CN113549578A - 一株抑制稻瘟病菌和促进种子发芽的暹罗芽孢杆菌BsNlG13及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株抑制稻瘟病菌和促进种子发芽的暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)BsNlG13菌株及其应用，所述菌株于2020年12月25日于广东省微生物菌种保藏中心保藏，其保藏编号为GDMCC NO：61391。本发明研究表明，暹罗芽孢杆菌BsNlG13菌株发酵液可以有效抑制水稻稻瘟病菌的生长，导致其菌丝变形，无法正常生长；同时暹罗芽孢杆菌BsNlG13菌株发酵液对水稻种子的萌发具有显著的促进作用。本发明暹罗芽孢杆菌BsNlG13菌株可作为一种良好的生防、植物生产调节资源，用于水稻稻瘟病的防控和促水稻种子萌发，具有良好的应用前景。

Description

一株抑制稻瘟病菌和促进种子发芽的暹罗芽孢杆菌BsNlG13 及其应用

技术领域

本发明涉及农业微生物技术领域，更具体地，涉及一种抑制稻瘟病菌和促进种子发芽的暹罗芽孢杆菌BsNlG13菌株及其应用。

背景技术

水稻作为一种非常重要的粮食作物，在全球范围内都有种植。水稻种植过程中发生的病害是目前水稻产量的重要限制因素。水稻稻瘟病是由于稻瘟病菌Magnaportheoryzae引起的一种重要的水稻真菌病害，属于水稻三大病害之一。稻瘟病在世界各稻区均有发生，以水稻叶部、节部发生较多。该病害发生时可引起水稻每年大幅减产10％-30％，造成较为严重的经济损失。目前，针对稻瘟病的防治方法主要是研究培育抗病的水稻品种或者利用化学药剂进行防治。而抗病品种研制周期长且常由于病原菌的遗传变异而丧失对病原菌的抗性，化学防治也会产生一定的抗药性和药剂残留等的环境问题，因此，利用生物菌剂对水稻稻瘟病进行防治可以具有环境友好，不易产生抗性等优点，生物菌剂可以作为一种良好的防治方法加以应用。

据报道，目前已有部分拮抗菌用于防治水稻稻瘟病的防治，如枯草芽孢杆菌、海洋枯草芽孢杆菌、伯克霍尔德菌等。暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis又译为西姆芽孢杆菌，于2010年被刊物International Journal ofSystematic and EvolutionaryMicrobiology收录为有效种名，属芽孢杆菌科芽孢杆菌属。现有研究表明暹罗芽孢杆菌对部分病原菌有一定的拮抗作用，具有作为生防菌剂的前景。也有研究表明暹罗芽孢杆菌在养殖和作物栽培上的促进作用，用含有菌株的饲料喂食鲇鱼不仅无副作用，而且能促进鱼生长(Meidong et al.,2017)；以厌氧消化液为主要原料，加入暹罗芽孢杆菌研制生物肥料，施用后作物的氮素利用效率提高，产量也显著提高(Pastor-Bueis et al.,2017)。中国专利CN105505834A公开了一株防治梨轮纹病和软腐病的暹罗芽孢杆菌，对稻瘟病菌有一定的抑菌率，而关于暹罗芽孢杆菌对于水稻种子萌发的影响，目前还鲜有报道。由于稻瘟病菌的同步进化以及单一拮抗菌株存在的局限性，因此还需要寻找新的菌株用于水稻稻瘟病害的防治。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种抑制稻瘟病菌和促进种子发芽暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)BsNlG13菌株。

本发明的第二个目的在于提供所述暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)BsNlG13菌株的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一株暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)BsNlG13菌株，所述菌株于2020年12月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，菌种保藏编号为GDMCC NO：61391。

具体地，所述菌株的16s rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明从褐飞虱雌成虫中肠内分离获得一株暹罗芽孢杆菌BsNlG13菌株，本发明采用平板对峙法通过PDA平板进行抑菌试验，结果发现，与对照相比，暹罗芽孢杆菌NlG13对于稻瘟病菌MoZC13具有显著的拮抗效果，对稻瘟病菌的生长有强烈的抑制作用，在显微镜下观察到BsNlG13对稻瘟病真菌菌丝具有破坏作用。同时，通过种子萌发试验表明，暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)BsNlG13菌株具有有效促进水稻种子绣占15发芽率的能力，在水稻种子播种前浸泡处理的水中加入上述BsNlG13菌株的菌体发酵液，可以使水稻种子的发芽率显著提高8.56％。

因此，本发明还提供暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)BsNlG13菌株或其菌体发酵液在抑制水稻稻瘟病菌或在防治水稻稻瘟病中的应用。

本发明还提供暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)BsNlG13菌株或其菌体发酵液在提高水稻种子发芽率中的应用。

暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)BsNlG13菌株或其发酵液在制备防治水稻稻瘟病和/或提高水稻种子发芽率的制剂中的应用。

本发明还提供一种防治稻瘟病和/或提高水稻种子发芽率的制剂，其特征在于，以权利要求1所述菌株或其菌体发酵液为活性成分。

优选地，所述的制剂的菌体发酵液浓度为1×10⁷CFU/mL。

进一步优选地，所述暹罗芽孢杆菌BsNlG13菌液的制备方法：将-80℃保存的甘油菌BsNlG13以1：100接入新鲜液体LB培养基，220rpm/min，37℃活化12h获得种子菌，再以1：100的比例取种子菌接于新鲜液体LB培养基，220rpm/min，37℃摇4h获得具有较强活性的菌液，测定OD值。

本发明还提供权利要求6或7所述制剂在防治水稻稻瘟病和/或提高水稻种子发芽率的制剂中的应用

本发明还提供一种提高水稻种子发芽率的方法，其特征在于，将暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)BsNlG13菌株配置成终浓度为1×10⁶CFU/mL的水溶液，对水稻种子进行浸泡萌发。

进一步优选地，所述水稻种子为为绣占15。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一株暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)BsNlG13菌株，所述菌株于2020年12月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，菌种保藏号为GDMCC No：61391。本发明研究表明，暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)BsNlG13菌株对稻瘟病菌的生长有强烈的抑制作用，抑菌率可达到82.6±0.5％，为水稻稻瘟病的生物防治提供了新的菌种资源，具有很好的生物防治潜力和应用前景。同时表明，暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)BsNlG13菌株具有有效促进水稻种子绣占15发芽率的能力，在水稻种子播种前浸泡处理的水中加入上述BsNlG13菌株的菌体发酵液，可以使水稻种子的发芽率显著提高8.56％，对提高种子的萌发率提供了一种新的方法思路和应用前景。

附图说明

图1为暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensisBsNlG13纯化培养菌落形态图。A：37℃，LB培养基生长12h菌落背面图；B：37℃，LB培养基生长12h菌落正面图。

图2为基于16s rDNA构建的暹罗芽孢杆菌BsNlG13***进化树。

图3为暹罗芽孢杆菌BsNlG13抑制稻瘟病菌试验结果。A为暹罗芽孢杆菌BsNlG13抑制稻瘟病菌对峙培养图；B为暹罗芽孢杆菌BsNlG13抑制稻瘟病菌对峙培养后稻瘟病菌菌落直径差异分析图；C为暹罗芽孢杆菌BsNlG13抑制稻瘟病菌对峙培养后稻瘟病菌菌丝变化形态图。

图4为暹罗芽孢杆菌BsNlG13处理水稻种子试验结果。A为暹罗芽孢杆菌BsNlG13处理水稻种子萌发效果对比图；B为暹罗芽孢杆菌BsNlG13处理水稻种子萌发率统计差异分析图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1菌株BsNlG13的分离与培养

解剖并涂板：BsNlG13菌株分离于褐飞虱雌成虫肠道，采用稀释涂布法进行分离培养。具体为在体式显微镜下解剖褐飞虱雌成虫肠道，将解剖后的肠道置于PBS中，手持电动研磨仪将其研磨成匀浆，稀释4个浓度梯度，涂布于三种培养基(LB培养基、EB培养基、NA培养基)，每个处理三个重复。置于37℃恒温培养箱培养，每隔24h观察一次。

连续纯化培养拍照：待选择性培养基中有单菌落长出后，首先根据菌落颜色，大小及形态挑取单菌落于相应培养基上连续划线纯化5次以上，然后对分离菌株的划线平板进行拍照(图1)并转接至相应的液体培养基中，摇菌至细菌指数生长期时保存于25％的甘油水溶液中，冻存于-80℃冰箱备用。

选择性分离培养基的配制：LB培养基(10g蛋白胨，5g酵母抽提物，10g NaCl，15g琼脂，溶于1L无菌水中，调pH至7.0，115℃高压灭菌20分钟)。EB培养基(3g牛肉浸粉，10g胰蛋白胨，15g酵母粉，5g氯化钠，10g葡萄糖，15g琼脂，溶于1L无菌水中，调pH至7.2，115℃高压灭菌20分钟)。NA培养基(10g胰蛋白胨，3g牛肉浸粉，5g氯化钠，15g琼脂，溶于1L无菌水中，调pH值至7.2，115℃高压灭菌20分钟)。

实施例2菌株BsNlG13鉴定及***发育分析

(1)传统的生物学鉴定：

在光学显微镜下观察，菌落形态为圆形或椭圆形，菌落为乳白色半透明，边缘完整，湿润菌落，稍***。在室温和37℃下生长速度较快，培养12h后菌落较大，直径3-5mm。

(2)生理生化特征测定：

细菌生理生化测定参考《常见细菌***鉴定手册》的方法进行，采用细菌微量生化反应管。显微观察可以看到该菌菌体为杆状，革兰氏阳性菌。该菌的生理生化特性见下表1。

表1 BsNlG13的生化特征

注：“+”为阳性反应，“﹣”为阴性反应。

(3)分子生物学鉴定(16S rDNA)：

使用天根生物公司DNA提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)提取分离获得细菌基因组DNA。以16S rDNA的通用引物27F(27F：5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R(1492R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)为引物，抽提的DNA为模板，扩增细菌的16SrDNA。PCR反应体系如表2，轻轻混匀后短暂离心，进行PCR反应。PCR反应基本条件设置为：98℃预变性2min；98℃变性10s，50℃退火15s，72℃延伸15s，30个循环；72℃，5min；10℃。PCR反应结束后，将PCR产物经1％琼脂糖凝胶检测并切胶回收纯化后送到广州擎科生物技术有限公司进行测序鉴定。

表2细菌16S rDNA PCR扩增体系(20μL)

(4)菌株PxG1***发育分析：

对获得的测序结果运用DNAStar拼接序列，将该序列与NCBI中rRNA/ITS数据库进行blast比对，确定近缘细菌菌株的分类地位。

选取下载整理肠道分离菌BsNlG13菌株的近缘序列后用ClustalW软件进行多序列比对分析，之后用Mega7.0软件采取邻接法(Neighbor-Joining)构建***进化树，调整bootstrap值并检验进化树的可靠性。结果如图2，由图2可知，BsNlG13与Bacillussiamensis KCTC 13613strain PD-A10(NR 117274.1:34-1474)相似性最高。将其命名为褐飞虱暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)BsNlG13菌株，该菌株于2020年12月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC NO：61391，命名为BsNlG13，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号。

实施例3暹罗芽孢杆菌BsNlG13对稻瘟病菌的抑制活性

采用平板对峙培养法测定暹罗芽孢杆菌BsNlG13对于稻瘟病菌的抑制效果。选择固体培养基为PDA培养基。先在PDA培养基中央接种活化好的直径5mm稻瘟病菌MoZC13菌片，在距离菌片2.5cm的对称处通过划线法接种拮抗菌暹罗芽孢杆菌BsNlG13的菌液，以仅接种稻瘟病菌MoZC13菌片的平板为对照，75％湿度下，置于恒温培养箱25℃中倒置培养5天。通过测量共培养5天后稻瘟病菌菌落的直径评估BsNlG13的抑菌效果。进行生物学重复。

平板对峙结果如图3A和图3B所示，稻瘟病菌MoZC13在培养皿中培养5天直径376±4.7mm，将稻瘟病菌MoZC13与BsNlG13菌液在培养皿中培养5d后直径为148±4.7mm，结果表明，暹罗芽孢杆菌NlG13对于稻瘟病菌MoZC13具有显著的拮抗效果。进一步将稻瘟病菌MoZC13在培养皿中培养10d直径为860±0.5mm，将稻瘟病菌MoZC13与BsNlG13菌液在培养皿中培养10d后直径为150±4.1mm，显示出很强的抑菌效果，抑菌率可达到82.6±0.5％。进一步利用显微镜对对峙培养中病原菌边缘菌丝的观察发现，处理组中病原菌边缘的菌丝生长畸形，出现菌丝破裂的现象，而对照组的菌丝正常生长，菌丝粗细均匀，完整光滑(如图3C)。

所述PDA培养基为每1L蒸馏水水中加入46g马铃薯葡萄糖琼脂培养基(不含抗生素)，加热至完全溶解，115℃高压灭菌20分钟。

所述暹罗芽孢杆菌BsNlG13菌液的制备方法：将-80℃保存的甘油菌以1：100接入新鲜液体LB培养基，220rpm/min，37℃活化12h获得种子菌，再以1：100的比例取种子菌接于新鲜液体LB培养基，220rpm/min，37℃摇4h获得具有较强活性的菌液，测定OD值，配制成1×10⁷CFU/mL。

实施例4暹罗芽孢杆菌BsNlG13对水稻种子(锈占15)萌发率的影响

挑选完整饱满的普通商业品种水稻种子(绣占15)100粒，自来水冲洗后置于无菌培养皿中，取18mL的自来水和2mL的暹罗芽孢杆BsNlG13菌液(1×10⁷CFU/mL)混合均匀后加入培养皿，对种子进行浸泡萌发。对照组中仅加100粒种子和20mL的自来水，后将培养皿置于温度28℃，湿度85％的恒温培养箱中避光培养，每隔24h更换一次自来水，每次培养皿中均留2mL的混合液体，只加18mL自来水，培养五天后统计水稻种子的萌发情况，拍照并记录，实验重复三次。

如图4A和图4B所示，对照组和处理组的种子萌发率分别为89±1.63％和97.33±1.25％，与对照组相比，处理组的种子萌发率显著提高了8.56％。表明在水稻种子萌发前处理浸泡时加入一定量的暹罗芽孢杆菌BsNlG13菌液可以显著提高种子的发芽率。结果表明，暹罗芽孢杆菌BsNlG13菌液可以作为一种提高水稻种子发芽率的辅助菌剂进行使用，有利于提高水稻的发芽率。

综上所述，本发明提供的一种暹罗芽孢杆菌BsNlG13可以有效抑制水稻稻瘟病菌的生长，导致其菌丝变形，无法正常生长，可作为一种良好的生防资源，具有较好的生物防治前景。另外，本发明提供的暹罗芽孢杆菌BsNlG13还对于水稻种子(绣占15)具有较好的萌发促进效果，可以有效提高水稻种子的发芽率，可以在水稻播种前处理环节加以运用。

以上所述仅为本发明的优选实施例，上述实施例并不能限制本发明的实施范围。熟悉本领域的相关技术人员对以上实施例做出的修改或替换都属于本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一株抑制稻瘟病菌和促进种子发芽的暹罗芽孢杆菌BsNlG13及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1461

<212> DNA

<213> 暹罗芽孢杆菌BsNlG13(Bacillus siamensis BsNlG13)

<400> 1

ggggaattgc ggcgtgctaa tacatgcagt cgagcggaca gatgggagct tgctccctga 60

tgttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ctgtaagact gggataactc 120

cgggaaaccg gggctaatac cggatggttg tttgaaccgc atggttcaga cataaaaggt 180

ggcttcggct accacttaca gatggacccg cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg 240

ctcaccaagg cgacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgag 300

acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc 360

tgacggagca acgccgcgtg agtgatgaag gttttcggat cgtaaagctc tgttgttagg 420

gaagaacaag tgccgttcaa atagggcggc accttgacgg tacctaacca gaaagccacg 480

gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggaattatt 540

gggcgtaaag ggctcgcagg cggtttctta agtctgatgt gaaagccccc ggctcaaccg 600

gggagggtca ttggaaactg gggaacttga gtgcagaaga ggagagtgga attccacgtg 660

tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga acaccagtgg cgaaggcgac tctctggtct 720

gtaactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc 780

cacgccgtaa acgatgagtg ctaagtgtta gggggtttcc gccccttagt gctgcagcta 840

acgcattaag cactccgcct ggggagtacg gtcgcaagac tgaaactcaa aggaattgac 900

gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac 960

caggtcttga catcctctga caatcctaga gataggacgt ccccttcggg ggcagagtga 1020

caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg 1080

agcgcaaccc ttgatcttag ttgccagcat tcagttgggc actctaaggt gactgccggt 1140

gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta 1200

cacacgtgct acaatggaca gaacaaaggg cagcgaaacc gcgaggttaa gccaatccca 1260

caaatctgtt ctcagttcgg atcgcagtct gcaactcgac tgcgtgaagc tggaatcgct 1320

agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg 1380

tcacaccacg agagtttgta acacccgaag tcggtgaggt aacctttatg gagccagccg 1440

ccgaagtgac agaagatttg g 1461

Claims (10)

1.一株暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)BsNlG13菌株，其特征在于，所述菌株于2020年12月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，菌种保藏编号为GDMCC NO：61391。

2.根据权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)BsNlG13菌株，其特征在于，所述菌株的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)BsNlG13菌株或其菌体发酵液在抑制水稻稻瘟病菌或在防治水稻稻瘟病中的应用。

4.权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)BsNlG13菌株或其菌体发酵液在提高水稻种子发芽率中的应用。

5.权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)BsNlG13菌株或其发酵液在制备防治水稻稻瘟病和/或提高水稻种子发芽率的制剂中的应用。

6.一种防治稻瘟病和/或提高水稻种子发芽率的制剂，其特征在于，以权利要求1所述菌株或其菌体发酵液为活性成分。

7.根据权利要求6所述的制剂，其特征在于，所述菌体发酵液浓度为1×10⁷CFU/mL。

8.权利要求6或7所述制剂在防治水稻稻瘟病和/或提高水稻种子发芽率的制剂中的应用。

9.一种提高水稻种子发芽率的方法，其特征在于，将暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)BsNlG13菌株配置成终浓度为1×10⁶CFU/mL的水溶液，对水稻种子进行浸泡萌发。

10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述水稻种子为绣占15。

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