CN110592278A - PRoV、PoSaV和PAstV的多重RT-PCR试剂盒 - Google Patents
PRoV、PoSaV和PAstV的多重RT-PCR试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了PRoV、PoSaV和PAstV的多重RT‑PCR检测引物组，包括三对特异性引物，分别是引物PRoV‑F和PRoV‑R、引物PoSaV‑F和PoSaV‑R、引物PAstV‑F和PAstV‑R。据此，发明人还研制了相应诊断试剂盒。应用本发明，可以通过一个RT‑PCR反应从样品中同时检测出PRoV、PoSaV和PAstV单个或混合感染病毒，具有特异性高、敏感性好、耗时短且成本低等特点。综上，本发明为猪群混合感染PRoV、PoSaV和PAstV的检测提供了快速简便的工具，为临床快速鉴别检测及实验室流行病学调查奠定坚实的基础，有利于养猪业及时制定治疗方案，减少猪群死亡率和经济损失。
Description
技术领域
本发明属于病毒核酸检测领域，尤其涉及一种PRoV、PoSaV和PAstV的多重RT-PCR试剂盒。
背景技术
近年来，随着养猪业向集约化、规模化方向发展，猪群发生多种病原混合感染的情况愈加普遍。猪轮状病毒(PRoV)、札幌病毒(Sapovirus，PoSaV)、猪星状病毒(PAstV)在健康的哺乳仔猪和腹泻的仔猪中被发现，是病毒性肠道疾病的病原体，由于其病理变化在临床症状及流行病学上的相似性，难以区分这些疾病。同时，据报道这三种病毒不仅仅感染哺乳仔猪，也是导致婴幼儿发生腹泻的主要病毒。上述疾病在猪群的混合感染不仅会给实验室诊断和临床治疗带来巨大的挑战，也将给养猪业及人类健康造成重大的经济损失。
猪轮状病毒(Porcine rotavirus；PRoV)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)轮状病毒属(Rotavirus)，在婴儿和其他哺乳动物中广泛存在，也是引起新生仔猪和断奶仔猪急性腹泻最常见的因素，易继发细菌感染。轮状病毒(RV)是导致全球婴幼儿病毒性腹泻的主要病原，无论是在发达国家还是在发展中国家，婴幼儿RV感染比较普遍，病毒主要通过粪-口途径传播，通常在感染后1-2d发病，几乎每名<5岁儿童均感染过RV，6月龄-2岁婴幼儿是RV感染的主要人群。幼龄仔猪最易感，1～4周龄仔猪发病率超过80％，死亡率达7％～20％，主要表现为严重腹泻、呕吐、脱水、消瘦、生长缓慢等。
札幌病毒(Sapovirus，PoSaV)是杯状病毒科、札幌样病毒属成员,可经粪-口途径传播引起猪急性胃肠炎,且是潜在的人畜共患病。研究表明,某些PoSaV与人SaV核苷酸序列具有很高的同源性,且越来越多来源于人和猪的SaV重组新毒株被发现，提示PoSaV具有跨种间感染及传播给人的潜在风险。人札幌病毒基因具有高度变异性，猪重组札幌病毒毒株的重组位点位于聚合酶和衣壳蛋白的重叠区。尽管目前还没有发现不同物种间杯状病毒的重组，但是许多其他RNA病毒存在这种现象，因此,不同物种间杯状病毒潜在重组也可能导致具有不同致病性和毒力的新毒株出现。
猪星状病毒(Porcine astrovirus,PAstV)为星状病毒科成员。星状病毒(AstV)是一类广泛存在于人和多种哺乳动物及鸟类的***共患病病原，广泛分布于世界各地。PAstV对哺乳期仔猪侵害较大，常引起腹泻、脱水和呕吐等临床症状，导致乳猪生长迟缓，严重者可引起死亡，给养猪业带来一定的经济损失。文献报道，星状病毒的检出率有随着年龄增长而升高的趋势。尽管目前国内报道的星状病毒感染率均较低，但是国外研究表明，星状病毒不应仅仅被认为是儿童普通肠道感染的病原体，还可能存在星状病毒引起的严重中枢神经***感染及其他未被识别的疾病。
研究表明多种病毒混合感染引起猪的腹泻病，严重危害猪的生产工作，而且根据临床症状和流行病学较难区分，必须依靠实验室检测技术进行鉴别诊断。其中电镜观察、病毒分离、免疫组织化学和荧光抗体技术等常用诊断技术操作复杂，难度较大；ELISA病原快速检测试剂盒和常规RT-PCR方法的应用比较广泛，但血清学方法准确率较低，常用的单一PCR方法耗时长。因此，有必要建立能同时检测这多种病毒的快速的早期诊断方法，以便尽快采取有效的防控措施，减少这些疾病对养猪业及人类健康造成的危害。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种PRoV、PoSaV和PAstV的多重RT-PCR试剂盒，该发明可在同一反应管内同时检测这三种病毒，适用于临床及科研中对PRoV、PoSaV和PAstV三种病毒的快速检测及流行病学调查。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
PRoV、PoSaV和PAstV的多重RT-PCR检测引物组，包括三对特异性引物，分别是引物PRoV-F和PRoV-R、引物PoSaV-F和PoSaV-R、引物PAstV-F和PAstV-R，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.6的碱基序列。
上述PRoV、PoSaV和PAstV的多重RT-PCR检测引物组在PCR扩增方面的应用。
PCR扩增中，PRoV-F和PRoV-R是针对PRoV的基因VP6的第359-518位设计，引物PoSaV-F和PoSaV-R是针对PoSaV的基因RdRp第4363-4661位设计，引物PAstV-F和PAstV-R是针对PAstV的基因ORF1的第3332-3797位设计。
PCR扩增的退火温度为50℃。
PRoV、PoSaV和PAstV的多重RT-PCR试剂盒，含有以下试剂：PCR标准品、阳性对照品、阴性对照品、引物，所有试剂均保存于-20℃；引物包括三对特异性引物，分别是引物PRoV-F和PRoV-R、引物PoSaV-F和PoSaV-R、引物PAstV-F和PAstV-R，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.6的碱基序列。
PCR标准品包括PRoV标准品、PoSaV标准品和PAstV标准品；阳性对照品含PRoV、PoSaV、PAstV三种病毒的阳性质粒混合品(质粒混合物的浓度约为4.58×108copies/μL)；阴性对照品为灭菌后超纯水。
PRoV标准品、PoSaV标准品和PAstV标准品分别具有序列表SEQ.ID.NO.7至SEQ.ID.NO.9的碱基序列。
上述引物中，三对特异性引物的上游引物PRoV-F、PoSaV-F和PAstV-F同管包装，三对特异性引物的下游引物PRoV-R、PoSaV-R和PAstV-R同管包装。
针对猪轮状病毒、札幌病毒和猪星状病毒鉴别检测存在的问题，运用多重RT-PCR技术，发明人分别针对PRoV的基因VP6、PoSaV的基因和PAstV的基因ORF1设计了PRoV、PoSaV和PAstV的多重RT-PCR检测引物组，包括三对特异性引物，分别是引物PRoV-F和PRoV-R、引物PoSaV-F和PoSaV-R、引物PAstV-F和PAstV-R，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.6的碱基序列。据此，发明人还研制了相应诊断试剂盒，含有以下试剂：PCR标准品、阳性对照品、阴性对照品、引物。应用本发明，可以通过一个RT-PCR反应从样品中同时检测出PRoV、PoSaV和PAstV单个或混合感染病毒，具有特异性高、敏感性好、耗时短且成本低等特点。综上，本发明为猪群混合感染PRoV、PoSaV和PAstV的检测提供了快速简便的工具，为临床快速鉴别检测及实验室流行病学调查奠定坚实的基础，有利于养猪业及时制定治疗方案，减少猪群死亡率和经济损失。
附图说明
图1是本发明同时检测猪轮状病毒、札幌病毒和猪星状病毒的对应引物的特异性检测结果图，图中：泳道从左至右依次为：M:DL 1000 DNA Marker；1:PRoV；2:PoSaV；3:PAstV；4:PRoV、PoSaV及PAstV；5:阴性对照。
图2是本发明同时检测猪轮状病毒、札幌病毒和猪星状病毒的对应引物的特异性检测结果图，图中：泳道从左至右依次为：M:DL 1000 DNA Marker；1:PRoV及PoSaV；2:PRoV及PAstV；3:PoSaV及PAstV；4：非靶标模板；5：阴性对照。
图3是本发明同时检测猪轮状病毒、札幌病毒和猪星状病毒的敏感性检测结果图，图中：泳道从左至右依次为：M:DL 1000 DNA Marker；1:4.58×109；2:4.58×108；3:4.58×107；4:4.58×106；5:4.58×105；6:4.58×104；7:4.58×103；8:4.58×102copies/μL阳性质粒混合物；9:阴性对照。
图4是本发明单独检测猪轮状病毒的敏感性检测结果图，图中：泳道从左至右依次为：M:DL 1000 DNA Marker；1:1.38×109；2:1.38×108；3:1.38×107；4:1.38×106；5:1.38×105；6:1.38×104；7:1.38×103；8:1.38×102；9:1.38×101；10:1.38×100copies/μL阳性质粒；11:阴性对照。
图5是本发明单独检测札幌病毒的敏感性检测结果图，图中：泳道从左至右依次为：M:DL 1000 DNA Marker；1:8.33×109；2:8.33×108；3:8.33×107；4:8.33×106；5:8.33×105；6:8.33×104；7:8.33×103；8:8.33×102；7:8.33×101；7:8.33×100copies/μL阳性质粒；11:阴性对照。
图6是本发明单独检测猪星状病毒的敏感性检测结果图，图中：泳道从左至右依次为：M:DL 1000 DNA Marker；1:4.40×109；2:4.40×108；3:4.40×107；4:4.40×106；5:4.40×105；6:4.40×104；7:4.40×103；8:4.40×102；9:4.40×101；10:4.40×100copies/μL阳性质粒；11:阴性对照。
具体实施方式
一、引物设计
针对猪轮状病毒、札幌病毒和猪星状病毒三种病毒，发明人设计了表1所示引物,由上海杰李生物技术有限公司合成引物，合成量为每管引物1OD。
表1 本发明所设计的多重PCR引物
在杨文宇老师的文章《猪A群轮状病毒、猪C群轮状病毒和猪星状病毒多重RT-PCR检测方法的建立与初步应用》一文中，选取了猪A群轮状病毒(GARV)、猪C群轮状病毒(GCRV)的VP4、VP7、VP6基因以及PAstV的ORF1a、ORF1b、ORF2基因进行保守性比较，对于猪A群轮状病毒的检测使用的参考基因区域为VP6的251bp-479bp，对于猪C群轮状病毒的检测使用的参考基因区域为1bp-166bp，对于猪星状病毒参考的区域为ORF2的7bp-416bp。
与杨文宇老师选取的参考基因区域不同，本发明中猪轮状病毒(PRoV)的检测引物对应的长度为160bp，位于目的基因VP6，359bp-518bp；札幌病毒(PoSaV)的检测引物对应的长度为299bp，目的基因为RdRp，位于全长4363bp-4661bp；猪星状病毒(PAstV)的检测引物对应的长度为466bp，位于目的基因ORF1，3332bp-3797bp。而且，研究表明，本发明引物组具有高特异性和稳定性，能够在同一PCR反应体系中对三种病毒的目的片段同时进行有效的扩增，使得检测过程更加简便、省时、省力。
二、试剂盒组装和使用
1.试剂盒组装
PRoV、PoSaV和PAstV的多重RT-PCR试剂盒，含有以下试剂：PCR标准品、阳性对照品、阴性对照品、引物以及盒体，盒体中设有相应的容器孔用于试剂的存放，所有试剂均保存于-20℃。其中，
PCR标准品包括PRoV标准品、PoSaV标准品和PAstV标准品；阳性对照品含PRoV、PoSaV、PAstV三种病毒的阳性质粒混合品(质粒混合物的浓度约为4.58×108copies/μL)；阴性对照品为灭菌后超纯水。
引物包括三对特异性引物，分别是引物PRoV-F和PRoV-R、引物PoSaV-F和PoSaV-R、引物PAstV-F和PAstV-R，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.6的碱基序列。三对特异性引物的上游引物PRoV-F、PoSaV-F和PAstV-F同管包装，三对特异性引物的下游引物PRoV-R、PoSaV-R和PAstV-R同管包装。
2.试剂盒使用
每次检测根据具体情况设立阴性对照和阳性对照；标准品用无菌超纯水稀释为109～102copies/μL。
RNA病毒样品提取：根据产品使用说明书，用病毒RNA抽提试剂盒RNAiso Plus从细胞株、新鲜或冷冻的样品中提取病毒核酸。
反转录反应：在高压灭菌的0.2mL PCR管中依次加入上一步骤制备的总RNA模板8μL,5×Reversa Transcriptase M-MLV Buffer 2.5μL、dNTP Mixture 1μL、下游引物0.5μL、Reversa Transcriptase M-MLV 0.25μL、Ribolock RNase Inhibitor 0.25μL，总体积为12.5μL，反应条件为42℃反应1h，待反转录反应结束后，所得反应液即为cDNA模板。
核酸的检测：取3μL已制备的cDNA模板进行多重PCR反应，其中2×Taq PlusMaster MixⅡ(Dye Plus)12.5μL、上游引物混合物0.5μL、下游引物混合物0.5μL、ddH2O8.5μL、cDNA 3μL，总体积为25μL；反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸5min；PCR产物用2％的琼脂凝胶电泳进行检测，经凝胶成像仪成像后分析。
结果报告：在阴性对照与阳性对照成立的条件下，根据PRoV、PoSaV和PAstV扩增基因片段的有无，对是否有猪轮状病毒、札幌病毒和猪星状病毒进行鉴定。
三、特异性实验
按照多重PCR反应体系，2×Taq Plus Master Mix Ⅱ(Dye Plus)12.5μL、上游引物混合物0.5μL、下游引物混合物0.5μL、ddH2O 8.5μL，分别加入3μL阳性样品cDNA模板1:PRoV；2:PoSaV；3:PAstV；4:PRoV及PoSaV；5:PRoV及PAstV；6:PoSaV及PAstV；7:PRoV、PoSaV及PAstV；8:非靶向模板；9：超纯水阴性对照。反应在life ProFlex PCR扩增仪进行，反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸5min。取10μL PCR产物，点样于2％的琼脂凝胶电泳板孔中，140V电压，电泳约20min，于凝胶成像仪紫外成像后拍照判定。
结果如图1和图2，对应PCR产物大小与表1中PRoV、PoSaV和PAstV分别为160bp、299bp和466bp完全一致，表明本发明构建的一种同时检测猪轮状病毒、札幌病毒和猪星状病毒的多重RT-PCR检测试剂盒特异性良好。
四、敏感性实验
多重PCR敏感性检测反应体系：2×Taq Plus Master Mix Ⅱ(Dye Plus)12.5μL，上游引物混合物0.5μL，下游引物混合物0.5μL，ddH2O 8.5μL，分别加入3μL 10倍系列稀释的PRoV、PoSaV和PAstV阳性质粒混合物(4.58×109～4.58×102copies/μL)模板。反应在life ProFlex PCR扩增仪进行，反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸5min。取10μL PCR产物，2％琼脂凝胶电泳检测。
常规单重PCR敏感性检测反应体系：2×Taq Plus Master Mix Ⅱ(Dye Plus)12.5μL，上游引物混合物0.5μL，下游引物混合物0.5μL，ddH2O 8.5μL，分别加入3μL 10倍系列稀释的PRoV、PoSaV和PAstV阳性质粒标准品(109～102copies/μL)模板。反应在life ProFlexPCR扩增仪进行，反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸5min。取10μL PCR产物，2％琼脂凝胶电泳检测。
结果如图3，本发明多重PCR同时检测猪轮状病毒、札幌病毒和猪星状病毒检出下限达4.58×104copies/μL，对三种病毒灵敏性较好。而常规单重PCR敏感性猪轮状病毒检出下限为1.38×103copies/μL、札幌病毒检出下限为8.33×102copies/μL、猪星状病毒检出下限为4.40×102copies/μL。
五、应用实例
应用本发明的多重RT-PCR试剂盒，对18份猪临床病料进行检测，检出轮状阳性1份，札幌阳性2份，星状阳性2份。
序列表
<110> 广西大学
<120> PRoV、PoSaV和PAstV的多重RT-PCR试剂盒
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atctgaagcg ttgagaaagt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agtaaatgaa gctgagtatg 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgacgagcg ccagtgttga c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aggccgtaca cacaatcatc c 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aacaacgaac ccgcacatct 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggaggaacat acggtgtcgt 20
<210> 7
<211> 160
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atctgaagcg ttgagaaagt tgtcgggtat taagtttagg agaattaatt ttgacaattc 60
atctgattac attgaaaatt ggaatttgca aaatagacga cagcgtactg gattcgtgtt 120
ccacaaacca aatatacttc catactcagc ttcatttact 160
<210> 8
<211> 299
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtgacgagcg ccagtgttga catcttggcc tcttacgctg aggacacgcc actcacttca 60
gcagctatag ccacactgtg ctcaccggcc gtcggccggc ttgatgacat tggtttgact 120
gtcacaactg ggctcccctc tggcatgcca ttcaccagtg tcataaactc tgtcaaccat 180
atgatatact ttgccatggc cgtgcttgaa gcttatgagg agttcaaggt gccctacatg 240
ggaaacatct ttgacaatga gactgtttac acgtatgggg atgattgtgt gtacggcct 299
<210> 9
<211> 466
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aacaacgaac ccgcacatct gtgggccagt gtgggtggac gccaatgcaa ggtgggttta 60
aagccataat ggagaggctt gtttcaaaag gtaatagtta ctttgtagaa atggactgga 120
ctcgttacgg cggaaccatt ccaacagaac ttttcaggca cattaaagaa ctacgatgga 180
agctgatcaa caaagaacag cgtgagaaat acgcagaagt ccacaagtgg tatgttgaca 240
acctattaaa taggtatgtc ctcctgccgt ctggggaagt aaccctgcag acacggggca 300
atccatctgg acaattctca actaccatgg acaataacat gatcaacttc tggctccagg 360
catttgagtt tgcttggatt aatggcccaa acaaggaact ctggaagagc tatgacacca 420
ttgtatacgg tgatgatcgt ttaaacacga caccgtatgt tcctcc 466
Claims (8)
1.PRoV、PoSaV和PAstV的多重RT-PCR检测引物组，其特征在于包括三对特异性引物，分别是引物PRoV-F和PRoV-R、引物PoSaV-F和PoSaV-R、引物PAstV-F和PAstV-R，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.6的碱基序列。
2.权利要求1所述的PRoV、PoSaV和PAstV的多重RT-PCR检测引物组在PCR扩增方面的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述PCR扩增中，PRoV-F和PRoV-R是针对PRoV的基因VP6的第359-518位设计，引物PoSaV-F和PoSaV-R是针对PoSaV的基因RdRp第4363-4661位设计，引物PAstV-F和PAstV-R是针对PAstV的基因ORF1的第3332-3797位设计。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述PCR扩增的退火温度为50℃。
5.一种PRoV、PoSaV和PAstV的多重RT-PCR试剂盒，其特征在于含有以下试剂：PCR标准品、阳性对照品、阴性对照品、引物；所述引物包括三对特异性引物，分别是引物PRoV-F和PRoV-R、引物PoSaV-F和PoSaV-R、引物PAstV-F和PAstV-R，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.6的碱基序列。
6.根据权利要求5所述PRoV、PoSaV和PAstV的多重RT-PCR试剂盒，其特征在于：所述PCR标准品包括PRoV标准品、PoSaV标准品和PAstV标准品；所述阳性对照品含PRoV、PoSaV、PAstV三种病毒的阳性质粒混合品；所述阴性对照品为灭菌后超纯水。
7.根据权利要求6所述PRoV、PoSaV和PAstV的多重RT-PCR试剂盒，其特征在于：所述PRoV标准品、PoSaV标准品和PAstV标准品分别具有序列表SEQ.ID.NO.7至SEQ.ID.NO.9的碱基序列。
8.根据权利要求5所述PRoV、PoSaV和PAstV的多重RT-PCR试剂盒，其特征在于：所述引物中，三对特异性引物的上游引物PRoV-F、PoSaV-F和PAstV-F同管包装，三对特异性引物的下游引物PRoV-R、PoSaV-R和PAstV-R同管包装。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20191220 |