CN114426937A - 一株具有解磷功能的根瘤内生菌s43及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一株具有解磷功能的根瘤内生菌S43及其应用。本发明分离获得一株根瘤内生菌韩国假单胞菌S43菌株，该菌株于2021年12月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62100。本发明研究表明，该菌株具有较强的解磷能力，在发酵后其上清液中的可溶磷含量达400μg/ml，并随着发酵时间的延长可溶磷含量还在增加；菌株S43还具泌氢能力，能使培养基pH值由7.0下降至4.13，有助于将难溶磷转化为植物能够吸收利用的可溶磷，促进作物的吸收利用。本发明为土壤溶磷的微生物菌株提供新的降解菌选择，扩充了解磷菌的菌种资源库，有利于植物对磷的吸收利用及改善土壤肥力。
Description
技术领域
本发明属于农业微生物技术领域。更具体地，涉及一株具有解磷功能的根瘤内生菌S43及其应用。
背景技术
磷是植物生长发育的所需的大量营养元素之一，在植物中的含量仅次于氮和钾。在农业生产上的种植过程中，由于磷在土壤中易与铁、铝、钙等元素形成难溶磷酸盐，导致植物难以直接利用吸收。缺乏磷元素的植株矮小，整体发育迟缓甚至停滞，为了达到生产要求，绝大部分的农田都要施用磷肥，而施用磷肥的利用率低，进而加剧了磷资源的消耗，并且长期的磷积累导致土壤中营养元素失衡，水体富营养化等问题。如何充分利用土壤磷资源，改善土壤有效磷缺乏的问题的同时减少环境污染，仍旧具有重要意义。
微生物肥料的使用在很大程度上缓解了化学肥料在应用中出现的问题，是实现减肥增效的有效方法之一。在目前施用的生产应用的微生物菌剂大多由数种促生菌组成，解磷菌是其中常见的一类，解磷菌又称溶磷菌，是指土壤中具有能将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用的形态这种能力的微生物，是能够依靠自身代谢产物或者与其他生物协同分解土壤中的难溶磷，为作物提供养分。这些微生物肥料大多来源于土壤及植物内生菌，具有解磷作用的微生物种类很多，也比较复杂。现有报道具有解磷作用的微生物解磷细菌类有芽孢杆菌(Bacillus)、沙门氏菌(Salmonella)、假单胞杆菌(Pseudomonas)、根瘤菌(Bradyrhizobium)、欧文氏菌(Erwinia)、土壤杆菌(Agrobacterium)、沙雷氏菌(Serratia)等；解磷菌的种类分布非常广，并不集中于某一种或某几种，虽然目前已经分离出不同的解磷菌菌株，但是还是需要不断地研究和筛选出更多的能够降解磷的高效菌株应用于植物吸收利用以及改善土壤肥力，将难溶磷转化为植物可吸收利用的有效磷，对提高土壤磷素的有效性，改善土壤肥力具有重大意义。如中国专利CN112322535A公开了一种解磷假单胞菌及其应用，分离出一株新的能够高效地溶解难溶态的磷酸钙的菌种：解磷假单胞菌(Pseudomonas phosphatilytica)PD171；而大多数的解磷菌都分离自土壤中，对植物内生菌的研究相对缺乏，筛选得到的植物内生解磷菌菌株更是少之又少；所以，为了扩充解磷菌的菌种资源库，研究出新的植物内生菌应用于植物吸收利用以及土壤肥力的改善具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷和不足，提供一株具有解磷功能的根瘤内生菌S43及其应用，丰富解磷菌的菌种资源库，有利于植物对磷的吸收利用及改善土壤肥力。
本发明的目的是提供一株具有解磷功能的根瘤内生菌韩国假单胞菌(Pseudomonas koreensis)S43菌株。
本发明第二个目的是提供所述韩国假单胞菌S43菌株的应用。
本发明第三个目的是一种解磷微生物制剂。
本发明第四个目的是提供一种土壤解磷的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供一株具有解磷功能的根瘤内生菌韩国假单胞菌(Pseudomonaskoreensis)S43菌株，该菌株于2021年12月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，菌种保藏号为GDMCC No：62100，所述菌株的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明从绿叶山蚂蝗根瘤样品分离获得一株具有解磷功能的根瘤内生菌韩国假单胞菌(Pseudomonas koreensis)S43菌株，菌株S43为杆菌，长1μm-2.5μm、宽0.5μm左右，在YMA平板上呈规则圆形，表面湿润粘稠，有光泽，整体呈现白色。菌株S43为革兰氏染色阴性，对柠檬酸盐反应阳性，淀粉水解反应阴性，泌氢反应阳性，明胶反应阳性，3-酮基乳糖反应阴性；通过生理生化特征、形态特征、16S rRNA同源序列和***进化树分析，表明菌株S43与Pseudomonas koreensis strain OHA11聚为一支且相似度达到98.85％，确定菌株S43隶属于假单胞菌属，与Pseudomonas koreensis属于同一种群，命名为韩国假单胞菌(Pseudomonas koreensis)S43菌株。
本发明通过钼锑抗比色法测定培养基中可溶磷含量以确定其解磷能力，研究表明，菌株S43具有较强的解磷能力，在28℃经过两天发酵后，其发酵上清液中的可溶磷含量达到400μg/ml，并且随着发酵时间的延长可溶磷含量还在缓慢增加；在经过28℃两天的培养后，培养基pH值由7.0下降至4.13，之后一直稳定在4.2左右，表明菌株S43还具有较强的泌氢能力，解磷菌在生长过程中产生的有机酸(诸如乙酸、乳酸、苹果酸等)和无机酸能够降低环境pH值，不仅有助于将难溶磷转化为植物能够吸收利用的可溶磷，此外，有机酸还能与铁、铝等离子形成螯合物，供作物吸收利用。
本发明提供所述韩国假单胞菌S43菌株在在作为解磷菌方面的应用，或制备解磷微生物制剂中的应用。
本发明提供一种解磷微生物制剂，含有韩国假单胞菌S43菌株和/或其菌液。
优选地，所述菌液为菌悬液。
优选地，所述菌悬液的OD值为0.5±0.05。
优选地，制备所述菌悬液采用的培养基为YMA液体培养基。
优选地，制备所述菌悬液的发酵温度为25～30℃。
更优选地，所述发酵温度为28℃。
优选地，制备所述菌悬液的发酵时间不低于2天。
本发明提供所述解磷微生物制剂在土壤解磷中的应用。
本发明还提供一种土壤解磷的方法，采用上述制备得到的解磷微生物制剂对土壤进行处理。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供一株具有解磷功能的根瘤内生菌韩国假单胞菌(Pseudomonaskoreensis)S43菌株，本发明研究表明，该菌株具有较强的解磷能力，在28℃经过两天发酵后，其发酵上清液中的可溶磷含量达到400μg/ml，并随着发酵时间的延长可溶磷含量还在缓慢增加；在经过28℃两天培养后，pH值由7.0下降至4.13，之后一直稳定在4.2左右，表明菌株S43还具有较强的泌氢能力，有助于将难溶磷转化为植物能够吸收利用的可溶磷，供作物吸收利用。本发明提供的韩国假单胞菌S43菌株为土壤溶磷的微生物菌株提供新的降解菌，扩充了解磷菌的菌种资源库，有利于植物对磷的吸收利用以及改善土壤肥力。
本发明研究的韩国假单胞菌S43菌株属于植物根瘤内生菌，植物内生菌是植物微生态***的重要组成部分，在生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物组织内部或细胞间隙、不会引起植物产生明显症状，并且不改变寄主植物的表型特征和功能。植物内生菌与植物在长期协同进化过程中形成了互惠互利、相互依存的关系，大多数内生细菌是兼性内生，相较于土壤微生物菌剂，内生菌菌剂受土著微生物的影响较小、易于植物形成共生关系。而根瘤内生菌相对于其他组织内生细菌而言，对土壤的适应性更强，与土壤生态的关系也更加紧密。除此之外，不少根瘤内生菌还能够促进根瘤菌的生长繁殖，甚至可能通过接受根瘤菌横向转移的共生基因而获得固氮能力，赋予内生菌固氮的潜能。
附图说明
图1为目标菌株溶磷圈特征图；
图2为菌株S43的***进化树示意图；
图3为菌株S43的格兰仕染色反应图(×400油镜)；
图4为菌株S43的柠檬酸盐反应、淀粉水解反应、泌氢能力、明胶反应、3-酮基乳糖反应和溶磷能力检测；
图5为韩国假单胞菌S43的溶磷能力定量检测；
图6为韩国假单胞菌S43的泌氢能力定量检测。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
以下实施例中采用的培养基配方为：
YMA固体培养基(酵母甘露醇琼脂培养基)：甘露醇10g，酵母粉3g，MgSO4·7H2O0.2g，NaCl 0.1g，K2HPO4 0.25g，KH2PO4 0.25g，琼脂17g，蒸馏水1000ml，pH 7.0；无机磷培养基：葡萄糖10g，酵母粉0.5g，(NH4)2SO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.1g，KCl 0.2g，MnSO4·H2O0.002g，FeSO4·7H2O 0.002g，Ca3(PO4)2 5g，NaCl 0.2g，琼脂17g，蒸馏水1000ml，pH 7.0；
无机磷培养基：葡萄糖10g，酵母粉0.5g，(NH4)2SO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.1g，KCl0.2g，MnSO4·H2O 0.002g，FeSO4·7H2O 0.002g，Ca3(PO4)2 5g，NaCl 0.2g，琼脂17g，蒸馏水1000ml，pH 7.0；
无机磷液体培养基：葡萄糖10g，酵母粉0.5g，(NH4)2SO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.1g，KCl 0.2g，MnSO4·H2O 0.002g，FeSO4·7H2O 0.002g，Ca3(PO4)2 5g，NaCl 0.2g，蒸馏水1000ml，pH 7.0。
实施例1菌株的分离
(1)样品采集
样品来自于贵州省兴义市纳灰村(Lat.24.514341N，Lon.104.590378E)绿叶山蚂蝗样品。
(2)根瘤样品表面消毒
收集绿叶山蚂蝗新鲜根瘤于干净三角瓶中，以无菌水浸泡5min并冲洗3～5次，加入75％酒精浸泡3min并轻微摇晃，使用无菌水冲洗3～5次，再加入3.5％的NaClO处理8min表面消毒，最后使用无菌水冲洗5～8次。
(3)根瘤内生菌分离培养
将消毒后的根瘤样品置于5ml离心管中，用灭菌后的玻璃棒碾碎根瘤，挤压获得根瘤汁液。在无菌条件下，取消毒处理后的根瘤汁液进行稀释，得到10-3、10-4和10-5倍浓度梯度的悬浊液样品，并将各浓度样品依次取0.1ml涂抹在YMA固体培养基上进行培养，于28℃恒温培养3天，挑取细菌菌落进行纯化。
将YMA固体培养基中的菌落转接于无机磷培养基观察解磷效果，筛选出具有解磷能力的细菌后在无机磷液体培养基中进行培养。通过无机磷液体培养基对具有溶磷能力的细菌进行筛选，得到一株具有明显溶磷圈的细菌S43，结果如图1所示，并将其作为目标菌株进行鉴定。
将YMA固体培养基中的菌落转接于无机磷培养基观察解磷效果，筛选出具有解磷能力的细菌后在无机磷液体培养基中进行培养。通过无机磷液体培养基对具有溶磷能力的细菌进行筛选，挑选生长良好、特征典型且溶磷圈大的单克隆菌落，在YMA固体培养基平板划线纯化，获得目标菌株活体培养物，并转接于50％的甘油中4℃保藏，最终得到一株具有明显溶磷圈的细菌S43，结果如图1所示，并将其作为目标菌株进行鉴定。
实施例2菌株的鉴定
(1)菌株的菌落特征
经鉴定上述分离得到的菌株S43呈杆状，菌落长1μm-2.5μm、宽0.5μm左右。在YMA平板上呈规则圆形，表面湿润粘稠，有光泽，整体呈现白色。
(2)菌株的生化指标
菌株的生理生化指标测定测表明，菌株S43为革兰氏染色阴性，结果如图2所示；菌株S43对柠檬酸盐反应阳性，淀粉水解反应阴性，泌氢反应阳性，明胶反应阳性，3-酮基乳糖反应阴性，结果如图3所示。
(3)菌株的鉴定
提取实施例1中分离得到的菌株S43基因组DNA，并以提取的DNA为模板，进行16SrDNA PCR扩增，并采用16S rDNA通用引物27F和1492R为正向引物和反向引物进行PCR扩增，引物序列如下所示：
正向引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；
反向引物1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；
PCR扩增的体系为(50μL)：2×PCR Buffer 25μL，引物16S rDNA F/16S rDNA R各2.0μL，dNTP 1.0μL，TaqDNA聚合酶1μL，模板2μL，灭菌ddH2O 17μL。
PCR扩增的程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸2min，扩增35个循环；72℃延伸10min。
对目标菌株16S rDNA扩增后进行测序分析，得到长度为1409bp的序列，菌株的16SrDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。将测序所得的基因序列在NCBI数据库中进行在线比对，对比结果显示菌株S43与登录号为NR_025228.1的Pseudomonas koreensis strainPs 9-14相似性超过99％；再使用MEGA 5.2软件构建***发育进化树，结果如图4所示，表明菌株S43与Pseudomonas koreensis strain OHA11聚为一支且相似度达到98.85％。
通过生理生化特征、形态特征、16S rRNA同源序列和***进化树分析，确定本发明所筛选的菌株S43隶属于假单胞菌属，与Pseudomonas koreensis属于同一种群，命名为韩国假单胞菌(Pseudomonas koreensis)S43菌株，该菌株于2021年12月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC No：62100，保藏单位地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
实施例3菌株S43的溶磷泌氢性能鉴定
(1)菌株S43的溶磷能力鉴定
将实施例1中通过无机磷培养基进行初步筛选，得到的具有明显溶磷圈的菌株S43作进一步的测定，采用钼锑抗比色法测定培养基中可溶磷含量以确定其解磷能力。
将菌株S43接种到装有50ml无机磷液体培养基的三角瓶中，调整初始pH值为7.0，置于28℃、180rpm摇床中进行培养，在培养6h、12h、24h以及48h时分别测定培养基中的可溶磷含量，之后每隔48h测定一次。测定结果以培养时间为横坐标，可溶磷含量为纵坐标绘制曲线，菌株S43的溶磷曲线如图5所示
结果表明，菌株S43经过两天发酵后培养基上清液中的可溶磷含量达到400μg/ml，并且菌株S43的可溶磷含量在发酵过程中仍有缓慢的增加，表明菌株S43具有较强的解磷能力。
(2)菌株S43的泌氢能力鉴定
将解磷菌S43菌株接种到装有50ml无机磷液体培养基的三角瓶中，置于28℃、180rpm摇床中进行培养，在培养6h、12h、24h以及48h时分别测定pH值，之后每隔48小时测定一次，以培养时间为横坐标，pH为纵坐标绘制pH变化曲线，菌株S43的pH变化曲线如图6所示。
结果表明，菌株S43在经过两天的培养后，培养基pH值由7.0下降至4.13，之后一直稳定在4.2左右，表明菌株S43具有较强的泌氢能力；而在菌株S43进行溶磷时会随着发酵时间增加溶磷量也会中缓慢的增加，是由于菌株S43在生长过程中产生的有机酸和无机酸等，够降低了pH值，有助于将难溶磷转化为植物能够吸收利用的可溶磷，促进作物的吸收利用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<120> 一株具有解磷功能的根瘤内生菌S43及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1409
<212> DNA
<213> 韩国假单胞菌（Pseudomonas koreensis）S43菌株(SIPOSequenceListing 1.0)
<400> 1
tgcagtcgag cggatgaagg gagcttgctc ccggattcag cggcggacgg gtgagtaatg 60
cctaggaatc tgcctggtag tgggggacaa cgtttcgaaa ggaacgctaa taccgcatac 120
gtcctacggg agaaagcagg ggaccttcgg gccttgcgct atcagatgag cctaggtcgg 180
attagctagt tggtgaggta atggctcacc aaggcgacga tccgtaactg gtctgagagg 240
atgatcagtc acactggaac tgagacacgg tccagactcc tacgggaggc agcagtgggg 300
aatattggac aatgggcgaa agcctgatcc agccatgccg cgtgtgtgaa gaaggtcttc 360
ggattgtaaa gcactttaag ttgggaggaa gggttgtaga ttaatactct gcaattttga 420
cgttaccgac agaataagca ccggctaact ctgtgccagc agccgcggta atacagaggg 480
tgcaagcgtt aatcggaatt actgggcgta aagcgcgcgt aggtggttcg ttaagttgga 540
tgtgaaatcc ccgggctcaa cctgggaact gcatccaaaa ctggcgagct agagtatggt 600
agagggtggt ggaatttcct gtgtagcggt gaaatgcgta gatataggaa ggaacaccag 660
tggcgaaggc gaccacctgg actgatactg acactgaggt gcgaaagcgt ggggagcaaa 720
caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatgt caactagccg ttgggagcct 780
tgagctctta gtggcgcagc taacgcatta agttgaccgc ctggggagta cggccgcaag 840
gttaaaactc aaatgaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 900
gaagcaacgc gaagaacctt accaggcctt gacatccaat gaactttcca gagatggatt 960
ggtgccttcg ggagcattga gacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga 1020
tgttgggtta agtcccgtaa cgagcgcaac ccttgtcctt agttaccagc acgttatggt 1080
gggcactcta aggagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaagtca 1140
tcatggccct tacggcctgg gctacacacg tgctacaatg gtcggtacaa agggttgcca 1200
agccgcgagg tggagctaat cccataaaac cgatcgtagt ccggatcgca gtctgcaact 1260
cgactgcgtg aagtcggaat cgctagtaat cgcgaatcag aatgtcgcgg tgaatacgtt 1320
cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgggagtg ggttgcacca gaagtagcta 1380
gtctaacctt cgggaggacg gtaccacgg 1409
Claims (10)
1.一株具有解磷功能的根瘤内生菌韩国假单胞菌(Pseudomonas koreensis)S43菌株，其特征在于，所述菌株于2021年12月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，菌种保藏号为GDMCC No：62100。
2.权利要求1所述韩国假单胞菌S43在作为解磷菌方面的应用，或制备解磷微生物制剂中的应用。
3.一种解磷微生物制剂，其特征在于，含权利要求1所述韩国假单胞菌S43菌株和/或其菌液。
4.根据权利要求3所述微生物制剂，其特征在于，所述菌液为菌悬液。
5.根据权利要求3所述微生物制剂，其特征在于，所述菌悬液的OD值为0.5±0.05。
6.根据权利要求4所述微生物制剂，其特征在于，制备所述菌悬液采用的培养基为YMA液体培养基。
7.根据权利要求4所述微生物制剂，其特征在于，制备所述菌悬液的发酵温度为25～30℃。
8.根据权利要求4所述微生物制剂，其特征在于，制备所述菌悬液的发酵时间不低于2天。
9.权利要求3-8任一所述微生物制剂在土壤解磷中的应用。
10.一种土壤解磷的方法，其特征在于，用权利要求3-8任一所述微生物制剂对土壤进行处理。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20220503 |
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