CN114107353A - 一种高效表达多肽毒素的质粒及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的一种高效表达多肽毒素的质粒，是由将多肽毒素的编码基因克隆到质粒载体pET‑26b‑DsbC中获得，其中质粒载体pET‑26b‑DsbC携带有His、pelB/ompT和DsbC标签，DsbC标签与pelB/ompT信号肽联合作用，将所要表达的多肽转运到更利于蛋白折叠和二硫键形成的细胞周质中，提高了多肽毒素的可溶性表达，解决了多肽毒素不表达或表达量低的问题，实现其高产率表达。本发明还提供利用该质粒的制备方法，制备出表达蜘蛛毒素的质粒，然后用基因工程菌培养表达蜘蛛毒素，制备得到的蜘蛛毒素产率高，生产成本低，该制备方法在多肽毒素的生产领域有着巨大的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种高效表达多肽毒素的质粒及其制备方法与应用。
背景技术
当前动物多肽毒素作为医学研究的热点，不仅作为工具试剂研究分子靶标(如离子通道和受体)的生理作用，还可将多肽毒素作为药物研究或治疗人类疾病。LGTX-F2来源于格式狼蛛，其野生型及突变体均可有效促进凝血因子FXa、FXIIa、thrombin和Kallikrein的酶活力，加快血液的凝固。利用传统的方法从动物毒液中直接采集或者通过化学合成的方法所能获得的多肽量较少，且对于有二硫键的多肽来说需经繁琐的复性过程而导致成本过高。
发明内容
本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，提出一种高效表达多肽毒素的质粒及其制备方法与应用。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
本发明提供的一种高效表达多肽毒素的质粒的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1，合成多肽毒素的编码基因的核苷酸序列；
步骤S2，将步骤S1得到的多肽毒素的编码基因克隆到质粒载体pET-26b-DsbC中，其过程为，利用NcoI和Xho I双酶切多肽毒素的编码基因和质粒载体pET-26b-DsbC，回收目标片段，将多肽毒素的基因片段和pET-26b-DsbC载体片段用T4连接酶连接，得到的连接物为重组质粒；
步骤S3，将步骤S2得到的重组质粒转化进大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取单克隆并提取正确序列的质粒，得到表达多肽毒素的质粒。
进一步的，所述多肽毒素含有多个二硫键。
进一步的，步骤S2中，所述质粒载体pET-26b-DsbC是通过在pET-26b的N端克隆位点***DsbC标签蛋白编码基因得到的。
本发明还提供了一种高效表达多肽毒素的质粒，采用上述制备方法得到的。
本发明还提供了一种蜘蛛毒素ω-LGTX-F2的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1，采用上述的高效表达多肽毒素的质粒的制备方法，制备得到表达蜘蛛毒素ω-LGTX-F2的质粒；
步骤S2，将步骤S1得到的表达蜘蛛毒素ω-LGTX-F2的质粒导入到宿主表达***；
步骤S3，将步骤S2得到的宿主接种培养，经IPTG诱导进行抗体表达，得到重组蛋白ω-LGTX-F2-pET-26b-DsbC；
步骤S4，提取纯化步骤S3得到的重组蛋白ω-LGTX-F2-pET-26b-DsbC；
步骤S5，将步骤S4得到的高纯度的重组蛋白ω-LGTX-F2-pET-26b-DsbC用TEV酶切掉pET-26b-DsbC，得到蜘蛛毒素ω-LGTX-F2。
进一步的，步骤S1中，蜘蛛毒素ω-LGTX-F2的编码基因的核苷酸序列SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
进一步的，步骤S2中，所述宿主的表达***包括原核表达***，所述原核表达***包括大肠杆菌BL21。
进一步的，步骤S3中，将所述大肠杆菌BL21的菌落接种于含卡那霉素的溶菌肉汤培养基中进行抗体表达，大肠杆菌BL21(DE3)的接种量为1～3％，诱导剂IPTG的浓度为0.1～1mmol/L；诱导温度为：28℃～37℃；诱导时间为：12～16h。
进一步的，步骤S4中，纯化过程使用的层析柱为His标签蛋白纯化柱。
本发明还提供了一种蜘蛛毒素ω-LGTX-F2，采用上述方法制备得到。
本发明提供的技术方案带来的有益效果是：
(1)本发明提供的一种高效表达多肽毒素的质粒，通过将多肽毒素的编码基因克隆到质粒载体pET-26b-DsbC中获得，其中质粒载体pET-26b-DsbC携带有His、pelB/ompT和DsbC标签。该质粒的制备方法是通过将二硫键氧化还原酶DsbC与pET-26b相结合的方法构建的一种新型的原核表达载体pET-26b-DsbC，DsbC添加入载体pET-26b的N端作为融合标签，与载体pET-26b上的pelB/ompT信号肽联合作用，将所要表达的多肽转运到更利于蛋白折叠和二硫键形成的细胞周质中，进一步提高了多肽毒素的可溶性表达，解决了目标蛋白不表达或表达量低的问题，实现多肽毒素的高产率表达。本发明所使用的DsbC标签存在于大肠杆菌细胞周质中，是具有二硫键异构酶活性的蛋白质。其含有两个亚基，且构成固定不变的V字型，在V字型的表面分布者疏水且不带电荷的残基，对于底物识别和异构酶活性有重要作用，正确配对的二硫键通常包埋在蛋白质内部，而错误的蛋白质会暴露出来。利用该特性不仅可以筛选出错误配对的二硫键，且其异构酶活性可以催化其形成正确构象，正确的构象体现为更好的表达效果。而且所使用的pET-26b本身携带的信号肽pelB/ompT位于分泌蛋白的N端，可有效引导所表达的毒素穿越大肠杆菌的质膜，分泌到周质空间，而周质空间内包括一系列酶，提供了一个氧化环境，有利于二硫键的形成，促进蛋白的折叠，从而使目的蛋白的产量得到提高。
(2)本发明还提供利用高效表达多肽毒素的质粒pET-26b-DsbC制备生产多肽毒素，具体的应用是本发明提供了一种蜘蛛毒素ω-LGTX-F2的制备方法。蜘蛛毒素含有4对二硫键，通过基因工程常规手段构建基因工程菌表达蜘蛛毒素，很难完整的表达出正确构象的蜘蛛毒素，而且得到的正确构象的蜘蛛毒素常以包涵体的形式呈现，溶解性差，导致产率较低。本发明的制备方法通过将编码蜘蛛毒素ω-LGTX-F2的基因***到到原核表达质粒载体pET-26b-DsbC的多克隆位点，使其位于DsbC信号肽及其编码基因下游，得到重组表达载体，再将该重组表达载体转化大肠杆菌，得到重组大肠杆菌，培养该重组大肠杆菌，表达、分离纯化、用酶切去掉pET-26b-DsbC，得到蜘蛛毒素ω-LGTX-F2。该制备方法得到的蜘蛛毒素ω-LGTX-F2产率高，利用质粒pET-26b-DsbC表达完美解决了含有二硫键蛋白质聚集和产率低的问题。
而且该方法制备简单、缩短了蜘蛛毒素ω-LGTX-F2的生产周期，制备得到的蜘蛛毒素ω-LGTX-F2产率高，生产成本低，适合大规模生产，该制备方法在多肽毒素的生产领域有着巨大的应用前景。
附图说明
图1为质粒pET-26b-DsbC的结构图；
图2为质粒pET-26b的结构图；
图3为用pET-26b-DsbC表达质粒构建的表达ω-LGTX-F2的质粒的结构示意图；
图4为实施例2制备的重组蛋白ω-LGTX-F2-pET-26b-DsbC经TEV酶切割后的电泳结果图；
图5为对比例1制备的重组蛋白ω-LGTX-F2-pET-32a经TEV酶切割后的电泳结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图和实施例对本发明实施方式作进一步地描述。
实施例1
pET-26b-DsbC表达质粒的构建
将去掉信号肽的DsbC基因***至pET-26b载体的N端克隆位点，获得pET-26b-DsbC表达质粒，其结构图如图1所示，含有T7启动子、Lac操纵子、核糖体结合位点、DsbC编码区、pelB/ompT、MSC、His编码区、TEV位点和T7终止子。
申请人在前期研究中发现，多肽毒素ω-LGTX-F2利用载体pET-32a进行原核表达，其蛋白呈现出包涵体的形态，导致无法通过正常手段而获得重组蛋白。该多肽拥有4对二硫键，需经特定的折叠加工才能形成正确的构象而成功表达。考虑到其多肽毒素的多方面特性，探究是否可以通过分泌表达而成功生产，因而将重组蛋白转运到更利于生产和折叠的细胞周质空间进行表达。申请人构建了如图1所示的pET-26b-DsbC表达质粒，所选择的如图2所示的pET-26b原核表达载体携带信号肽pelB/ompT序列，其包含22-24个氨基酸，拥有细胞周质定位的功能，利于蛋白的输出。且载体本身无其他特殊的标签，从而将利于二硫键折叠和加工的DsbC标签嵌入其N端，不会对载体的其他部件产生巨大影响而造成载体的部分功能缺失的情况。申请人为了证明新构建的pET-26b-DsbC原核表达载体表达能力，利用新建立的pET-26b-DsbC原核表达载体表达多肽毒素ω-LGTX-F2，通过分泌表达成功生产其重组蛋白，再经过一系列的纯化过程，最终其产率可达2.5mg/L。
实施例2
利用实施例1制备的pET-26b-DsbC表达质粒通过基因工程手段制备蜘蛛毒素ω-LGTX-F2
(1)制备表达ω-LGTX-F2的质粒
根据大肠杆菌密码子使用偏好，对所表达的基因系列进行优化，为了使TEV酶可以有效切割重组蛋白以去除融合标签，在ω-LGTX-F2的N端引入其特异性识别编码序列ENLYFQG。
采用化学方法合成ω-LGTX-F2基因(上海生物工程公司)，经NcoI和Xho I双酶切后连接入同样酶切且添加DsbC标签的原核表达载体pET-26b-DsbC(购自Novagen公司)，重组质粒进行DNA测序。
(2)将表达蜘蛛毒素ω-LGTX-F2的质粒导入到宿主表达***
将成功构建的表达蜘蛛毒素ω-LGTX-F2的质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株(购自北京擎科生物科技公司)感受态细胞，37℃倒置培养过夜，次日挑取单菌落至1mL含有相应抗性的培养基，37℃220rpm，进行种子培养基的富集，得到基因工程菌。
(3)将基因工程菌接种培养，经IPTG诱导进行抗体表达，得到重组蛋白ω-LGTX-F2-pET-26b-DsbC
将菌株按1：100比例接种于10mL LB培养基(含卡那青霉素100μg/mL)，37℃小摇震荡过夜，再按比例转移入LB培养基，37℃220rpm进行大规模震荡培养，至OD600值为0.8左右，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，28℃100rpm震荡培养12-16小时。
将诱导表达过夜的菌体5000rpm离心8min，富集菌体，弃上清，用超纯水吹打重悬漂洗两次，5000rpm离心弃上清。
利于提前配置的1xBinding Buffer吹打重悬菌体，必须吹打至无菌体颗粒，富集的1L菌液菌体约100ml1xBinding Buffer定容用于破菌。将重悬好的菌体置于提前预冷好的高压均质机破菌，高压均质机选取30MPa，连续高压破碎菌体3次。将破碎好的菌体12000rpm离心20min，重复2次，即获得含有重组蛋白ω-LGTX-F2-pET-26b-DsbC的上清液。
(4)提取纯化得到的ω-LGTX-F2重组蛋白
将上述获得的ω-LGTX-F2重组蛋白上清溶液装入含His Bind Resin树脂的亲和层析柱，均匀滴完，纯化出高浓度的融合蛋白。过柱前必须利用5-10倍的1xBinding Buffer平衡亲和层析柱。后续通过浓度逐步递增的咪唑洗脱液将融合蛋白洗脱，洗脱液加入超滤管(截留分子量为10kDa)进行脱盐，在4度5000rpm离心30分钟后，收集超滤管中脱盐后的ω-LGTX-F2重组蛋白。将收集的ω-LGTX-F2重组蛋白利用Nano Drop测定浓度并分装，用于12％SDS-PAGE电泳鉴定及酶切。
(5)将得到的高纯度的重组蛋白ω-LGTX-F2-pET-26b-DsbC用TEV酶切掉pET-26b-DsbC，得到蜘蛛毒素ω-LGTX-F2。
使用重组TEV酶对分离纯化的重组蛋白ω-LGTX-F2-pET-26b-DsbC进行切割，16℃酶切过夜。SDS-PAGE电泳结果表明，该质粒可以有效表达ω-LGTX-F2，且酶切完全，得到蜘蛛毒素ω-LGTX-F2。
对比例1
利用市售的pET-32a表达质粒通过基因工程手段制备蜘蛛毒素ω-LGTX-F2。
制备方法过程同实施例2。
如图3所示，为用pET-26b-DsbC表达质粒构建的表达ω-LGTX-F2的质粒的结构示意图。图中DsbC标签具有二硫键异构酶活性，可催化错配的二硫键异构化重新配对。pelB信号肽在蛋白表达时，能将目的基因定位于细胞周质，从而有利于蛋白生产。His标签为多聚His标签，可用于镍离子亲和层析分离纯化重组蛋白；箭头所示处为重组TEV蛋白酶的切割位点，该酶特异性识别Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly氨基酸序列，并有高特异性、高活性剪切。
如图4所示，为实施例2制备的重组蛋白ω-LGTX-F2-pET-26b-DsbC经TEV酶切割后的电泳结果图。M：蛋白质Marker，1：未经TEV酶切割的重组蛋白ω-LGTX-F2-pET-26b-DsbC，2：重组蛋白ω-LGTX-F2-pET-26b-DsbC经TEV酶切割的产物pET-26b-DsbC，箭头所示为TEV酶切割后的对应条带。
如图5所示，为对比例1制备的重组蛋白ω-LGTX-F2-pET-32a经TEV酶切割后的电泳结果图。M：蛋白质Marker，1：未经TEV酶切割的重组蛋白ω-LGTX-F2-pET-32a，2、重组蛋白ω-LGTX-F2-pET-32a经TEV酶切割的产物pET-32a。箭头所示为TEV酶切割后的对应条带。
由图4和图5中的重组蛋白条带的深浅以判断两者之间的表达量的差异，其次，该毒素并不是完全不可溶，只是大部分形成包涵体，图4中的2泳道依然有一定的目的条带，但是纯化后产率低。实施例2和对比例1目的蛋白的产量的差异如表1所示：
表1：
由表1可知，采用pET-26b-DsbC表达质粒通过基因工程手段制备蜘蛛毒素ω-LGTX-F2的产率提高了3倍多，更进一步证明了pET-26b-DsbC表达质粒有利于细胞周质中的蛋白折叠和二硫键形成的，同时pET-26b-DsbC表达质粒中的pelB/ompT更利于细胞周质定位，从而提高蛋白的输出产量。
在不冲突的情况下，本文中上述实施例及实施例中的特征可以相互结合。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 苏州佩德生物医药有限公司
<120> 一种高效表达多肽毒素的质粒及其制备方法与应用
<141> 2021-10-12
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 195
<212> DNA
<213> 蜘蛛毒素ω-LGTX-F2
<400> 1
gctgaagctt gcaccccgcg cctgcatgat tgctctcatg atcgccattc ttgctgccgc 60
ggcgaactgt ttaaagatgt ttgttattgt ttttatccgg aaggtgaaga taaaaccgaa 120
gtttgtagct gtcagcagcc gaaaagccat aaatatattg aaaaagttgt tgataaaacc 180
aaaaccctgg tgggt 195
<210> 2
<211> 65
<212> PRT
<213> 蜘蛛毒素ω-LGTX-F2
<400> 2
Ala Gly Ala Cys Thr Pro Ala Leu His Ala Cys Ser His Ala Ala His
1 5 10 15
Ser Cys Cys Ala Gly Gly Leu Pro Leu Ala Val Cys Thr Cys Pro Thr
20 25 30
Pro Gly Gly Gly Ala Leu Thr Gly Val Cys Ser Cys Gly Gly Pro Leu
35 40 45
Ser His Leu Thr Ile Gly Leu Val Val Ala Leu Thr Leu Thr Leu Val
50 55 60
Gly
65
Claims (10)
1.一种高效表达多肽毒素的质粒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、合成多肽毒素的编码基因的核苷酸序列；
S2、将步骤S1得到的多肽毒素的编码基因克隆到质粒载体pET-26b-DsbC中，其过程为，利用NcoI和Xho I双酶切多肽毒素的编码基因和质粒载体pET-26b-DsbC，回收目标片段，将多肽毒素的基因片段和pET-26b-DsbC载体片段用T4连接酶连接，得到的连接物为重组质粒；
S3、将步骤S2得到的重组质粒转化进大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取单克隆并提取正确序列的质粒，得到表达多肽毒素的质粒。
2.如权利要求1所述的一种高效表达多肽毒素的质粒的制备方法，其特征在于：步骤S2中，所述质粒载体pET-26b-DsbC是通过在pET-26b的N端克隆位点***DsbC标签蛋白编码基因得到的。
3.如权利要求2所述的一种高效表达多肽毒素的质粒的制备方法，其特征在于：所述多肽毒素含有多个二硫键。
4.一种高效表达多肽毒素的质粒，其特征在于：采用如权利要求1-3任一项所述的方法制备得到。
5.一种蜘蛛毒素ω-LGTX-F2的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、采用如权利要求4所述的高效表达多肽毒素的质粒的制备方法，制备得到表达蜘蛛毒素ω-LGTX-F2的质粒；
S2、将步骤S1得到的表达蜘蛛毒素ω-LGTX-F2的质粒导入到宿主表达***；
S3、将步骤S2得到的宿主接种培养，经IPTG诱导进行抗体表达，得到重组蛋白ω-LGTX-F2-pET-26b-DsbC；
S4、提取纯化步骤S3得到的重组蛋白ω-LGTX-F2-pET-26b-DsbC；
S5、将步骤S4得到的高纯度的重组蛋白ω-LGTX-F2-pET-26b-DsbC用TEV酶切掉pET-26b-DsbC，得到蜘蛛毒素ω-LGTX-F2。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤S1中，蜘蛛毒素ω-LGTX-F2的编码基因的核苷酸序列SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤S2中，所述宿主的表达***包括原核表达***，所述原核表达***包括大肠杆菌BL21。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于：步骤S3中，将所述大肠杆菌BL21的菌落接种于含卡那霉素的溶菌肉汤培养基中进行抗体表达，大肠杆菌BL21(DE3)的接种量为1～3％，诱导剂IPTG的浓度为0.1～1mmol/L；诱导温度为：27～28℃；诱导时间为：12～16h。
9.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤S4中，纯化过程使用的层析柱为His标签蛋白纯化柱。
10.一种蜘蛛毒素ω-LGTX-F2，其特征在于：采用如权利要求5-9所述的制备方法制得。
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| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114107353A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116236819A (zh) * | 2023-05-09 | 2023-06-09 | 成都佩德生物医药有限公司 | 一种批量纯化多肽毒素的方法及复合型双层层析柱 |
| CN116284308A (zh) * | 2023-03-27 | 2023-06-23 | 成都佩德生物医药有限公司 | 多肽lgtx-f2突变体及其应用 |
Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995029235A1 (en) * | 1994-04-27 | 1995-11-02 | British Technology Group Limited | Spider neurotoxins and method of producing the same |
| WO1998056930A2 (en) * | 1997-06-09 | 1998-12-17 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods for producing heterologous disulfide bond-containing polypeptides in bacterial cells |
| EP0992588A1 (en) * | 1998-09-09 | 2000-04-12 | Hsp Research Institute, Inc. | DsbA/DsbB/DsbC/DsbD expression plasmid |
| US20060246541A1 (en) * | 2005-02-11 | 2006-11-02 | Minea Radu O | Method of expressing proteins with disulfide bridges |
| CN101585872A (zh) * | 2008-05-23 | 2009-11-25 | 成都蓉药集团四川长威制药有限公司 | 重组蛛毒蛋白、其制备方法和表达载体以及用于治疗ed的药物 |
| WO2010104115A1 (ja) * | 2009-03-10 | 2010-09-16 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 膜タンパク質を特異的に認識するポリペプチドの調製方法 |
| CN106754945A (zh) * | 2016-12-28 | 2017-05-31 | 怀化学院 | 一种毒素Tx4(6‑1)无标签重组蛋白的生产方法 |
| CN108822196A (zh) * | 2018-06-06 | 2018-11-16 | 湖南师范大学 | 一种促凝血多肽lgtx-f2及其应用 |
| KR101922425B1 (ko) * | 2017-05-24 | 2018-11-29 | 대한민국 | 재조합 거미독 단백질 발현용 베큘로바이러스 또는 이를 이용하여 누에로부터 생산된 재조합 단백질 |
| CN108912218A (zh) * | 2018-08-02 | 2018-11-30 | 南京农业大学 | 拟环纹豹蛛a家族杀虫基因及其编码的成熟肽与应用 |
| CN112028981A (zh) * | 2020-09-08 | 2020-12-04 | 湖州眺旺生物科技有限公司 | 重组白额高脚蛛毒素多肽及其制备方法 |
-
2021
- 2021-10-29 CN CN202111270816.2A patent/CN114107353A/zh active Pending
Patent Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995029235A1 (en) * | 1994-04-27 | 1995-11-02 | British Technology Group Limited | Spider neurotoxins and method of producing the same |
| WO1998056930A2 (en) * | 1997-06-09 | 1998-12-17 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods for producing heterologous disulfide bond-containing polypeptides in bacterial cells |
| US6083715A (en) * | 1997-06-09 | 2000-07-04 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods for producing heterologous disulfide bond-containing polypeptides in bacterial cells |
| EP0992588A1 (en) * | 1998-09-09 | 2000-04-12 | Hsp Research Institute, Inc. | DsbA/DsbB/DsbC/DsbD expression plasmid |
| US20060246541A1 (en) * | 2005-02-11 | 2006-11-02 | Minea Radu O | Method of expressing proteins with disulfide bridges |
| CN101585872A (zh) * | 2008-05-23 | 2009-11-25 | 成都蓉药集团四川长威制药有限公司 | 重组蛛毒蛋白、其制备方法和表达载体以及用于治疗ed的药物 |
| WO2010104115A1 (ja) * | 2009-03-10 | 2010-09-16 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 膜タンパク質を特異的に認識するポリペプチドの調製方法 |
| CN106754945A (zh) * | 2016-12-28 | 2017-05-31 | 怀化学院 | 一种毒素Tx4(6‑1)无标签重组蛋白的生产方法 |
| KR101922425B1 (ko) * | 2017-05-24 | 2018-11-29 | 대한민국 | 재조합 거미독 단백질 발현용 베큘로바이러스 또는 이를 이용하여 누에로부터 생산된 재조합 단백질 |
| CN108822196A (zh) * | 2018-06-06 | 2018-11-16 | 湖南师范大学 | 一种促凝血多肽lgtx-f2及其应用 |
| CN108912218A (zh) * | 2018-08-02 | 2018-11-30 | 南京农业大学 | 拟环纹豹蛛a家族杀虫基因及其编码的成熟肽与应用 |
| CN112028981A (zh) * | 2020-09-08 | 2020-12-04 | 湖州眺旺生物科技有限公司 | 重组白额高脚蛛毒素多肽及其制备方法 |
Non-Patent Citations (9)
| Title |
|---|
| PENGPENG LI等: "LCTX-F2, a Novel Potentiator of Coagulation Factors From the Spider Venom of Lycosa singoriensis", FRONTIERS IN PHARMACOLOGY, vol. 11, pages 1 - 10 * |
| 刘君梁,刁建波,唐建洲,谢锦云,梁宋平: "重组虎纹捕鸟蛛毒素Ⅺ用pMAL-p2X载体的表达和纯化", 中国生物化学与分子生物学报, no. 01, pages 39 - 44 * |
| 张科军;李力;戴秋云;: "富含二硫键多肽毒素的表达与纯化", 中国生物工程杂志, no. 11, pages 106 - 111 * |
| 徐小静编著: "分子生物学与基因工程技术与实验", 30 November 2018, 中央民族大学出版社, pages: 112 - 115 * |
| 苏格: "基于狼蛛转录组筛选的一种多肽毒素结构和功能研究", 中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑, no. 1, pages 2 * |
| 蒋立平;官剑武;舒衡平;: "一种富含半胱氨酸的蜘蛛多肽基因的克隆和初步表达", 中国病原生物学杂志, no. 04, 30 April 2010 (2010-04-30), pages 259 - 262 * |
| 邵婕;潘娇;瞿芳;刘子昊;丁易颖;罗莎;张学文;陈金军;: "蜘蛛多肽毒素JZTX-51和JZTX-26的重组表达和纯化", 生物工程学报, no. 10, 23 July 2018 (2018-07-23), pages 1668 - 1678 * |
| 黄彪: "狼蛛毒素LCTX-F2的表达与活性研究", 中国优秀硕士学位论文全文数据库基础科学辑, no. 1, 15 January 2021 (2021-01-15), pages 006 - 1675 * |
| 黄彪: "狼蛛毒素LCTX-F2的表达与活性研究", 中国优秀硕士学位论文全文数据库基础科学辑, no. 1, pages 006 - 1675 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116284308A (zh) * | 2023-03-27 | 2023-06-23 | 成都佩德生物医药有限公司 | 多肽lgtx-f2突变体及其应用 |
| CN116284308B (zh) * | 2023-03-27 | 2024-02-02 | 成都佩德生物医药有限公司 | 多肽lgtx-f2突变体及其应用 |
| CN116236819A (zh) * | 2023-05-09 | 2023-06-09 | 成都佩德生物医药有限公司 | 一种批量纯化多肽毒素的方法及复合型双层层析柱 |
| CN116236819B (zh) * | 2023-05-09 | 2023-08-04 | 成都佩德生物医药有限公司 | 一种批量纯化多肽毒素的方法及复合型双层层析柱 |
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