CN110904005B - 一株氟磺胺草醚降解菌及其应用 - Google Patents

一株氟磺胺草醚降解菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株氟磺胺草醚降解菌,该降解菌分类命名为中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)W16,保藏号为CCTCC NO:M 2019915。本发明的降解菌筛选自大豆根瘤中,能够稳定降解氟磺胺草醚,可应用至施用氟磺胺草醚的农田中,进行治理修复,相对于现有技术中的其他土壤细菌更加有利于开发和应用。

Description

一株氟磺胺草醚降解菌及其应用
技术领域
本发明属于环境微生物领域,具体涉及一株氟磺胺草醚降解菌及其应用。
背景技术
氟磺胺草醚(Fomesafen)是一种二苯醚类除草剂,广泛应用于大豆、花生等豆科作物田间阔叶杂草的防治中。氟磺胺草醚在土壤中半衰期较长,达到100-240天。自20世纪90年代以来,氟磺胺草醚的大面积使用导致种植豆科作物的农田中药害残留问题日益严重。农田中大量除草剂的残留会产生一系列的影响:①影响豆科作物产量及后茬作物立苗;②产生抗性杂草;③通过影响土壤微生物、土壤动物的活性,破坏土壤生态环境,影响土壤功能;④通过饮用水或土壤−植物***经食物链进入人体,危害人体健康。因此,修复豆科作物农田土壤的除草剂污染提升作物产量成为亟待解决的环境问题。
目前应用于修复除草剂污染土壤的修复技术主要有物理修复、化学修复和生物修复等。其中,生物修复法虽然对高浓度有机污染土壤的修复周期较长,但因其经济环保,且不易破坏生态***等优点,是修复农田除草剂污染等中低度污染水平土壤的优选方法。微生物-植物的联合修复技术能够克服微生物修复易受环境影响难以定殖,以及植物修复降解酶系不完整效率低等不足,逐渐成为有机污染土壤生物修复技术发展的潮流。国内外诸多研究者采用微生物-植物联合修复技术修复中低水平有机污染土壤获得了良好效果。
有研究者对农田中的氟磺胺草醚降解菌进行了分离,获得了隶属于包括Shigella、Pseudomonas、Lysinibacillus等菌属的氟磺胺草醚降解菌。然而,目前对于氟磺胺草醚土壤的修复依然多采用接种高效降解微生物的手段,利用微生物修复氟磺胺草醚污染土壤的过程面临微生物的存活及降解活力易受环境影响,同时定殖困难的问题。因此,获得能够与豆科作物共生的氟磺胺草醚降解根瘤菌对于药害的缓解及豆科作物田间产量的具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的上述缺陷,提供一株氟磺胺草醚降解菌及其应用。
本发明的目的可通过以下技术方案来实现:
第一方面,本发明提供了一株氟磺胺草醚降解菌,其分类命名为中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)W16,属于革兰氏阴性菌,保藏号为:CCTCC NO:M 2019915。
第二方面,本发明提供了上述氟磺胺草醚降解菌的培养方法,将所述氟磺胺草醚降解菌接种至培养基,在30℃条件下培养。
进一步的,所述培养基为酵母-甘露醇(YMA)培养基,其成分为:10.0 g/L甘露醇,0.4 g/L酵母粉,0.5 g/L K2HPO4,0.2 g/L MgSO4·7H2O,0.1 g/L NaCl;pH 7.2。
第三方面,本发明提供了上述氟磺胺草醚降解菌在氟磺胺草醚降解中的应用,包括:活化氟磺胺草醚降解菌,并制备种子液,将种子液接种至含氟磺胺草醚的无机盐培养基中进行降解。
本发明的上述应用,所述无机盐培养基成分为:氟磺胺草醚,0.9 g/L KH2PO4,6.5g/L NaHPO4·12H2O,0.4 g/L (NH4)2SO4,0.2 g/L MgSO4·7H2O,1 mL Ferrari微量元素溶液,pH 7.2;所述Ferrari微量元素溶液为:500 mg/L EDTA·2Na,5 mg/L MnSO4·H2O,5 mg/L Na2MoO4·2H2O,30 mg/L H3BO4,5 mg/L CuSO4·5H2O,10 mg/L ZnSO4·7H2O,24 mg/LCoSO4·7H2O,50 mg/L Ca(OH)2
所述无机盐培养基中氟磺胺草醚含量为10~50 mg/L。
所述种子液制备方法为:将氟磺胺草醚降解菌接种至YMA培养基,30℃、150 rpm条件下培养至菌株对数生长末期,获取种子液。
所述种子液接种量为5%;降解条件为:30℃,pH7.2。
本发明从大豆根瘤中筛选出一株中华根瘤菌属的菌株W16,能够稳定降解氟磺胺草醚,可应用至施用氟磺胺草醚的农田中,进行治理修复,相对于现有技术中的其他土壤细菌更加有利于开发和应用。
附图说明
图1是本发明中降解根瘤菌W16的菌落形态。
图2是本发明中降解根瘤菌W16的***发育关系图。
图3是本发明中从降解培养液中提取的氟磺胺草醚的液相色谱图与标准曲线。
图4是本发明中不同氟磺胺草醚浓度条件下菌株W16对其降解率变化图。
本发明所述的生物材料,其分类命名为中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)W16,已于2019年11月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏号为:CCTCC NO:M2019915,地址:中国武汉。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,下面结合附图和具体实施方案对本发明作进一步详细说明。
本发明提供了一株氟磺胺草醚降解菌,其分类命名中华根瘤菌(Sinorhizobiumsp.)W16菌株,保藏号为:CCTCC NO:M 2019915。
注:2003年有研究者发现SinorhizobiumEnsifer属不同菌种之间的16S rRNA基因序列相似性范围为97.9%−99.9%,建议合并为一个属,国际细菌分类委员会于2009年裁定Ensifer为合法属名,Sinorhizobium为同物异名,目前在官方的分类学杂志——“International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology” (IJSEM)上,发表归属于这两个属的***分育分支的新种时,必须使用Ensifer作为属名。2016年,中国农业大学生物学院暨中国农业大学根瘤菌研究中心发表的综述文章提出,如果分离自根瘤内,且能与豆科植物结瘤固氮,又与Sinorhizobium内的一些种接近,在研究与结瘤固氮相关的工作时,发表的非IJSEM杂志的论文时,则最好要使用Sinorhizobium,以使读者更容易理解论文内容,不产生歧义。故认为本发明中所述降解根瘤菌属于Sinorhizobium属。
该菌株属于革兰氏阴性菌,命名为W16,菌株形态特征为:菌落直径约为0.2-0.5cm,LB平板上菌落呈白色,圆形,边缘整齐,表面湿润粘稠。菌株最适生长条件为:pH7.2,温度30℃。
进一步地,将菌株送至北京擎科新业生物技术有限公司进行测序,测定菌株16SrRNA序列如SEQ ID NO:1所示,将基因序列登录美国国立生物技术信息中心网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行核苷酸序列Blast比对,得到与相关菌株的基因序列同源性的若干核苷酸序列,表明菌株W16的16S rRNA序列与剑菌属(Ensifer)/中华根瘤菌属(Sinorhizobium)的基因序列同源性在99%以上,分离菌株被鉴定为中华根瘤菌属(Sinorhizobium sp.)。
本发明提供的细菌制备物为上述菌株W16的酵母-甘露醇(YMA)培养基培养物。
所述YMA培养基成分如下:每升含10.0 g甘露醇,0.4 g 酵母粉,0.5 g K2HPO4,0.2g MgSO4·7H2O,0.1 g NaCl;pH 7.2。
以下对菌株W16对氟磺胺草醚的降解性能进行阐述。
实施例所述氟磺胺草醚唯一碳源的无机盐培养基成分如下:每升含氟磺胺草醚10mg/20 mg/50 mg,0.9 g KH2PO4,6.5 g NaHPO4·12H2O,0.4 g (NH4)2SO4,0.2 g MgSO4·7H2O及1 mL Ferrari微量元素溶液,pH 7.2;所述Ferrari微量元素溶液为:每升含500 mgEDTA·2Na,5 mg MnSO4·H2O,5 mg Na2MoO4·2H2O,30 mg H3BO4,5 mg CuSO4·5H2O,10 mgZnSO4·7H2O,24 mg CoSO4·7H2O,50 mg Ca(OH)2
其配制方法如下:
将氟磺胺草醚溶解于甲醇中,配制成浓度为1000 mg L-1的氟磺胺草醚母液,在无菌操作台中,取适量母液于无菌三角瓶中,待甲醇挥发后,加入高温高压灭菌后的上述无机盐培养基,使得氟磺胺草醚浓度为10 mg L-1/20 mg L-1/50 mg L-1
在氟磺胺草醚唯一碳源的无机盐培养基中接种中华根瘤菌W16,30℃,150 rpm条件下,培养7 d,菌株W16对10 mg L-1/20 mg L-1/50 mg L-1的氟磺胺草醚降解率分别达52.9%、43.6%、35.4%,说明该根瘤菌对氟磺胺草醚存在较稳定的降解效果,具有较好的应用前景。
实施例1
根瘤菌W16的分离和筛选
菌株分离自施用两倍田间浓度氟磺胺草醚的大豆农田中的大豆根瘤,具体分离方法如下:
(1)根瘤的表面消毒:采集大豆根(包括根瘤),用流水冲洗植物表面脏污,吸干水分;用无菌剪刀剪取根瘤部分,按照75%乙醇浸泡30 s——无菌水冲洗3次——0.3%次氯酸钠浸泡6 min——无菌水冲洗5次的步骤对根瘤进行表面消毒;用无菌镊子压碎根瘤后将根瘤内容物加入100 mL氟磺胺草醚唯一碳源无机盐培养基(含氟磺胺草醚10 mg L-1)。
(2)富集培养:将上述培养液于30℃,150 rpm条件下振荡培养5 d,并将5 mL富集培养液接种至新鲜的100 mL氟磺胺草醚唯一碳源无机盐培养基中,继续进行5 d的培养,重复转接5次。氟磺胺草醚起始浓度为10 mg L-1,每次转接氟磺胺草醚浓度增加10 mg L-1,氟磺胺草醚最终浓度为60 mg L-1
(3)分离纯化:将第六代富集培养液以10-4、10-5、10-6倍数进行稀释,分别取100 µL稀释液涂布于含有20 mg L-1氟磺胺草醚的无机盐培养基平板上,30℃倒置培养3-4天,挑取单菌落,进行3次划线纯化。
(4)根瘤菌筛选:YMA刚果红固体培养基配方如下:每升含10.0 g甘露醇,0.4 g 酵母粉,0.5 g K2HPO4,0.2 g MgSO4·7H2O,0.1 g NaCl,1%刚果红溶液5 mL;pH 7.2。将纯化获得的单菌落于YMA刚果红平板上划线,共生根瘤菌由于产生大量胞外多糖,在刚果红培养基上长出的菌落呈现白色,而其他细菌菌落为红色,挑取刚果红平板上呈白色的单菌落,获得目标菌株。
实施例2
根瘤菌W16的分类鉴定
采用16S rRNA基因序列分析方法对菌株W16进行分类鉴定,具体步骤如下:
(1)细菌总DNA的提取:采用宝日医生物技术有限公司(TaKaRa)MiniBEST细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株W16的基因组DNA。
(2)菌株W16 16S rRNA基因序列的扩增:采用通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG -3’)/ 1492R(5’- CGGYTACCTTGTTACGACTT -3’),采用南京诺唯赞生物技术有限公司2×Taq Master Mix进行PCR预混样的制备,体系如下:2×Taq MasterMix 25 µL,F、R引物各1 µL,模板DNA 1 µL,dd H2O补齐至50 µL;反应循环参数:预变性95℃ 5 min;95℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 1 min,35循环;总延伸72℃ 10 min。
(3)PCR产物的克隆测序分析:将菌株送至北京擎科新业生物技术有限公司进行测序,将菌株16S rRNA基因序列于美国国立生物技术信息中心网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行核苷酸序列比对,得到与相关菌株的基因序列同源性的若干核苷酸序列,表明菌株W16的16S rRNA序列与剑菌属(Ensifer)/中华根瘤菌属(Sinorhizobium)的基因序列同源性在99%以上,分离菌株被鉴定为中华根瘤菌属(Sinorhizobium sp.)。
(4)菌株W16的形态特征鉴定如下:
中华根瘤菌W16属于革兰氏阴性菌,菌落直径约为0.2-0.5 cm,LB平板上菌落呈白色,圆形,边缘整齐,表面湿润粘稠。菌株最适生长条件为:pH7.2,温度30℃。
实施例3
菌株W16对不同浓度氟磺胺草醚的降解能力分析
(1)液体降解试验:将氟磺胺草醚溶解于甲醇中,配制成浓度为1000 mg L-1的氟磺胺草醚母液,在无菌操作台中,取适量母液于无菌三角瓶中,待甲醇挥发后,加入高温高压灭菌后的上述无机盐培养基,使得氟磺胺草醚浓度为10 mg L-1/20 mg L-1/50 mg L-1;无菌条件下将甘油管中保存的W16菌液于YMA平板上划线后30℃培养至单菌落形成,挑取单菌落接种于YMA液体培养基中,于30℃,150 rpm条件下培养至菌株对数生长末期,获取种子液,以5%的接种量转接入上述以氟磺胺草醚为唯一碳源的无机盐培养基中,置于30℃,150 rpm条件下振荡培养7天。
(2)氟磺胺草醚的提取:取3 mL培养液,与等量二氯甲烷混合后涡旋震荡1 min,将有机相过干燥Na2SO4去除水分,取1 mL有机相溶液加入玻璃试管中氮吹至干燥,加入1 mL乙腈溶解,过0.22 µm有机滤膜,放置于4℃冰箱中待测。
(3)氟磺胺草醚的测定:用电子天平准确称取氟磺胺草醚(99.7%)标准品0.0103 g(精确到0.0001 g),用色谱纯乙腈溶解并定容至100 mL,配制成浓度为100 mg L-1的储备液,准确移取适量储备液,分别用乙腈稀释成1 mg L-1,5 mg L-1,10 mg L-1,20 mg L-1,50mg L-1,100 mg L-1,200 mg L-1的系列标准品溶液。采用高效液相色谱对氟磺胺草醚浓度进行测定,以ZORBAX SB-C18(4.6×150 mm)反向色谱柱为分离柱,柱温30℃,流动相为乙腈:水(0.5%磷酸)=65:35(v:v),流速1.0 mL min-1,检测波长290 nm,进样量20 µL。氟磺胺草醚保留时间为3.468 min。
由图4可见,培养7天后,菌株W16对10 mg L-1、20 mg L-1、50 mg L-1的氟磺胺草醚降解率分别达52.9%、43.6%、35.4%,说明该根瘤菌对氟磺胺草醚存在较稳定的降解效果。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
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<141> 2019-12-09
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<213> 中华根瘤菌W16(Sinorhizobium sp. W16)
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tcggattgca ctctgcaact cgagtgcatg aagttggaat cgctagtaat cgcagatcag 1260
catgctgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgggagtt 1320
ggttctaccc gaaggtagtg cgctaaccgc aaggaggcag ctaaccacgt agtcaacac 1379

Claims (2)

1.一株氟磺胺草醚降解菌,其特征在于,分类命名为中华根瘤菌Sinorhizobium sp.W16,保藏号为CCTCC NO:M 2019915。
2.权利要求1所述氟磺胺草醚降解菌的培养方法,其特征在于,将所述氟磺胺草醚降解菌接种至培养基,在30℃条件下培养;所述培养基为酵母-甘露醇培养基,其成分为:10.0g/L甘露醇,0.4 g/L酵母粉,0.5 g/L K2HPO4,0.2 g/L MgSO4·7H2O,0.1 g/L NaCl;pH7.2。
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杨隆华等.氟磺胺草醚对大豆根瘤及产量的影响.《科技信息》.2010,(第9期),第434-435页. *

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