重组工程菌入10ml LA，37度、200转/分振摇培养至OD_600nm达0.6-0.8时分别加入终浓度为0.2-1mmol/L IPTG诱导，30度诱导6小时，37度诱导4小时，其余温度过夜培养。离心收集细菌并用2ml PBS重悬，进行超声破菌，对超声破菌上清进行10％SDS-PAGE考察目的表达，结果如图1所示。对目的蛋白进行初步的Ni-NTA亲和层析并10％SDS-PAGE，结果如图2所示。

在多种载体表达的比较研究中发现pGEX-TTEV/XL1-Blue(如图1所示)，pCOLD-TTEV/BL21(DE3)(如图3所示)两个重组工程菌，目的蛋白TEV酶以可溶表达形式从融合蛋白中分离出来，表明融合蛋白中的TEV酶在表达过程中具备酶活性。

由于pCOLD-SUMO载体的SUMO标签自身带His6，故对pCOLD-TTEV重组质粒进行去His6突变，其突变方法如下：

突变引物PCOLDSH-R：5'CATATGCACTTTGTGATTCATGGTGT ATTACC 3'

PCOLDSH-F:5'TCGGACTCAGAAGTCAATCAAGAAGCTAAGC CAG 3'

以pCOLD-TTEV为模板进行全长扩增，用宝生物MutanBest试剂盒按说明书方法进行突变体构建，去掉His6的pCOLD-TTEV命名为pCOLD-H-TTEV。突变体测序正确后转化BL21(DE3)以构建pCOLD-H-TTEV/BL21(DE3)继续进行表达研究，对超声破菌上清进行初步Ni-NTA亲和层析，然后进行10％SDS-PAGE，结果如附图3所示。

实施例3重组TEV蛋白工程菌的发酵

本实施例中使用的TEV蛋白工程菌为含有表达TEV重组蛋白的pGEX-6p-2载体(pGEX-6p-2-TEV)的大肠杆菌XL1-Blue(pGEX-6p-2-TEV/XL1-blue)。

1.发酵条件的确定

1)培养基对工程菌生长与目的蛋白表达的影响：

在摇瓶中测试2种培养基对工程菌生长的影响：

动物源性TB(磷酸二氢钾2.31g、十二水磷酸氢二钠25.79g、甘油4ml、酵母提取物24g、动物源胰蛋白胨12g，加水至1L)；动物源性改良TB(磷酸二氢钾2.31g、十二水磷酸氢二钠25.79g、甘油2ml、酵母提取物12g、动物源胰蛋白胨6g、七水硫酸镁0.5g、硫酸铵1.16g，加水至1L)。

取pGEX-6p-2-TEV/XL1-Blue接种于Amp⁺(100μg/mL)LB平板内，37℃孵育16h-20h，挑取单菌落于10ml Amp⁺LB培养基里，置摇床中37℃、220rpm摇到OD_600nm大约0.5-1.0时，按1:100分别接种于100ml 2种培养基中，37℃、220rpm摇16h，每2h取样测OD_600nm。

将新鲜TEV工程菌菌液(OD600大约0.5-1.0)按1:100分别接种于100ml TB和改良TB培养基中，37℃、220rpm摇至OD_600nm大约0.8左右时，加入1mmol/L IPTG，25℃诱导12h。取100ml菌液离心，弃上清，称重TB:g、改良TB:g。以1g:10ml加PBS超声(功率300瓦)裂解10min(工作5秒，休息5秒)破菌，结合GST-琼脂糖凝胶4B(参考实施例2)，通过用10％SDS-PAGE结果判定重组工程在各培养基中的表达效果。

结果表明：单位目的蛋白表达量改良TB好于正常TB，故TEV工程菌发酵选用改良TB培养基。

2)不同种子菌接种量下工程菌的生长和目的蛋白的表达情况

研究8％、10％、12％三种不同种子菌接种量对发酵的影响。通过细菌生长曲线、单位蛋白表达量来确定最佳接种量。当种子菌OD_600nm在2.0-3.0左右时，转入发酵罐内培养，每1h取样测OD_600nm，直到诱导前结束，绘制工程菌前期生长期曲线来判断细菌生长速度快慢。诱导结束后，按照上述破菌方法处理，再进行10％SDS-PAGE以判断单位目的蛋白表达量。

结果表明：10％种子菌接种量获得的单位目的蛋白表达量最高。

3)甘油浓度对目的蛋白表达的影响：

发酵时培养基中甘油的量对菌量的多少有很大影响。当培养基中甘油耗完时，pH值和溶氧值会迅速上升，此时应马上流加10％浓度的甘油溶液，以维持菌体的继续生长，待生长至对数期后期时，加入IPTG开始诱导。因此，甘油含量的多少将直接决定诱导时机。通过研究培养基中甘油含量为1ml/L、2ml/L、4ml/L时目的蛋白表达情况，来确定最佳甘油浓度。10％SDS-PAGE以判断单位目的蛋白表达量。

结果表明：2ml/L甘油浓度时，表达量最高；1ml/L其次；4ml/L最差。故TEV工程菌发酵时甘油量选为2ml/L。

4)不同溶氧浓度对目的蛋白表达的影响：

工程菌发酵过程中，培养基中溶解氧浓度的高低对细菌生长有很大影响，所以发酵过程中对溶氧的控制很重要，现分别考察溶氧在30％、40％、50％时细菌生长和目的蛋白的表达情况。10％SDS-PAGE以判断单位目的蛋白表达量。

结果表明：40％溶氧条件下，细菌长得最好；同时40％溶氧时，目的蛋白的表达量也是最好的，故TEV工程菌发酵时溶氧浓度选为40％。

5)不同IPTG浓度对目的蛋白表达的影响：

将新鲜TEV工程菌菌液(OD_600nm大约0.5-1.0)按1:100分别接种于4个100ml改良TB培养基中，37℃、220rpm摇至OD_600nm大约0.8左右时，分别加入IPTG，使其终浓度分别是0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L，25℃诱导12h。然后分别离心，弃上清，破菌，再进行10％SDS-PAGE以判断单位目的蛋白表达量。

结果如图4所示：IPTG终浓度为0.2mmol/L时蛋白表达量明显好于0.1mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L时的蛋白表达量，故TEV工程菌发酵时IPTG终浓度选为0.2mmol/L。

6)不同诱导温度和诱导时间对目的蛋白表达的影响

考察16℃、25℃、30℃三个不同诱导温度下目的蛋白的表达情况，以及达到最大表达量时所用的时间。其中，诱导后每2h取样，诱导10h，如上述要求处理样品，进行10％SDS-PAGE以判断单位目的蛋白表达量。

结果表明：25℃时单位表达量是最高的，且表达用时最短，4h-6h之间的表达差异不大。而16℃、30℃时单位表达量不如25℃，且表达时间长。故TEV工程菌发酵时最适诱导温度为25℃，诱导时间为5h。

综上，本发明确定了重组TEV蛋白的最适发酵工艺：

(1)基础培养基为动物源性改良TB培养基，其中蛋白胨和酵母提取物含量为正常TB含量的一半，甘油含量是2ml/L；

(2)发酵罐种子菌的接种比例是10％，种子菌转种OD_600nm值在2.0-3.0左右；

(3)控制发酵过程溶氧浓度在40％左右；

(4)发酵过程中pH和溶氧升高时，流加10％甘油溶液以维持菌体生长；

(5)诱导条件是：25℃、IPTG浓度为0.2mmol/L、诱导5h。

2.发酵工艺放大

按照上述优化的工艺条件进行发酵规模放大(12L)3次，分别收获菌体330g，445g，376g；对破菌上清进行10％SDS-PAGE后分别用灰度扫描法测得目的蛋白量分别为20.8，21.4，21.1％。

如图4所示，目的蛋白表达量随时间的延长明显增加，5h时表达量已达最高。

综上：重组TEV工程菌发酵工艺放大完全达到预期结果。本发明的发酵工艺可适用于大规模的工业发酵生产。

实施例4：重组TEV蛋白的纯化工艺

1、破菌上清制备

取实施例2发酵生产的各批次菌体100g加入20mmol/L PB+150mmol/L氯化钠+10mmol/L咪唑，pH7.0缓冲液，按重量：体积比1g:8ml比例加入，混匀悬浮，4℃预冷高压破碎：使用蒸馏水冲洗高压匀质机(高压匀质机AH-1500，加拿大ATS工业***有限公司)管道，低温循环***开启预冷至1-4℃备用。将预冷的悬浮菌液加入高压匀质机，压力维持在750-800bar破菌3-5次。高速离心：破菌后的液体装入离心桶(Beckman，美国)，4℃，7500rpm，离心30min，收集上清备用。

2、Ni-NTA亲和层析纯化

按每升上清液加入100ml Ni填料，20～25℃结合1h以上，结合过程采用垂直旋转或搅拌的方法以促进TEV蛋白酶与Ni填料的结合。将上述结合TEV蛋白的Ni填料采用20mmol/L PB+150mmol/L氯化钠+25mmol/L咪唑，pH7.0洗涤5个体积以除去未与Ni填料结合的杂蛋白。然后按每100ml GST填料加入100ml 20mmol/L PB+150mmol/L氯化钠+500mmol/L咪唑重悬后转移入玻璃蛋白层析柱静止5min，使TEV蛋白酶充分洗脱；随后用100ml20mmol/L PB+150mmol/L氯化钠+1mol/L咪唑继续。收集流穿即获得TEV蛋白酶，进行10％SDS-PAGE分析。结果如附图5所示，

实验显示，经过Ni填料亲和后获得的TEV蛋白酶的含量与纯度有了显著的提高，且工艺具有很好的稳定性，为后续进一步纯化奠定了基础。

3.G25层析置换缓冲液

仪器***：NGC Quest100 plus Chromatography System(美国Bio-Rad公司)；层析填料：G25；柱规格：50ml预装柱；装柱体积：50ml；缓冲液：PBS缓冲液；上样样品：Ni-NTA洗脱样品；流速：10ml/min。将上步纯化获得的样品通过G25层析柱置换缓冲液，收集蛋白峰。

4.阴离子交换层析

层析柱选择GE 5ml Q HP柱仪器***：NGC Quest100 plus ChromatographySystem(美国Bio-Rad公司)缓冲液：缓冲液A:20mmol/L PB，pH7.1，缓冲液B:20mmol/L PB+1mol/L氯化钠，pH7.1，上样样品：G25层析收集的流穿上样流速：5ml/min，洗脱流速5ml/min；洗脱程序：100％B，10个柱体积(CV)。收集：将上样过程的流穿液(TEV-Q)，平衡时出现的小峰，洗脱峰。进行10％SDS-PAGE纯度分析(附图6)及HPLC纯度分析(附图9)，评价纯化效果。从附图6可以看出，在阴离子层析过程中，目的蛋白基本不挂柱，在流穿液大量存在；而杂蛋白则吸附于柱上。经此层析后，目的蛋白纯度有明显的提高。

5.阳离子交换层析

层析柱选择GE 5ml SP HP柱；仪器***：NGC Quest100 plus ChromatographySystem(美国Bio-Rad公司)；缓冲液：缓冲液A:①20mmol/L PB，pH7.1，②20mmol/L PB+1mol/L氯化钠，pH7.1；缓冲液B:①20mmol/L PB，pH6.1，②20mmol/L PB+1mol/L氯化钠，pH6.1。上样样品：Q HP层析收集的流穿调pH7.1和6.1。上样流速：5ml/min，洗脱流速5ml/min；洗脱程序：0-100％B，10个柱体积(CV)。收集：分别收集洗脱峰1#，2#及3#(附图7)，并进行10％SDS-PAGE纯度分析，评价纯化效果(附图8)。洗脱峰3#(TEV-SP-3)同时进行HPLC纯度检测(附图10)。

在阳离子层析过程中，pH较低的条件下，TEV蛋白酶在层析过程中分离效果更好，纯度更高。

6.三批次TEV蛋白酶纯化统计(表1)

计算为每升培养基产率如表2所示：

表2培养基产率表

发酵批次	一	二	三
				发酵培养基(L)	12	12	12
收获细菌	330	445	376
				收获蛋白(mg/100g细菌)	500	530	550
收获蛋白(mg/L培养基)	137.5	196.5	172.3

实施例5：重组TEV酶HPLC纯度检测

参照《中国药典》2015版三部附录III高效液相色谱法。高效液相色谱仪：ShimadzuLC-2040C 3D(日本Shimadzu)。色谱柱：Agilent ZORBAX 300SB-C3(美国Agilent)。乙腈购自Honeywell公司，三氟乙酸(TFA)购自Aladdin公司。流动相A：含0.1％TFA的100％水溶液；流动相B：含0.1％TFA的乙腈-水(90:10)溶液。检测条件：柱温30℃，214nm紫外检测，对照品，待测样品：TEV-Q及TEV-SP-3，分别上样10μl；梯度洗脱：0-17min，B：10％-30％；17-30min，B：30％-100％；30-38min,B:100％；38-40min，B:100％-10％；40-50min，B:10％；流速：0.2ml/min，采用外标法计算待测样品含量，面积归一化法计算待测样品纯度。纯度检测结果如图9、图10所示。

实施例6：重组TEV酶活性检测

将本发明纯化的TEV蛋白酶对本公司表达的融合蛋白SUMO-PTH(1-34)在如下条件下：

20mmol/L PB+100mmol/L氯化钠+2mol/L尿素，pH7.1

再改变咪唑及温度进行切割。进行10％SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色。酶切产物大小为约16kD的SUMO标签和约4kD目的蛋白PTH(1-34)，如图11所示。通过与其他公司的TEV蛋白酶进行活性比较，本发明的TEV蛋白酶的比活性不低于对照品。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本申请作了详尽的描述，但在本申请基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本申请精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本申请要求保护的范围。

序列表

<110> 重庆艾力彼生物科技有限公司

<120> 用于表达TEV蛋白的重组质粒、重组工程菌，以及制备和纯化TEV蛋白的方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 242

<212> PRT

<213> TEV(TEV)

<400> 1

Gly Glu Ser Leu Phe Lys Gly Pro Arg Asp Tyr Asn Pro Ile Ser Ser

1 5 10 15

Ser Ile Cys His Leu Thr Asn Glu Ser Asp Gly His Thr Thr Ser Leu

20 25 30

Tyr Gly Ile Gly Phe Gly Pro Phe Ile Ile Thr Asn Lys His Leu Phe

35 40 45

Arg Arg Asn Asn Gly Thr Leu Leu Val Gln Ser Leu His Gly Val Phe

50 55 60

Lys Val Lys Asp Thr Thr Thr Leu Gln Gln His Leu Val Asp Gly Arg

65 70 75 80

Asp Met Ile Ile Ile Arg Met Pro Lys Asp Phe Pro Pro Phe Pro Gln

85 90 95

Lys Leu Lys Phe Arg Glu Pro Gln Arg Glu Glu Arg Ile Cys Leu Val

100 105 110

Thr Thr Asn Phe Gln Thr Lys Ser Met Ser Ser Met Val Ser Asp Thr

115 120 125

Ser Cys Thr Phe Pro Ser Ser Asp Gly Ile Phe Trp Lys His Trp Ile

130 135 140

Gln Thr Lys Asp Gly Gln Cys Gly Ser Pro Leu Val Ser Thr Arg Asp

145 150 155 160

Gly Phe Ile Val Gly Ile His Ser Ala Ser Asn Phe Thr Asn Thr Asn

165 170 175

Asn Tyr Phe Thr Ser Val Pro Lys Asn Phe Met Glu Leu Leu Thr Asn

180 185 190

Gln Glu Ala Gln Gln Trp Val Ser Gly Trp Arg Leu Asn Ala Asp Ser

195 200 205

Val Leu Trp Gly Gly His Lys Val Phe Met Val Lys Pro Glu Glu Pro

210 215 220

Phe Gln Pro Val Lys Glu Ala Thr Gln Leu Met Asn Glu Arg Arg Arg

225 230 235 240

Arg Arg

<210> 2

<211> 726

<212> DNA

<213> TEV(TEV)

<400> 2

ggtgaaagct tgtttaaggg tccacgtgat tacaacccga tttcgagcag catttgtcat 60

ttgaccaatg aatctgatgg tcacacaaca tcgttgtatg gtattggttt tggtccgttc 120

atcattacaa acaagcactt gtttcgccgt aataatggta cactgttggt ccaatcactg 180

catggtgtat tcaaggtcaa ggacaccacc actttgcaac aacacctcgt tgatggtcgt 240

gacatgatca ttattcgcat gcctaaggat ttcccaccat ttcctcaaaa gctgaaattt 300

cgcgagccac aacgcgaaga gcgcatttgt cttgtgacaa ccaacttcca aactaagagc 360

atgtctagca tggtgtcaga cactagttgc acattccctt catctgatgg catcttctgg 420

aagcattgga ttcaaaccaa ggatggtcag tgtggcagtc cattagtatc aactcgcgat 480

ggtttcattg ttggtatcca ctcagcatcg aatttcacca acacaaacaa ttatttcaca 540

agcgtgccga aaaacttcat ggaattgttg acaaatcagg aggcgcagca gtgggttagt 600

ggttggcgtt taaatgctga ctcagtattg tggggtggcc ataaagtttt catggttaaa 660

cctgaagagc cttttcagcc agttaaggaa gcgactcaac tcatgaatga acgtcgccgc 720

cgccgc 726

<210> 3

<211> 803

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtggatccg aggatctgta ctttcagagc caccaccacc accaccacca cggtgaaagc 60

ttgtttaagg gtccacgtga ttacaacccg atttcgagca gcatttgtca tttgaccaat 120

gaatctgatg gtcacacaac atcgttgtat ggtattggtt ttggtccgtt catcattaca 180

aacaagcact tgtttcgccg taataatggt acactgttgg tccaatcact gcatggtgta 240

ttcaaggtca aggacaccac cactttgcaa caacacctcg ttgatggtcg tgacatgatc 300

attattcgca tgcctaagga tttcccacca tttcctcaaa agctgaaatt tcgcgagcca 360

caacgcgaag agcgcatttg tcttgtgaca accaacttcc aaactaagag catgtctagc 420

atggtgtcag acactagttg cacattccct tcatctgatg gcatcttctg gaagcattgg 480

attcaaacca aggatggtca gtgtggcagt ccattagtat caactcgcga tggtttcatt 540

gttggtatcc actcagcatc gaatttcacc aacacaaaca attatttcac aagcgtgccg 600

aaaaacttca tggaattgtt gacaaatcag gaggcgcagc agtgggttag tggttggcgt 660

ttaaatgctg actcagtatt gtggggtggc cataaagttt tcatggttaa acctgaagag 720

ccttttcagc cagttaagga agcgactcaa ctcatgaatg aacgtcgccg ccgccgctaa 780

tgaaagcttg gcgcggccgc tta 803

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtggatccg atgacgatga caaacaccac caccaccacc accacggtga 50

<210> 5

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggtggatcca tcgagggtcg ccaccaccac caccaccacc acggtga 47

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taagcggccg cgccaagctt tcattagcgg cggcggcgac g 41

Claims

1.一种用于表达TEV蛋白的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包含骨架质粒序列和TEV蛋白表达片段；所述TEV蛋白表达片段依次由上游限制性内切酶位点、蛋白酶酶切位点序列、His6、表达TEV的核苷酸序列、下游限制性内切酶位点组成，其中，所述蛋白酶酶切位点序列选自表达TEV酶酶切位点序列、表达EK酶酶切位点序列和表达Xa因子蛋白酶酶切位点序列中的一种；所述骨架质粒选自pCOLD-SUMO、pMal-c4X、pET32a、pET39b(+)和pGEX-6P-2中的一种。

2.如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述上游限制性内切酶位点为BamHI。

3.如权利要求1或2所述的重组质粒，其特征在于，所述下游限制性内切酶位点为HindIII或NotI。

4.如权利要求1-3中任一项所述的重组质粒，其特征在于，所述骨架质粒为pCOLD-SUMO，所述蛋白酶酶切位点序列为表达TEV酶酶切位点序列。

5.如权利要求1-3中任一项所述的重组质粒，其特征在于，所述骨架质粒为pGEX-6P-2，所述蛋白酶酶切位点序列为表达TEV酶酶切位点序列。

6.一种用于表达TEV蛋白的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌含有如权利要求1-5中任一项所述的重组质粒，所述宿主菌为XL1-Blue或BL21(DE3)。

7.如权利要求6所述的重组工程菌，其特征在于，所述宿主菌为XL1-Blue，所述重组质粒为以pGEX-6P-2为骨架质粒，以表达TEV酶酶切位点序列为蛋白酶酶切位点序列的重组质粒。

8.如权利要求6所述的重组工程菌，其特征在于，所述宿主菌为BL21(DE3)，所述重组质粒为以pCOLD-SUMO为骨架质粒，以表达TEV酶酶切位点序列为蛋白酶酶切位点序列的重组质粒。

9.利用如权利要求6-8中任一项所述的重组工程菌制备TEV蛋白的发酵方法，其特征在于，包括：

优选地，所述培养基中甘油含量为1-4ml/L，优选为2ml/L；

优选地，所述培养基中溶解氧浓度为30％-50％，优选为40％；

10.一种重组TEV蛋白的纯化方法，其特征在于，包括：

1)将根据权利要求9完成发酵的菌体与破菌缓冲液以1g：8ml的重量体积比混合，混匀悬浮，4℃预冷高压破碎；然后，高速离心，收集上清液备用；其中，所述破菌缓冲液由20mmol/L PB、150mmol/L氯化钠、10mmol/L咪唑以及pH7.0缓冲液制备而成；

2)NI-NTA亲和层析纯化；

按每升上清液加入100ml Ni填料，20～25℃结合1h以上；以20mmol/L PB+150mmol/L氯化钠+25mmol/L咪唑，pH7.0洗涤除杂后，按每100ml GST填料加入100ml 20mmol/L PB+150mmol/L氯化钠+500mmol/L咪唑重悬后转移入玻璃蛋白层析柱静止5min，使TEV蛋白酶充分洗脱；随后用100ml 20mmol/L PB+150mmol/L氯化钠+1mol/L咪唑继续洗脱，收集流穿即获得TEV蛋白酶。

优选地，还包括3)通过G25层析置换缓冲液进行脱盐处理；

4)阴离子交换层析或阳离子交换层析。