KR20130130563A - 전체 세포 분리 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 N-아세틸 글루코사민의 불용성 고분자인 키틴에 대해 높은 친화도를 갖는 키틴 결합 도메인 또는 셀룰로오스에 높은 친화도를 갖는 셀룰로오스 결합 도메인이 진핵 세포 표면에 부여된 세포 선택의 새로운 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 ChBD (Chitin binding domain) 또는 CBD (Cellulose binding domain)를 포함하는 발현 카세트를 진핵세포에 도입하고, 상기 도입된 진핵세포를 선별하는 단계를 포함하는 형질전환된 진핵세포의 분리 방법, 원형질막의 분리 방법, 상기 발현 카세트, 발현 카세트를 포함하는 벡터, 상기 벡터가 도입된 진핵세포 및 상기 발현 카세트를 포함하는 형질전환된 진색세포 분리용 키트에 관한 것이다.

Description

전체 세포 분리 방법 {Method for purification of intact cells}

본 발명은 N-아세틸 글루코사민의 불용성 고분자인 키틴에 대해 높은 친화도를 갖는 키틴 결합 도메인 또는 셀룰로오스에 높은 친화도를 갖는 셀룰로오스 결합 도메인이 진핵 세포 표면에 부여된 세포 선택의 새로운 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 ChBD (Chitin binding domain) 또는 CBD (Cellulose binding domain)를 포함하는 발현 카세트를 진핵세포에 도입하고, 상기 도입된 진핵세포를 선별하는 단계를 포함하는 형질전환된 진핵세포의 분리 방법, 원형질막의 분리 방법, 상기 발현 카세트, 발현 카세트를 포함하는 벡터, 상기 벡터가 도입된 진핵세포 및 상기 발현 카세트를 포함하는 형질전환된 진색세포 분리용 키트에 관한 것이다.

개체군으로부터 변형된 세포를 선택하는 것은 분자 생물학에서 가장 중요한 방법 중의 하나이다. 발현된 단백질에 마커 (Flag 및 GFP 등)의 선택적인 부가는 분자 생물학에서 표준 방법이 되어오고 있다. 가장 흔히 사용되는 마커는 형광 단백질 및 에피토프 태그이다. 녹색 형광 단백질 (GFP)과 같은 형광 마커는 GFP가 부가된 단백질이 발현되고 있음을 확인하고 형광 현미경에 의한 상기 단백질의 세포내 위치 및 유세포 분석기를 통한 단백질을 발현하는 세포의 분리 연구를 가능하게 한다. 유사하게, 항체를 갖는 항원 또는 니켈과 같은 리간드에 친화도를 갖는 펩티드의 단백질 태깅 (tagging)은 단백질에 부가되고, 세포에서 주어진 단백질의 위치를 연구, 분석 절차 후 분자를 동정, 및 친화도 크로마토그래피에 의한 단백질을 분리하는데 사용된다. 따라서, 개개의 단백질 레벨에서 상기 실험은 표지된 단백질의 발현 패턴 연구 및 유세포 분석에 의해 그것을 발현하는 세포를 분리하는 방법들 중의 한가지 방법이 될 수 있다. 상기 방법에서 중요한 점은 이들 모든 방법들에서 상기 태그는 그것이 연결되어 있는 단백질의 성질을 변형시키지 말아야 한다는 것이다.

이에, 상기 분자 생물학 방법 중에서 개체 군집 중 소수 구성 성분으로 존재하는 세포를 쉽고 단순하게 분리할 수 있는 세포 표면을 표지하는 강력한 유전학적 방법의 필요성이 요구되고 있다. 특히, 그러한 방법은 형질전환 빈도가 낮을 때 형질전환체를 농축하는데 중요할 수 있고, 타겟 세포가 커다란 개체군의 소수 구성 성분일 때 세포 표면에 결합하는 파지의 조합 항체 선택을 용이하게 한다. 또한 그러한 방법은 생화학 연구를 위한 원형질막의 빠른 친화성 기반 분리를 가능하게 한다.

효소인 키티나제 (chitinase) 및 셀룰라제 (cellulase)는 지구상에서 가장 풍부한 불용성 고분자인 키틴 및 셀룰로오스를 가수분해한다. 그들은 활성 부위가 기질에 친화성을 갖는 표준 효소 포맷뿐만 아니라 각각 불용성인 기질에 대한 작은 부착된 결합 도메인을 갖는 점에서 특이하다 (도 1). 키틴-결합 도메인의 경우, 상기 작은 부착물은 불용성인 기질에 대해 공유결합 에너지를 갖는다. 만약 키틴 및 셀룰로오스 결합 도메인인 ChBD 및 CBD로 명명된 이들 결합 도메인들이 진핵세포 표면에 발현될 수 있다면, 상기 세포는 동물 세포에는 존재하지 않는 불용성 고분자에 대해 친화성을 갖을 것이다. 이와 같은 ChBD를 이용한 세포의 분리는 E.coli와 같은 원핵세포에서 사용하는 방법 (Jen-You Wang et al., Applied and Environmental Microbiology, JAN. (2006), 927-931) 또는 ChBD를 융합 단백질의 형태로 진핵세포에서 발현시키는 방법 등이 보고되고 있으나, ChBD 또는 CBD를 진핵세포의 표면에서 발현시켜서 ChBD 또는 CBD가 형질전환된 세포 전체를 완전한 형태 (intact form)로 분리하는 방법에 대해서 개시된 바는 없다.

세포를 분리하는 방법으로는 세포 표면 단백질에 대한 항체 또는 아비딘-바이오틴 시스템을 사용한 방법이 이용될 수 있다. 그러나, 항체는 일반적으로 키틴-결합 도메인의 친화성이 없으며, 사용하기에는 비용 부담이 크다. 또한, 아비딘은 테트라머이고, 바이오틴은 필수 비타민이기에 상기 리간드가 모든 세포에 이미 존재함에 따라서, 아비딘-바이오틴 시스템은 소수 구성 성분인 세포를 분리하기에는 적합하지 않다. 즉, 만약에 아비딘 테트라머가 기능적인 형태로 세포 표면에 발현될 수 있다고 하더라도 아비딘은 이미 리간드로 포화되어 있다. 사실, 상기 아비딘-바이오틴 시스템은 이미 사용 가능성에 대해 연구가 되었으나, 진핵세포에서 실패하였다. 또한, 유세포 분석기를 이용한 분리 방법을 사용할 수 있지만, 이와 같은 방법은 비싼 기기를 필요로 하는 단점이 있다. 따라서, 진핵세포의 개체군집에서 소수 구성 성분으로 존재하는 세포 전체를 효과적으로 분리 및 상기 원형질막을 분리 정제하는 간단하고 비용이 저렴한 방법의 필요성은 여전히 대두 되고 있다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 원하는 진핵세포를 특이적으로 분리 및 원형질막을 분리시키기 위한 방법을 찾기 위해 예의 노력한 결과, ChBD 또는 CBD 발현 카세트를 이용하여, ChBD 또는 CBD를 발현하는 전체 세포를 효과적으로 분리하고, 원형질막을 분리 정제할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다. 본 발명에서 사용되는 ChBD 발현 카세트의 키틴에 대한 결합 기능성 또는 CBD 발현 카세트의 셀룰로오스에 대한 결합 기능성은 진핵세포에서 대응관계를 가지고 있지 않아서 변형된 세포 표면을 임의의 다른 동물 세포와 구분시킬 수 있는 장점이 있다.

본 발명의 하나의 목적은 ChBD (chitin binding domain) 또는 CBD (Cellulose binding domain)를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함하는, 벡터를 진핵세포에 도입하는 단계; 및 상기 벡터가 도입된 진핵세포를 키틴 또는 셀룰로오스가 코팅된 비드를 이용하여 선별하는 단계를 포함하는, 목적 유전자가 형질전환된 진핵세포의 분리 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 ChBD 또는 CBD를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함하는, 벡터를 진핵세포에 도입하는 단계; 상기 진핵세포를 분쇄하여 균질액을 수득하는 단계; 및 균질액을 키틴 또는 셀룰로오스가 코팅된 비드를 이용하여 선별하는 단계를 포함하는, 원형질막의 분리 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 ChBD 또는 CBD를 코딩하는 유전자를 포함하는 목적 유전자를 발현하는 진핵세포를 분리하기 위한 발현 카세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 벡터가 도입된 진핵세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 발현 카세트를 포함하는 형질전환된 세포 분리용 키트를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 ChBD (chitin binding domain)를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함하는, 벡터를 진핵세포에 도입하는 단계; 및 상기 벡터가 도입된 진핵세포를 키틴이 코팅된 비드를 이용하여 선별하는 단계를 포함하는, 목적 유전자가 형질전환된 진핵세포의 분리 방법을 제공하는 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 CBD (cellulose binding domain)를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함하는, 벡터를 진핵세포에 도입하는 단계; 및 상기 벡터가 도입된 진핵세포를 셀룰로오스가 코팅된 비드를 이용하여 선별하는 단계를 포함하는, 목적 유전자가 형질전환된 진핵세포의 분리 방법을 제공하는 것이다.

구체적으로 상기 방법은 (a) (i) ChBD (chitin binding domain)를 코딩하는 유전자; (ii) 트랜스멤브레인 도메인 (transmembrane)을 코딩하는 유전자; 및 (iii) 목적 유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함하는, 벡터를 진핵세포에 도입하는 단계; 및 (b) 상기 벡터가 도입된 진핵세포를 키틴이 코팅된 비드를 이용하여 선별하는 단계를 포함하는, 목적 유전자가 형질전환된 진핵세포의 분리 방법을 제공한다.

또한 상기 방법은 CBD를 사용할 경우, (a) (i) CBD (cellulose binding domain)를 코딩하는 유전자; (ii) 트랜스멤브레인 도메인 (transmembrane)을 코딩하는 유전자; 및 (iii) 목적 유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함하는, 벡터를 진핵세포에 도입하는 단계; 및 (b) 상기 벡터가 도입된 진핵세포를 셀룰로오스가 코팅된 비드를 이용하여 선별하는 단계를 포함하는, 목적 유전자가 형질전환된 진핵세포의 분리 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어, "ChBD (chitin binding domain)"는 키티나제 (chitinase) 효소의 구성 성분으로 키틴에 결합할 수 있는 키티나제의 구성 도메인 중의 하나이다. 이와 같은 키티나제 효소 및 ChBD의 구조는 도 1에 나타낸 바와 같다. 대부분의 키티나제는 도 1에 나타낸 바와 같이 서로 독립적으로 기능하는 별개의 촉매 도메인 및 비-촉매 도메인을 갖는 모듈형 도메인 구성을 갖는다. ChBD는 단백질 서열 유사성을 기초로 3개의 구조 클래스 (타입 1, 2 또는 3) 중 하나에 속할 수 있으며, 개별 키티나제에 따라, ChBD의 존재는 촉매 도메인에 의한 키틴 가수분해를 향상시키거나 억제할 수 있다. 상기 ChBD는 불용성인 기질에 대해 공유결합 에너지를 갖으며, 본 발명의 목적상 사이 ChBD가 진핵세포 표면에서 발현하면, 상기 ChBD를 발현하는 진핵세포는 동물 세포에는 존재하지 않는 불용성 고분자에 대해 친화성을 가져서 상기 진핵세포를 손쉽게 분리할 수 있다. 키틴 (N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)의 β-1,4-연결된 비분지형 중합체)은 지구 상에서 셀룰로스 다음으로 두번째로 가장 풍부한 불용성 중합체를 구성하며 이는 동물세포 등 진핵세포에는 대부분 존재하지 않아, ChBD를 표면에 발현하는 진핵세포 전체를 분리하기에 용이할 수 있다.

본 발명의 상기 ChBD를 코딩하는 유전자는 진균, 세균 및 곤충 등 다양한 세포 유래의 유전자를 사용할 수 있으나, 바람직하게는 애로모나드 (Aeromonads) 속, 바실러스 (Bacillus) 속, 비브리오 (Vibrio) 속 유래일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. ChBD는 키티나제로부터 유래하는 임의의 ChBD를 사용할 수 있으나, 키티나제 효소 활성으로부터 분리된 ChBD가 바람직하다. 이와 같은 ChBD 유전자 정보는 공지의 데이터 베이스인 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 GenBank 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 바실러스 서큘란스 (Bacillus circulans) 유래의 ChBD를 사용하였다. 바람직하게는 ChBD는 서열번호 21로 기재되는 아미노산 서열일 수 있다.

본 발명에서 용어, "CBD (cellulose binding domain)"는 탄수화물 분해와 관련된 다양한 효소군인 셀룰라아제 (cellulase), 자일란나아제 (xylenase), 헤미셀룰라아제 (hemicellulase), 엔도-만나나아제 (endo-mannanase), 아세틸-자일렌에스터라제 (acetyl-xylanesterase), 에스터라아제 (esterase), 펙테이트 리아제 (pectate lyase), 베타-글리코시다아제 (β-glycosidase), 엔도 글루카나아제 (endoglucanase) 등 다양한 효소에 포함되는 단백질 구조이며, 단백질이 셀룰로오스에 결합되도록 하는 기능을 하는 구성 도메인 중의 하나이다. 상기 CBD를 코딩하는 유전자는 진균, 세균 및 곤충 등 다양한 세포 유래의 유전자를 사용할 수 있으나, 바람직하게는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 클로스트리디움 써모셀럼 (Clostridium thermocellum), 셀룰로모나스 피미, 클로스트리디움 셀룰로보란스 (Clostridium cellulovorans)를 비롯한 세균 유래의 것과, 트리코더마 레세이 (Trichoderma reesei), 트리코더마 비리디(Trichoderma viride) 등의 곰팡이 유래의 것들이 알려져 있으며 크기 및 구조에 있어서도 다양한 것들이 알려져 있으나, 이에 제한되지는 않는다. CBD의 유전자 정보는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 트리코더마 레세이 유래의 CBD를 사용하였다. 바람직하게 상기 CBD는 서열번호 26으로 기재되는 아미노산 서열일 수 있다.

본 발명에서 용어, "트랜스멤브레인 도메인 (transmembrane domain)"은 트랜스멤브레인 단백질의 알파 헬릭스를 의미할 수 있다. 이는 세포막을 뚫고 나와 존재하는 단백질에서 세포막을 관통하는 영역을 의미하며, 대부분 소수성 아미노산으로 구성된 α나선구조이다. 이와 같은 트랜스멤브레인 도메인은 본 발명의 발현 카세트 내의 ChBD 도메인 또는 CBD 도메인이 세포 표면에서 발현할 수 있도록 세포막에 존재할 수 있다. 바람직하게는 PDGFR TMD (platelet derived growth factor recptor transmembrane domain), CD80 TM (murine B7-1), 인간 TCRzeta, 인간 CD8, 인간 ASGPR (asialoglycoprotein receptor) 또는 인간 Fc γ 수용체일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이와 같은 트랜스멤브레인 도메인의 유전자 정보는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 PDGFR TMD를 트랜스멤브레인 도메인으로 사용하였다. 바람직하게 상기 PDGFR TMD은 서열번호 23으로 기재되는 아미노산 서열일 수 있다.

본 발명에서 용어, "목적 유전자"란 형질전환된 진핵세포에 형질전환된 유전자를 의미하며, 치료용 단백질을 코딩하는 유전자 또는 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 형질전환시켜서 분리하고자 하는 유전자는 본 발명의 목적상 제한없이 포함될 수 있다. 바람직하게는 세포 군집 내에서 소수의 개체군을 구성하는 유전자일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 EGFP (enhanced green fluorescence protein)를 목적 유전자로 사용하여 본 발명의 발현 카세트가 ChBD 및 EGFP 모두를 기능적으로 온전히 발현시키는 것을 확인하였다.

바람직하게 상기 (a) 단계의 발현 카세트는 분비 시그널 펩티드를 코딩하는 유전자를 5'-말단에 추가로 포함할 수 있다. 이와 같은 분비 시그널 펩티드를 코딩하는 유전자는 ChBD 또는 CBD를 코딩하는 유전자의 5'-말단에 위치시켜서 ChBD 또는 CBD를 세포 외부로 분비를 유도할 수 있다. 바람직하게는 생쥐 또는 인간의 Ig K 리더, 인간 Ig λ 리더, Ig 중쇄 V 리더, 인간 성장 호르몬 리더, IL-7 리더 (interleukin-7 leader), IL-2 수용체 리더 (interleukin-2 receptor leader), IL-4 수용체 리더 (interleukin-4 receptor leader), 제1형 IL-1 수용체 리더 (type I interleukin-1 receptor leader) 또는 제2형 IL-1 수용체 리더 (type Ⅱ interleukin-1 receptor leader)일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이와 같은 분비 시그널 펩티드의 유전자 정보는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 Ig K 리더를 분비 시그널 펩티드로 사용하였다. 바람직하게 상기 Ig K 리더는 서열번호 19로 기재되는 아미노산일 수 있다.

바람직하게, 상기 (a) 단계의 발현 카세트는 ChBD를 코딩하는 유전자의 5' 위치 또는 3' 위치 중 하나 또는 5' 및 3' 위치 모두에 에피토프 태그를 코딩하는 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 또한, CBD를 사용할 경우, 상기 (a) 단계의 발현 카세트는 CBD를 코딩하는 유전자의 5' 위치 또는 3' 위치 중 하나 또는 5' 및 3' 위치 모두에 에피토프 태그를 코딩하는 유전자를 추가로 포함할 수 있다.

이와 같은 에피토프 태그는 본 발명의 ChBD 또는 CBD의 발현 수준을 검출하는 태그로 사용할 수 있다. 사용가능한 태그는 그 예로 HA (Hemagglutinie A) 에피토프, MYC 에피토프, B-태그 (VP7 protein of blue-tongue virus, "QYPALT" (서열번호 31)) E 태그 (GAPVPYPDPLEPR (서열번호 32)), FLAG 태그 (DYKDDDDK (서열번호 33)) His6 태그 (HHHHHH (서열번호 34)), HSV 태그 (QPELAPEDPED (서열번호 35)), Pk 태그 (P/V proteins of paramyxovirus SV5, GKPIPNPLLGLDST (서열번호 36)), 단백질 C 태그 (EDQVDPRLIDGK (서열번호 37)), T7 태그 (Major capsid protein of the T7 phage, MASMTGGQQMG (서열번호 38)), VSV-G 태그 (Vesicular Stomatitis Virus Glycoprotein, YTDIEMNRLGK (서열번호 39)) 또는 V5 태그 (simian virus 5, GKPIPNPLLGLDST (서열번호 40)) 일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는 HA (Hemagglutinie A) 에피토프 또는 MYC 에피토프 일 수 있다. 상기 HA 에피토프는 서열번호 20으로 기재되는 아미노산 서열일 수 있으며, MYC 에피토프는 서열번호 22로 기재되는 아미노산 서열일 수 있다. 이와 같은 에피토프 태그의 유전자 정보는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 HA를 5' 위치에, Myc을 3' 위치에 위치시켰다.

상기 유전자들은 바람직하게는 작동가능하게 연결된 발현 카세트로서, 벡터의 형태일 수 있다. 바람직하게는 5' 위치부터 IgK-HA 에피토프-ChBD-MYC-PDGFR TMD-EGFP가 작동가능하게 연결된 발현 카세트일 수 있으며, 이는 도 2A에 나타낸 바와 같다. 또는 IgK-HA 에피토프-CBD-MYC-PDGFR TMD-EGFP가 작동가능하게 연결된 발현 카세트일 수 있다. 바람직하게는 상기 ChBD를 포함하는 발현 카세트는 서열번호 17로 기재되는 아미노산 서열 또는 서열번호 18로 기재되는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게 상기 CBD를 포함하는 발현 카세트는 서열번호 24로 기재되는 아미노산 서열 또는 서열번호 25로 기재되는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 "작동가능하게 연결된 (operably linked)"은, 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되면 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편의 영향을 받지만, 이들 핵산 단편의 여러 가능한 결합 조합 중에서 각 단편이 그 기능을 수행하는데 있어 검출할 만한 영향이 없는 상태의 결합을 의미한다. 즉, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 아울러, 본 발명의 발현 카세트는 전사를 조절하기 위한 임의의 전사 시작 조절 서열 및 전사 종결 조절 서열을 추가로 포함할 수 있다. 작동가능한 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.

바람직하게 상기 진핵세포는 상기 발현 카세트의 각 구성요소의 정상적인 구현이 가능한 모든 균주를 제한없이 사용할 수 있으며, 본 발명의 목적상 곰팡이, 효모, 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주), 동물세포 및 식물세포 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어 "발현 카세트"란 ChBD 또는 CBD를 발현할 수 있는 단위, 트랜스멤브레인 도메인을 발현할 수 있는 단위, 및 목적 유전자를 발현할 수 있는 단위로 구성된 카세트를 의미한다.

또한, 본 발명에서 용어, "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 유전자를 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

본 발명의 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다. 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.

바람직하게 상기 (a) 단계의 벡터를 진핵세포에 도입하는 단계는 트랜스펙션 (transfection) 또는 형질도입 (transduction)에 의해 외래 DNA를 세포로 유입시키는 것으로 수행될 수 있다. 이와 같은 트랜스펙션은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 트랜스펙션법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당 분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 형질도입은 감염 (infection)을 수단으로 하여 바이러스 입자를 사용하여 목적물을 세포 내로 전달시키는 것을 의미한다. 아울러, 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 본 발명에서 도입은 형질전환과 혼용되어 사용될 수 있다.

바람직하게 상기 (b) 단계는 ChBD를 포함하는 발현 카세트의 경우에는 상기 (a) 단계의 벡터가 도입된 진핵세포를 키틴이 코팅된 비드를 이용하여 선별할 수 있다. 상기 (c) 단계는 CBD를 포함하는 발현 카세트의 경우에는 상기 (a) 단계의 벡터가 도입된 진핵세포를 셀룰로오스가 코팅된 비드를 이용하여 선별할 수 있다.

상기 진핵세포의 표면에 발현하는 ChBD 단백질에 결합하기 위한 키틴 또는 CBD 단백질에 결합하기 위한 셀룰로오스는 세포 군집으부터 목적 유전자가 도입된 진핵세포를 용이하게 선별할 수 있도록 임의로 자화되어 자성을 띌 수 있다. 자화된 키틴 또는 셀룰로오스는 키틴 또는 셀룰로오스를 자기 물질과 결합시켜 제조된다. 자기 물질은 분산된 파편, 예를 들어 철 파일링 (filing)일 수 있다. 바람직하게, 자화된 키틴 또는 셀룰로오스는 비드 형태로 존재하지만, 자화된 키틴 또는 셀룰로오스는 임의로 불활성일 수 있는 추가의 물질에 코팅으로서 사용될 수 있다. 비드의 크기는 중요하지 않지만, 직경 200 nm 미만의 크기로부터 형성된 비드가 멸균 필터를 통해 통과하고 자기력이 적용될 때까지 배지 중에서 콜로이드를 형성하는 잇점이 있다. 그러나, 이와 같은 크기에 제한되지 않으며, 보다 큰 비드도 사용될 수 있다. 키틴 비드 또는 셀룰로오스 비드는 솔리드형 (solid)이거나 (예를 들어, 뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인크.) 다공성일 수 있다. 또한, 비드는 다양한 수단에 의해, 예를 들어, 철 파일링을 비드 전체에 분산시킴으로써 또는 철 코어를 갖는 비드를 형성함으로써 (철을 키틴 또는 셀룰로오스로 코팅하여) 자화될 수 있다. 본 발명에서 사용된 키틴 비드 또는 셀룰로오스 비드는 그들의 결합 특성을 유의하게 변경시키지 않으면서 멸균될 수 있다. 키틴 비드 또는 셀룰로오스 비드를 세포 성장 동안 배양 배지에 첨가할 때, 비드는 멸균시키는 것이 바람직하다. 자성 키틴-코팅된 비드 또는 자성 셀룰로오스-코팅된 비드와 결합하는 목적 단백질이 도입된 진핵세포는 자기장 내에서 수거되고, 도입되지 않은 세포는 비드로부터 세척 제거된다. 이어서, 키틴 또는 셀룰로오스가 코팅된 비드를 자기장으로부터 해제하고, 수거된 세포는 키틴 자기 비드 또는 셀룰로오스 자기 비드 상에 무한정 고정된 상태로 유지하거나, 분리가능한 ChBD일 경우 키틴으로부터 해리할 수 있으며, 분리가능한 CBD일 경우 셀룰로오스로부터 해리할 수 있다. 진핵세포는 키틴 또는 셀룰로오스에 결합하는 단백질을 천연적으로 생산하지 않으므로, 경쟁 결합 및 오염이 방지될 수 있다. 추가로, 단백질 분해 절단 부위가 ChBD 또는 CBD와 목적하는 단백질 사이에 존재하는 경우, ChBD 또는 CBD 태그는 목적하는 세포로부터 프로테아제 (예를 들어, 엔테로키나제, 게네나제, 푸린, 인자 X 등)를 사용한 소화에 의해 방출될 수 있다. ChBD-키틴 상호작용 또는 CBD-셀룰로오스 상호작용의 강한 특성으로 ChBD 또는 CBD가 표면에 발현되는 세포는 어떠한 형태의 자화된 키틴 또는 셀룰로오스에도, 예를 들어 비드에도 신속하게 고정될 수 있다. 자화된 키틴이 비드 형태인 경우, 결합된 ChBD를 표면에 발현하는 세포는 자기장 내에서 수초 내에 수거될 수 있다. 자화된 셀룰로오스가 비드 형태인 경우에도, 결합된 CBD를 표면에 발현하는 세포는 자기장 내에서 수초 내에 수거될 수 있다.

특히, 본 발명의 방법의 경우 세포 내에서 발현이 적게 되는 유전자 또는 발현이 어려운 유전자가 세포 군집에 혼재해 있을 경우, 세포 표면에 ChBD 또는 CBD를 발현하는 세포를 손쉽게 분리할 수 있는 장점이 있으며, 형질전환된 세포를 완전한 (intact) 형태로 분리할 수 있다.

본 발명자들은 진핵세포 표면 상에서 ChBD를 발현하는 진핵세포를 선별하기 위하여, 도 2A와 같은 ChBD를 발현할 수 있는 발현 카세트를 제조하고, 이를 pBudCE4.1 벡터를 기반으로 BH1 벡터를 제조하고 (도 2B), pCEP4 벡터를 기반으로 BH2 벡터를 제조하였다 (도 2C). 또한 제조한 BH1 벡터가 형질전환이 효율적인지 여부를 공초점 현미경으로 분석한 결과, BH1 벡터 내의 EGFP가 효율적으로 발현되는 것을 확인하여 (도 3), 본 발명의 발현 카세트가 진핵세포 내에서 효율적으로 형질전환될 뿐만 아니라, 기능적으로 발현 카세트 내의 유전자들이 발현할 수 있는 것을 확인하였다. 아울러, 키틴 비드에 상기 발현 벡터가 도입된 진핵세포가 특이적으로 결합하여 상기 진핵세포를 분리할 수 있는 지 자성 키틴-코팅된 비드와 함께 항온처리한 결과, 본 발명의 상기 벡터는 키틴 비드에 효율적으로 결합하는 구조체를 발현시키는 것을 확인하여 (도 4B), 본 발명의 ChBD 발현 카세트가 효율적으로 ChBD를 진핵세포의 표면에 발현시키고 키틴 비드에 특이적으로 결합할 수 있도록 키틴과의 결합능을 기능적으로 유지하는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과들은 본 발명의 발현 카세트를 이용하여 ChBD를 발현하는 진핵세포를 상기 진핵세포에 흠을 주지 않고, 특이적으로 분리할 수 있음을 뒷받침하는 것이다. 또한, CBD 발현 세포가 셀룰로오스 극세사에 결합하는 것을 확인하였다 (도 6 및 7). 이와 같은 결과들은 본 발명의 발현 카세트를 이용하여 CBD를 발현하는 진핵세포를 상기 진핵세포에 흠을 주지 않고, 특이적으로 분리할 수 있음을 뒷받침하는 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 ChBD를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함하는, 벡터를 진핵세포에 도입하는 단계; 상기 진핵세포를 분쇄하여 균질액을 수득하는 단계; 및 균질액을 키틴이 코팅된 비드를 이용하여 선별하는 단계를 포함하는, 원형질막의 분리 방법을 제공한다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 CBD를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함하는, 벡터를 진핵세포에 도입하는 단계; 상기 진핵세포를 분쇄하여 균질액을 수득하는 단계; 및 균질액을 셀룰로오스가 코팅된 비드를 이용하여 선별하는 단계를 포함하는, 원형질막의 분리 방법을 제공한다.

구체적으로 상기 원형질막의 분리 방법은 (a) (i) ChBD (chitin binding domain)를 코딩하는 유전자; 및 (ii) 트랜스멤브레인 도메인 (transmembrane)을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함하는, 벡터를 진핵세포에 도입하는 단계; (b) 상기 벡터가 도입된 진핵세포를 분쇄하여 균질액을 수득하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 분쇄된 균질액을 키틴이 코팅된 비드를 이용하여 선별하는 단계를 포함하는, 원형질막의 분리 방법을 제공한다.

또한 상기 방법은 CBD를 사용할 경우, 상기 원형질막의 분리 방법은 (a) (i) CBD를 코딩하는 유전자; 및 (ii) 트랜스멤브레인 도메인 (transmembrane)을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함하는, 벡터를 진핵세포에 도입하는 단계; (b) 상기 벡터가 도입된 진핵세포를 분쇄하여 균질액을 수득하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 분쇄된 균질액을 셀룰로오스가 코팅된 비드를 이용하여 선별하는 단계를 포함하는, 원형질막의 분리 방법을 제공한다.

ChBD를 코딩하는 유전자 또는 CBD를 코딩하는 유전자, 트랜스멤브레인 도메인을 코딩하는 유전자, 발현 카세트, 벡터를 진핵세포에 도입하는 단계, 키틴이 코팅된 비드를 이용하여 선별하는 방법은 상기에서 설명한 바와 동일하다.

본 발명에서 용어, "원형질막 (plasma membrane)"은 진핵세포를 둘러싼 막으로 인지질 이중층에 막단백질이 삽입 또는 결합되어 있는 형태를 의미하며, 세포막에는 선택 투과성, 피자극성, 식장용, 생체전기 발생, 능동수송, 면역 특성의 발현 등 세포의 생활에 있어서 중요하고 복잡한 기능을 담당하고 있어서, 이의 분리는 생화학 연구를 위해서 중요하다.

바람직하게, 상기 (b) 단계의 균질액을 수득하는 단계는 음파분쇄 방법 등 공지된 다양한 방법으로 수행할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면 진핵세포 표면에 ChBD를 발현하는 진핵세포를 음파분쇄하여 얻은 균질액을 자성 키틴-코팅된 비드와 항온처리한 결과, 키틴-코팅된 비드에 진핵세포의 원형질막 단편이 결합되어 분리할 수 있음을 확인하였다 (도 5). 이와 같은 결과는 본 발명의 ChBD 발현 카세트가 원형질막을 효율적으로 정제할 수 있음을 뒷받침하는 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 (i) ChBD (chitin binding domain)를 코딩하는 유전자; (ii) 트랜스멤브레인 도메인 (transmembrane)을 코딩하는 유전자; 및 (iii) 목적 유전자를 포함하는, 목적 유전자를 발현하는 진핵세포를 분리하기 위한 발현 카세트를 제공한다.

또 하나의 양태로서, 본 (i) CBD를 코딩하는 유전자; (ii) 트랜스멤브레인 도메인 (transmembrane)을 코딩하는 유전자; 및 (iii) 목적 유전자를 포함하는, 목적 유전자를 발현하는 진핵세포를 분리하기 위한 발현 카세트를 제공한다.

발현 카세트 및 이의 구성 요소는 상기에서 설명한 바와 동일하다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제공한다.

벡터 및 이의 구성 요소는 상기에서 설명한 바와 동일하다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터가 도입된 진핵세포를 제공한다.

벡터가 도입된 진핵세포는 상기에서 설명한 바와 동일하다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 발현 카세트를 포함하는, 형질전환된 진핵세포 분리용 키트를 제공한다.

발현 카세트 및 이의 구성 요소는 상기에서 설명한 바와 동일하다.

본 발명의 상기 키트는 형질전환된 세포를 완전한 형태 (intact form)로 분리 정제하기 위한 키트일 수 있다.

바람직하게 상기 발현 카세트는 벡터에 포함된 형태일 수 있다.

바람직하게 상기 키트는 추가로 숙주세포를 포함할 수 있으며, 본 발명의 목적상 상기 숙주세포는 진핵세포일 수 있다.

바람직하게 상기 키트는 키틴이 코팅된 비드를 추가로 포함할 수 있다. 이와 같은 키틴이 코팅된 비드는 상기에서 설명한 바와 동일하다. 상기 키트는 CBD를 포함하는 발현 카세트를 사용할 경우, 셀룰로오스가 코팅된 비드를 추가로 포함할 수 있다. 또한 상기 키트는 ChBD를 포함하는 발현 카세트 및 CBD를 포함하는 발현 카세트를 동시에 포함할 수 있다.

또한, 상기 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용설명서를 추가로 포함할 수 있다. 사용설명서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함할 수 있다.

본 발명의 방법은 풍부하고 가격이 싼 N-아세틸 글루코사민의 불용성 고분자인 키틴에 대해 높은 친화도를 갖는 ChBD를 이용하여 진핵세포 표면에서 기능적으로 발현시켜서 키틴 비드 등을 이용하거나, 셀룰로오스에 대해 높은 친화도를 갖는 CBD를 이용하여 진핵세포 표면에서 기능적으로 발현시켜서 셀룰로오스 비드 등을 이용하여 형질전환된 세포의 특이적인 회수, 원형질 막 절편의 분리 정제 등에 간편하고 적은 비용으로 유용하게 이용할 수 있을 것이다. 아울러, 세포의 운명을 추적하거나 세포의 소수 개체군을 복구하는 데에서 시험관 내 또는 생체 내에서 다양하게 사용될 수 있을 것으로 예상되며 의약 분야에 응용될 수 있을 것이다.

도 1은 비브리오 하베이 (Vibrio harveyi) 키티나제 A (chitinase A)의 ChBD 구조를 나타낸 도이다. 키토올리고사카라이드와 복합체를 이룬 Vibrio harveyi 키티나제 A의 리본 모식도 (A) 및 정전기력 표면 (B)을 나타낸다 (PDB code: 3B9A). N-터미널 ChBD는 노란색이고; 촉매 도메인 및 삽입 도메인은 청록색이다. 촉매 틈에 결합된 키틴 올리고사카라이드는 자홍색으로 나타낸 공-막대 모델로 나타냈다. 이미지는 PyMol 소프트웨어로 나타냈다.
도 2는 ChBD-EGFP 구조체 (A), BH1 벡터 (B), BH2, EBV (Epstein Barr virus) 기반 벡터 (C)의 모식도를 나타낸다. 상기 구조체는 ChBD의 N-터미널 앞에 쥐의 Ig kappa-chain V-J2-C 시그널 펩티드인 IgK leader 및 HA (Hemagglutinin A) 에피토프를 코딩하는 유전자를 포함한다. 키틴-결합 도메인 (ChBD)은 Bacillus circulans로부터 유래된 것을 사용하였다; PDGFR TMD (platelet derived growth factor receptor transmembrane domain), EGFP (enhanced green fluorescent protein)이다. Myc 에피토프를 코딩하는 유전자 (myc)는 ChBD 및 트랜스멤브레인 도메인 (transmembrane domain) 사이에 위치해 있다.
도 3은 mock (왼쪽), pBudCE4.1-EGFP (중간) 및 BH1(오른쪽)이 트랜스펙션된 HEK 293T 세포에서의 EGFP의 발현을 나타낸 도이다.
도 4는 BH1가 트랜스펙션된 HEK 293T 세포에서 ChBD-EGFP의 세포 표면 발현이 키틴-코팅된 비드에 접착할 수 있도록 해주는 것을 나타낸 도이다. A, 공초점 현미경 이미지는 mock-트랜스펙션된 HEK 293T 세포에서 (왼쪽 위) 어떠한 ChBD-EGFP도 발현되지 않음을 보여주지만, BH1 트랜스펙션된 HEK 293T 세포 (오른쪽 위)에서는 ChBD가 고르게 발현됨을 보여준다. ChBD는 소맥배 응집소와 같이 위치하여 세포막의 외부 표면을 표지한다 (왼쪽 아래 및 오른쪽 아래). B, 선택 후, 비-ChBD-EGFP 발현 세포는 키틴-코팅된 비드에 결합하지 않으나 (왼쪽), ChBD-EGFP 발현 세포는 키틴-코팅된 비드에 특별히 결합할 수 있다(오른쪽).
도 5는 ChBD을 이용한 원형질막 정제를 나타낸 도이다. ChBD-EGFP 트랜스펙션된 HEK 293T 세포 (293T-CG)의 원형질막 절편은 두가지 원형질막 마커 단백질인 알파 1 소디움/포타슘 ATPase 및 판 캐드헤린에 대한 항체를 사용하여 키틴 비드(B), 전체 세포 균질액 (H), 및 여과된 분획 (FT)에 접착된 막 분획을 표지하였다. 대조군으로서 mock-트랜스펙션된 HEK 293T 세포 (293T)로부터의 원형질막 절편을 사용하였다.
도 6은 CBD를 발현하는 세포가 셀룰로오스 극세사와 결합하는 것을 나타낸 도이다.
도 7은 CBD를 발현하는 세포가 셀룰로오스 극세사와 결합하는 것을 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 세포 배양

인간 배아 신장 세포주인 HEK 293T 세포는 ATCC (American Type Culture Collection)로부터 구입하였고, 10% 우태아혈청 (GIBCO) 및 비필수 아미노산 (GIBCO)이 첨가된 DMEM (GIBCO)으로 37℃의 습화된 CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. HEK 293T 세포는 X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Roche)로 트랜스펙션시켰다.

실시예 2: 벡터의 구축

본 발명자들은 ChBD를 진핵세포에서 발현시킬 수 있는 벡터를 다음과 같은 방법으로 구축하였다. 구체적으로 세포 표면상의 EGFP에 연결된 ChBD를 발현하는 벡터를 구축하였다 (도 2A). BH1 벡터는 pBudCE4.1 벡터 (Invitrogen)에 기반하여 제조하였다. ChBD-EGFP 카세트는 CMV 프로모터 조절하의 클로닝 부위에 삽입하였다. EF-1α 프로모터 조절하의 두 번째 클로닝 부위는 다른 관심 유전자를 발현하는데 사용될 수 있다 (도 2B). BH2 벡터는 pCEP4 벡터 (Invitrogen)를 기반으로 제조하였다. BH1로부터의 CMV-ChBD-EGFP 및 EF-1α 프로모터 카세트는 pCEP4의 OriP 앞에 삽입하였다 (도 2C). 구체적인 방법은 다음과 같다.

ChBD-EGFP는 오버랩핑 PCR을 사용하여 클로닝하였다. 첫째로, IgK 리더로부터 PDGFR TMD까지의 절편을 하기 표 1의 프라이머를 사용하여 얻었다. PCR 조건은 1) 95℃에서 5분, 2) 94℃에서 30초, 2) 57℃에서 30초, 4) 72℃에서 1분 후 5) 2)~4) 단계를 30 사이클 반복 실행 후, 6) 72℃에서 10분을 수행하였다.

프라이머 이름	서열	서열번호
CMV-CBD-5	ACGCGTCGACATGGAGACAGACACACTCCTGCTATG	1
CMV-CBD-A	ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACTATCCATATGATGTTCCAGATTATGCTG	2
CMV-CBD-B	GCTGTGTTGACCTGCCAAGCGGATACACCAGGATTTGTCGTGGCCGGCTGGGCCAAGGCTCCAGCATAATCTGGAACATCATATGGATAGTC	3
CMV-CBD-C	GCTTGGCAGGTCAACACAGCTTATACTGCGGGACAATTGGTCACATATAACGGCAAGACGTATAAATGTTTGCAGCCTCACACATCATTGGCAG	4
CMV-CBD-D	GAGATGAGCTTCTGTTCGAGGCCTCGGGGGCCTTGAAGCTGCCACAAGGCAGGAACGTTGGATGGTTCCCATCCTGCCAATGATGTGTGAGGCTG	5
CMV-CBD-E	GGCCTCGAACAGAAGCTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATGCTGTGGGCCAGGACACGCAGGAGGTCATCGTGGTGCCACACTCCTTGCCCTTTAAGG	6
CMV-CBD-F	CATGATGAGGATGATAAGGGAGATGATGGTGAGCACCACCAGGGCCAGGATGGCTGAGATCACCACCACCTTAAAGGGCAAGGAGTGTGGC	7
CMV-CBD-3	CGCGGATCCCTAACGTGGCTTCTTCTGCCAAAGCATGATGAGGATGATAAGGGAGATGATG	8

두 번째로, EGFP 절편은 하기 표 2의 프라이머를 사용하여 pEGFP (Clontech)로부터 증폭하였다. PCR 조건은 1) 95℃에서 5분, 2) 94℃에서 30초, 2) 57℃에서 30초, 4) 72℃에서 1분 후 5) 2)~4) 단계를 30 사이클 반복 실행 후, 6) 72℃에서 10분을 수행하였다.

프라이머 이름	서열	서열번호
EF-GFP-5	CCGTTTCGAACCAGACGTCTGGGCCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG	9
EF-GFP-3	CCGTTTCGAACTCCAGCATGCTGGTCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG	10

상기 EGFP 절편을 pBudCE4.1 벡터 (Invitrogen)의 BstBI 부위에 삽입하여 pBudCE4.1-EGFP를 얻었다.

세 번째로, ChBD 및 EGFP 유전자를 하기 표 3의 프라이머를 사용하여 융합하였다.

프라이머 이름	서열	서열번호
CG-5	ACGCGTCGACATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTAC	11
CG-CP-F	ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTAC	12
CG-CP-R	GCTCCTCGCCCTTGCTCACCATGCTGCCTCCTGCAGCGGCCGCTCCGGAACGTGGCTTCTTCTGCCAAAGCATG	13
CG-EGFP-F	ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC	14
CG-EGFP-R	CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAG	15
CG-3	CGCGGATCCCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAG	16

상기 ChBD-EGFP 융합체를 pBudCE4.1 (Invitrogen)의 SalI 및 BamHI 부위에 삽입하여 BH1를 얻었다.

그런 다음, 다음 프라이머 5'-CGTTCCGGAGCAGCCGCTGCAGG-3' (서열번호 17)와 QuikChange Lightning Multi Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent)를 사용하여 EGFP의 NotI 부위를 제거하였다. BH2를 얻기 위해서, ChBD-EGFP 및 CMV 프로모터를 BH1로부터 증폭하여 pCEP4 (Invitrogen)의 BsrGI 및 BamHI 부위에 삽입하였다. 그런 다음, EF-1α 카세트를 BH1으로부터 증폭하였고, XbaI 및 PciI 부위에 삽입하였다. "ChBD-TM-EGFP" 발현 카세트의 전체 뉴클레오티드 서열은 서열번호 18로, 아미노산 서열은 서열번호 17로 나타냈다. 분비서열인 IgK 리더 서열의 아미노산 서열은 서열번호 19로, HA 태그의 아미노산 서열은 서열번호 20으로, Myc 태그의 아미노산 서열은 서열번호 22로, PDGFR TMD (platelet derived growth factor receptor transmembrane domain)의 아미노산 서열은 서열번호 23으로, ChBD의 아미노산 서열은 서열번호 21로 나타냈다.

실시예 3: 공초점 현미경을 사용한 면역형광 분석

ChBD를 코딩하는 벡터의 형질전환이 효율적인지 여부 및 기능적인 형태로 세포 표면에서 발현되는지 여부를 결정하고자, 상기 형질전환된 세포의 GFP 발현 능력에 대해서 조사하였다.

콜라겐-코팅된 커버 슬립에서 성장시킨 BH1 및 mock이 트랜스펙션된 HEK 293T 세포를 염색 전에 10% 포름알데히드로 고정시켰다. 원형질막을 5 ㎍/㎖의 Alexa Fluor 555가 결합된 소맥배 응집소 (wheat germ agglutinin, Invitrogen)으로 염색하였다. 핵은 5 ㎍/㎖의 Hoechst 34580 (Invitrogen)으로 염색하였다. 공초점 형광 이미지는 60 x 대물렌즈를 가진 Nikon TE2000-U 현미경에 부착된 Bio-Rad (Zeiss) Radiance 2100 Rainbow 레이저 스캔닝 공초점 현미경을 사용하여 얻었다. 순차적인 여기 후에, 같은 세포의 청색, 녹색 및 적색 형광 이미지를 수집하였다. 이미지는 ImageJ 소프트웨어를 가지고 분석하였다. 공동 위치 (co-locaization)는 공초점 현미경에서 측정되듯이 녹색 및 적색 형광의 동시 발생을 의미한다.

그 결과, EGFP 단독 및 ChBD에 연결된 EGFP는 HEK 293T 세포에서 효율적으로 발현되었다 (도 3).

이와 같은 결과는 본 발명의 발현 카세트가 진핵세포 내에서 효율적으로 형질전환 될 뿐만 아니라 기능적으로 발현할 수 있음을 뒷받침하는 것이다.

실시예 4: 세포 결합 분석

또한, ChBD를 코딩하는 벡터의 형질전환이 효율적인지 여부 및 기능적인 형태로 세포 표면에서 발현되는지 여부를 결정하고자, 상기 형질전환된 세포의 GFP 발현 능력 및 키틴 비드에 결합하는 능력에 대해서 조사하였다.

BH1 또는 pBudCE4.1-EGFP가 트랜스펙션된 HEK 293T 세포는 10배의 비-트랜스펙션된 HEK 293T 세포와 혼합하여, 자성 키틴-코팅된 비드 (magnetic chitin-coated beads, New England Biolabs)와 항온처리하였다. 비드는 자석으로 분리하여 실온에서 PBS로 5번 세척하였다. 비드의 분획을 슬라이드에 올려놓고 형광 현미경으로 관찰하였다.

그 결과, ChBD 발현은 세포 표면에 한정된 것을 확인하였다 (도 4A). ChBD-EGFP를 발현하는 세포는 키틴 비드에 효율적으로 결합하는 구조체를 코딩했으나 오직 EGFP만을 발현하는 세포는 그러하지 않았다 (도 4B).

즉, mock-트랜스펙션된 HEK 293T 세포에서는 어떠한 ChBD-EGFP도 발현되지 않았지만 (도 4A의 왼쪽 위), BH1 트랜스펙션된 HEK 293T 세포에서는 ChBD가 고르게 발현되었고 (도 4A의 오른쪽 위), ChBD는 소맥배 응집소와 같이 위치하여 세포막의 외부 표면을 표지하는 것을 확인하였다 (도 4A의 왼쪽 아래 및 오른쪽 아래). 비드에 결합한 세포를 선택한 후, 비-ChBD-EGFP 발현 세포는 키틴-코팅된 비드에 결합하지 않으나 (도 4B의 왼쪽), ChBD-EGFP 발현 세포는 키틴-코팅된 비드에 특별히 결합하는 것을 확인하였다 (도 4B의 오른쪽).

상기와 같은 결과들은 본 발명의 ChBD 발현 카세트가 효율적으로 ChBD를 진핵세포의 표면에 발현시키고 키틴 비드에 특이적으로 결합할 수 있도록 키틴과의 결합능을 기능적으로 유지시키는 것을 시사하는 것으로, 본 발명의 발현 카세트를 이용하여 ChBD를 발현하는 진핵세포를 상기 진핵세포에 흠을 주지 않고, 특이적으로 분리할 수 있는 것을 뒷받침하는 것이다.

실시예 5: 원형질막 정제

ChBD를 발현하는 완전한 세포의 선택뿐만 아니라, 생화학 연구를 위한 원형질막 정제에 대해서도 유용한지 여부를 확인하기 위해, 세포 표면에 키틴-결합 도메인을 발현하는 HEK-293T 세포를 음파분쇄하여 키틴 비드 상에 막 절편을 수집하였다.

구체적으로, BH1 또는 mock가 트랜스펙션된 HEK 293T 세포를 수확하여 실온에서 PBS로 3번 세척하였고, 그 후 600 ㎕의 PBS에서 음파분쇄하였다. 균질액을 자성 키틴-코팅된 비드를 가지고 항온처리하였다. 비드를 자석으로 분리하여 결합되거나 결합되지 않은 분획(여과된)을 수거하였다. 비드를 실온에서 PBS로 5번 세척하고 600 ㎕의 PBS로 재현탁하였다. 균질액, 여과액, 및 비드 분획을 SDS-PAGE 로딩 완충액으로 처리하고 웨스턴 블롯팅을 위해 10 ㎕를 로딩하였다. ChBD-EGFP 트랜스펙션된 HEK 293T 세포 (293T-CG)의 원형질막 절편은 두가지 원형질막 마커 단백질인 알파 1 소디움/포타슘 ATPase 및 판 캐드헤린에 대한 항체를 사용하여 키틴 비드(B), 전체 세포 균질액 (H), 및 여과된 분획 (FT)에 접착된 막 분획을 표지하였다. 대조군으로서 mock-트랜스펙션된 HEK 293T 세포 (293T)로부터의 원형질막 절편을 사용하였다.

그 결과, 전기 영동 및 웨스턴 블롯팅으로 고순도로 원형질막 제조물을 공급할 수 있음을 확인하였다 (도 5).

이와 같은 결과는 본 발명의 ChBD 발현 카세트가 원형질막을 효율적으로 정제할 수 있음을 뒷받침하는 것이다.

실시예 6: CBD 발현 벡터의 구축 및 셀룰로오스 결합 분석

상기 실시예 2와 유사한 방법으로 CBD 발현 벡터를 구축하였다. 본 발명에 사용된 CBD 발현 카세트의 아미노산 서열은 서열번호 24로, 뉴클레오티드 서열은 서열번호 25로 나타냈다.

pCEP4.BH 및 pBUDCE4.1.BH로 클로닝하기 위한 프라이머는 하기 표 4와 같다.

프라이머 이름	서열	서열번호
CBHII_1_fwd	ggagccttggcccagccggccCAGGCTTGCTCAAGCGTCTGGGGCCAATGTGGTGGCCAG	27
CBHII_2_fwd	TGGGGCCAATGTGGTGGCCAGAATTGGTCGGGTCCGACTTGCTGTGCTTCCGGAAGCACA	28
CBHII_3_rvs	ACACTGGGAGTAATAGTCGTTGGAGTAGACGCATGTGCTTCCGGAAGCACAGCAAGT	29
CBHII_4_rvs	gttcgaggcctcgggggccAAGACACTGGGAGTAATAGTCGTTGG	30

CBD를 발현하는 세포와 셀룰로오스 극세사와 결합여부를 분석한 결과, 셀룰로오스 극세사에 CBD를 발현하는 세포가 응집하는 결과를 확인하여, 본 발명의 CBD 발현 카세트가 효율적으로 CBD를 진핵세포의 표면에 발현시키고 셀룰로오스에 특이적으로 결합할 수 있도록 셀룰로오스와 의 결합능을 기능적으로 유지시키는 것을 시사하는 것으로, CBD를 발현하는 진핵세포를 상기 진핵세포에 흠을 주지 않고, 특이적으로 분리할 수 있는 것을 뒷받침하는 것이다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당 업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> SCRIPPS KOREA ANTIBODY INSTITUTE THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE <120> Method for purification of intact cells <130> PA110969/KR <160> 40 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV-CBD-5 primer <400> 1 acgcgtcgac atggagacag acacactcct gctatg 36 <210> 2 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV-CBD-A primer <400> 2 atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60 gactatccat atgatgttcc agattatgct g 91 <210> 3 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV-CBD-B primer <400> 3 gctgtgttga cctgccaagc ggatacacca ggatttgtcg tggccggctg ggccaaggct 60 ccagcataat ctggaacatc atatggatag tc 92 <210> 4 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV-CBD-C primer <400> 4 gcttggcagg tcaacacagc ttatactgcg ggacaattgg tcacatataa cggcaagacg 60 tataaatgtt tgcagcctca cacatcattg gcag 94 <210> 5 <211> 95 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV-CBD-D primer <400> 5 gagatgagct tctgttcgag gcctcggggg ccttgaagct gccacaaggc aggaacgttg 60 gatggttccc atcctgccaa tgatgtgtga ggctg 95 <210> 6 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV-CBD-E primer <400> 6 ggcctcgaac agaagctcat ctcagaagag gatctgaatg ctgtgggcca ggacacgcag 60 gaggtcatcg tggtgccaca ctccttgccc tttaagg 97 <210> 7 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV-CBD-F primer <400> 7 catgatgagg atgataaggg agatgatggt gagcaccacc agggccagga tggctgagat 60 caccaccacc ttaaagggca aggagtgtgg c 91 <210> 8 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV-CBD-3 primer <400> 8 cgcggatccc taacgtggct tcttctgcca aagcatgatg aggatgataa gggagatgat 60 g 61 <210> 9 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EF-GFP-5 primer <400> 9 ccgtttcgaa ccagacgtct gggccgccac catggtgagc aagggcgagg ag 52 <210> 10 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EF-GFP-3 primer <400> 10 ccgtttcgaa ctccagcatg ctggtcttgt acagctcgtc catgccgag 49 <210> 11 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CG-5 primer <400> 11 acgcgtcgac atggagacag acacactcct gctatgggta c 41 <210> 12 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CG-CP-F primer <400> 12 atggagacag acacactcct gctatgggta c 31 <210> 13 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CG-CP-R primer <400> 13 gctcctcgcc cttgctcacc atgctgcctc ctgcagcggc cgctccggaa cgtggcttct 60 tctgccaaag catg 74 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CG-EGFP-F primer <400> 14 atggtgagca agggcgagga gc 22 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CG-EGFP-R primer <400> 15 cttgtacagc tcgtccatgc cgagag 26 <210> 16 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CG-3 primer <400> 16 cgcggatccc tacttgtaca gctcgtccat gccgagag 38 <210> 17 <211> 402 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ChBD-TM-EGFP <400> 17 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Ala 20 25 30 Leu Ala Gln Pro Ala Thr Thr Asn Pro Gly Val Ser Ala Trp Gln Val 35 40 45 Asn Thr Ala Tyr Thr Ala Gly Gln Leu Val Thr Tyr Asn Gly Lys Thr 50 55 60 Tyr Lys Cys Leu Gln Pro His Thr Ser Leu Ala Gly Trp Glu Pro Ser 65 70 75 80 Asn Val Pro Ala Leu Trp Gln Leu Gln Gly Pro Arg Gly Leu Glu Gln 85 90 95 Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ala Val Gly Gln Asp Thr Gln 100 105 110 Glu Val Ile Val Val Pro His Ser Leu Pro Phe Lys Val Val Val Ile 115 120 125 Ser Ala Ile Leu Ala Leu Val Val Leu Thr Ile Ile Ser Leu Ile Ile 130 135 140 Leu Ile Met Leu Trp Gln Lys Lys Pro Arg Ser Gly Ala Ala Ala Ala 145 150 155 160 Gly Gly Ser Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val 165 170 175 Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser 180 185 190 Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu 195 200 205 Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu 210 215 220 Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp 225 230 235 240 His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr 245 250 255 Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu 275 280 285 Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys 290 295 300 Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys 305 310 315 320 Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu 325 330 335 Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile 340 345 350 Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln 355 360 365 Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu 370 375 380 Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu 385 390 395 400 Tyr Lys <210> 18 <211> 1209 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ChBD-TM-EGFP <400> 18 atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60 gactatccat atgatgttcc agattatgct ggagccttgg cccagccggc cacgacaaat 120 cctggtgtat ccgcttggca ggtcaacaca gcttatactg cgggacaatt ggtcacatat 180 aacggcaaga cgtataaatg tttgcagcct cacacatcat tggcaggatg ggaaccatcc 240 aacgttcctg ccttgtggca gcttcaaggc ccccgaggcc tcgaacagaa gctcatctca 300 gaagaggatc tgaatgctgt gggccaggac acgcaggagg tcatcgtggt gccacactcc 360 ttgcccttta aggtggtggt gatctcagcc atcctggccc tggtggtgct caccatcatc 420 tcccttatca tcctcatcat gctttggcag aagaagccac gttccggagc agccgctgca 480 ggaggcagca tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc 540 gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat 600 gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc 660 tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac 720 cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc 780 accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc 840 gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc 900 ctggggcaca agctggagta caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag 960 cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg 1020 cagctcgccg accactacca gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc 1080 gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat 1140 cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctc 1200 tacaagtag 1209 <210> 19 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ig k leader <400> 19 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp 20 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA-tag <400> 20 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 1 5 <210> 21 <211> 52 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ChBD <400> 21 Thr Thr Asn Pro Gly Val Ser Ala Trp Gln Val Asn Thr Ala Tyr Thr 1 5 10 15 Ala Gly Gln Leu Val Thr Tyr Asn Gly Lys Thr Tyr Lys Cys Leu Gln 20 25 30 Pro His Thr Ser Leu Ala Gly Trp Glu Pro Ser Asn Val Pro Ala Leu 35 40 45 Trp Gln Leu Gln 50 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Myc-tag <400> 22 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 1 5 10 <210> 23 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PDGFR TMD <400> 23 Ala Val Gly Gln Asp Thr Gln Glu Val Ile Val Val Pro His Ser Leu 1 5 10 15 Pro Phe Lys Val Val Val Ile Ser Ala Ile Leu Ala Leu Val Val Leu 20 25 30 Thr Ile Ile Ser Leu Ile Ile Leu Ile Met Leu Trp Gln Lys Lys Pro 35 40 45 Arg <210> 24 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CBD expression construct <400> 24 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Ala 20 25 30 Leu Ala Gln Pro Ala Gln Ala Cys Ser Ser Val Trp Gly Gln Cys Gly 35 40 45 Gly Gln Asn Trp Ser Gly Pro Thr Cys Cys Ala Ser Gly Ser Thr Cys 50 55 60 Val Tyr Ser Asn Asp Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu Gly Pro Arg Gly Leu 65 70 75 80 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ala Val Gly Gln Asp 85 90 95 Thr Gln Glu Val 100 <210> 25 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBD expression construct <400> 25 atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60 gactatccat atgatgttcc agattatgct ggagccttgg cccagccggc ccaggcttgc 120 tcaagcgtct ggggccaatg tggtggccag aattggtcgg gtccgacttg ctgtgcttcc 180 ggaagcacat gcgtctactc caacgactat tactcccagt gtcttggccc ccgaggcctc 240 gaacagaagc tcatctcaga agaggatctg aatgctgtgg gccaggacac gcaggaggtc 300 300 <210> 26 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CBD <400> 26 Cys Ser Ser Val Trp Gly Gln Cys Gly Gly Gln Asn Trp Ser Gly Pro 1 5 10 15 Thr Cys Cys Ala Ser Gly Ser Thr Cys Val Tyr Ser Asn Asp Tyr Tyr 20 25 30 Ser Gln Cys Leu 35 <210> 27 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBHII_1_fwd primer <400> 27 ggagccttgg cccagccggc ccaggcttgc tcaagcgtct ggggccaatg tggtggccag 60 60 <210> 28 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBHII_2_fwd primer <400> 28 tggggccaat gtggtggcca gaattggtcg ggtccgactt gctgtgcttc cggaagcaca 60 60 <210> 29 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBHII_3_rvs primer <400> 29 acactgggag taatagtcgt tggagtagac gcatgtgctt ccggaagcac agcaagt 57 <210> 30 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBHII_4_rvs primer <400> 30 gttcgaggcc tcgggggcca agacactggg agtaatagtc gttgg 45 <210> 31 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B-tag <400> 31 Gln Tyr Pro Ala Leu Thr 1 5 <210> 32 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E tag <400> 32 Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg 1 5 10 <210> 33 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FLAG tag <400> 33 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 34 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> His6 tag <400> 34 His His His His His His 1 5 <210> 35 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSV tag <400> 35 Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp 1 5 10 <210> 36 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pk tag <400> 36 Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr 1 5 10 <210> 37 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein C tag <400> 37 Glu Asp Gln Val Asp Pro Arg Leu Ile Asp Gly Lys 1 5 10 <210> 38 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T7 tag <400> 38 Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly 1 5 10 <210> 39 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VSV-G tag <400> 39 Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys 1 5 10 <210> 40 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V5 tag <400> 40 Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr 1 5 10

Claims (24)

1. (a) (i) ChBD (chitin binding domain) 또는 CBD (cellulose binding domain)를 코딩하는 유전자; (ii) 트랜스멤브레인 도메인 (transmembrane)을 코딩하는 유전자; 및 (iii) 목적 유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함하는, 벡터를 진핵세포에 도입하는 단계; 및
   (b) 상기 벡터가 도입된 진핵세포를 키틴 또는 셀룰로오스가 코팅된 비드를 이용하여 선별하는 단계를 포함하는, 목적 유전자가 형질전환된 진핵세포의 분리 방법.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 발현 카세트는 분비 시그널 펩티드를 코딩하는 유전자를 5'-말단에 추가로 포함하는 것인 방법.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 발현 카세트는 ChBD 또는 CBD를 코딩하는 유전자의 5' 위치 또는 3' 위치 중 하나 또는 모두에 에피토프 태그를 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 것인 방법.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 트랜스멤브레인 도메인은 PDGFR TMD (platelet derived growth factor receptor transmembrane domain), CD80 TM (murine B7-1), 인간 TCRzeta, 인간 CD8, 인간 ASGPR (asialoglycoprotein receptor) 및 인간 Fc γ 수용체로 이루어진 군에서 선택된 것인 방법.
   
5. 제2항에 있어서, 상기 분비 시그널 펩티드는 Ig K 리더, Ig λ 리더, Ig 중쇄 V 리더, 인간 성장 호르몬 리더, IL-7 리더 (interleukin-7 leader), IL-2 수용체 리더 (interleukin-2 receptor leader), IL-4 수용체 리더 (interleukin-4 receptor leader), 제1형 IL-1 수용체 리더 (type I interleukin-1 receptor leader) 및 제2형 IL-1 수용체 리더 (type Ⅱ interleukin-1 receptor leader)로 이루어진 군에서 선택된 것인 방법.
   
6. 제3항에 있어서, 상기 에피토프 태그는 HA (Hemagglutinin A) 에피토프 또는 Myc 에피토프인 것인 방법.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 목적 유전자는 치료용 단백질 또는 외래 단백질을 코딩하는 유전자인 것인 방법.
   
8. (a) (i) ChBD (chitin binding domain) 또는 CBD (cellulose binding domain)를 코딩하는 유전자; 및 (ii) 트랜스멤브레인 도메인 (transmembrane)을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함하는, 벡터를 진핵세포에 도입하는 단계;
   (b) 상기 벡터가 도입된 진핵세포를 분쇄하여 균질액을 수득하는 단계; 및
   (c) 상기 (b) 단계에서 분쇄된 균질액을 키틴 또는 셀룰로오스가 코팅된 비드를 이용하여 선별하는 단계를 포함하는, 원형질막의 분리 방법.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 트랜스멤브레인 도메인은 PDGFR TMD (platelet derived growth factor receptor transmembrane domain), CD80 TM (murine B7-1), 인간 TCRzeta, 인간 CD8, 인간 ASGPR (asialoglycoprotein receptor) 및 인간 Fc γ 수용체로 이루어진 군에서 선택된 것인 방법.
   
10. (i) ChBD (chitin binding domain) 또는 CBD (cellulose binding domain)를 코딩하는 유전자;
    (ii) 트랜스멤브레인 도메인 (transmembrane)을 코딩하는 유전자; 및
    (iii) 목적 유전자를 포함하는, 목적 유전자를 발현하는 진핵세포를 분리하기 위한 발현 카세트.
    
11. 제10항에 있어서, 상기 발현 카세트는 분비 시그널 펩티드를 코딩하는 유전자를 5'-말단에 추가로 포함하는 것인 발현 카세트.
    
12. 제10항에 있어서, 상기 발현 카세트는 ChBD 또는 CBD를 코딩하는 유전자의 5' 위치 또는 3' 위치 중 하나 또는 모두에 에피토프 태그를 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 것인 발현 카세트.
    
13. 제10항에 있어서, 상기 발현 카세트는 ChBD 또는 CBD를 코딩하는 유전자의 5' 위치 또는 3' 위치 중 하나 또는 모두에 에피토프 태그를 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 것인 발현 카세트.
    
14. 제10항에 있어서, 상기 트랜스멤브레인 도메인은 PDGFR TMD (platelet derived growth factor receptor transmembrane domain), CD80 TM (murine B7-1), 인간 TCRzeta, 인간 CD8, 인간 ASGPR (asialoglycoprotein receptor) 및 인간 Fc γ 수용체로 이루어진 군에서 선택된 것인 발현 카세트.
    
15. 제11항에 있어서, 상기 분비 시그널 펩티드는 Ig K 리더, Ig λ 리더, Ig 중쇄 V 리더, 인간 성장 호르몬 리더, IL-7 리더 (interleukin-7 leader), IL-2 수용체 리더 (interleukin-2 receptor leader), IL-4 수용체 리더 (interleukin-4 receptor leader), 제1형 IL-1 수용체 리더 (type I interleukin-1 receptor leader) 및 제2형 IL-1 수용체 리더 (type Ⅱ interleukin-1 receptor leader)로 이루어진 군에서 선택된 것인 발현 카세트.
    
16. 제13항에 있어서, 상기 에피토프 태그는 HA (Hemagglutinin A) 에피토프 또는 Myc 에피토프인 것인 발현 카세트.
    
17. 제10항에 있어서, 상기 ChBD를 포함하는 발현 카세트는 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 CBD를 포함하는 발현 카세트는 서열번호 25의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 발현 카세트.
    
18. 제10항에 있어서, 상기 목적 유전자는 치료용 단백질 또는 외래 단백질을 코딩하는 유전자인 것인 발현 카세트.
    
19. 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항의 발현 카세트를 포함하는 벡터.
    
20. 제19항의 벡터가 도입된 진핵세포.
    
21. 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항의 발현 카세트를 포함하는, 형질전환된 진핵세포 분리용 키트.
    
22. 제21항에 있어서, 상기 발현 카세트는 벡터에 포함된 것인 키트.
    
23. 제21항에 있어서, 상기 키트는 숙주세포를 추가로 포함하는 것인 키트.
    
24. 제21항에 있어서, 상기 키트는 키틴 또는 셀룰로오스가 코팅된 비드를 추가로 포함하는 것인 키트.
    
    
    
    
    
    

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