CN106811551A - 荧光定量PCR检测FAdV‑4型禽腺病毒的引物对、探针、试剂盒及方法 - Google Patents

荧光定量PCR检测FAdV‑4型禽腺病毒的引物对、探针、试剂盒及方法 Download PDF

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蔡骁垚
熊炜
胡建华
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Abstract

本发明公开了一种荧光定量PCR检测FAdV‑4型禽腺病毒的引物对、探针、试剂盒及方法，所述检测方法是以样品DNA为模板，SEQ ID No:1和SEQ ID No:2为引物，SEQ ID No:3为探针，进行荧光定量PCR扩增，采集荧光信号。本发明的荧光定量PCR检测方法可以实现快速、准确、方便快捷、特异性地针对FAdV‑4型禽腺病毒核酸进行检测，灵敏度高、特异性强、重复性好，具有广阔的应用前景。

Description

荧光定量PCR检测FAdV-4型禽腺病毒的引物对、探针、试剂盒 及方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种荧光定量PCR检测FAdV-4型禽腺病毒的引物对、探针、试剂盒及方法。
背景技术
禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV)属腺病毒科，根据抗原性可分为A～E群。从鸡分离的I群FAdV有12个血清型(FAdV 1-12)是鸡、鸭、鹅等禽类常见的传染病病原之一。自2013年以来，国内爆发了一种可引起IBH和HPS的高致病性FAdV感染，主要侵害3～5周龄雏鸡,尤其侵害4周龄。至2015年6月，该病在全国大范围流行，多呈急性发病，且多发生于20～30日龄肉鸡，发病后4～8d为死亡高峰，病程8～15d，死亡率为20％～100％，给养鸡业造成严重的经济损失。牛登云等人于2015年在华东和华北区域采集240份样品，其中分离到30株Ⅰ群禽腺病毒毒株，经hexon基因的遗传进化树表明，分离株分别是I群C和E两基因型，FAdV-4和FAdV-8b型血清型，且4型毒株比8b型毒株的流行性更普遍，9～12月是该病的高发期，华中地区的流行情况更为严重。最近几年，FAdV感染已呈全球流行，可引起非典型病变和亚临床症状，表现为肝炎、再生障碍性贫血、出血、轻度呼吸道疾病和产蛋量下降，严重的造成鸡包涵体肝炎(IBH)、心包炎综合征(HPS)、肌胃糜烂和溃疡(GEU)等。
自从FAdV-4型禽腺病毒爆发以来，还没有一种有效快速诊断的方法。目前检测FAdV-4型禽腺病毒，主要还是SPF鸡胚扩毒和普通PCR传统方法，但是，SPF鸡胚扩毒周期长，操作比较复杂、繁琐，而普通PCR对于病毒含量很低的情况很难检测到，因此急需建立一种操作简便、快速、高灵度检测方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种荧光定量PCR检测FAdV-4型禽腺病毒的引物对、探针、试剂盒及方法，该试剂盒及方法能简便、快速、灵敏、特异地对FAdV-4型禽腺病毒进行检测。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
在本发明的一个方面，提供了一种荧光定量PCR检测FAdV-4型禽腺病毒的引物对，所述引物对具有如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的碱基序列。
在本发明的另一方面，还提供了一种荧光定量PCR检测FAdV-4型禽腺病毒的探针，所述探针具有如SEQ ID No:3所示的碱基序列。
优选的，所述探针的5’结合有FAM，所述探针的3’结合有BHQ1。
在本发明的另一方面，还提供了一种荧光定量PCR检测FAdV-4型禽腺病毒的试剂盒，所述试剂盒包括如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的引物对、以及SEQ ID No:3所示的探针。
优选的，所述试剂盒还包括：含有FAdV-4型禽腺病毒ON1毒株hexon基因第852～1518位核酸序列的阳性重组质粒标准品。
在本发明的另一方面，还提供了一种荧光定量PCR检测FAdV-4型禽腺病毒的方法，包括以下步骤：以样品DNA为模板，SEQ ID No:1和SEQ ID No:2为引物，SEQ ID No:3为探针，进行荧光定量PCR扩增，采集荧光信号。
在其中一些实施例中，所述荧光定量PCR扩增的反应体系为：Premix Ex Taq 10μL、ROX Reference Dye II 0.2μL、DNA模板2μL、SEQ ID No:1引物0.4μL、SEQ ID No:2引物0.4μL、SEQ ID No:3探针0.8μL、加灭菌蒸馏水至20μL。
在其中一些实施例中，所述荧光定量PCR扩增的反应条件为：95℃预变性30sec；95℃变性5sec，60℃退火延伸34sec，40个循环。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明的荧光定量PCR检测方法只需收集能提取到微量DNA的组织即可，收集口腔和泄殖腔棉拭子便可进行检测，适合快速流行学病学调查；
2、本发明的荧光定量PCR检测方法仅需要合成引物对，探针，制成试剂盒，便可方便快捷的检测几千个样本，便捷廉价；
3、本发明的荧光定量RT-PCR检测方法的最低可检测模板浓度为22.8拷贝/μL，比常规的PCR方法高出约100倍，其它常见的禽病病毒均无特异性扩增，没发现交叉反应，批内和批间变异系数均小于1％，说明本发明的检测方法和试剂盒灵敏度高、特异性强、重复性好，具有广阔的应用前景。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明实施例1的PCR扩增结果图；
图2是本发明实施例1的FAdV-4 qPCR融解曲线及的标准曲线图；
图3是本发明实施例2的FAdV-4TaqMan探针qPCR动力学曲线图；
图4是本发明实施例3的FAdV-4Taqman荧光定量PCR检测方法的特异性结果图；
图5是本发明实施例4的攻毒后排毒散点图；
图6是本发明实施例4的HN病毒在鸡体内各组织脏器分布结果图。
具体实施方式
下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(萨姆布鲁克J，拉塞尔D W，著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.分子克隆实验指南，第3版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。
实施例1FAdV-4型禽腺病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立
1.材料
1.1主要试剂和仪器
荧光定量TaqMan Universal PCR Master Mi×购自Applied Biosystems公司；Applied Biosystems 7500型荧光定量仪；RNA反转录试剂盒Prime Script RT kit购自Takara公司；TIANamp病毒RNA提取试剂盒购自QIAGEN公司。
1.2病毒毒株
HN毒株(FAdV)和DAdV-8b从2016.6月份临床分离所得，MD-CIV988、CLV-J、NDV、IBV、MG、H9N2、H5N6由上海兽医研究所提供。
2.方法
2.1标准质粒构建与引物设计
参考GenBank中FAdV-4型禽腺病毒ON1毒株hexon基因(登录号：GU188428)的852～1518bp处设计特异性引物，FAdV-4-F1：5'-CAACTACATCGGGTTCAGGGATAACTTC-3'(SEQ IDNO：4)；FAdV-4-667R：5'CCAGTTTCTGTGGTGGTTGAAGGGGTT-3'(SEQ ID NO：5)，扩增目的片段为667bp。使用基因组DNA提取试剂盒提取分离病毒DNA，扩增、回收纯化PCR产物，并连接到pGEM-Teasy载体，构建pGEM-Teasy-hexon质粒并以其作为标准品。同时，通过NCBI中BLAST比对分析找保守特异区域，在该处设计特异性引物和Taqman探针，序列如下表1。
表1特异性引物和Taqman探针序列
2.2样品核酸的提取
对鸡样品研磨液和DNA病毒进行DNA核酸提取，提取方法参照Ezup柱式病毒DNA抽提试剂盒说明书。对于RNA病毒，提取方法参照病毒RNA提取试剂盒说明书，提取RNA进行反转录合成cDNA：模板为提取的病毒RNA，流感病毒引物为Unit12A，其余RNA病毒反转录引物为Olig(dT)18。
进行反转录合成cDNA，反转录体系(50μL)为RNA模板10μL，引物2μL，5×反转录Buffer 10μL，d NTP(10mmol/L)2μL，Ribonuclease Inhibitor(40U/μL)1μL，反转录酶M-MLV(200U)1μL，DEPC·H2O 24μL。42℃1h，70℃水浴4min，10℃4min。-20℃保存备用。
2.3qPCR反应体系和条件
FAdV-4 TaqMan荧光定量PCR扩增反应体系：2×Premi×E×Taq(Probe qPCR)10μL，50×RO×Reference Dye II 0.2μL，DNA模板2μL，Hexon-1293F、Hexon-1387R引物(10μmol/L)各0.4μL，FAM-probe(10μmol/L)0.8μL，用灭菌ddH2O补至20μL。优化后的反应条件为：95℃30sec；95℃5sec，60℃35sec，并采集荧光40个循环。
3.结果
3.1pGEM-Teasy-hexon的构建及PCR结果
提取FAdV DNA PCR扩增667bp片段(见图1A)，回收产物，连接pGEM-Teasy载体，用蓝白斑筛选，挑阳性菌测序，测序正确的质粒命名为pGEM-Teasy-hexon质粒。构建质粒以10倍稀释，取2.28×109～2.28copies/μL浓度以Hexon-1293F、Hexon-1387R为引物，进行PCR扩增。结果见图1B显示，PCR最低能检测到2.28×103copies/μL。图1A中，M:DNA分子量标准(DL2000)；1：阳性对照；2：Hexon基因。图1B中，1～12分别为pGEM-Teasy-Hexon质粒稀释2.28×109～2.28copies/μL；M:DNA分子量标准(DL2000)。
3.2qPCR标准曲线及融解曲线
将构建pGEM-Teasy-hexon质粒以10倍倍比稀释，取3×107～3×100copies/μL，按上述2.3的方法进行FAdV-4染料法SYBR Green II qPCR，同时进行融解曲线分析，单一峰，无非特异性荧光(见图2A)，说明所用的引物是特异的，无引物二聚体，定量准确。
接下来，根据上述反应条件进行FAdV-4TaqManqPCR，起始模板浓度的对数值和相应的Ct值绘制出标准曲线(图2B)，结果显示：y＝-3.5237×+35.988(R2＝0.9976)，qPCR扩增效率达到92％在90％-120％区间内，这表明qPCR反应有效性以及不同梯度对数值与Ct值之间呈现良好的线性关系，具有良好的直线性。
实施例2灵敏度与重复性检测
以pGEM-Teasy-hexon质粒为模板，按2.28×107～2.28×101copies/μL 10倍稀释，分别进行荧光定量PCR扩增，Ct值大于35视为阴性。绘制不同浓度的标准曲线。结果显示：该方法具有很高的灵敏度，最低可检测模板浓度为22.8copies/μL(图3)，比普通PCR灵敏度高100倍。图3中，1～7对应标准质粒以10倍稀释浓度2.28×107～2.28×101copies/μL。
以pGEM-Teasy-hexon质粒2.28×104和2.28×105copies/μL两个稀释度的DNA作为模板，对这两个稀释度在不同时间段进行3次重复测定，每次对同一模板同时进行3次重复测定及设置3个重复孔，按照实施例1的扩增体系和条件进行实时荧光定量PCR。结果表明：批内和批间变异系数均小于1％，说明建立的FAdV-4荧光定量PCR方法具有较好的重复性，结果稳定可靠(表2)。
表2FAdV-4Taqman荧光定量PCR检测方法的重复性
实施例3FAdV-4型禽腺病毒实时荧光定量PCR方法的特异性实验
收集实验室引起家禽患病的常见病毒MD-CVI988、CLV-J、MG、NDV、IBV、H9N2、H5N6、FAdV-8b病毒，用于检测本发明FAdV-4型禽腺病毒实时荧光定量PCR方法的特异性，体系和扩增反应条件参考以上实施例1进行扩增。结果如图4所示，MD-CVI988、CLV-J、MG、NDV、IBV、H9N2、H5N6、FAdV-8b、无菌双蒸水均无扩增曲线，为阴性，只有FAdV-4扩增阳性曲线。表明该荧光定量PCR方法检测的其他病毒与FAdV-4没有交叉反应，进一步说明该方法具有很高的特异性。
实施例4采用本发明建立的FAdV-4型禽腺病毒的TaqMan实时荧光定量PCR方法进行临床样品检测
实验室临床分离腺病毒HN毒株(KY379035)取病毒稀释成1×106TCID 50/100μL，经胸肌注射5只3周龄SPF鸡。采集攻毒后3天的口腔和泄殖腔棉拭子，加1mL无菌PBS震荡混匀12000rpm 2min，取其200uL上清液参照DNA试剂盒提取DNA，以及放血采集3只鸡组织脏器，称重加PBS使其浓度为0.33g/mL，取100uL研磨液提取DNA。利用建立的FAdV-4TaqManqPCR方法，检测HN毒株在鸡体内增殖以及排毒情况。
结果：HN毒株攻毒感染SPF鸡，感染后第2d，口腔和泄殖腔已出现排毒(见图5)，这表明病毒已侵染SPF鸡的消化道***。同时对采集鸡各组织脏器进行病毒含量的检测发现，病毒在鸡各组织脏器均已经能复制增殖，其中肝脏含量最高，其次是十二指肠、空肠和盲肠，大脑含量最低(见图6)。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序 列 表
<110> 中国农业科学院上海兽医研究所
<120> 荧光定量PCR检测FAdV-4型禽腺病毒的引物对、探针、试剂盒及方法
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccagaggcgc aactttat 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgtactcgt aggtggtagg 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgcccgaccg ttacaagttt agca 24
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
caactacatc gggttcaggg ataacttc 28
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ccagtttctg tggtggttga aggggtt 27

Claims (8)

1.一种荧光定量PCR检测FAdV-4型禽腺病毒的引物对，其特征在于，所述引物对具有如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的碱基序列。
2.一种荧光定量PCR检测FAdV-4型禽腺病毒的探针，其特征在于，所述探针具有如SEQID No:3所示的碱基序列。
3.根据权利要求2所述的荧光定量PCR检测FAdV-4型禽腺病毒的探针，其特征在于，所述探针的5’结合有FAM，所述探针的3’结合有BHQ1。
4.一种荧光定量PCR检测FAdV-4型禽腺病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物对、以及权利要求2或3所述的探针。
5.根据权利要求4所述的荧光定量PCR检测FAdV-4型禽腺病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：含有FAdV-4型禽腺病毒ON1毒株hexon基因第852～1518位核酸序列的阳性重组质粒标准品。
6.一种荧光定量PCR检测FAdV-4型禽腺病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：以样品DNA为模板，SEQ ID No:1和SEQ ID No:2为引物，SEQ ID No:3为探针，进行荧光定量PCR扩增，采集荧光信号。
7.根据权利要求6所述的荧光定量PCR检测FAdV-4型禽腺病毒的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR扩增的反应体系为：Premix Ex Taq 10μL、ROX Reference Dye II 0.2μL、DNA模板2μL、SEQ ID No:1引物0.4μL、SEQ ID No:2引物0.4μL、SEQ ID No:3探针0.8μL、加灭菌蒸馏水至20μL。
8.根据权利要求6所述的荧光定量PCR检测FAdV-4型禽腺病毒的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR扩增的反应条件为：95℃预变性30sec；95℃变性5sec，60℃退火延伸34sec，40个循环。
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