CN113564081A - 一种产呕吐毒素降解酶的德沃斯氏菌scs-3及其应用 - Google Patents

一种产呕吐毒素降解酶的德沃斯氏菌scs-3及其应用 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种降解呕吐毒素的德沃斯氏菌的细菌，该德沃斯氏菌的分类命名为耐盐德沃斯氏菌SCS‑3(Devosia salina SCS‑3)，所述耐盐德沃斯氏菌SCS‑3的保藏编号为GDMCC NO：61245。该菌可直接作为产呕吐毒素降解酶的供体，也可以作为新的基因工程菌株，通过接受外来优良基因获得更多的优良性状，从而用于饲料、食品、畜牧等领域的呕吐毒素的生物降解。

Description

一种产呕吐毒素降解酶的德沃斯氏菌SCS-3及其应用
技术领域
本公开涉及微生物技术领域，具体地，涉及一种产呕吐毒素降解酶的德沃斯氏菌SCS-3及其应用。
背景技术
呕吐毒素(vomitoxin)，又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)，是由镰刀菌属产生的毒性代谢产物，属于单端孢霉烯族类毒素。DON污染普遍发生在田间作物、谷物饲用和食用农产品，严重危害人畜健康，造成巨大的经济损失。生物法降解霉菌毒素具有专一性强、转化效率高、不影响饲料营养价值、避免毒素的重新产生等优点，逐渐引起研究者的广泛关注。目前研究发现DON的C12-13位开环氧化、C3位羟基发生乙酰化、糖苷化或氧化修饰能够有效地降低DON的毒性。尽管目前已经开展了一些呕吐毒素降解菌的筛选和构建，但由于降解能力低、高效表达生产工艺差和无法保障安全性等原因，离实际应用还有一定差距。
生物脱毒法利用酶在温和的条件下特异性地降解呕吐毒素及其衍生物，不使用有害的化学试剂、无营养物质流失，避免造成二次污染。因此筛选挖掘新的快速降解呕吐毒素的菌株，获得高效降解呕吐毒素的降解酶，是解决呕吐毒素污染问题、挽回饲料业和畜牧业巨大损失的重要手段。
发明内容
本公开的目的是提供一种产呕吐毒素降解酶细菌，该菌可直接作为产呕吐毒素降解酶的供体，也可以作为新的基因工程菌株，通过接受外来优良基因获得更多的优良性状，从而用于饲料、食品、畜牧等领域的呕吐毒素的生物降解。
一方面，本公开提供了一种能够降解呕吐毒素的德沃斯氏菌，其特征在于，该德沃斯氏菌的分类命名为耐盐德沃斯氏菌SCS-3(Devosia salina SCS-3)，所述耐盐德沃斯氏菌SCS-3的保藏编号为GDMCC NO：61245。
另一方面，本公开还提供了一种制备呕吐毒素降解酶的方法，其中，该制备方法包括：将第一方面所述的耐盐德沃斯氏菌SCS-3接种至培养基中进行培养，得到培养物。
另一方面，本公开还提供了一种呕吐毒素降解酶，其中，所述呕吐毒素降解酶为通过第二方面所述的方法制备得到。
另一方面，本公开还提供了一种制备基因工程菌的方法，其中，所述方法包括：对野生型的德沃斯氏菌进行基因工程改造，该野生型的德沃斯氏菌为耐盐德沃斯氏菌SCS-3，所述耐盐德沃斯氏菌SCS-3的保藏编号为GDMCC NO：61245。
通过上述技术方案，本公开获得了一种产呕吐毒素降解酶的德沃斯氏菌，该产呕吐毒素降解酶的德沃斯氏菌是德沃斯氏菌属(Devosia)中的一个新的种(Devosiasalina)，可以直接或间接获得呕吐毒素降解酶。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
生物材料保藏信息
耐盐德沃斯氏菌SCS-3，分类命名为Devosia salina SCS-3，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2020年9月23日，保藏编号为GDMCC NO：61245。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1是耐盐德沃斯氏菌SCS-3(Devosia salina SCS-3)的电镜图片。
图2是耐盐德沃斯氏菌SCS-3(Devosia salina SCS-3)的负染图片。
图3是耐盐德沃斯氏菌SCS-3(Devosia salina SCS-3)的菌落形态。
图4是耐盐德沃斯氏菌SCS-3(Devosia salina SCS-3)与其它德沃斯氏菌属成员之间的进化分析(基于16S rDNA序列分析)。
图5是耐盐德沃斯氏菌SCS-3(Devosia salina SCS-3)的呕吐毒素降解能力测定。
具体实施方式
以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
一方面本公开提供一种能够降解呕吐毒素的德沃斯氏菌，其特征在于，该德沃斯氏菌的分类命名为耐盐德沃斯氏菌SCS-3(Devosia salina SCS-3)，所述耐盐德沃斯氏菌SCS-3(Devosia salina SCS-3)，耐盐德沃斯氏菌SCS-3的保藏编号为GDMCC NO：61245。
根据本公开，其中，所述耐盐德沃斯氏菌SCS-3的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
根据本公开，其中，所述耐盐德沃斯氏菌SCS-3为革兰氏阴性、好氧、单极性鞭毛、白色和杆状。
根据本公开，其中，所述耐盐德沃斯氏菌SCS-3为β-半乳糖苷酶阳性，脲酶阳性，β-葡萄糖苷酶阳性，明胶水解蛋白酶阳性。
根据本公开，其中，所述耐盐德沃斯氏菌SCS-3能够以葡萄糖、***糖、甘露糖、甘露醇、N-乙酰-葡糖胺、麦芽糖和葡萄糖酸为碳源；不能以α-甘露糖苷酶、β-岩藻糖苷酶、糜蛋白酶、α-半乳糖苷酶和β-葡萄糖醛酸酶为碳源，不能水解淀粉、吐温80和酪蛋白。
根据本公开，其中，所述耐盐德沃斯氏菌SCS-3的细胞壁脂肪酸中，C18:1ω7c和/或C18:1ω6c的含量为19.49％、C18:1ω7c 11-methyl的含量为31.41％，C16:0的含量为29.60％。
另一方面，本公开还提供了一种制备呕吐毒素降解酶的方法，其中，该制备方法包括：将第一方面所述的耐盐德沃斯氏菌SCS-3接种至培养基中进行培养，得到培养物。
优选地，所述培养基为LB液体培养基、MSM培养基中的至少一种；
优选地，所述培养的培养条件包括：培养温度为25-30℃，培养时间为2-4天，振荡速度为140-160rpm，转接1-3轮。
根据本公开，其中，所述LB液体培养基中，其成分包括：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g。
根据本公开，其中，所述MSM培养基中，其成分包括：K2HPO4 2.0g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaNO3 0.5g，(NH4)2SO4 0.5g，1mL过滤除菌的微量金属溶液(每升加入FeCl2·4H2O 3g，CoCl2·6H2O 0.38g，MnCl2·4H2O 0.2g，ZnCl2 0.14g，H3BO3 0.124g，Na2MoO4·2H2O 0.072g，NiCl2·6H2O 0.048g和CuCl2·2H2O 0.034g)。
另一方面本公开还提供了一种呕吐毒素降解酶，其中，所述呕吐毒素降解酶为通过第二方面所述的方法制备得到。
另一方面，本公开还提供了一种制备基因工程菌的方法，其中，所述方法包括：对野生型的德沃斯氏菌进行基因工程改造，该野生型的德沃斯氏菌为耐盐德沃斯氏菌SCS-3，所述耐盐德沃斯氏菌SCS-3的保藏编号为GDMCC NO：61245。
下面通过实施例来进一步举例说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。
实施例1
本实施例用于说明耐盐德沃斯氏菌SCS-3的制备及鉴定过程。
称取1.0g样品(海洋沉积物样品)，加入到100ml生理盐水中，重悬震荡1h，然后以5％的接种量，吸取样品的悬液至含有1μg/mL DON毒素的50mL基础盐培养基(Mineral SaltMedium,MSM)中，在30℃，180rpm下培养7天。随后以5％的接种量将菌悬液转接至含有5μg/mL DON毒素的50mL MSM培养基中。如此重复转接4次并不断提高DON的浓度，使得培养基中DON的终浓度分别为1μg/mL、5μg/mL、20μg/mL和40μg/mL。将其倒置于28℃培养箱中培养3d，得到分离菌株。
MSM培养基的成分包括：K2HPO4 2.0g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaNO3 0.5g，(NH4)2SO4 0.5g，1mL过滤除菌的微量金属溶液(每升加入FeCl2·4H2O 3g，CoCl2·6H2O0.38g，MnCl2·4H2O 0.2g，ZnCl2 0.14g，H3BO3 0.124g，Na2MoO4·2H2O 0.072g，NiCl2·6H2O0.048g和CuCl2·2H2O 0.034g)，121℃高压灭菌20min。
上述分离菌株在电子显微镜下观察该菌株为杆状细菌，如图1所示；经过负染，在电子显微镜下观察具有鞭毛如图2。在LB培养基上培养，培养条件：温度28℃，时间16h，菌落呈现白色，圆形，凸起(如图3所示)。
该分离得到的菌株生理生化特征为：好革兰氏阴性、好氧、有鞭毛、乳白色和杆状。β-半乳糖苷酶阳性，脲酶阳性，β-葡萄糖苷酶阳性，明胶水解蛋白酶阳性。能够以葡萄糖、***糖、甘露糖、甘露醇、N-乙酰-葡糖胺、麦芽糖和葡萄糖酸为碳源；不能以α-甘露糖苷酶、β-岩藻糖苷酶、糜蛋白酶、α-半乳糖苷酶和β-葡萄糖醛酸酶为碳源，不能水解淀粉、吐温80和酪蛋白。细胞壁脂肪酸中，C18:1ω7c和/或C18:1ω6c的含量为19.49％、C18:1ω7c11-methyl的含量为31.41％，C16:0的含量为29.60％。
对该分离得到的菌株进行鉴定，见测试实施例1，确认该菌株属于德沃斯氏菌属(Devosia)，并命名为耐盐德沃斯氏菌SCS-3(Devosia salina SCS-3)，并对其进行全基因组测序。
实施例2
本实施例用于说明耐盐德沃斯氏菌SCS-3具有呕吐毒素降解活性。
将实施例1中分离得到的耐盐德沃斯氏菌SCS-3接种于LB液体培养基中，在28℃下，以220rpm的振荡频率摇床培养活化1-2d，将菌液划线接种于到呕吐毒素为唯一碳源的无机盐培养基平板上。设置DON浓度梯度，使得无机盐培养基的DON终浓度分别为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL。28℃培养72-96h后，观察各菌株的形态与生长情况，记录菌株的DON耐受能力。
通过HPLC检测耐盐德沃斯氏菌SCS-3菌株对DON的降解活性，按5％接种量将德沃斯氏菌SCS-3的种子液接种到含40μg/mL DON为唯一碳源的MSM培养基中，28℃，220rpm摇床中培养。每隔24h取样，加入色谱级甲醇对半稀释，离心取上清液进行HPLC色谱测定，在220nm下检测DON的剩余含量。
结果显示，德沃斯氏菌SCS-3菌株能够在以呕吐毒素为唯一碳源的无机盐固体培养基上生长。表明分离得到的德沃斯氏菌SCS-3菌株具有降解霉菌毒素呕吐毒素的能力。HPLC检测结果显示，在72h时德沃斯氏菌SCS-3对DON的降解率达到约85％，96h时几乎完全降解(图5)。
实施例3
本实施例对德沃斯氏菌SCS-3菌株扩增得到的16S rRNA DNA进行测序。
将实施例1分离得到的耐盐德沃斯氏菌SCS-3菌株基因组使用
Figure BDA0003190352130000061
公司的细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱形)进行提取。德沃斯氏菌SCS-3菌株的16S rRNA的DNA的PCR扩增所用的通用引物序列的设计参照William G.Weisburg(1991)的文章，引物由北京六合华大基因科技有限公司合成，扩增所用的试剂盒购买于南京诺唯赞生物科技有限公司。
正向引物
27F-(5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’，SEQ ID NO.2)，
反向引物
1492R(5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’，SEQ ID NO.3)；
表1 16S rDNA扩增体系：
成分 体积/μL
2×Phanta PCR mix Buffer 25
27F 2
1492R 2
HR1基因组 2
灭菌ddH<sub>2</sub>O 定容至50μL
表2 PCR反应程序
Figure BDA0003190352130000071
将扩增得到的16S rRNA DNA序列连接于
Figure BDA0003190352130000072
公司的pJET 1.2/blunt载体上，导入大肠杆菌DH5α感受态细胞，并在含有氨苄抗生素的LB固体平板上筛选阳性子，对***序列进行测序，测序得到的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
测试实施例1
将实施例1分离得到的德沃斯氏菌SCS-3的16S rDNA与同属的其它种的16S rDNA相比，具有显著差异：
与Devosia riboflavina IFO13584T的相似度为98.22％；
与Devosia indica IO390501T的相似度为97.72％；
与Devosia elaeis S37T的相似度为97.31％；
与Devosia soli GH2-10T的相似度为97.22％；
与Devosia subaequoris HST3-14T的相似度为97.22％；
与Devosia chinhatensis IPL18T的相似度为97.01％；
与Devosia crocina IPL20T的相似度为96.94％等等。
构建的***发育树如图4所示。
测试实施例2
将实施例1中分离得到的德沃斯氏菌SCS-3菌株与其近缘菌株Devosiariboflavina IFO13584T、Devosia indica IO390501T进行微生物特性比较(见表3)，本实施例获取的菌株与近缘菌株的微生物学特性有显著差异。
表3德沃斯氏菌SCS-3与同属不同近缘菌株的微生物特性比较
Figure BDA0003190352130000081
Figure BDA0003190352130000091
注：“+”表示阳性，“-”表示阴性，“w”表示弱阳性。
测试实施例1和2的结果能够证明，本公开的得到的耐盐德沃斯氏菌SCS-3是德沃斯氏菌属(Devosia)中的一个新的种(Devosia salina)，并且具有降解呕吐毒素的功能。
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
序列表
<110> 中国农业科学院生物技术研究所
<120> 一种产呕吐毒素降解酶的德沃斯氏菌SCS-3及其应用
<140> 20235CAAS-B-ZW
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1441
<212> DNA
<213> 耐盐德沃斯氏菌(Devosia salina SCS-3)
<400> 1
ttaccttgtt tcgacttcac cccagtcgct gaccctaccg tggtcggctg cttccttgcg 60
gttagcgcac cggcttcggg taaaaccaac tcccatggtg tgacgggcgg tgtgtacaag 120
gcccgggaac gtattcaccg cagcatgctg atctgcgatt actagcgatt ccaacttcat 180
gcacccgagt tgcagagtgc aatccgaact gagacggttt ttcgggatta gcatcatgtc 240
gccatgtagc tgccctctgt caccgccatt gtagcacgtg tgtagcccag cccataaggg 300
ccatgatgac ttgacgtcat ccccaccttc ctccggctta tcaccggcag tctccttaga 360
gtgcccaact aaatgatggc aactaaggac gagggttgcg ctcgttgcgg gacttaaccc 420
aacatctcac gacacgagct gacgacagcc atgcagcacc tgtgtgtcag tcaccgaagt 480
gaaggaatcc atctctggaa accgtccgac catgtcaagg gctggtaagg ttcttcgcgt 540
tgcttcgaat taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc ccccgtcaat tcctttgagt 600
tttaatcttg cgaccgtact ccccaggcgg agagcttaat gcgttagctg cgccactgag 660
tggtaaacca cccaacggct agctctcata gtttacggcg tggactacca gggtatctaa 720
tcctgtttgc tccccacgct ttcgcacctc agcgtcagtt ccggaccagt aagccgcctt 780
cgccactggt gttcttccta atatctacga attccacctc tacactagga gttccactta 840
cctcttccgg actctagctt gccagtatca aaggcagttc cggagttgag ctccgggatt 900
tcacctctga cttaacaaac cgcctacgtg cgctttacgc ccagtaaatc cgaacaacgc 960
tagccccctt cgtattaccg cggctgctgg cacgaagtta gccggggctt cttctccgac 1020
taccgtcatt atcttcatcg gtgaaagagc tttacaaccc taaggccttc atcactcacg 1080
cggcatggct ggatcaggct tgcgcccatt gtccaatatt ccccactgct gcctcccgta 1140
ggagtctggg ccgtgtctca gtcccagtgt ggctgatcat cctctcagac cagctaaaga 1200
tcgtcgcctt ggtaggccat taccccacca actagctaat cttacgcggg ctcatccaat 1260
tccgataaat ctttcccccg tagggcgtat acggtattag cagtcgtttc caactgttgt 1320
tccgtagaac tgggtagatt cccacgcgtt actcacccgt ctgccactcc ccttgcgggg 1380
cgttcgactt gcatgtgtta agcctgccgc cagcgttcgt tctgagccag gatcaaactc 1440
t 1441
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagtttgat catggctcag 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tacggttacc ttgttacgac tt 22

Claims (10)

1.能够降解呕吐毒素的德沃斯氏菌，其特征在于，该德沃斯氏菌的分类命名为耐盐德沃斯氏菌SCS-3(Devosia salina SCS-3)，所述耐盐德沃斯氏菌SCS-3的保藏编号为GDMCCNO：61245。
2.根据权利要求1所述的德沃斯氏菌，其中，所述耐盐德沃斯氏菌SCS-3的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的德沃斯氏菌，其中，所述耐盐德沃斯氏菌SCS-3为革兰氏阴性、好氧、有鞭毛、白色和杆状。
4.根据权利要求1所述的耐盐德沃斯氏菌，其中，所述耐盐德沃斯氏菌SCS-3为β-半乳糖苷酶阳性，脲酶阳性，β-葡萄糖苷酶阳性，明胶水解蛋白酶阳性。
5.根据权利要求1所述的耐盐德沃斯氏菌，其中，所述耐盐德沃斯氏菌SCS-3能够以葡萄糖、***糖、甘露糖、甘露醇、N-乙酰-葡糖胺、麦芽糖和葡萄糖酸为碳源；不能以α-甘露糖苷酶、β-岩藻糖苷酶、糜蛋白酶、α-半乳糖苷酶和β-葡萄糖醛酸酶为碳源，不能水解淀粉、吐温80和酪蛋白。
6.根据权利要求1所述的耐盐德沃斯氏菌，其中，所述耐盐德沃斯氏菌SCS-3的细胞壁脂肪酸中，C18:1ω7c和/或C18:1ω6c的含量为19.49％、C18:1ω7c 11-methyl的含量为31.41％，C16:0的含量为29.60％。
7.一种制备呕吐毒素降解酶的方法，其中，该制备方法包括：将权利要求1-6中任意一项所述的耐盐德沃斯氏菌SCS-3接种至培养基中进行培养，得到培养物。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述培养基为LB液体培养基、MSM培养基中的至少一种；所述培养的培养条件包括：培养温度为25-30℃，培养时间为2-4天，振荡速度为140-160rpm，转接1-3轮。
9.一种呕吐毒素降解酶，其中，所述呕吐毒素降解酶为通过权利要求7或8所述的方法制备得到。
10.一种制备基因工程菌的方法，其中，所述方法包括：对野生型的德沃斯氏菌进行基因工程改造，该野生型的德沃斯氏菌为耐盐德沃斯氏菌SCS-3，所述耐盐德沃斯氏菌SCS-3的保藏编号为GDMCC NO：61245。
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