CN115927234A - amt基因、突变株M107在表达固氮菌嗜铁素中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，尤其是涉及amt基因、突变株M107在表达固氮菌嗜铁素中的应用。本发明利用Tn5转座技术，通过构建突变体库，筛选出嗜铁素合成能力较野生株GXGL‑4A显著提高的突变株M107。突变株M107的***位点为氨甲基转移酶基因amt。通过CAS平板检测和嗜铁素相对含量测定，确认目标突变株M107嗜铁素产量较野生株显著提高，并且细菌生长不受影响；对黄瓜的促生实验表明获得的高产嗜铁素突变株对黄瓜有显著的促进生长效果。与现有技术相比，本发明通过对固氮菌的amt基因进行突变，显著提高了该菌嗜铁素产率，所得到的突变株可用作植物促生菌，在保持固氮活性的同时，增加对土壤中铁的吸收。

Description

amt基因、突变株M107在表达固氮菌嗜铁素中的应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其是涉及amt基因、突变株M107在表达固氮菌嗜铁素中的应用。

背景技术

铁是微生物生长必需的元素，是多种关键酶的组分，这些酶在电子传递、RNA合成及抗活性氧胁迫中发挥着重要作用。铁元素在生理条件下往往以Fe(OH)₃的形式存在，铁溶解性差，无法满足微生物对铁的需要。在低铁环境下，细菌会合成一类对Fe³⁺有着高亲和性、小分子量的螯合因子(1-2KDa)称为嗜铁素，分泌到胞外或细胞表面来获取Fe³⁺，形成嗜铁素-铁复合物，与细胞膜上的受体蛋白结合从胞外向胞内运输铁，以满足微生物生长对铁的需要。嗜铁素的分泌是植物根际促生菌的一项重要的生防机制。这些促生菌可以通过产生嗜铁素竞争土壤中有限的铁，使得病原菌因缺少铁而不能生长甚至死亡，从而达到生防的目的。近年来，国内外学者对嗜铁素的生物合成及其对铁的吸收和转运机制进行了较深入的研究。通过改进细菌的培养条件、筛选高产嗜铁素菌株、引入外源嗜铁素的受体及嗜铁素生物合成调控等来提高微生物产嗜铁素的能力，取得了一定的进展。但是，相关的研究多以大肠杆菌和铜绿假单胞菌为对象。采用基因工程的办法来提高嗜铁素的生物合成能力以进一步改良促生菌或生防菌的生防能力将会有广阔的应用前景。此外，许多研究证实嗜铁素在促进植物生长发育、提高作物抗逆性等方面发挥着重要的作用。

联合固氮菌具有很好的生物固氮能力，尤其对于非豆科植物来源的固氮菌进行基因工程开发是当今的研究热点。这些固氮菌具有宿主范围广、培养方便、来源广泛等优点，若能将其开发成高产嗜铁素的菌株可充分发挥细菌固氮吸铁的能力，提高促生和防病能力，从而有助于宿主植物的生长发育。嗜铁素的生物合成属于非核糖体肽合成途径，由一类多功能蛋白质复合体即非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide synthetases，NRPS)识别、激活、转运氨基酸底物并按特定顺序合成非核糖体肽(NRPS)。嗜铁素是许多细菌和真菌等产生的一种重要的次级代谢产物，由嗜铁素合成基因簇负责合成。通过测定细菌或真菌全基因组序列，通过生物信息学手段分析完整的嗜铁素合成基因簇，并对核心嗜铁素合成酶基因进行改造是提高微生物产嗜铁素能力的一条途径。但是，嗜铁素的生物合成除了受到基因调控外，还受细菌培养条件、铁离子浓度、嗜铁素受体、铁信号传导与转运等多因素的影响。所以，通过改造嗜铁素合成基因簇上部分基因来提高微生物产嗜铁素能力实际上并非易事。为了能更好地开发利用包括固氮菌在内的植物促生菌，将之开发成多功能的生物菌剂，设法提高细菌产嗜铁素能力是一种新思路。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是提供amt基因、突变株M107在表达固氮菌嗜铁素中的应用。本发明利用Tn5转座技术，通过构建突变体库，筛选出嗜铁素合成能力较野生株GXGL-4A显著提高的突变株M107。突变株M107的***位点为氨甲基转移酶基因amt。通过CAS平板检测和嗜铁素相对含量测定，确认目标突变株嗜铁素产量较野生株显著提高，并且细菌生长不受影响。对黄瓜的促生实验表明获得的高产嗜铁素突变株对黄瓜有显著的促进生长效果。与现有技术相比，本发明通过对固氮菌的amt基因进行突变，显著提高了菌株的嗜铁素产率，所得到的突变株可用作植物促生菌，在保持固氮活性的同时，增加对土壤中铁的吸收，有利于植物根系获取更多的铁，提高植物生物量。同时，突变株通过竞争土壤中病原菌的铁营养，抑制了土壤病原菌的生长，有助于提高植物的抗病性。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明的第一个目的是提供一种目的基因在表达固氮菌嗜铁素中的应用，所述目的基因为amt基因，所述amt基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供突变株M107在表达固氮菌嗜铁素中的应用，所述突变株M107的保藏编号为CGMCC No.24401。

在本发明的一个实施方式中，所述突变株M107在表达固氮菌嗜铁素以促进植物生长的应用方法包括以下步骤：

(1)将突变株M107接种至LB培养基中，过夜培养后收集突变株M107细胞沉淀；

(2)将步骤(1)收集的突变株M107细胞沉淀后处理后施放至植物根际。

在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，将突变株M107以1％接种量接种至LB培养基中。

在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，所述后处理为将突变株M107细胞沉淀重悬于无菌水后离心，该过程重复多次，将最后一次离心得到的突变株M107细胞沉淀重悬于无菌水中得到突变株M107细胞悬液。

在本发明的一个实施方式中，植物处于两叶一心期时施放突变株M107细胞悬液。

在本发明的一个实施方式中，每棵植物释放5-10mL突变株M107细胞悬液，细菌数为1×10⁸CFU/mL；频率为每5天施用1次，连续处理5次。

本发明的第三个目的是提供敲除或替换目的基因的物质在制备高产嗜铁素固氮菌菌剂或产嗜铁素的促生菌菌剂中的应用，所述目的基因为amt基因，所述amt基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第四个目的是提供突变株M107在制备高产嗜铁素固氮菌菌剂或产嗜铁素的促生菌菌剂中的应用，所述突变株M107的保藏编号为CGMCC No.24401。

本发明的第五个目的是提供突变株M107，所述突变株M107的保藏编号为CGMCCNo.24401。

本发明采用基因突变的方法，通过目标基因的***失活来实现菌株产嗜铁素能力的提升是一条可控高效的途径。本方法使用简单，目标基因的失活很容易操控实现，具有普遍的适用性，在植物促生菌、固氮菌等产嗜铁素调控方面有很好的推广价值。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明通过***突变，使得目标基因amt失活，实现嗜铁素生物合成的显著提升，操作简单，结果可靠，效果明显。研究发现这个基因与嗜铁素合成产率密切相关，推测为负调控机制，但基因的具体调控机制目前并不清楚。

(2)本发明中嗜铁素的高表达不会对细菌细胞自身产生任何危害，细菌的生长繁殖不受影响，细菌形态特征及生理生化过程未见有明显改变。所得到的转化株作为促生菌较对照野生株能显著促进植物的生长。

(3)本发明首次明确了amt基因能够调控嗜铁素的生物合成。

(4)本发明创制的突变菌株可应用于制备高产嗜铁素的固氮菌菌剂或产嗜铁素的促生菌菌剂。对基因进行敲除等遗传操作构建的高产嗜铁素突变株可以用作高效的促生菌，尤其是当土壤缺铁或低铁时，能显著提高植物对铁的吸收，做成菌剂后可用于农业生产或生态环境保护领域。

附图说明

图1是固氮菌GXGL-4A在高渗培养后的感受态细胞形态，用于转座突变；图1A：常规LB培养；图1B：含有15g/L NaCl的LB培养；图1C:HO-2培养基(用7.5g/L CaCl₂替换掉常规LB培养基中的NaCl)。

图2是突变株M107嗜铁素生物合成能力的定性及定量检测。

图3是突变株M107转座***位点示意图。

图4是amt基因的PCR克隆及突变株M107转座位点的鉴定；M：DNA分子量Marker；4A：以固氮菌野生株GXGL-4A基因组DNA为模板扩增目的基因amt；M107：以突变株M107基因组DNA为模板扩增突变后的目的基因amt。。

图5是amt基因的***发育树；其中，E：Escherichia；括号内为GenBank中的菌株基因组登录号。

图6是突变株M107突变位点基因的荧光定量PCR；GXGL-4A内的amt基因为相对定量1，M107表示突变后的靶基因trX和amt的相对表达量。荧光定量PCR实验以rpoB基因为内参基因。

图7是目标菌株的生长曲线。

图8是目标菌株对黄瓜的促生作用检测，图8A为突变株M107处理对黄瓜株高的影响；图8B为突变株M107处理对黄瓜根鲜重的影响；图8C为突变株M107处理对黄瓜株鲜重的影响；图8D为突变株M107处理对黄瓜根长的影响。

图9是目标菌株对黄瓜的促生作用实物图。

图10是目标菌株对玉米小斑病病原菌生长的抑制作用检测。

具体实施方式

本发明提供一种目的基因在表达固氮菌嗜铁素中的应用，所述目的基因为amt基因，所述amt基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供突变株M107在表达固氮菌嗜铁素中的应用，所述突变株M107的保藏编号为CGMCC No.24401。

在本发明的一个实施方式中，所述突变株M107在表达固氮菌嗜铁素以促进植物生长的应用方法包括以下步骤：

(1)将突变株M107接种至LB培养基中，过夜培养后收集突变株M107细胞沉淀；

(2)将步骤(1)收集的突变株M107细胞沉淀后处理后施放至植物根际。

在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，将突变株M107以1％接种量接种至LB培养基中。

在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，所述后处理为将突变株M107细胞沉淀重悬于无菌水后离心，该过程重复多次，将最后一次离心得到的突变株M107细胞沉淀重悬于无菌水中得到突变株M107细胞悬液。

在本发明的一个实施方式中，植物处于两叶一心期时施放突变株M107细胞悬液。

在本发明的一个实施方式中，每棵植物释放5-10mL突变株M107细胞悬液，细菌数为1×10⁸CFU/mL；频率为每5天施用1次，连续处理5次。

本发明提供敲除或替换目的基因的物质在制备高产嗜铁素固氮菌菌剂或产嗜铁素的促生菌菌剂中的应用，所述目的基因为amt基因，所述amt基因的DNA序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明提供突变株M107在制备高产嗜铁素固氮菌菌剂或产嗜铁素的促生菌菌剂中的应用，所述突变株M107的保藏编号为CGMCC No.24401。

本发明提供突变株M107，所述突变株M107的保藏编号为CGMCC No.24401。

本发明采用基因突变的方法，通过目标基因的***失活来实现菌株产嗜铁素能力的提升是一条可控高效的途径。本方法使用简单，目标基因的失活很容易操控实现，具有普遍的适用性，在植物促生菌、固氮菌等产嗜铁素调控方面有很好的推广价值。

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

下述各实施例中，所用材料如无特殊说明，均为市售；所述技术或检测手段若无特殊说明均为本领域常规技术或检测手段。

实施例1

本实施例提供一种突变株M107。

(1)固氮菌GXGL-4A感受态细胞的制备

联合固氮菌GXGL-4A分离自广西桂林的玉米根部，在GenBank中的全基因组序列的收录号为CP015113.1；GXGL-4A在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)保藏号为CGMCC No.12588。

GXGL-4A制备感受态细胞的方法包括以下步骤：

1)在普通LB平板上划线培养，挑取单菌落，接种到常规LB培养基中过夜培养；

2)再以1％接种量接种于含有7.5g/L CaCl₂的HO-2培养基(改良LB培养基，无NaCl)中培养到对数期；

3)低温下离心收集细菌沉淀，PEB电击缓冲液洗去杂质和菌体碎片，得到细菌感受态细胞。

(2)固氮菌GXGL-4A感受态细胞的形态观察

将固氮菌GXGL-4A在HO-2溶液中培养至OD₆₀₀达到0.6-0.8时，吸取1mL固氮菌GXGL-4A菌液在8000rpm离心5min，弃上清液，用等量无菌水洗涤，重复操作两次，最后用无菌水重悬，取10μL重悬菌液滴在铜片上，隔夜阴干。以常规LB、HO-1(含有15g/NaCl的LB培养基)培养基中培养制备的感受态细胞为对照，在透射电镜下进行观察。结果表明普通LB培养的固氮菌GXGL-4A荚膜和细胞质结合紧致均匀，未见明显界限。HO-1培养的固氮菌GXGL-4A则表现出胞质皱缩现象，胞质颜色较深，荚膜厚度不均匀，且荚膜与胞质有明显的界限。HO-2培养条件下的固氮菌GXGL-4A出现皱缩更加严重，且形态发生扭曲。由此可见，不同培养方式下菌体形态发生了明显变化(图1)。

(3)电击转化，筛选Tn5突变株

1)在含有固氮菌GXGL-4A感受态细胞的PEB溶液中，加入Tn5转座复合体，使其终浓度为2.5μg/mL，冰浴5分钟。然后，取此混合液200μL加入到0℃预冷过的Bio-Rad电击杯中，电极距离0.2cm，在电压2.0Kv的Bio-Rad MicroPulser电击转化仪上电击，电击时间一般为2ms。电击结束后，立即加入800μL SOC培养基，37℃，150rpm培养1h。

2)涂布平板，筛选转化子的步骤：取100μL恢复生长细胞涂布含Km(50μg/mL)抗生素的平板，37℃培养箱中培养16h，挑取转化子，纯培养后进行鉴定。

SOC恢复培养基：含0.5％(W/V)酵母抽提物、2％(W/V)胰蛋白胨、10mmol/L NaCl、2.5mmol/L KCl、10mmol/L MgCl₂、20mmol/L MgSO₄、20mmol/L葡萄糖。8磅压力下灭菌20min，于4℃保存备用。

PEB电击缓冲液：含272mmol/L蔗糖和1mmol/L MgCl₂。

3)阳性转化子的鉴定：以固氮菌GXGL-4A的anfD基因和Tn5转座元件上的基因片段为扩增目标片段，共设计引物4对引物。其中引物对anfD/anfR用于扩增以保证转化子来源于固氮菌GXGL-4A；其余3对引物Screen 1-F/Screen 1-R、Screen 2-F/Screen 2-R和Screen 3-F/Screen 3-R是根据Tn5基因序列设计的，3组引物都扩增出预期大小的目标片段就可以保证转化子基因组中***了Tn5元件也即是保证了转化子为转座突变株。以细菌转化子总DNA为模板，进行PCR扩增。PCR程序：预变性94℃10min，变性94℃30s，退火54℃30s，延伸72℃1min，共进行35个循环，最后延伸72℃7min。4对引物序列如下：

anfD：5′-CGGGCAATCTCTTCATCAAT-3′(SEQ ID NO.2)，

anfR：5′-ATACCTTCGCGACCGATATG-3′(SEQ ID NO.3)，目标产物655bp；

Screen 1-F：5′-CAGGGATCTGCCATTTCATT-3′(SEQ ID NO.4)，

Screen 1-R：5′-GCCTGAGCGAGACGAAATAC-3′(SEQ ID NO.5)，目标产物922bp；

Screen 2-F：5′-GGACGCGATGGATATGTTCT-3′(SEQ ID NO.6)，

Screen 2-R：5′-GCCTGAGCGAGACGAAATAC-3′(SEQ ID NO.7)，目标产物602bp；

Screen 3-F：5′-ATTCAACGGGAAACGTCTTG-3′(SEQ ID NO.8)，

Screen 3-R：5′-ATTCCGACTCGTCCAACATC-3′(SEQ ID NO.9)，目标产物656bp。

实施例2

本实施例提供固氮菌突变株嗜铁素合成能力的检测方法。

(1)CAS检测平板的制备

1)200mL磷酸盐缓冲液配制：1.924g Na₂HPO₄、0.9082g NaH₂PO₄、0.15g KH₂PO₄、0.5g NH₄Cl、0.25g NaCl，用1mol/L NaOH调节pH至6.8-7.0。

2)CAS固体检测培养基制备：分别配置A、B液。

A液：取两个烧杯，分别量取40mL、50mL双蒸水溶解0.0605g CAS-S、0.0729g CTAB(HTDMA)。CTAB加热溶解至澄清，再将CAS-S倒入CTAB溶液中，边加入边搅拌(该步骤顺序不可颠倒，否则可能出现大量沉淀)，混匀后高温高压待用。配制1mmol/L FeCl₃(溶解于10mmol/L HCl)，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌(铁盐溶液高压灭菌易变性)。CTAB-CAS冷却后，加入10mL FeCl₃溶液，摇匀即得蓝色无沉淀的100mL CAS染色剂。

B液：磷酸缓冲液50mL，酸水解酪蛋白60mL，2mL1 mmol/L CaCl₂，2mL10mmol/LMgSO₄，1mol/L NaOH调节pH至6.9，20g琼脂，定容至1L。

灭菌处理后，100mL B液中加入10mL CAS染色剂，摇匀后量取30mL倒入直径为9cm的培养皿中，即得蓝色的CAS固体检测培养基，冷却凝固后备用。

(2)嗜铁素合成能力的CAS平板筛选

将9cm内径的培养皿标记划分为6个区域，6个区域分别接种3个GXGL-4A野生菌株以及1个突变菌株的3个平行样本。培养24h后观察突变菌株与野生菌株所产生黄色晕圈大小，通过比较晕圈大小初筛出产嗜铁素能力显著变异的突变株。

(3)嗜铁素合成的定量检测

经过CAS平板检测法初筛后，得到的目标突变株再用定量检测法进行复筛。用接种环挑取突变株与野生菌株于液体LB中分别培养至OD₆₀₀值为0.7-0.8，取600μL菌液于1.5mL离心管中，8000rpm离心5min后取上清液，按体积比1：1与CAS检测液混合，混匀后静置1h，测630nm波长下的吸光值(As)，以双蒸水为对照调零。另取空白培养基与CAS检测液混匀，以其吸光值作为参比值(Ar)，再按[(Ar-As)/Ar]×100％计算突变株产嗜铁素的相对量。

CAS定量检测液(100mL)：配制步骤参考B液，各试剂用量为：0.009g CAS-S，0.0218g CTAB，1.5mL 1mmol/L FeCl₃。

实施例3

本实施例提供高产嗜铁素的突变株M107的鉴定。

(1)高产嗜铁素的定量和定性鉴定

经CAS平板多轮初筛和CAS检测液定量检测复筛，最终从1633个突变株中筛选出高产嗜铁素的突变株M107(Kosakonia radicincitans M107)，其产嗜铁素能力较野生株GXGL-4A显著提高(图2)；突变株M107已在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)长久保藏，保藏号为CGMCC No.24401。

(2)突变株M107突变基因的确定

对目标突变株进行全基因组测序，最终确定这个突变株为单拷贝***，***位点分别在基因amt(DNA序列如SEQ ID NO.1所示)(locus tag:A3780_01680)编码区内(该基因编码序列由SEQ ID NO.1突变为SEQ ID NO.16)(图3)。为进一步鉴定所得到的突变株为目标基因的单拷贝转座突变，根据基因组测序得到的突变基因两端侧翼序列设计正反向引物进行扩增，以野生株GXGL-4A的基因组DNA为模板得到的扩增产物为对照，突变株扩增产物会增加2019bp，若所得结果与预期相符则可确认突变基因。所用引物对如下：

M107-amt-F：5′-cgcctataacgaaccgatgg-3′(SEQ ID NO.10)；

M107-amt-R：5′-gctctttatttcccggctgg-3′(SEQ ID NO.11)；

经过PCR扩增最终得到产物大小分别约为1.1Kb和3.1Kb的目标产物，基因amt突变为如SEQ ID NO.16所示的DNA序列；与理论预期完全相符，证明突变株基因组测序完全正确，突变株突变基因鉴定无误(图4)。

实施例4

本实施例提供amt基因***发育树的构建。

依据固氮菌GXGL-4A amt基因的DNA序列，提交GenBank进行BLAST比对，挑选出序列相似度在80％以上的序列，采用MEGA7软件以邻接法做***发育树(图5)。结果表明该基因具有明显的种属特异性，在属内水平上高度保守基因，与Kosakonia属之外的菌种间基因序列差异大，进化距离远。

实施例5

本实施例提供突变株M107的荧光定量PCR。

以固氮菌GXGL-4A为对照，采用UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒提取菌株总RNA，反转录后对突变株M107突变基因进行荧光定量PCR分析，管家基因rpoB为内参基因。荧光定量PCR引物序列如下：

rpoB-F3：5'-GGTGCGTGTAGAGCGTGC-3'(SEQ ID NO.12)，

rpoB-R3：5'-ATCTCGGACAGCGGGTTG-3'(SEQ ID NO.13)，PCR产物：168bp

amt-F4：5'-TCCATACGCCTGGGAAGTC-3'(SEQ ID NO.14)，

amt-R4：5'-AAGTTTCTGCCACTGTTCCG-3'(SEQ ID NO.15)，PCR产物：178bp

(1)cDNA第一链合成

RNA按照800ng反转录。

1)在冰浴的nuclease-free PCR管中加入以下试剂：

Random Primer p(dN)6(100pmol)1μL

dNTP Mix(0.5mM final concentration)1μL

Rnase-free ddH₂O定容至14.5μL

2)轻轻混匀后离心3s，反应混合物在65℃温浴5min后，冰浴2min，然后离心3s；

3)将试管冰浴，再加入下列试剂：

5x RT Buffer 4μL

Thermo Scientific RiboLock RNase Inhibitor(20U)0.5μL

Maxima Reverse Transcriptase(200U)1μL

4)轻轻混匀后离心3s；

5)在PCR仪上按照下列条件进行反转录反应：

25℃，10min；50℃，30min；85℃，5min。

6)将上述溶液-20℃保存。

(2)荧光定量PCR

将cDNA样品稀释10倍作为模板上机检测。

定量PCR试剂：2x SG Fast qPCR Master Mix(B639271，BBI，Roche罗氏)。

定量PCR仪：LightCycler480 II型荧光定量PCR仪(Roche，Rotkreuz，Switzerland)。

1)配制反应混合液

SybrGreen qPCR Master Mix(2×)5μL

引物F(10μM)0.2μL

引物R(10μM)0.2μL

ddH₂O 3.6μL

Template(cDNA)1μL

2)PCR循环条件

95℃，3min；45个循环，每个循环包括95℃，5s；60℃，30s。

加好样品的96/384孔板放在LightCycler480 II(Roche罗氏)中进行反应。

荧光定量PCR检测结果表明***后突变的amt基因几乎不转录(图6)。目标基因由于Tn5转座发生了突变，表达产物已变化。

实施例6

本实施例提供突变株M107生长曲线的测定。

固氮菌GXGL-4A和突变株M107纯化后挑取单菌落在20mL LB中，放置在摇床上，37℃180rpm过夜培养。按1％(V/V)的接种量将活化菌株接种在100mL LB中，每隔1h测定1次OD₆₀₀值，每个处理进行3次重复测定。

结果表明基因突变后目标突变株的生长几乎不受影响，与野生株生长速率没有显著差异(图7)。

实施例7

本实施例提供突变株M107对黄瓜促生作用的测定。

用目标菌株对黄瓜幼苗进行处理后，测定黄瓜的株高、株鲜重、根长和根鲜重等生理指标。结果表明，突变株M107处理组(CK)的黄瓜各生物量显著高于野生株处理组；除了根长外，野生株处理组其他3个生物量指标又显著高于空白对照组(无菌水处理)(图8)，图9显示各处理下黄瓜植株整体情况。总体来看，固氮菌处理对黄瓜植株有显著的促生效应，且突变株M107处理较野生株更能提高黄瓜植株长势。

实施例8

本实施例提供突变株M107发酵液上清对玉米小斑病病原菌(Bipolaris maydis)的抑制测定。

菌株接种于LB培养基，37℃过夜摇菌。取50mL菌液，于8000rpm离心5min。注射器吸取上清液，用微孔滤膜过滤，将滤液置于4mL离心管中于4℃冰箱保存备用。

取滤液600μL涂布于PDA培养基上，空白对照加入等量液体LB，均匀涂布。然后，将B.maydis菌苔倒置在PDA培养基中央，轻按几下使与培养基表面紧密接触，于28℃下恒温培养箱中倒置培养4天，采用十字交叉法测量菌苔直径。结果表明对照组平板上生长的菌苔直径约为8cm，明显高于M107处理组。固氮菌GXGL-4A和突变株M107对B.maydis生长具有显著的抑制作用，且突变株M107的抑菌效果较好。上清液中的嗜铁素竞争了真菌生长所需要的铁，导致小斑病病原菌生长受限，嗜铁素含量越高，真菌生长越慢(图10)。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种目的基因在表达固氮菌嗜铁素中的应用，其特征在于，所述目的基因为amt基因，所述amt基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

2.突变株M107在表达固氮菌嗜铁素中的应用，其特征在于，所述突变株M107的保藏编号为CGMCC No.24401。

3.根据权利要求2所述的突变株M107在表达固氮菌嗜铁素中的应用，其特征在于，所述突变株M107在表达固氮菌嗜铁素以促进植物生长的应用方法包括以下步骤：

(1)将突变株M107接种至LB培养基中，过夜培养后收集突变株M107细胞沉淀；

(2)将步骤(1)收集的突变株M107细胞沉淀后处理后施放至植物根际。

4.根据权利要求3所述的突变株M107在表达固氮菌嗜铁素中的应用，其特征在于，步骤(1)中，将突变株M107以1％接种量接种至LB培养基中。

5.根据权利要求3所述的突变株M107在表达固氮菌嗜铁素中的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述后处理为将突变株M107细胞沉淀重悬于无菌水后离心，该过程重复多次，将最后一次离心得到的突变株M107细胞沉淀重悬于无菌水中得到突变株M107细胞悬液。

6.根据权利要求5所述的突变株M107在表达固氮菌嗜铁素中的应用，其特征在于，植物处于两叶一心期时施放突变株M107细胞悬液。

7.根据权利要求6所述的突变株M107在表达固氮菌嗜铁素中的应用，其特征在于，每棵植物释放5-10mL突变株M107细胞悬液，细菌数为1×10⁸CFU/mL；频率为每5天施用1次，连续处理5次。

8.敲除或替换目的基因的物质在制备高产嗜铁素固氮菌菌剂或产嗜铁素的促生菌菌剂中的应用，其特征在于，所述目的基因为amt基因，所述amt基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

9.突变株M107在制备高产嗜铁素固氮菌菌剂或产嗜铁素的促生菌菌剂中的应用，其特征在于，所述突变株M107的保藏编号为CGMCC No.24401。

10.突变株M107，其特征在于，所述突变株M107的保藏编号为CGMCC No.24401。

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