CN110669870B

CN110669870B - 一种帕利亚姆血清群病毒血清型的实时荧光定量rt-pcr检测引物、探针及检测试剂盒

Info

Publication number: CN110669870B
Application number: CN201910979854.1A
Authority: CN
Inventors: 杨恒; 廖德芳; 李卓然; 李占鸿; 杨振兴; 肖雷; 李华春
Original assignee: Yunnan Animal Science and Veterinary Institute
Current assignee: Yunnan Animal Science and Veterinary Institute
Priority date: 2019-10-15
Filing date: 2019-10-15
Publication date: 2023-08-04
Anticipated expiration: 2039-10-15
Also published as: CN110669870A

Abstract

本发明涉及一种帕利亚姆血清群病毒血清型的实时荧光定量RT‑PCR检测引物、探针及检测试剂盒，属于动物病毒分子生物检测技术领域。该试剂盒包括3对引物；还包括与三对引物对配合使用的三条探针、阴性对照模板、阳性对照模板、标准品模板和PCR扩增试剂。阴性对照模板为RNase‑free水；阳性对照模板分别为CHUV、BCV和DAV灭活病毒；标准品模板为CHUV、BCV和DAV基因节段2单链RNA。采用本发明试剂盒能够检出流行于中国的三种血清型PALV，具有特异、敏感、快速和高效等优势；并且配合利用标准品模板建立的标准曲线能够对临床样本内PALV各血清型毒株的RNA进行定量检测，大大提高了工作效率。

Description

一种帕利亚姆血清群病毒血清型的实时荧光定量RT-PCR检测引物、探针及检测试剂盒

技术领域

本发明属于动物病毒分子生物学检测技术领域，具体涉及应用TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术对中国流行的帕利亚姆血清群病毒的血清型进行快速检测的三对扩增引物、三条TaqMan探针及组装的检测试剂盒。

背景技术

帕利亚姆血清群病毒(Palyam serogroup virus,PALV)是呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)成员，广泛流行于北纬49°至南纬35°之间的热带以及亚热带地区。PALV主要通过雌性吸血昆虫库蠓(Culicoides)对动物的吸血性叮咬传播，感染牛羊等反刍动物，导致妊娠动物的生产异常，主要表现为流产、早产、死产或产无脑畸形胎。1985年至1986年，帕利亚姆病毒疫情在曾在日本爆发，其临床症状为新生牛先天性异常，并伴有水脑畸形和小脑发育不良综合征，给畜牧业生产带来了巨大的经济损失。

PALV基因组由10个双链RNA节段(Seg1～Seg10)构成，共编码7个结构蛋白(VP1～VP7)和4个非结构蛋白(NS1～NS3和NS3A)。PALV具有双层衣壳结构，外层衣壳由Seg-2和Seg-6编码的VP2和VP5构成，主要参与介导宿主细胞表面吸附以及细胞膜通透等生物学过程。Seg-2和Seg-5都具有高度的遗传变异性，其中，由Seg-2编码的VP2是诱导被感染动物产生中和抗体的主要抗原，对PALV血清型具有决定性作用。PALV具有多种不同的血清型，由于历史原因，不同血清型的PALV往往以病毒首次分离地的地名进行命名，在亚洲存在ChuzanVirus(CHUV)、D’Aguilar Virus(DAV)和Bunyip Creek virus(BCV)三种血清型PALV的流行。

CHUV于2012年首次分离于我国云南省的哨兵牛，在随后开展的云南省、广东省和广西壮族自治区PALV监测与病毒分离工作中，除分离获得多株CHUV外，还在我国首次分离获得BCV和DAV，表明多种血清型的PALV流行于我国南方地区。我国内蒙古、新疆、山东、江苏、湖北、广西和云南等省区牛羊体内CHUV抗体的血清阳性率介于6％～48.65％之间，而海南省牛羊的血清阳性率高达57.35％；另外，甘肃省牦牛CHUV抗体的血清阳性率为7.89％。由此可见，PALV已在我国呈现广泛分布的趋势。由于不同血清型PALV之间交叉保护的效果不尽相同，而为了掌握PALV在我国的流行及分布情况，并制定科学的防控策略，所以，非常有必要建立能够快速鉴定PALV血清型的检测方法。

中和试验是血清型鉴定的“金标准”之一，能够对不同血清型的PALV进行检测，但是，进行中和试验不仅需要各血清型参考毒株和标准阳性血清，而且检测周期长达1～2周，费时费力。此外，中和试验需要使用参考毒株，存在病毒扩散等生物安全问题。因此，建立高效、快速和安全的鉴定PALV血清型检测方法和检测试剂盒不仅能够提高工作效率，而且能够为我国PALV的防控提供技术支持和知识储备。

荧光定量PCR技术是美国ABI公司于1996年推出的一种新型核酸定性及定量技术，该技术自发明以来，已经被广泛应用于细菌、病毒等病原体检测，具有特性强、灵敏度高、检测速度快、可进行高通量检测等优势，更为重要的是该技术可以用于临床样本检测，但是目前尚没有能够鉴定PALV血清型的一步法实时荧光定量RT-PCR(one step quantitativereal time RT-PCR,qRT-PCR)检测方法面世。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供三对用于不同血清型PALV核酸检测的qRT-PCR引物和三条特异性TaqMan荧光探针及含有该引物和探针的检测试剂盒，以实现对中国流行的不同血清型PALV的定性和定量检测，从而弥补现有技术的不足。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种帕利亚姆血清群病毒血清型的实时荧光定量RT-PCR检测引物，包括3对引物，分别为CHUV_F和CHUV_R、BCV_F和BCV_R、DAV_F和DAV_R；

CHUV_F：ggagagggtcatccactcaa；(SEQ ID NO.1)

CHUV_R：tcccatcaaacgttccatatgt；(SEQ ID NO.2)

BCV_F：gtacatgattttccgcaactatc；(SEQ ID NO.3)

BCV_R：tcctctattttgatccgaaacata；(SEQ ID NO.4)

DAV_F：ggaggagtgtcgaagagcac；(SEQ ID NO.5)

DAV_R：gtgctgccactctgtytcat。(SEQ ID NO.6)

本发明还提供与上述引物配合使用的探针，具体为：与CHUV_F和CHUV_R引物配合使用的探针CHUV_Probe；与BCV_F和BCV_R引物配合使用的探针BCV_Probe；与DAV_F和DAV_R引物配合使用的探针DAV_Probe；

CHUV_Probe：FAM-tgccccgcaacacctcttctactct-BHQ1；(SEQ ID NO.7)

BCV_Probe：FAM-ctcttcggcttattccattcytcatctc-BHQ1；(SEQ ID NO.8)

DAV_Probe：FAM-tagytgaatataaacgtgcgggycg-BHQ1。(SEQ ID NO.9)

本发明同时提供含有上述引物和/或上述探针的检测试剂盒。

进一步，优选的是，还包括：阴性对照模板、阳性对照模板、标准品模板和PCR扩增试剂；

所述的阴性对照模板为RNase-free水；

所述的阳性对照模板有三个，分别为CHUV、BCV、DAV灭活病毒；

所述的标准品模板有三个，分别为CHUV、BCV、DAV基因节段2(Seg-2)单链RNA(single strand RNA，ssRNA)。

进一步，优选的是，阳性对照模板中CHUV、BCV、DAV灭活病毒的拷贝数分别为2.6×10⁷拷贝/mL、3.1×10⁷拷贝/mL和1.9×10⁷拷贝/mL；标准品模板中CHUV、BCV、DAV的Seg-2ssRNA的拷贝数分别为2.07×10¹⁴拷贝/mL、2.52×10¹⁴拷贝/mL和3.03×10¹⁴拷贝/mL。

进一步，优选的是，所述的PCR扩增试剂包括One Step PrimeScript RT-PCR试剂(共3种)和ROX参比染料(ROX Reference DyeⅡ(50×))。

进一步，优选的是，所述的试剂盒的扩增体系为：

2×One Step RT-PCR BufferⅢ，10.0μL；

TaKaRa Ex Taq HS(5U/μL)，0.4μL；

PrimeScript RT Enzyme MixⅡ，0.4μL；

ROX Reference DyeⅡ(50×)，0.4μL；

上游引物10μmol/L)，0.4μL；

下游引物(10μmol/L)，0.4μL；

探针(10μmol/L)，0.8μL；

模板，1.0μL；

RNase-free水，6.2μL；

总计20.0μL；

所述的上游引物和下游引物所组成的引物对为CHUV_F和CHUV_R、BCV_F和BCV_R、DAV_F和DAV_R三对引物中的任意一对；所述的探针为所采用的上游引物和下游引物组成的引物对所配合使用的TaqMan探针。

进一步，优选的是，所述的试剂盒的扩增程序：

反转录42℃，5min，共1个循环；预变性95℃，10s，共1个循环；变性95℃，5s，退火60℃，34s，共40个循环。

本发明提供的三条用于对不同血清型PALV进行定性和定量检测的TaqMan探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.7至SEQ ID NO.9所示的碱基序列，所述探针的5’端以报告荧光基团标记，3’端以淬灭荧光基团标记，为防止PCR扩增时被延伸，所述探针3’端需要经过磷酸化处理。其中FAM为6-羧基荧光素报告荧光基团，BHQ1为黑洞淬灭荧光基团。

本发明提供用于CHUV、BCV和DAV进行定性和定量检测的三对引物、三条TaqMan探针以及检测试剂盒，通过提取待检样品总RNA，并结合qRT-PCR技术，可达到准确定性和定量待检样品中CHUV、BCV和DAV RNA的目的。本发明所提供的引物、探针和检测试剂盒不仅可用于对CHUV、BCV和DAV的临床检测，还可以用于对被感染动物中CHUV、BCV和DAV RNA的定性及定量分析，将在我国PALV的防控工作中发挥重要作用。

本发明试剂盒提供RNase-free水作为阴性对照模板、已知拷贝数灭活CHUV、BCV和DAV分别作为阳性对照模板。即当qRT-PCR扩增体系以阴性对照模板进行反应时，所述的模板为RNase-free水；当qRT-PCR扩增体系以阳性对照模板进行反应时，所述的模板分别为CHUV、BCV和DAV灭活病毒；当qRT-PCR扩增体系以待检样品模板进行反应时，所述的模板为从疑似PALV感染的动物组织或血液中抽提的病毒RNA。利用本发明提供的引物和探针对阴性对照模板、阳性对照模板以及待检样品模板进行qRT-PCR扩增，扩增后收集每个循环的荧光信号，收集得到的待检样品模板的荧光信号与阳性对照模板的荧光信号进行比较，待检样品模板qRT-PCR扩增出现类似阳性对照模板的扩增曲线者为阳性，未出现扩增曲线者为阴性。

本发明试剂盒提供已知拷贝数CHUV、BCV和DAV Seg-2ssRNA分别作为标准品模板。当qRT-PCR扩增体系以标准品模板进行反应时，所述的模板分别为CHUV、BCV和DAV Seg-2ssRNA；当qRT-PCR扩增体系以待检样品模板进行反应时，所述的模板为从疑似PALV感染的动物组织或血液中抽提的病毒RNA。利用本发明提供的引物和探针对标准品模板以及待检样品模板进行qRT-PCR扩增，扩增后收集每个循环的荧光信号。分别以CHUV、BCV和DAV标准品模板起始拷贝数Log10的对数值为X轴，以Ct值为Y轴进行标准曲线绘制。将待检样品模板的荧光信号与标准曲线进行比较，进而对待检样品模板内的病毒RNA进行定量检测，确定待检样品模板内病毒RNA的拷贝数。

本发明的具体原理是，针对中国流行的CHUV、BCV和DAV Seg-2序列，设计了适用于qRT-PCR检测的三对特异性引物和三条TaqMan探针，使用FAM基团作为探针的报告荧光基团，BHQ1作为探针的淬灭荧光基团；分别构建包含CHUV、BCV和DAV Seg-2全长序列的阳性质粒，利用限制性内切酶将该质粒线性化，并作为模板进行CHUV、BCV和DAV Seg-2ssRNA的体外转录，以纯化的ssRNA为模板优化qRT-PCR的反应体系及反应条件，并建立标准曲线；利用β-丙内酯对已知拷贝数的CHUV、BCV和DAV进行灭活处理，并分别作为阳性对照模板，灭活方法如下：β-丙内酯与病毒培养液的体积比为1:4000，混合均匀后于4℃灭活24h，再于37℃水浴2h水解β-丙内酯；最终构建出适用于检测不同血清型PALV的qRT-PCR引物、探针和检测试剂盒。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

(1)本发明设计了特异性强的CHUV、BCV和DAVqRT-PCR扩增引物和探针，并在此基础上构建一种能够检出流行于中国的三种血清型PALV(即CHUV、BCV和DAV)RNA的qRT-PCR检测试剂盒，该试剂盒具有特异、敏感、快速、高效和安全等优势。

(2)目前，世界范围内仅有Imadeldin报道的针对PALV Seg-3基因设计的血清群特异性巢式PCR检测方法，但是关于鉴定PALV血清型的核酸检测方法尚无报道。本发明首次开发了针对中国PALV毒株的血清型特异性qRT-PCR检测试剂盒。中国存在CHUV、BCV与DAV三种血清型毒株的流行，依靠传统的中和试验进行血清型鉴定不仅需要参考毒株和标准阳性血清，而且耗时较长，一般为1～2周，而本发明开发的检测试剂盒仅需要1小时就能够对PALV血清型进行准确鉴定，大大缩短了病毒鉴定的时间，节省了人力成本。传统的中和试验需要利用参考毒株对血清型进行鉴定，存在病毒扩散等生物安全问题，而本发明开发的检测试剂盒整个操作过程则均不涉及活病毒，提高了生物安全性。

(3)本发明分别以CHUV、BCV和DAV Seg-2ssRNA为标准品模板进行标准曲线的构建(附图1～3)，比利用重组质粒DNA或病毒液提取的核酸作为标准品模板所获得的数据更准确可靠，更重要的是本发明开发的PALV血清型qRT-PCR检测试剂盒能够利用绘制的标准曲线对临床样本内PALV各血清型毒株的RNA进行定量检测；同时，本发明分别以灭活的CHUV、BCV和DAV为阳性对照模板，也更贴近现实中的检测情况。

(4)动物感染PALV早期，其血液内病毒含量较低，而本发明开发的PALV血清型qRT-PCR检测试剂盒具有良好的检测灵敏度，适用于早期临床样本的检测。本发明的灵敏度试验结果显示，对CHUV、BCV和DAV而言，其检出下限分别为2.07×10¹拷贝/μL、2.52×10¹拷贝/μL和3.03×10¹拷贝/μL(附图4～6)，而普通RT-PCR的检出下限一般为10³拷贝/μL，表明本发明对CHUV、BCV和DAV的检测灵敏度比普通RT-PCR分别高48、40和33倍。

(5)本发明特异性强。如附图7所示，本发明的开发的PALV血清型特异性引物和探针只对本血清型PALV毒株产生特异性对数扩增曲线，而未与其它血清型PALV毒株以及其它种属病毒毒株发生交叉反应，包括蓝舌病病毒、非洲马瘟病毒灭活疫苗、流行性出血热病毒以及阿卡斑病毒。

(6)本发明的qRT-PCR特异性引物、探针和检测试剂盒反应速度快，整个扩增过程不到1个小时即可完成；并且，只需要提取病毒RNA，无需进行反转录，操作步骤少且简便，能够有效地避免RNA降解和污染；同时，在qRT-PCR扩增完成后，无需进行琼脂糖凝胶电泳即可直接判断待检样品是否有CHUV、BCV和DAV RNA的存在。

(7)本发明开发的qRT-PCR检测试剂盒与竞争性ELISA(competitive ELISA,C-ELISA)方法相比具有灵敏度高，能够进行早期临床诊断的优点。C-ELISA方法主要对被感染动物产生的抗体进行检测，从PALV感染到产生可检测的抗体一般需要2～3周，但本发明开发的qRT-PCR检测试剂盒能够在抗体产生之前对病毒核酸进行定性和定量检测，因此，应用实例中本发明开发的qRT-PCR检测试剂盒能够比C-ELISA方法检出更多的阳性血液样本。利用PALV抗体C-ELISA试剂盒和本发明开发的qRT-PCR试剂盒同时对120份临床血液样品进行检测，结果显示两者间的符合率为85.71％。

附图说明

图1本发明利用CHUV Seg-2ssRNA建立标准曲线；X轴为标准品模板起始拷贝数Log₁₀的对数值，Y轴为Ct值；

图2本发明利用BCV Seg-2ssRNA建立标准曲线；X轴为标准品模板起始拷贝数Log₁₀的对数值，Y轴为Ct值；

图3本发明利用DAV Seg-2ssRNA建立标准曲线；X轴为标准品模板起始拷贝数Log₁₀的对数值，Y轴为Ct值；

图4本发明开发的PALV的CHUV血清型qRT-PCR灵敏度试验；其中，1～6：标准品模板浓度分别为2.07×10⁶拷贝/μL～2.07×10¹拷贝/μL的CHUV Seg-2ssRNA；7：阴性对照模板；

图5本发明开发的PALV的BCV血清型qRT-PCR灵敏度试验；其中，1～6：标准品模板浓度分别为2.52×10⁶拷贝/μL～2.52×10¹拷贝/μL的BCV Seg-2ssRNA；7：阴性对照模板；

图6本发明开发的PALV的DAV血清型qRT-PCR灵敏度试验；其中，1～6：标准品模板浓度分别为3.03×10⁶拷贝/μL～3.03×10¹拷贝/μL的DAV Seg-2ssRNA；7：阴性对照模板；

图7本发明开发的PALV血清型qRT-PCR试剂盒特异性试验；其中，1：模板为CHUV；2：模板为BCV；3：模板为DAV；其余：模板分别为BTV-1～BTV-24、AHSV、EHDV-1、-2、-5、-6、-7、-8以及AKAV。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

(1)实验材料

PALV CHUV血清型、BCV血清型和DAV血清型毒株(共计19株)记载在2012—2016年中国南方地区帕利亚姆血清群病毒的分离与序列特征分析，杨恒，肖雷，李占鸿，孟锦昕，杨振兴，吕敏娜，林栩慧，廖德芳，牛保生，李华春，《畜牧兽医学报》2018年，第49期，公众可从云南省畜牧兽医科学院获得；CHUV、BCV和DAV Seg-2ssRNA由云南省畜牧兽医科学院按本发明内标准品模板制备方法进行制备；蓝舌病病毒(Bluetongue Virus,BTV)血清型1型(BTV-1)至BTV-24型国际标准参考毒株(BTV-1_RSArrrr/01～BTV-24_RSArrrr/24)、非洲马瘟病毒(African Horse Sickness Virus,AHSV)灭活疫苗、5种血清型流行性出血热病毒(Epizootic Haemorrhagic Disease Virus,EHDV)毒株(EHDV-1、-2、-5、-6、-7和-8)以及阿卡斑病毒(Akabane Virus,AKAV)均由世界动物卫生组织(OIE)参考实验室澳大利亚麦克阿瑟.伊丽莎白农业研究所友情赠送；幼仓鼠肾细胞(BHK-21)来源于云南省畜牧兽医科学院；兔抗CHUV、BCV与DAV标准阳性血清，由云南省畜牧兽医科学院以分离的CHUV、BCV与DAV毒株灭活后经三次注射免疫新西兰大白兔(昆明医科大学动物试验中心)制备得到，标准阳性血清抗体效价分别为1:453、1:320和1:226，同时抽取未免疫新西兰大白兔血液制备标准阴性血清。

(2)试剂与仪器

β-丙内酯(Sigma)；One Step PrimeScript^TM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)试剂盒、PrimeScript^TM One Step RT-PCR Kit Ver.2和DNA Marker购自TaKaRa公司；pLB零背景快速连接试剂盒、质粒小提试剂盒、大肠杆菌DH5α感受态细胞、Universal DNA纯化回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；Xba I限制性内切酶、HiScribe^TM T7 High Yield RNASynthesis Kit和Monarch RNA Cleanup Kit购自NEB公司；EasyPure Vrial DNA/RNA Kit购自Transgen Biotech公司；PALV抗体C-ELISA试剂盒由云南省畜牧兽医科学院提供。

梯度PCR仪Veriti 96Well Thermal Cycler(ABI)；实时荧光定量PCR仪7500Fast(ABI)；电泳仪Power Pac Basic(BIO-RAD)；水平电泳***DYCP-32B(北京六一)；紫外凝胶成像***Gel Doc XR⁺(BIO-RAD)；紫外分光光度计Nano Vue Plus(GE)；干式恒温金属浴OSE-96(天根生化科技有限公司)；台式离心机1-14(Sigma)；多功能酶标仪Versa MaxMicroplate Reader SoftMax Pro5(Molecular Devices)。

(3)设计引物和探针

针对中国流行的CHUV、BCV和DAV Seg-2序列，设计用于qRT-PCR检测CHUV、BCV和DAV的特异性引物和TaqMan探针，分别使用FAM和BHQ1作为报告荧光基团和淬灭荧光基团。引物和探针序列如表1所示。

表1 CHUV、BCV和DAV qRT-PCR检测所用引物和探针序列信息

(4)标准品模板的制备

根据前期获得的中国PALV CHUV血清型、BCV血清型和DAV血清型毒株的全基因组序列，设计三对特异性引物：CHUV-S2-F与CHUV-S2-R(SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11)；BCV-S2-F与BCV-S2-R(SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13)；DAV-S2-F与DAV-S2-R(SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15)，分别用于不同血清型PALV Seg-2片段的扩增(扩增产物大小分别为CHUV767bp、BCV891bp和DAV 828bp)，所述通过PCR反应扩增所得核酸序列如SEQ ID NO.16至SEQID NO.18所示。引物序列如表2所示。

表2扩增CHUV、BCV与DAVSeg-2片段引物信息

使用病毒DNA/RNA抽提试剂盒“EasyPure Vrial DNA/RNA Kit”(TransgenBiotech)抽提我国分离到的CHUV、BCV和DAV RNA，94℃变性3min后，利用上述引物和一步法RT-PCR技术分别扩增我国CHUV、BCV和DAV Seg-2片段，按PrimeScript^TM One Step RT-PCRKit Ver.2(TaKaRa)使用说明进行反应获得CHUV、BCV和DAV Seg-2 DNA片段。

扩增体系：

PrimeScript 1Step Enzyme Mix，2.0μL；

2×1Step Buffer，25.0μL；

上游引物(20μmol/L)，1.0μL；

下游引物(20μmol/L)，1.0μL；

模板RNA，5.0μL；

RNase-free水，16.0μL；

总计50.0μL；

反应条件：反转录50℃，30min，1个循环；预变性94℃，3min，1个循环；[变性94℃，30s，退火55℃，30s，延伸72℃，1min]，35个循环；延伸72℃，5min，1个循环。

将CHUV、BCV和DAV Seg-2 DNA片段按照“pLB零背景快速连接试剂盒”(天根生化科技有限公司)说明书与pLB平末端克隆载体进行连接，转化“大肠杆菌DH5α感受态细胞”(天根生化科技有限公司)，筛选阳性克隆菌进行测序鉴定。

按照“质粒小提试剂盒”(天根生化科技有限公司)说明书提取***目的基因的质粒，并命名为pLB_CHUV_S2、pLB_BCV_S2和pLB_DAV_S2，按照“Xba I”限制性内切酶(NEB)说明书线性化质粒，按照“Universal DNA纯化回收试剂盒”(天根生化科技有限公司)说明书对酶切产物进行胶回收纯化。以纯化后的线性化质粒DNA作为模板，按照“HiScribe^TM T7High Yield RNA Synthesis Kit”(NEB)说明书进行CHUV、BCV和DAV Seg-2ssRNA的体外转录。使用RNA纯化试剂盒“Monarch RNA Cleanup Kit”(NEB)纯化转录产物，测定纯化后核酸浓度，并根据CHUV、BCV和DAV Seg-2ssRNA的分子量计算拷贝数；RNA拷贝数计算公式：

拷贝数(拷贝/mL)＝RNA浓度(g/mL)×6.02×10²³(拷贝/mol)/(340×RNA碱基数)。

(5)优化qRT-PCR反应体系

通过反复试验，优化qRT-PCR的反应体系，确定采用的反应总体系为20μL，所需各组分及相应浓度、相应用量见表3。

CHUV、BCV和DAV Seg-2体外转录ssRNA的浓度分别为2.07×10¹⁴拷贝/mL、2.52×10¹⁴拷贝/mL和3.03×10¹⁴拷贝/mL，利用RNase-free水对CHUV、BCV和DAV Seg-2ssRNA进行稀释，分别以1μL拷贝数分别为2.07×10²拷贝/μL、2.52×10²拷贝/μL和3.03×10²拷贝/μL的CHUV、BCV和DAV Seg-2ssRNA作为模板，分别对引物浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1μmol/L)和探针浓度(0.2、0.4、0.6、0.8μmol/L)进行优化，以20μL反应体系进行qRT-PCR，最佳扩增引物与探针浓度分别为0.2μmol/L与0.4μmol/L。如调整反应体系，应保证体系内引物和探针的终浓度为0.2μmol/L和0.4μmol/L，即能得到较好的扩增曲线。

表3 qRT-PCR检测CHUV、BCV和DAV反应体系

反应体系组分	用量(μL)	终浓度(μmol/L)
			2×One Step RT-PCR BufferⅢ	10.0
TaKaRa Ex Taq HS(5U/μL)	0.4
			PrimeScript RT Enzyme MixⅡ	0.4
CHUV_F/BCV_F/DAV_F Primer(10μmol/L)	0.4/0.4/0.4	0.2/0.2/0.2
			CHUV_R/BCV_R/DAV_R Primer(10μmol/L)	0.4/0.4/0.4	0.2/0.2/0.2
CHUV_Probe/BCV_Probe/DAV_Probe(10μmol/L)	0.8/0.8/0.8	0.4/0.4/0.4
			ROX Reference DyeⅡ(50×)	0.4
模板	1.0
			RNase-Free水	6.2/6.2/6.2
总计	20.0

(6)优化qRT-PCR反应条件

分别以1μL拷贝数为2.07×10²拷贝/μL、2.52×10²拷贝/μL和3.03×10²拷贝/μL的CHUV、BCV和DAV Seg-2ssRNA作为模板，对退火温度(55～60℃)进行优化，确定最佳反应条件为：反转录42℃，5min，1个循环；预变性95℃，10s，1个循环；[变性95℃，5s，退火60℃，34s]，40个循环。

(7)分别利用CHUV、BCV和DAV Seg-2ssRNA建立标准曲线

分别以1μL拷贝数数量级为10⁶拷贝/μL至10²拷贝/μL等5个稀释度的CHUV、BCV和DAV Seg-2ssRNA作为模板进行qRT-PCR反应，建立CHUV、BCV和DAV特异性标准曲线。以标准品模板起始拷贝数Log₁₀的对数值为X轴，以Ct值为Y轴进行回归曲线的绘制，得到CHUV、BCV和DAV血清型特异性qRT-PCR的标准曲线。其斜率分别为-3.70、-3.47和-3.79，截距分别为41.26、42.04和42.90，相关系数分别为0.999、0.997和0.999，回归方程分别为y＝-3.70x+41.26、y＝-3.47x+42.04和y＝-3.79x+42.90(附图1-3)。

表4标准曲线和回归方程

血清型	斜率	截距	回归方程	相关系数
					CHUV	-3.70	41.26	y＝-3.70x+41.26	0.999
BCV	-3.47	42.04	y＝-3.47x+42.04	0.997
					DAV	-3.79	42.90	y＝-3.79x+42.90	0.999

(8)灵敏性分析

利用本发明所涉及的CHUV、BCV和DAV检测引物、探针和检测试剂盒，按优化的反应体系和反应条件，以1μL拷贝数数量级分别为10⁵拷贝/μL、10⁴拷贝/μL、10³拷贝/μL、10²拷贝/μL和10¹拷贝/μL的CHUV、BCV和DAV Seg-2ssRNA标准品模板以及阴性对照模板进行qRT-PCR敏感性分析，本发明涉及的CHUV、BCV和DAV检测引物、探针和试剂盒的检出下限分别为2.07×10¹拷贝/μL、2.52×10¹拷贝/μL和3.03×10¹拷贝/μL(附图4～6)。

(9)特异性分析

利用病毒DNA/RNA抽提试剂盒“EasyPure Vrial DNA/RNA Kit”(TransgenBiotech)抽提BTV-1_RSArrrr/01～BTV-24_RSArrrr/24型、AHSV、EHDV-1、-5、-6、-7、-10、AKAV、CHUV、BCV和DAV RNA，94℃变性3min后立即冰浴。利用本发明所涉及的CHUV、BCV和DAV检测引物、探针和检测试剂盒，按优化的反应体系和反应条件，取1μL上述变性病毒RNA为模板进行qRT-PCR特异性分析，本发明涉及的CHUV、BCV和DAV检测引物、探针和检测试剂盒能够特异性检出CHUV、BCV或DAV，与其他血清型PALV没有交叉反应，并且与BTV、AHSV、EHDV以及AKAV均没有交叉反应(附图7)。

(10)应用实例

A.利用本发明开发的qRT-PCR试剂盒对PALV毒株进行检测

利用本发明所涉及的CHUV、BCV和DAV检测引物、探针和检测试剂盒，按优化的反应体系和反应条件，与中和试验同时对19株PALV进行检测。实施操作过程中，阴性对照模板、阳性对照模板以及待检样品模板在不同的反应孔中同时进行qRT-PCR扩增过程。利用标准阳性血清和标准阴性血清对PALV毒株进行中和试验，方法如下：首先，将待检病毒培养液进行10倍梯度稀释，并分别接种单层BHK-21细胞，采用Karber法对各毒株的TCID₅₀进行测定；然后，在96孔板上利用“固定病毒-稀释血清”方法进行微量中和试验，将CHUV、BCV和DAV标准阳性血清和标准阴性血清分别进行1:20倍稀释，取50μL稀释后的血清与100个TCID₅₀的待检病毒液等体积混合，于37℃培养箱孵育1h后接种单层BHK-21细胞，并逐日观察CPE是否出现；最后，计算血清对病毒的中和指数。

本发明涉及的血清型特异性qRT-PCR试剂盒能够有效地鉴定CHUV、BCV和DAV毒株，Ct值范围在14.85～27.26之间，与中和试验的符合率为100％，具体见表5。

表5利用qRT-PCR试剂盒和中和试验对PALV毒株进行检测的结果

B.利用本发明开发的qRT-PCR试剂盒对PALV感染动物进行动态检测

采集CHUV、BCV和DAV三种血清型毒株感染哨兵动物的血液样本，取每头动物PALV血清抗体C-ELISA检测结果为阳性(血清学转阳)前4周和血清学转阳后4周的抗凝血各50μL，提取总RNA作为待检样品模板，利用本发明开发的qRT-PCR试剂盒进行PALV血清型定量检测，设置多个浓度梯度的CHUV、BCV和DAV Seg-2ssRNA为标准品模板进行扩增反应并获得标准曲线。标准品模板和待检样品模板在不同反应孔中同时进行qRT-PCR扩增反应。

qRT-PCR的反应结果以Ct值形式进行展示，阴性与阳性判定标准为：Ct值＞39.5判定为阴性，Ct值在38.5～39.5判定为可疑，Ct值＜38.5判定为阳性；再根据利用CHUV、BCV和DAV Seg-2ssRNA为标准品模板建立的标准曲线以及待检样品模板的Ct值确定阳性待检样品模板内PALV RNA的拷贝数。C-ELISA方法的结果以抑制率形式进行展示，反应结果阴性与阳性判定标准为：抑制率＞50％为阳性，抑制率＜50％为阴性。本发明开发的PALV血清型qRT-PCR检测试剂盒能够在PALV抗体产生之前检测到较高水平的PALV RNA，而抗体产生之后PALV RNA水平逐渐下降；C-ELISA方法在第4周检测到PALV抗体转阳，在接下来的4周之内，PALV抗体水平一直维持在较高水平。

表6利用qRT-PCR试剂盒和C-ELISA方法对哨兵牛进行跟踪检测的结果

C.利用本发明开发的qRT-PCR试剂盒对临床血液样本进行检测

采集家畜血液样本共计120份，各取50μL血液提取总RNA，同时利用本发明涉及的qRT-PCR引物、探针和检测试剂盒以及C-ELISA方法对CHUV、BCV和DAV进行检测。其中C-ELISA方法检出阳性样本36份，本发明涉及的引物、探针和检测试剂盒共检出阳性样本42份，符合率为85.71％。利用Imadeldin等开发的巢式PCR对上述检测结果中不符合的6份样本进行检测，检测结果均为阳性。由于C-ELISA方法主要对抗体进行检测，从PALV感染到产生可检测的抗体需要2～3周时间，而本发明开发的qRT-PCR检测试剂盒则对病原核酸进行检测，因此，在宿主被感染但还未产生抗体时，本发明开发的qRT-PCR引物、探针和检测试剂盒具有良好的敏感性。利用本发明开发的qRT-PCR检测试剂盒检测为阳性样本中，13份为CHUV阳性，10份为BCV阳性性，11份为DAV阳性，8份为混合感染阳性，说明本发明涉及的qRT-PCR引物、探针和检测试剂盒具有良好的可靠性。

由本发明引物对衍生的引物序列也属于本发明的保护范围。所述衍生序列是指在SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.9的基础上经过一至十个碱基的取代、缺失或添加得到的引物序列。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

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序列表

<110> 云南省畜牧兽医科学院

<120> 一种帕利亚姆血清群病毒血清型的实时荧光定量RT-PCR检测引物、探针及检测试剂盒

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

ggagagggtc atccactcaa 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

tcccatcaaa cgttccatat gt 22

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

gtacatgatt ttccgcaact atc 23

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

tcctctattt tgatccgaaa cata 24

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

ggaggagtgt cgaagagcac 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

gtgctgccac tctgtytcat 20

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

tgccccgcaa cacctcttct actct 25

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

ctcttcggct tattccattc ytcatctc 28

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

tagytgaata taaacgtgcg ggycg 25

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

tatgcgttga accttatgta gg 22

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

catatcgcac aatcctatca tc 22

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

gaaccatttg agagggagag a 21

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

ggatgtggtc caacttcaca 20

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

caatgttgta tggatttgga tcc 23

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

acatgtccat aggaacacct t 21

<210> 16

<211> 767

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

tatgcgttga accttatgta ggctctattt cagtggatcc aacgtatagt gattttacga 60

tgcaaatgag ggtaccctta catcggaaaa agtgtgacgc tttcccaggt gaaaatcttt 120

atgaaagcgc gctacgagga cactttacta ttgatgtgcc aaaacagaga gggttaggag 180

cttcatatag tgttcagact gataacatca tcgaaagtgt agttggcgaa agtggtataa 240

cttctagaca atttcaggaa atttcaaggt tgggagaggg tcatccactc aaaattattt 300

atacaaacat gttgatcgag ttcagagtag aagaggtgtt gcggggcatg caggcatata 360

gctgtaaaac atatggaacg tttgatggga tgatagatga acagagttta acgcgtaagc 420

taacttggcg ggtccggaaa atcatgtcgt atgacgagag agatttatat gatttcaaaa 480

agaaagaaaa agcatttcta gacgaatgga agaggaaaat agagcaacag ggagggataa 540

tcaacagtcc agctaaattt agcacatatg atcaaaatct ttctgtattg aagacacagt 600

ttcaaagtca gtataacttt gacattacaa caggtggtcc attatggcaa gcgtatgtac 660

agactgcagg gggaagaatt aatgtagaag attggttgaa atggatgttc aaagttaaat 720

attgtgggga ttcacgctat tactcggatg ataggattgt gcgatat 767

<210> 17

<211> 891

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

gaaccatttg agagggagag attagaagaa atcgctaatg aagcgagaca cccgtggatg 60

cgaaggatct tatatgtagt tgccgcaata ataatcgaag aaggcggatg tgttacatta 120

gggagaagga aatggtattc caccatactg caagcatgta tcgatctaaa tccaagggtg 180

ctagacgagt gcaggcaaaa gttgaatttc gaggtttcat gcgggttaga ggcaacagac 240

ccaacgacta atttaggttc atattctgag agagatgtat tgagtgttag ttatgtagaa 300

atgcaatggg ttggggatca aatgttagat ggaaacgaga ttgattgtac tgatgttgat 360

gtgcttgaca gtaatgagga gagttttata gccaccgggt ggtcggctgt gagtaaaaat 420

acggatagct atttcaacga tatcaaagta catgattttc cgcaactatc taaatttgaa 480

cagaagggaa gaaatatatt agtgactttg aagagagatg aagaatggaa taagccgaag 540

aggttcagtt cgtatatgtt tcggatcaaa atagaggatt cagttaagat aagaattgga 600

gatcatgatg tttatgaagt gaaaggaagg aaatatccct atccttttag tgaattagga 660

ccacatacac ggacttatat gcttgagagc atgttaaccg ggcaaacacg cattatgacg 720

aaggagccga atgaaaagtg gttatggatt aagaatgaat tccagcagag gggggctcaa 780

catagagtag gaagtgagtg ggagggatgc ggagcgtcag agtggtcgca catctatctg 840

aatgaaatgg ctagattatt gcaatttaca ttaaggagaa tttgtgaagt t 891

<210> 18

<211> 828

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

caatgttgta tggatttgga tccgcaggtt ttaaatgaga taaaaaagaa gttcgatatc 60

gatgtaacgt gtgaaataga gttaaatgat ccaaccagtg atttaggacc atacgcatta 120

agaagttcga ataccgttgc atatgttgag atgaaatggg aaggagattt gtttttggat 180

aataattgga ttgaatgtgg tgatcaagat atcatcgacg aaaataatga gtcattcatt 240

aatattggtt ggggaggagt gtcgaagagc actgatagtt attttaaaga tgtcgaggtt 300

cataacttcc caaagttagc tgaatataaa cgtgcgggcc ggaacataga ggtgatattt 360

gatgaaacag agtggcagca cccaaaaaga ttccaatcat ataaattcag aattaaggta 420

gaggaagtga tgaagttttc ttttcagaca agagaagttt acgaagtatt aggtcaaaaa 480

tatcctcacc cttttggaga gtgggcaccg cacattagaa catatatgac agagaactta 540

tttacgggta tggtcagaga taaaacaccg gaaccaaacg aaaagtggaa gtgggttgaa 600

agtgaatacc gcaaacgtgg gagtttgcga agactagcgc gagattggga tggatgtcat 660

gtaagcaatt ggtccgcatg tgagatgttt gagacaagaa ggcttcttat ttttcttcta 720

agacgtattt cccagccagg accccatcca ttattttcaa aatttgatga tgaagattgg 780

ttggagagta agggatatgg cctgggtaaa ggtgttccta tggacatg 828

Claims

1.一种帕利亚姆血清群病毒血清型的实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，包括3对引物，分别为CHUV_F和CHUV_R、BCV_F和BCV_R、DAV_F和DAV_R；

CHUV_F：ggagagggtcatccactcaa；

CHUV_R：tcccatcaaacgttccatatgt；

BCV_F：gtacatgattttccgcaactatc；

BCV_R：tcctctattttgatccgaaacata；

DAV_F：ggaggagtgtcgaagagcac；

DAV_R：gtgctgccactctgtytcat；

还包括与引物配合使用的探针，具体为：与CHUV_F和CHUV_R引物配合使用的探针CHUV_Probe；与BCV_F和BCV_R引物配合使用的探针BCV_Probe；与DAV_F和DAV_R引物配合使用的探针DAV_Probe；

CHUV_Probe：FAM-tgccccgcaacacctcttctactct-BHQ1；

BCV_Probe：FAM-ctcttcggcttattccattcytcatctc-BHQ1；

DAV_Probe：FAM-tagytgaatataaacgtgcgggycg-BHQ1。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括：阴性对照模板、阳性对照模板、标准品模板和PCR扩增试剂；

所述的阴性对照模板为RNase-free水；

所述的阳性对照模板有三个，分别为CHUV、BCV、DAV灭活病毒；

所述的标准品模板有三个，分别为CHUV、BCV、DAV 基因节段2单链RNA。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，阳性对照模板中CHUV、BCV、DAV灭活病毒的拷贝数分别为2.6×10⁷拷贝/mL、3.1×10⁷拷贝/mL和1.9×10⁷拷贝/mL；标准品模板中CHUV、BCV、DAV的Seg-2 ssRNA的拷贝数分别为2.07×10¹⁴拷贝/mL、2.52×10¹⁴拷贝/mL和3.03×10¹⁴拷贝/mL。

4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR扩增试剂包括One StepPrimeScript RT-PCR试剂和ROX参比染料。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，其扩增体系为：

2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ，10.0 μL；

TaKaRa Ex Taq HS（5 U/μL），0.4 μL；

PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ，0.4 μL；

ROX Reference Dye Ⅱ（50×），0.4 μL；

上游引物（10 μmol/L），0.4 μL；

下游引物（10 μmol/L），0.4 μL；

探针（10 μmol/L），0.8 μL；

模板，1.0 μL；

RNase-free水，6.2 μL；

总计20.0 μL；

所述的上游引物和下游引物所组成的引物对为CHUV_F和CHUV_R、BCV_F和BCV_R、DAV_F和DAV_R三对引物中的任意一种；所述的探针为所采用的上游引物和下游引物组成的引物对所配合使用的探针。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒的扩增程序：

反转录42 ℃，5 min，共1个循环；预变性95 ℃，10 s，共1个循环；变性95 ℃，5s，退火60 ℃，34s，共40个循环。