CN107419034A

CN107419034A - 五种猪腹泻病毒多重pcr快速诊断试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN107419034A
Application number: CN201710534310.5A
Authority: CN
Inventors: 姜永厚; 刘高鹏
Original assignee: Hangzhou Hongqiao Biotechnology Co Ltd; Zhejiang Sci Tech University ZSTU
Current assignee: Hangzhou Hongqiao Biotechnology Co Ltd; Zhejiang Sci Tech University ZSTU; Zhejiang University of Science and Technology ZUST
Priority date: 2017-07-03
Filing date: 2017-07-03
Publication date: 2017-12-01
Anticipated expiration: 2037-07-03
Also published as: CN107419034B

Abstract

本发明公开了五种猪腹泻病毒多重PCR快速诊断试剂盒，包括5对PCR引物，还包括PCR反应液、PCR标准品、阳性对照品、阴性对照品。本发明还同时公开了上述试剂盒在同时特异检测五种猪腹泻病毒感染中的应用，这五种猪腹泻病毒为TGEV、GAR、GCR、PEDV和PCV2。

Description

五种猪腹泻病毒多重PCR快速诊断试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于病毒核酸检测领域，具体涉及一种五种猪腹泻病毒多重PCR快速诊断试剂盒，可在同一个反应管内同时检测猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrheavirus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪轮状病毒A型(Porcine group A rotaviruses,GAR)、猪轮状病毒C型(Porcine group Crotaviruses,GCR)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)五种猪病毒，适用于临床及科研中对五种猪病毒的快速检测。

背景技术

近年来，随着养猪业向规模化和集约化方向发展，猪群发生多病原混合感染及继发感染的情况越来越普遍。感染猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒A型(GAR)、猪轮状病毒C型(GCR)、猪圆环病毒2型(PCV2)这几种疾病在临床上呈现出相似的腹泻症状，并且它们常常呈混合感染，而且上述疾病的发生使对其它疾病如呼吸和繁殖障碍的诊断变得复杂和困难，死亡率很高，给养猪业造成重大损失。

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起猪的一种以呕吐、腹泻和脱水为主要特征的肠道传染病。该病以7日龄以内仔猪发病为主，病程短、传播迅速、仔猪死亡率极高，可达100％。1978年，比利时和英国首次报道PEDV疫情，1984年，我国证实该病的存在。在2010-2012年中国不同地区均有PEDV大暴发的报道，造成哺乳仔猪大量死亡，严重影响了我国养猪业的健康发展。

猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)属冠状病毒科、冠状病毒属，基因组为单股正链不分节段的RNA，全长28.5kb。对小肠造成损伤，产生消化和吸收不良，最终导致腹泻和脱水，引起哺乳仔猪死亡(Tuboly et al.,2000；南文金and娄高明,2010)。该病毒感染率高，造成的仔猪死亡率高(王黎等,2015)。

轮状病毒(RV)属于呼肠病毒科家族，无包膜，基因组是一条的11分段的双链RNA(Estes and Cohen,1989)。RV是引起包括人类以及其他动物腹泻的重要因素，目前轮状病毒以VP6基因分成8个种，其中A、B、C、E和H(GAR、GBR、GCR、GER和GHR)都已经在猪上检测出(Matthijnssens et al.,2012；Saif et al.,1980；Wakuda et al.,2011)。GAR在1975年首次报道，一直被认为是猪腹泻的一个主要病原(Amimo et al.,2013a；Ciarlet et al.,2002；Ciarlet et al.,1995；Miyazaki et al.,2011,2012)。GCR在1979年首次被检测出，很难进行细胞培养(Amimo et al.,2013b；Marthaler et al.,2013；Saif et al.,1988；Saif et al.,1996；Tsunemitsu et al.,1991)。GCR能引起严重胃肠感染且易造成散发性传播或大爆发(Bohl et al.,1982；Collins et al.,2008；Saif et al.,1980)。一般GAR被认为是引起猪腹泻的首因，而GBR、GCR的作用没那么大。Douglas marthaler等应用RT-PCR检测7508份猪腹泻样品的研究发现GAR的阳性率为62％，GCR感染率也很高(53％)，GCR主要感染1-20天仔猪，GAR主要感染21天以上仔猪。认为应该同时检测GAR、GCR(Marthaler etal.,2014)。

猪圆环病毒2型(PCV2)属圆环病毒科圆环病毒属，近年新报道猪病毒，是能在哺乳动物细胞自主复制最小单链环状DNA病毒，包含4个开放阅读框(ORF)：ORF1-4(Murphy,1995)。猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)症状之一是引发肠炎。PCV2可以由单独感染或者混合感染引发肠炎(Kim et al.,2004；Zhang et al.,2013)。PCV2对猪有很强感染力，各年龄都可感染，而且侵害猪的免疫***产生免疫抑制和其它病原微生物继发感染。

常规的病原学和血清学检测很难将上述这些疾病同时加以区别鉴定，同时又存在操作繁琐、费时费力、敏感度低等缺陷，尤其是多种病原感染时，难以有效进行早期检测，容易产生误判错判。而多重PCR技术可以一次同时检测多种病原体，并具有高特异性和敏感性、检测时间短、检测成本低等优点，是一种较为理想的检测方法。因此，开发出一种同时特异检测多种猪腹泻病毒感染的多重PCR快速诊断试剂盒，有助于提升猪腹泻病毒检测水平，在疾病诊断和防治及食品安全等方面具有重要的应用前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种五种猪腹泻病毒多重PCR快速诊断试剂盒及其应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种五种猪腹泻病毒多重PCR快速诊断试剂盒：

包括如下5对PCR引物(为五种病毒特异性引物)：

TGEV-F：GTGGTGTTAGGTGATTATTTTCC，

TGEV-R：TATGGTTTAACCTGCACTCACTA；

GAR-F：TATGCAATACCAGTAGGACCAG，

GAR-R：GCTCTACGTAGCGAGTATGAAATC；

PEDV-F：AACACGGCGACTACTCAGC，

PEDV-R：GCCTTCTTTAGCAACCCAG；

GCR-F：TGTTGCATCCGTGAAGAGAATGGT；

GCR-R：GCATTAGCCCCTACGCAAGC；；

PCV2-F：AAGAAGCGGACCCCAAC，

PCV2-R：AGGTGGCCCCACAATGA。

作为本发明的五种猪腹泻病毒多重PCR快速诊断试剂盒的改进：

所述试剂盒包括：a)多重PCR反应液、b)引物(病毒特异性引物)、c)阳性对照品、d)阴性对照品和e)PCR标准品；

a)、所述PCR反应液(即，多重PCR反应混合液)包含PCR反应缓冲液和耐热DNA聚合酶；所述PCR反应缓冲液包括缓冲液，氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物；

b)、所述引物为五种病毒特异性引物；

c)、所述阳性对照品为：含TGEV、GAR、GCR、PEDV和PCV2五种病毒的阳性质粒混合品(每种病毒浓度约为300ng/μl)；

d)、所述阴性对照品为：灭菌后焦碳酸二乙酯处理水(DEPC-H₂O)；

e)、所述PCR标准品由以下5种标准品组成：PEDV标准品、TGEV标准品、GAR标准品、GCR标准品、PCV2标准品。

备注说明：

上述5种病毒标准品序列如SEQ ID NO:11～SEQ ID NO:15所述。

作为本发明的五种猪病毒多重PCR快速诊断试剂盒的进一步改进：

五种病毒的特异性引物的上下游引物同管包装。

本发明的诊断试剂盒，能用于检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒A型(GAR)、猪轮状病毒C型(GCR)、猪圆环病毒2型(PCV2)。

本发明提供的快速诊断试剂盒，避光保存于-20℃，尽量减少反复冻融。

表1、本发明中所设计的多重PCR引物

本发明试剂盒的使用方法具体可如下：

每次检测根据具体使用情况设立阴性对照和阳性对照；

标准品用无菌双蒸水稀释为1.0×10¹～1.0×10⁸Copies/μl。

RNA/DNA病毒样品提取：根据产品使用说明书，用病毒RNA/DNA抽提试剂盒MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0(TAKARA)从细胞株、新鲜或冷冻的样本提取病毒核酸。

反转录反应：在无RNase的0.2ml PCR管中依次加入上一步骤制备的总RNA/DNA模板1μl，使用TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0(Code No.RR019A)进行RT-PCR反应，其中10×RT PCR Buffer 1μl，25mM MgCl₂ 2μl，10mM dNTP Mixture 1μl，40U/μl RNaseInhibitor 0.25μl，5U/μl AMV RTase XL 0.5μl，Random 9 mers 0.5μl，RNase Free dH₂O至总体积为10μl，待反转录反应结束后，所得反应液即为cDNA/DNA模板。

核酸的检测：取1μl已制备的cDNA/DNA为模板进行多重荧光PCR反应，其中多重PCR反应液19μl，引物混合物1μl，ddH₂O 4μl；反应程序为先95℃变性3min；40个循环的反应条件为95℃变性20s，55℃退火30s，72℃延伸30s；最后72℃5min。PCR产物用2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，经凝胶成像仪成像后分析。

结果报告：根据TGEV、GAR、GCR、PEDV和PCV2基因目标片段的有无，对是否有这五种猪腹泻病毒进行鉴定。

本发明的优点：运用多重PCR技术，设计TGEV、GAR、GCR、PEDV和PCV2五种病毒的特异性引物，开发研制的一种五种猪腹泻病毒多重PCR快速诊断试剂盒，通过一个PCR反应可以从样本中同时检测出TGEV、GAR、GCR、PEDV和PCV2单个或混合感染病毒，特异性高，比传统的普通PCR方法更简便、省时和成本更低。本发明提供的试剂盒可区分猪腹泻病毒感染，为猪腹泻病毒感染的检测提供快速简便的工具，从而实现临床早期诊断并及时制定治疗方案，减少猪群死亡率和经济损失。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1五种猪腹泻病毒对应引物的特异性检测。泳道从左至右依次为：M:DL2000 DNAMarker；1:GCR；2:GAR；3:TGEV；4:PEDV；5:PCV2；6:GCR、GAR、TGEV、PEDV及PCV2；7:GCR及TGEV；8:GAR及PEDV；9:TGEV及PCV2；10:GCR及PCV2；11:GCR、GAR、及TGEV；12：TGEV、PEDV及PCV2；13:GCR、TGEV及PCV2；14:GCR、TGEV、PEDV及PCV2；15：GAR、TGEV、PEDV及PCV2；16：阴性对照；17:非靶标模板。

图2本发明对五种猪腹泻病毒的灵敏性检测。泳道1-9从左至右依次为：1:5×10⁵；2:5×10⁴；3:5×10³；4:5×10²；5:5×10¹；6:5×10⁰；7:5×10^-1；8:5×10^-2copies/μL标准品混合物；9:阴性对照。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1、试剂盒结构

一种五种猪病毒多重实时荧光定量PCR快速诊断试剂盒，由多重PCR反应混合液、病毒引物、TGEV病毒标准品、GAR病毒标准品、GCR病毒标准品、PEDV病毒、PCV2病毒标准品、阳性对照品、阴性对照品和盒体组成。

在盒体中设有相应的容器孔，用于分别放置定量PCR反应液管、五种病毒引物管、TGEV病毒标准品管、GAR病毒标准品管、GCR病毒标准品管、PEDV病毒标准品管、PCV2病毒标准品管、阳性对照品管和阴性对照品管。

其中多重PCR反应混合液包含PCR反应缓冲液(含氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物等)和耐热DNA聚合酶；病毒引物为五种病毒引物上下游引物同管装；阳性对照品为TGEV、GAR、GCR、PEDV和PCV2五种病毒的阳性质粒混合品(每种病毒浓度约为300ng/μl)；阴性对照品为灭菌后焦碳酸二乙酯处理水(DEPC-H₂O)。

实施例2、本发明检测五种病毒特异性实验

第一步：引物合成

将本发明所设计的5种病毒引物序列(见表1)由中国上海生工生物公司技术服务公司合成引物，合成量为每引物3OD。

第二步：多重PCR体系特异性检测

按照多重PCR反应体系，取17份相同的PCR反应预混液(即，多重PCR反应混合液19μL和5种病毒引物混合物1μl)，分别加入1μL阳性样品cDNA/DNA模板1:GCR；2:GAR；3:TGEV；4:PEDV；5:PCV2；6:GCR、GAR、TGEV、PEDV及PCV2；7:GCR及TGEV；8:GAR及PEDV；9:TGEV及PCV2；10:GCR及PCV2；11:GCR、GAR、及TGEV；12：TGEV、PEDV及PCV2；13:GCR、TGEV及PCV2；14:GCR、TGEV、PEDV及PCV2；15：GAR、TGEV、PEDV及PCV2；16：去离子水阴性对照；17:非靶标模板，加ddH₂O至反应体系总体积为25μL。反应在Bio-Rad S1000 PCR扩增仪进行，反应参数为：先95℃变性3min；40个循环的反应条件为95℃变性20s，55℃退火30s，72℃延伸30s；最后72℃5min。取5μL PCR产物，与1μL Loading Buffer混匀后，点样于2％琼脂糖凝胶电泳板孔中，120V电压，电泳30min，于紫外荧光成相仪下拍照判定，结果参见图1，对应PCR产物大小与表1中GCR、GAR、TGEV、PEDV和PCV2分别为126bp、242bp、319bp、394bp和508bp完全一致，可见本发明中构建的猪腹泻病毒多重PCR反应体系特异性较好。

实施例3、本发明检测五种病毒敏感性实验

第一步：引物合成

同实施例2中第一步。

第二步：敏感性检测

多重PCR敏感性检测体系如下：19μL PCR反应液(多重PCR反应混合液)，10μM的TGEV、GAR、GCR、PEDV和PCV2上下游引物混合液1μL，1μL 10倍系列稀释的TGEV、GAR、GCR、PEDV和PCV2质粒标准品(5.0×10⁸～5.0×10¹copies/μL)模板，加ddH₂O至反应体系总体积为25μL；反应在Bio-Rad S1000 PCR扩增仪进行，反应参数为95℃变性3min；40个循环的95℃变性20s，55℃退火30s，72℃延伸30s；最后72℃5min。取5μL PCR产物，与1μL LoadingBuffer混匀后，2％琼脂糖电泳检测。

常规单重PCR敏感性检测反应体系：10×PCR buffer 2.5μL，25mM MgCl₂ 2.5μL，2.5mΜ dNTP 2μL，Taq DNA Polymerase(上海生工)1.25U，表1中所述的每种腹泻病毒引物，上下游引物终浓度均为0.2μM，10倍系列稀释的每种病毒质粒标准品(5.0×10⁸～5.0×10¹copies/μL)模板，加ddH₂O至反应体系总体积为25μL；反应在Bio-Rad S1000 PCR扩增仪进行，扩增反应参数为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，40个循环，72℃10min。取5μL扩增产物进行1％的琼脂糖电泳检测。

试验结果表明，多重PCR反应对GCR、GAR、TGEV、PEDV和PCV2五种病毒的最低检出量均为50copies，结果参见图2。而单重PCR反应GCR的最低检出量为5×10²copies，GAR为5×10³copies，TGEV为5×10²copies，PEDV为5×10²copies，PCV2为5×10²copies。

由此可见本发明多重PCR检测腹泻病毒的灵敏度高于单重PCR 10-100倍，而且显著高于Zhao等(2013,Journal of Virological Methods)报道的四种腹泻病毒多重PCR检测灵敏度(GAR为1.26×10⁴copies，TGEV为1.74×10⁴copies，PEDV为2.1×10³copies，PCV2为2.17×10³copies)，高约250-40倍。

实施例4、本发明临床检测五种猪腹泻病毒试验

第一步：引物合成

同实施例2中第一步。

第二步：样本采集

血清样本共计78份，其中在浙江地区采集粪便53份，组织病料25份。

第三步：总DNA/RNA小量抽提

根据产品使用说明书，用病毒RNA/DNA抽提试剂盒MiniBEST Viral RNA/DNAExtraction Kit Ver.4.0(TAKARA)从新鲜或冷冻的第二步中采集的样本中提取病毒核酸。

第四步：反转录合成cDNA/DNA：

反转录反应：在无RNase的0.2ml PCR管中依次加入上一步骤制备的总RNA/DNA模板2μl，根据TaKaRa One Step RNA PCR Kit(AMV)(Code No.RR024A)的操作说明书，进行RT-PCR反应，待反转录反应结束后，所得反应液即为cDNA/DNA模板。

第五步：普通PCR检测和多重PCR

1、普通PCR检测：PCR反应体系(总反应体积25μl)：10×PCR buffer 2.5μl，25mMMgCl₂2.5μl，2.5mΜdNTP 2μl，Taq DNA聚合酶1.25U，终浓度均为0.2μM的第一步中合成的五种病毒引物，以第四步中合成cDNA/DNA(约100ng)为模板，加ddH₂O至反应体系总体积为25μL。反应在Bio-Rad S1000 PCR扩增仪进行，反应参数为：95℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，40个循环，72℃10min。取5μL扩增产物进行1％的琼脂糖电泳检测。

2、多重PCR检测体系如下：19μL PCR反应液(即，多重PCR反应混合液)，10μM的TGEV、GAR、GCR、PEDV和PCV2上下游引物混合液1μL，1μL第四步中合成的cDNA/DNA模板，加ddH₂O至反应体系总体积为25μL；反应参数为95℃变性3min；40个循环的95℃变性20s，55℃退火30s，72℃延伸30s；最后72℃5min。取5μL PCR产物，与1μL Loading Buffer混匀后，2％琼脂糖电泳检测。

第六步：检测结果

普通PCR法检测与本发明检测结果如下：普通PCR检测出PEDV 38份，本发明检测出46份；普通PCR检测出PCV2 31份，本发明检测出39份阳性；普通PCR检测出GCR 7份，本发明检测出7份阳性；普通PCR检测出TGEV 3份，本发明检测出4份阳性；普通PCR检测出GAR 1份，本发明检测出3份阳性；其中，本发明检测出PEDV和PCV2混合感染12份，普通PCR检测出PEDV和PCV2混合感染9份；发明检测出PEDV和GCR混合感染2份，普通PCR检测出PEDV和PCV2混合感染1份；发明检测出TGEV和PCV2混合感染1份，普通PCR检测出TGEV和PCV2混合感染0份。

本发明检测效果明显好于单重PCR检测效果，可以减少假阴性的发生，同时一次可以检测出混合感染，减少二次PCR验证及不需要PCR扩增后续处理，大大节约时间和试剂材料成本，提高工作效率。

验证实验：按照本行业所公认的检测精度最好的荧光定量PCR法对上述78份样品进行复查，所得结果完全同本发明。

对比例1、将GCR对应的引物改成如下引物对：

上游引物GCR-F:5’-TGCATCCGTGAAGAGAATGGTGTT，

下游引物GCR-R:5’-TGCATCCGTGAAGAGAATGGTATGC；

其余等同于实施例3。

试验结果为，多重PCR反应对GCR、GAR、TGEV、PEDV和PCV2五种病毒的最低检出量分别为5×10³、5×10²、5×10¹、5×10²、5×10¹和5×10¹copies。

对比例2、将PEDV对应的引物改成如下引物对：

上游引物PEDV-F:5’-CACGGCGACTACTCAGCTG，

下游引物PEDV-R:5’-CTTCTTTAGCAACCCAGAA；

其余等同于实施例3。

试验结果为，多重PCR反应对GCR、GAR、TGEV、PEDV和PCV2五种病毒的最低检出量分别为5×10¹、5×10²、5×10¹、5×10¹、5×10²和5×10¹copies。

对比例3、将PCV2对应的引物改成如下引物对：

上游引物PCV2-F:5’-GAAGCGGACCCCAACCAC，

下游引物PCV2-R:5’-ACCCAGGTGGCCCCACAAT；

其余等同于实施例3。

试验结果为，多重PCR反应对GCR、GAR、TGEV、PEDV和PCV2五种病毒的最低检出量分别为5×10¹、5×10¹、5×10²、5×10¹、5×10¹和5×10²copies。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

<110> 浙江理工大学

<120> 五种猪腹泻病毒多重PCR快速诊断试剂盒及其应用

<160> 15

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物PEDV-F

<400> 1

aacacggcga ctactcagc 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物PEDV-R

<400> 2

gccttcttta gcaacccag 19

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物TGEV-F

<400> 3

gtggtgttag gtgattattt tcc 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物TGEV-R

<400> 4

tatggtttaa cctgcactca cta 23

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物GAR-F

<400> 5

tatgcaatac cagtaggacc ag 22

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物GAR-R

<400> 6

gctctacgta gcgagtatga aatc 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物GCR-F

<400> 7

tgttgcatcc gtgaagagaa tggt 24

<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物GCR-R

<400> 8

gcattagccc ctacgcaagc 20

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物PCV2-F

<400> 9

aagaagcgga ccccaac 17

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<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物PCV2-R

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aggtggcccc acaatga 17

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> PEDV标准品

<400> 11

aacacggcga ctactcagct gtgagtaatc cgagtgcggt tctcacagat agtgagaaag 60

tgcttcattt agtctaaaca gaaactttat ggcttctgtc agctttcagg atcgtggccg 120

caaacgggtg ccattatccc tctatgcccc tcttagggtt actaatgaca aacccctttc 180

taaggtactc gcaaacaacg ctgtacccac taataagggg aataaggacc agcaaattgg 240

atactggaat gagcaaattc gctggcgcat gcgccgtggt gagcgaattg aacaaccttc 300

caattggcat ttctactacc tcggaacagg acctcacgcc gacctccgtt ataggactcg 360

tactgagggt gttttctggg ttgctaaaga aggc 394

<210> 12

<211> 319

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> TGEV标准品

<400> 12

gtggtgttag gtgattattt tcctactgta caaccttggt ttaattgcat tcgcaatgat 60

agtaatgacc tttatgttac actggaaaat cttaaagcat tgtattggga ttatgctaca 120

gaaaatatca cttggaatca cagacaacgg ttaaacgtag tcgttaatgg atacccatac 180

tccatcacag ttacaacaac ccgcaatttt aattctgctg aaggtgctat tatatgcatt 240

tgtaagggct caccacctac taccaccaca gaatctagtt tgacttgcaa ttggggtagt 300

gagtgcaggt taaaccata 319

<210> 13

<211> 242

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> GAR标准品

<400> 13

tatgcaatac cagtaggacc agtatttcca ccgggtatga attggacgga attgattacc 60

aattattcac cttcaagaga agataacttg caacgtgttt ttacagtagc ttccattaga 120

agcatgttga ttaagtgagg actaggctaa ctacctggta tccgatctta accaacatgt 180

agctatgtca agtcaatcag actctacaag taagggtatg atttcatact cgctacgtag 240

ag 242

<210> 14

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GCR标准品

<400> 14

tgttgcatcc gtgaagagaa tggtgttgta aagaagctag agatctaaca aatctctatg 60

tggactacgc accatgtagc atgattcacg aatgggttta gtccatgctt gcgtaggggc 120

aaatgc 126

<210> 15

<211> 508

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCV2标准品

<400> 15

aagaagcgga ccccaaccac acaaaaggtg ggtgttcacg ttgaataatc cttccgagga 60

cgagcgcaag aaaatacggg agcttccaat ctcccttttt gattatttta ttgttggcga 120

ggagggtaat gaggaaggac gaacacccca cctccagggg ttcgctaatt ttgtgaagaa 180

gcaaacattt aataaagtga aatggtattt cggtgcccgc tgccacatcg agaaagcgaa 240

aggaactgat cagcagaata aagaatattg cagtaaagaa ggcaacttac tgattgaatg 300

tggagctcct agatctcagg gacaacggag tgacctgtct actgctgtga gtaccttgct 360

ggagagcggg agtctggtga ccgttgcaga gcagcaccct gtaacgtttg tcagaaattt 420

ccgcgggctg gctgaacttt tgaaagtgag cgggaaaatg cagaagcgtg attggaagac 480

taatgtacac gtcattgtag ggccacct 508

Claims

1.五种猪腹泻病毒多重PCR快速诊断试剂盒，其特征在于：

包括如下5对PCR引物：

2.根据权利要求1所述的五种猪腹泻病毒多重PCR快速诊断试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括：

a)PCR反应液、b)PCR标准品、c)阳性对照品、d)阴性对照品、e)引物。

3.根据权利要求2所述的五种猪腹泻病毒多重PCR快速诊断试剂盒，其特征在于：

所述PCR标准品由以下5种标准品组成：PEDV标准品、TGEV标准品、GAR标准品、GCR标准品、PCV2标准品。

4.根据权利要求2所述的五种猪腹泻病毒多重PCR快速诊断试剂盒，其特征在于：

所述PCR反应液包含PCR反应缓冲液，耐热DNA聚合酶；

所述PCR反应缓冲液含有缓冲液，氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物。

5.根据权利要求2所述的五种猪腹泻病毒多重PCR快速诊断试剂盒，其特征在于：

所述阳性对照品含TGEV、GAR、GCR、PEDV和PCV2五种病毒的阳性质粒混合品；

所述阴性对照品为灭菌后焦碳酸二乙酯处理水。

6.根据权利要求2所述的五种猪腹泻病毒多重PCR快速诊断试剂盒，其特征在于：

每种病毒的特异性引物的上下游引物同管包装。

7.根据权利要求2所述的五种猪腹泻病毒多重PCR快速诊断试剂盒，其特征在于：

所述的试剂盒避光保存于-20℃。

8.如权利要求1～7任一所述的试剂盒在同时特异检测五种猪腹泻病毒感染中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：五种猪腹泻病毒为TGEV、GAR、GCR、PEDV和PCV2。