CN106434436A - 巨大芽孢杆菌1.1123在制备微生物菌剂或菌肥中的应用 - Google Patents

巨大芽孢杆菌1.1123在制备微生物菌剂或菌肥中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了巨大芽孢杆菌1.1123在制备微生物菌剂或菌肥中的应用。巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)1.1123于2016年8月30日保藏于广东省微生物研究所菌种保藏中心(GIMCC)，保藏编号为：GIMCC 1.1123。本发明的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)1.1123是一种解磷微生物，能够将难溶性或不溶性磷转化为植物能吸收的可溶性磷，提高土壤中植物可利用的有效磷含量，促进植物生长。经测定，该菌的解磷能力达到61.2％，摇瓶发酵试验活菌数达5.6×109/mL，芽孢率达到87.5％。因此，可作为农用微生物菌剂应用于微生物菌肥的生产，对农业种植方面具有重要的研究和应用价值。

Description

巨大芽孢杆菌1.1123在制备微生物菌剂或菌肥中的应用
技术领域：
本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一种巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)1.1123在降解难溶性或不溶性磷，制备微生物菌剂或微生物菌肥中的应用。
背景技术：
在植物生长发育的过程中，磷起着重要的作用，作物的产量和质量与磷利用率密切相关。然而，由于固化磷的广泛存在使得大部分土壤存在缺磷的情况，因此，缺磷是制约国内外农业生产中最重要的因素之一。从国内农业生产现状来看，全国有74％耕地土壤缺磷，而要解决土壤中普遍存在的缺磷现状，主要可以通过两种途径实现，第一是增加磷肥的施用量，第二是增加土壤中固化磷的使用率。如果仅仅通过途径一单一的增加磷肥的投入，来解决土壤中的缺磷现状，既不符合农业的可持续发展，也不能有效地、彻底地解决土壤缺磷问题。因此，提高土壤中固化磷的使用率既符合现代农业的发展方向，是低投入高产出的可持续发展，又能有效的解决土壤中缺磷现象。
提高土壤中的磷肥使用率，可以通过以下三种方式实现，第一是根据农作物吸磷特性，研究土壤中的磷形态分布情况，通过改进磷肥的施用技术等方式提高磷的利用率；第二是通过育种技术的创新，发挥植物的自身优势，定向培育筛选磷高效利用的品种，开发利用土壤中难溶性磷资源；第三是筛选高效解磷微生物，通过工业化发酵生产，制成解磷菌剂拌种或直接施入土壤，活化土壤中难溶性磷。
巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)作为微生物肥料生物安全分级目录中作为一级菌株，具有降解难溶性或不溶性磷的作用，被广泛的作为微生物肥料的常用菌株。目前，国内厂家生产巨大芽孢杆菌产品普遍存在着质量不高(形成芽孢率低，保藏时间短)、菌株功能退化和解磷效果不佳等问题，严重的的制约着该菌株的广泛应用。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)1.1123在降解难溶性或不溶性磷中的应用，所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)1.1123，该菌于2016年8月30日保藏于广东省微生物研究所菌种保藏中心，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼，保藏编号GIMCC 1.1123。
巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)1.1123的生物学特征如下：
1、菌株形态特征：该菌在NA培养基平板上培养24小时后，菌落呈白色，圆形，表面光滑不透明，边缘缺刻；革兰氏染色为阳性，菌体杆状，具有端生鞭毛，运动，无夹膜，芽孢中生，椭圆形。
2、生理生化特征：本发明的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)1.1123V-P试验为阴性；吲哚试验为阴性；硝酸盐还原阴性；柠檬酸盐利用阴性；碳源产酸中的葡萄糖为阳性；能水解酪素、尿素、七叶苷、β-半乳糖苷(ONPG)；生长温度范围20～45℃，最适pH为7.0～7.5。
巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)1.1123的分子分类学地位：提取巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)1.1123的基因组DNA并对其16S rDNA进行测序，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。将该序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较分析，并从数据库获得相关种属的16S rDNA序列，构建***发育树。***发育树表明该菌株与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)有着最近相似度，命名为巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)1.1123。
本发明的第二个目的是提供上述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)1.1123在制备微生物菌剂或微生物菌肥中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种微生物菌剂，其特征在于，以上述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)1.1123作为活性成份。
本发明的第四个目的是提供一种微生物菌肥，其特征在于，以上述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)1.1123作为活性成份。
本发明的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)1.1123是一种解磷微生物，能够将难溶性或不溶性磷转化为可溶性磷，提高土壤中植物可利用的有效磷含量，促进植物生长，减少化肥的使用。经测定，该菌的解磷能力达到61.2％，摇瓶发酵试验活菌数达5.6×109个/mL，芽孢率达到87.5％。因此，可作为农用微生物菌剂应用于微生物菌肥的生产，对农业种植方面具有重要的研究和应用价值。
本发明的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)1.1123于2016年8月30日保藏于广东省微生物研究所菌种保藏中心，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼，保藏编号为：GIMCC 1.1123。
附图说明：
图1是巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)1.1123的透射电子显微镜照片(6000倍)；
图2是巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)1.1123依据16S rDNA序列构建的***发育树；
图3是巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)1.1123水解有机磷的效果图。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。所用方法及技术，如无特别说明，均为常规方法和技术。
实施例1：巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)1.1123的生物学性状及生理生化和分子鉴定
S1.1形态特征
巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)1.1123在NA培养基平板上培养24小时后，菌落白色，圆形，表面光滑不透明，边缘缺刻；革兰氏染色为阳性；菌体杆状，具有端生鞭毛，运动，无夹膜，芽孢中生，椭圆形(透射电子显微镜照片见图1)。
S1.2生理生化特征
经生理生化测定，本发明的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)1.1123V-P试验为阴性；吲哚试验为阴性；硝酸盐还原阴性；柠檬酸盐利用阴性；碳源产酸中的葡萄糖为阳性；能水解酪素、尿素、七叶苷和β-半乳糖苷(ONPG)；生长温度范围20～45℃，最适pH为7.0～7.5，结果见表1。
表1巨大芽孢杆菌1.1123生理生化特征
注：+，阳性；－，阴性；WH，白色；R，杆状
S1.3巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)1.1123的16S rDNA的序列测定与分析
S1.3.1DNA模板的快速准备：将巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)1.1123划线接种在NA培养基平板上，37℃培养24小时。取单一菌落悬浮于10μL无菌蒸馏水中，于沸水中加热5min，离心，取上清作为DNA模板。
S1.3.2 16S rDNA基因PCR扩增
引物：Primer A：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；Primer B：5’-AAGGAGGTGATCCACCCCCA-3’。
PCR反应体系如表2所示：
表2PCR反应体系
10×PCR缓冲液 5μL
2mmol/L dNTP 4μL
10pmol/L Primer A 1μL
10pmol/L Primer B 1μL
2U/L Tap酶 0.4μL
DNA模板 1μL
灭菌ddH2O 37.4μL
总体积 50μL
PCR扩增条件：94℃5min；94℃1min，56℃1min，72℃2min，30个循环；72℃，7min。
S1.3.3序列测定：PCR产物纯化后，经测序，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。该序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较分析，并从数据库获得相关种属的16SrDNA序列，构建***发育树，如图2所示。***发育树表明该菌株与巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)有着最近相似度，命名为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)1.1123。
实施例2：巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)1.1123水解有机磷试验
有机磷培养基配方：葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，酵母浸粉0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，硫酸镁0.3g，硫酸亚铁0.3g，硫酸锰0.03g，卵磷脂0.2g，碳酸钙1.0g，琼脂15g，水1000mL，pH 7.0～7.5。
将灭菌好的有机磷培养基冷却至45℃左右开始倒平板，待平板冷却凝固后倒置于37℃恒温培养箱中放置24小时，目的是控干培养基表面水分和验证平板没有污染杂菌。将巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)1.1123点接于干燥且无菌的有机磷培养基平板上，倒置放置于37℃培养箱中培养7天，观察菌落周围水解圈情况(如图3所示)。从图3中可知，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)1.1123菌落周围形成了水解圈，说明本发明的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)1.1123具有强有机磷水解活性。
实施例3：巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)1.1123水解有机磷能力测定
有机磷液体培养基配方：葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，酵母浸粉0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，硫酸镁0.3g，硫酸亚铁0.3g，硫酸锰0.03g，卵磷脂0.2g，碳酸钙1.0g，水1000mL，pH 7.0。
种子液的制备：150mL三角瓶装有机磷液体培养基50mL，灭菌。挑取一环活化好的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)1.1123菌体接种于有机磷液体培养基中，180rpm，37℃培养16h获得种子液。
液体培养：准备有机磷液体培养基，装液量为100mL/500mL锥形瓶。将制备的种子液分别取5mL接入有机磷液体培养基中，于37℃，180rpm培养7天，重复三次，对照不接菌，同样重复三次。
磷含量标准曲线绘制：准确吸取磷标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4mL(相当于含磷0、2、4、6、8、10、12和14μg)，分别置于10mL具塞试管中，加入钼蓝比色混合液5mL，加水至刻度、混匀，于45℃水浴25min后，以0号管作空白，使用可见分光光度计在660nm波长处测定吸光度，以测出的吸光度对磷含量绘制磷标准曲线。
培养液中磷含量的测定：将培养液5000rpm离心10min，准确吸取5mL上清液置于10mL具塞试管中，加入5mL比色混合液，于45℃水浴25min，使用紫外分光光度计在660nm波长处测定吸光度，利用磷含量标准曲线计算培养液中的磷含量。通过测定原培养液和培养后的上清液中的磷含量，可以计算出巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)1.1123的解磷能力。试验表明，经过三次重复试验，解磷能力达到61.2％。
实施例4：巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)1.1123摇瓶发酵试验
种子液培养基配方：蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，氯化钠5.0g，水1000mL。
发酵培养基配方：豆粕6％，蔗糖2％，氯化钠0.3％，硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.15％，余量为水。
发酵培养基装液量100mL/500mL锥形瓶，挑取一环活化好的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)1.1123菌体接种于种子液培养基中，180rpm，37℃培养16h获得种子液。将种子液按5％的接种量接种到发酵培养基中，200rpm，37℃培养24h。平板菌落计数法检测活菌数及芽孢数，算出芽孢率。经过三次重复试验，活菌数达5.6×109个/mL，芽孢率达87.5％。

Claims (3)

1.巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)1.1123在降解难溶性或不溶性磷中的应用。
2.巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)1.1123在制备微生物菌剂或微生物菌肥中的应用。
3.一种微生物菌剂或菌肥，其特征在于，以巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)1.1123作为活性成份。
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