CN110616177B - 一株具有高发酵密度的芽孢杆菌及其发酵生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株具有高发酵密度的芽孢杆菌，所述菌株命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.)19‑B，其确定为具芽孢形态小且高发酵密度的巨大芽孢杆菌，该菌株已于2008年10月29日保藏在“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为CGTCC No.M208187。本发明还公开了一种适于所述芽孢杆菌高密度发酵培养的培养基及发酵控制方式。实验证实，本发明的芽孢杆菌有效解决了目前芽孢杆菌发酵密度较低，发酵周期长的问题，同时利用本发明的发酵培养基使得芽孢杆菌19‑B的生物量在20小时内提高4‑5倍，最高生物量达到150亿/ml。预示该菌株在制备微生物菌剂及其生产方面具有广泛的应用前景。

Description

一株具有高发酵密度的芽孢杆菌及其发酵生产方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株具芽孢形态小且高发酵密度的芽孢杆菌及其发酵生产方法与应用。
背景技术
芽孢杆菌(Bacillus sp.)为革兰氏阳性菌，属于芽孢杆菌属(Bacillus)。它能够形成芽孢，其芽孢的抗辐射能力是大肠杆菌的36倍。其中的巨大芽孢杆菌为革兰氏阳性菌及好氧菌，工业上用于生产葡萄糖异构酶和VB12，同时也是著名的解磷菌。因此，在农业上可用于制造磷细菌肥料并具有良好的肥效。巨大芽孢杆菌具体功效如下：1)巨大芽孢杆菌是一种解磷促钾细菌，能够分解土壤中的吸附态有机磷、无机磷，提高土壤肥力，促进作物增产；2)作为植物病害生物防治的主要生防细菌，巨大芽孢杆菌通过在生长发育过程中产生多种拮抗性或竞争性的代谢产物，以直接或间接方式阻碍或杀死病原菌；3)巨大芽孢杆菌不仅可以改善畜牧养殖环境，而且可以变废为宝，提高畜牧养殖效益；4)巨大芽孢杆菌在水体净化上具有一定的作用，可开发为水质微生态制剂应用到水源匮乏的养殖区域，降低养殖成本，提高养殖效益；5)巨大芽孢杆菌是异源表达的优良寄主，该***与传统的原核表达***(如大肠杆菌表达***、枯草芽孢杆菌表达***)相比，具有外源蛋白分泌能力强且不产内毒素；载体质粒稳定且不产生或很少产生胞外蛋白酶；胞外蛋白易于提取且提取成本低；使用的诱导剂廉价等优点。与哺乳动物表达***相比，不存在培养时间长、支原体和病毒污染难控制等问题。
目前常用的微生物菌剂有枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等。相比于其它几种芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌存在发酵菌数低、生产成本高的缺点，从而极大的限制了该类菌株在微生物菌剂领域的推广应用。一般巨大芽孢杆菌的发酵菌数在20-60cfu/ml发酵液之间，如饶犇等运用单因素试验、PB设计和响应面法优化，最终48小时发酵得到42.2×108cfu/ml的菌数；陈凯等通过优化巨大芽孢杆菌P1的发酵配方，经过32小时培养菌数达到60×108cfu/mL，芽孢比率达90％以上。造成巨大芽孢杆菌发酵菌数限制的主要原因在于该菌株菌体尺寸大，因此筛选一株形态较小且具有高生物量的巨大芽孢杆菌，并进一步开发生长速度快、高生物量、高芽孢率、低成本的发酵配方，对于其在微生物菌剂领域的大规模应用具有重要价值和潜力。
发明内容
针对现有的巨大芽孢杆菌发酵密度低生产成本高的瓶颈，本发明目的在于提供一株芽孢形态小、生长快、生物量高、芽孢产率高的巨大芽孢杆菌及相关大规模发酵生产工艺。
本发明所述的芽孢杆菌，其特征在于：所述菌株命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.)19-B，其确定为具芽孢形态小且高发酵密度的巨大芽孢杆菌，该菌株已于2008年10月29日保藏在“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为CCTCC No.M 208187。
具体的，上述芽孢杆菌(Bacillus sp.)19-B菌体呈杆状，末端圆。单个或呈链状排列，初期2.5-3.0×1.5微米，能运动，革兰氏阳性，可产椭圆形芽胞，芽孢中生，芽孢尺寸明显变小(1.2×0.8微米)。在普通营养琼脂培养基中生长良好，其上的菌落呈圆形，边缘整齐，扁平状，中部略微有小突起，黄色，毛玻璃状表面，4℃放置一段时间后表面呈现光滑发亮，过夜培养后菌落直径3-5mm。
上述芽孢杆菌(Bacillus sp.)19-B生长温度为25-42℃，最适生长温度为37℃。
上述芽孢杆菌(Bacillus sp.)19-B可以在基本培养基上生长，也可以在完全培养基上生长，也可以在发酵培养基上生长。
其中，上述基本培养基配方如下，1L升蒸馏水中含：10.8克磷酸氢二钾，5.99克磷酸二氢钾，1.98克硫酸铵，1.91克二水合柠檬酸三钠，0.2克七水合硫酸镁，0.2克酪蛋白氨基酸，0.08克四水合氯化锰，0.106克二水合氯化钙，0.005克七水合硫酸铁，0.004克钼酸铵，0.0022克氯化钴，10克葡萄糖，pH 7.5，115℃条件下灭菌30分钟。
其中，上述完全培养基配方如下，1升蒸馏水中含：10克葡萄糖，10克蛋白胨，5克酵母粉，5克氯化钠，10克牛肉膏，pH 7.5，固体完全培养基在上述配方的基础上加入质量体积比为1.8％的琼脂粉，115℃条件下灭菌30分钟。
一种适于上述芽孢杆菌高密度发酵培养的培养基，其特征在于：所述发酵培养的培养基配方为：1升蒸馏水中含：20克葡萄糖，10克玉米面，20克酵母粉，2克氯化钠，0.2克一水合硫酸锰，0.5克七水合硫酸镁，1.3克三水合磷酸氢二钾，0.03克氯化铁；pH 8.0-8.5，115℃条件下灭菌30分钟。
一种适于上述芽孢杆菌高密度发酵培养的方法，其特征在于，所述芽孢杆菌的发酵控制方式是：发酵罐初始参数设定为温度37℃，pH 7.0，初始转速400rpm；每4个小时取样测定OD600nm值，镜检；发酵过程加消泡剂控制气泡；当菌生长至对数生长期时转速提高直至800rpm，若pH低于7.0时加NaOH调至7.0以上，若pH高于7.0则加HCl调低至7.0±0.1，在发酵培养基中培养15-20小时。
常规方法提取本发明所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)19-B CCTCC No.M 208187的16S rDNA，其中芽孢杆菌(Bacillus sp.)19-B菌株的16S rDNA核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。并通过在美国生物工程信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)查阅国际相关的基因库，将本发明的芽孢杆菌(Bacillus sp.)19-BCCTCC No.M 208187 16S rDNA基因序列与相关菌株的16S rDNA基因序列比较，确定为本发明所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)19-B为巨大芽孢杆菌，基因序列虽有相似性，但却不完全相同，说明本发明的菌株是首次分离鉴定，具有原创性。
本发明所述的具有高发酵密度的芽孢杆菌(Bacillus sp.)19-B在制备微生物菌剂中的应用。
上述芽孢杆菌(Bacillus sp.)19-B在5L发酵罐中，利用上述公开的发酵培养基，在37℃条件下，培养15-20小时，最终芽孢数量能达到150亿/ml。获得的芽孢杆菌可广泛用于制备微生物菌剂。
本发明公开了一株芽孢形态小、且短时间内能够达到高发酵菌数的巨大芽孢杆菌，有效解决了目前芽孢杆菌发酵密度较低，发酵周期长的问题，同时利用新型优化后的发酵培养基使得芽孢杆菌(Bacillus sp.)19-B的生物量提高数倍，最高生物量达到150亿/ml。与目前生产所用芽孢杆菌的发酵菌数30亿/ml左右相比，提高约4-5倍，因此发酵成本可以节约4-5倍左右。预示本发明所述芽孢杆菌菌株在制备微生物菌剂的生产方面具有广阔的应用前景。
附图说明
本发明所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)19-B已于2008年10月29日保藏在“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为CCTCC No.M 208187。
图1芽孢杆菌(Bacillus sp.)19-B和生产菌株Bacillus megaterium SC-1在发酵培养基中的扫描电子显微镜照片。
图2将芽孢杆菌(Bacillus sp.)19-B基因组与其它四种巨大芽孢杆菌序列比对后构建的进化树图。
图3芽孢杆菌(Bacillus sp.)19-B和生产菌株Bacillus megaterium SC-1在发酵培养基中37℃培养24小时，菌体生长密度(OD600nm)与生长时间的曲线图。
图4芽孢杆菌(Bacillus sp.)19-B解无机磷效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
实施例1：芽孢杆菌(Bacillus sp.)19-B CCTCC No.M 208187菌株的筛选及生理生化特性
将造纸黑液池的液体样品涂布在完全培养基琼脂平板上，倒置平板37℃培养24小时，挑取黄色圆形，表面粗糙的菌落，镜检为杆菌，反复划线确定纯菌落，接种到完全培养基，显微观察个体形态及进行生化反应测定，最终筛选得到一株芽孢杆菌，命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.)19-B(见图1)。
上述芽孢杆菌(Bacillus sp.)19-B菌株为革兰氏阳性菌，好氧，单个或呈链状排列。生长初期菌体大小2.5-3.0×1.5微米，能运动，革兰氏阳性，可产椭圆形芽胞，芽孢中生，大小1.2×0.8微米，与生产菌株SC-1芽孢尺寸相比明显变小(图1)。在普通营养琼脂培养基中生长良好，其上的菌落呈圆形，边缘整齐，扁平状，中部略微有小突起，黄色，毛玻璃状表面。
上述芽孢杆菌(Bacillus sp.)19-B生长温度为25-42℃，最适生长温度为37℃。
上述芽孢杆菌(Bacillus sp.)19-B可以在基本培养基上生长，也可以在完全培养基上生长，也可以在发酵培养基上生长。
其中，上述基本培养基配方如下，1L升蒸馏水中含：10.8克磷酸氢二钾，5.99克磷酸二氢钾，1.98克硫酸铵，1.91克二水合柠檬酸三钠，0.2克七水合硫酸镁，0.2克酪蛋白氨基酸，0.08克四水合氯化锰，0.106克二水合氯化钙，0.005克七水合硫酸铁，0.004克钼酸铵，0.0022克氯化钴，10克葡萄糖，pH 7.5，115℃条件下灭菌30分钟。
其中，上述完全培养基配方如下，1升蒸馏水中含：10克葡萄糖，10克蛋白胨，5克酵母粉，5克氯化钠，10克牛肉膏，pH 7.5，固体完全培养基在上述配方的基础上加入质量体积比为1.8％的琼脂粉，115℃条件下灭菌30分钟。
上述筛选的菌株芽孢杆菌(Bacillus sp.)19-B已于2008年10月29日保藏在“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为CCTCC No.M 208187。
实施例2：芽孢杆菌(Bacillus sp.)19-B菌株16S rDNA基因的提取
培养5ml的细菌培养物至饱和状态，取1ml培养物，12000rpm离心1min，去上清。向菌体中加入180μl TE buffer，再加入适量溶菌酶，37℃处理30分钟以上。向管中加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。加入220μl缓冲液GB，震荡15秒，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁溶液，混匀。加220μl无水乙醇，充分震荡混匀15秒，此时可能出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁溶液。将上一步得到的溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30秒倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否加入无水乙醇)，12000rpm离心30秒倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否加入无水乙醇)，12000rpm离心30秒倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。再向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW，12000rpm离心30秒倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3至于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附柱中残留的漂洗液。将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50～100μl ddH2O，室温放置2～5分钟，12000rpm离心两分钟，将洗脱液收集到离心管中。以提取的基因组DNA为模板，利用购自上海华大基因生物技术有限公司的细菌引物27F和1492R，进行PCR扩增，在100μl反应体系依次混匀下列试剂：76μl H2O，10μl 10倍浓度的PCR反应缓冲液，1μl上游引物，1μl下游引物，1μl模板DNA即上述的基因组DNA，1μl Taq DNA聚合酶，混匀后离心5秒钟。将混合物在94℃加热5分钟。94℃变性1分钟，50℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，总共25个循环。最后一个循环后，于72℃下保温10分钟，使反应混合物扩增充分。PCR反应产物测序。
得到测序结果：芽孢杆菌(Bacillus sp.)19-B菌株的16S rDNA核苷酸序列如SEQID No.1所示。
通过在美国生物工程信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)查阅国际相关的基因库，将本发明的芽孢杆菌(Bacillus sp.)19-BCCTCC No.M 208187 16S rDNA基因序列与相关菌株的16S rDNA基因序列比较，确定为本发明所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)19-B为巨大芽孢杆菌，基因序列虽有相似性，但却不完全相同，说明本发明的菌株是首次分离鉴定，具有原创性。
进一步通过软件在美国生物工程信息中心使用BLASTN程序比对，对给出的序列使用Vector NTI软件构建进化树(见图2)。
实施例3：芽孢杆菌(Bacillus sp.)19-B菌株发酵培养基优化
正交试验设计方法简介：利用正交表，进行正交试验设计完全克服单因素轮换法安排试验的诸多缺点，且能选出影响质量的最主要因素，便于进一步试验。通过四因素三水平的实验，氮源对菌体影响最大。进一步做关于氮源的PB实验。
利用PB实验，对培养基碳源以及氮源等进行优化，Plackett-Burman(PB)设计是一种经常用于配方优化的高效方法。我们用它众多的培养基成分中挑选出对发酵有显著性影响的成分，不重要的成分在进一步的实验中可以忽略掉。一个包含有12次实验的PB设计用于从6个因子中筛选出重要的因子，并采用最小二乘法处理得到的数据，拟合的方程为
Figure BDA0002252503840000051
Figure BDA0002252503840000052
其中
Figure BDA0002252503840000053
是预测的产物产量，β0、β1、β2、β3、β4、β5、β6为拟合的系数，X1、X2、X3、X4、X5、X6是独立的变量的水平。
通过实验数据得出结论，至此得到优化后的芽孢杆菌的发酵培养基：1升蒸馏水中含：20克葡萄糖，10克玉米面，20克酵母粉，2克氯化钠，0.2克一水合硫酸锰，0.5克七水合硫酸镁，1.3克三水合磷酸氢二钾，0.03克氯化铁；pH 8.0-8.5，115℃条件下灭菌30分钟。
实施例4：芽孢杆菌(Bacillus sp.)19-B菌株和生产菌株Bacillus megateriumSC-1在发酵培养基中的发酵生长曲线。
利用MM培养基和本发明优化的发酵培养基来培养芽孢杆菌(Bacillus sp.)19-B和市售生产菌株Bacillus megaterium SC-1。
在LB培养基中培养种子，170rpm，37℃，培养时间5-8小时。按照5％的接种量接种到发酵培养基和MM培养基。200rpm，37℃，培养30小时。每4小时取样测定OD600nm并在芽孢率>95％后取样，系列稀释涂平板计数。
将发酵培养基发酵液(生长30小时)稀释107、108、109倍并且取100μl于平板上涂布均匀。将平板放于37℃恒温培养箱中培养一天，计数。发现稀释到108最为合适，平行三个平板上的菌落数为44，40，42，发酵液的平均菌体数量达到42亿/mL。而经过系列稀释计数的生产菌株Bacillus megaterium SC-1，平均菌数仅为9.7亿/ml(表1)。
将MM培养液(生长24小时)稀释106、107、108倍并且取100μl于平板上涂布均匀。将平板放于37℃恒温培养箱中培养一天，计数。发现稀释到107最为合适，三个平行平板上的菌落数为14，15，16，发酵液的菌体数量达到15亿/mL。而经过系列稀释计数的生产菌株Bacillus megaterium SC-1，平均菌数仅为4.3亿/ml(表1)。
表1：芽孢杆菌(Bacillus sp.)19-B和生产菌株Bacillus megaterium SC-1的发酵培养基和MM培养基计数结果
Figure BDA0002252503840000061
实施例5：芽孢杆菌(Bacillus sp.)19-B和生产菌株Bacillus megaterium SC-1菌株分解无机磷效果
斜面活化，将芽孢杆菌(Bacillus sp.)19-B和生产菌株Bacillus megateriumSC-1菌株转接至已灭菌的LB液体培养基摇管中，置37℃恒温培养箱活化培养24小时，系列稀释涂LB固体培养基平板计数。分别吸取1ml的19-B和0.28ml的SC-1菌液(按照等量的菌数)，转接到含有50ml无机磷液体培养基的500ml三角瓶中，每株菌3个平行。对照则不接入菌，仅接入1ml的LB液体培养基。至于摇床中37℃培养4天，每隔12小时取样离心，通过钼蓝比色法测定上清液中的有效磷含量(图4)。比较芽孢杆菌19-B和SC-1的解无机磷能力可知，在相同接种量下，19-B的解磷能力明显高于SC-1。
上述无机磷液体培养基配方：葡萄糖l0 g，(NH4)2SO4 0.5g，酵母粉0.5g，MgSO4·7H2O0.3g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，FeSO4·7H2O 0.03g，MnSO4·7H2O 0.03g，Ca3(PO4)2 5g，蒸馏水1000ml，pH 7.2，115℃灭菌20min。
实施例6：芽孢杆菌(Bacillus sp.)19-B菌株发酵工艺确定(以3L发酵罐为例)及其生物量测定。
本发明所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)19-B菌株经过优化后的发酵工艺为：
(1)一级种子培养：以5％接种量接上述菌株于完全培养基。由于芽孢杆菌后期生长速度快，为保证种子活力，种子培养时间5-8小时即可，170rpm，37℃。
(2)二级摇瓶发酵种子培养：将一级种子液按照5％接种量，接种到装有100ml的二级发酵液摇瓶中。170rpm，37℃，培养时间5-8小时。
(3)发酵过程控制：5-10％接种量，接种前须镜检种子。发酵罐初始参数设定为温度37℃，pH 7.0，初始转速400rpm；每4个小时取样测定OD600nm值，镜检；发酵过程加消泡剂控制气泡；当菌生长至对数生长期时转速转速提高到800rpm，若pH低于7.0加NaOH调至7.0以上，若pH高于7.0则加HCl调低至7.0±0.1，在发酵培养基中培养24小时。
用优化后的发酵培养基来培养菌体，得到芽孢杆菌的生长曲线(见图3)，通过生长曲线可以看出，此种芽孢杆菌在培养7.5小时后进入对数生长期，在培养10-20小时阶段菌体繁殖速度很快，菌体处于旺盛的***期，菌体数目快速增加，之后进入稳定期在此阶段菌体数量基本维持稳定。
上述发酵培养基配方为：20克葡萄糖，10克玉米面，20克酵母粉，2克氯化钠，0.2克一水合硫酸锰，0.5克七水合硫酸镁，1.3克三水合磷酸氢二钾，0.03克氯化铁；pH 8.0-8.5，115℃条件下灭菌30分钟。
微生物菌剂的衡量指标为芽孢数量。通过平板计数可知：将完全产芽孢的发酵培养基发酵液(生长30小时)稀释107、108、109倍并且取100μl于平板上涂布均匀。将平板放于37℃恒温培养箱中培养一天，计数。发现稀释到108最为合适，平行三个平板上的菌落数为14，16，17，发酵液的菌体数量达到150亿/mL。
序列表
<110> 山东大学
<120> 一株具有高发酵密度的芽孢杆菌及其发酵生产方法
<141> 2019-10-24
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1455
<212> DNA
<213> 芽孢杆菌（Bacillus sp）
<221> 芽孢杆菌（Bacillus sp）19-B菌株的16S rDNA序列
<400> 1
tgcggggggg gtgcctatac atgcagtcga gcgaactgat tagaagcttg cttctatgac 60
gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg gcaacctgcc tgtaagactg ggataacttc 120
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cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccgcaatgg acgaaagtct 360
gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg ctttcgggtc gtaaaactct gttgttaggg 420
aagaacaagt acgagagtaa ctgctcgtac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc 480
taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttatccg gaattattgg 540
gcgtaaagcg cgcgcaggcg gtttcttaag tctgatgtga aagcccacgg ctcaaccgtg 600
gagggtcatt ggaaactggg gaacttgagt gcagaagaga aaagcggaat tccacgtgta 660
gcggtgaaat gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg aaggcggctt tttggtctgt 720
aactgacgct gaggcgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca 780
cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttaga gggtttccgc cctttagtgc tgcagctaac 840
gcattaagca ctccgcctgg ggagtacggt cgcaagactg aaactcaaag gaattgacgg 900
gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca 960
ggtcttgaca tcctctgaca actctagaga tagagcgttc cccttcgggg gacagagtga 1020
caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg 1080
agcgcaaccc ttgatcttag ttgccagcat ttagttgggc actctaaggt gactgccggt 1140
gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta 1200
cacacgtgct acaatggatg gtacaaaggg ctgcaagacc gcgaggtcaa gccaatccca 1260
taaaaccatt ctcagttcgg attgtaggct gcaactcgcc tacatgaagc tggaatcgct 1320
agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg 1380
tcacaccacg agagtttgta acacccgaag tcggtggagt aaccgtaagg agctagccgc 1440
taagtgccgg cgctg 1455

Claims (1)

1.一种芽孢杆菌的发酵方法，其特征在于，芽孢杆菌的发酵控制方式是：发酵罐初始参数设定为温度37℃，pH 7.0，初始转速400rpm；每4个小时取样测定OD600nm值，镜检；发酵过程加消泡剂控制气泡；当菌生长至对数生长期时转速提高到800rpm，若pH低于7.0加NaOH调至7.0以上，若pH高于7.0则加HCl调低至7.0±0.1，在发酵培养基中培养15-20小时；
所述芽孢杆菌命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.)19-B，其确定为具芽孢形态小且高发酵密度的巨大芽孢杆菌，该菌株已于2008年10月29日保藏在“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为CCTCC No.M 208187；
发酵培养的培养基配方为：1升蒸馏水中含：20克葡萄糖，10克玉米面，20克酵母粉，2克氯化钠，0.2克一水合硫酸锰，0.5克七水合硫酸镁，1.3克三水合磷酸氢二钾，0.03克氯化铁；pH 8.0-8.5，115℃条件下灭菌30分钟。
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