CN114438265A - 同时检测猪德尔塔冠状病毒、呼肠孤病毒和猪嵴病毒的核酸组合物、试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

同时检测猪德尔塔冠状病毒、呼肠孤病毒和猪嵴病毒的核酸组合物、试剂盒及检测方法。本发明属于猪病原检测技术领域，具体涉及同时检测猪德尔塔冠状病毒、呼肠孤病毒和猪嵴病毒的核酸组合物、试剂盒及检测方法。本发明提供的所述核酸组合物能够特异性识别猪德尔塔冠状病毒、呼肠孤病毒和猪嵴病毒，利用所述核酸组合物建立的三重荧光定量PCR检测方法，具有快速、方便、高效、灵敏度高的特点，可广泛应用于猪腹泻病流行病学调查、实验室鉴别检测和相关科学研究，具体很高的实际应用价值。

Description

同时检测猪德尔塔冠状病毒、呼肠孤病毒和猪嵴病毒的核酸 组合物、试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于猪病原检测技术领域，具体涉及同时检测猪德尔塔冠状病毒、呼肠孤病毒和猪嵴病毒的核酸组合物、试剂盒及检测方法。
背景技术
近年来，猪腹泻病的流行越来越广，且疾病的复杂程度日益增加，给我国畜牧业造成了严重的经济损失。猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemic diarrhea virus，PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissiblegastroenteritis virus，TGEV)和猪轮状病毒(Porcinerotavirus，PoRV)是引起猪腹泻的三种重要的病毒性病原。近年来不断报道有新的腹泻病原出现，导致猪腹泻病原复杂化，鉴别检测困难。
猪德尔塔冠状病毒(Porcine delta coronavirus，PDCoV)又称猪丁型冠状病毒，属冠状病毒科德尔塔冠状病毒属，是一种有囊膜的单股正链RNA病毒。该病毒可感染不同日龄的猪，感染率约为20％～30％，主要引起呕吐、腹泻、脱水等临床症状。哺乳仔猪对其易感性较强，临床症状更加严重，感染后病死率高达50％～100％。
哺乳动物呼肠孤病毒(Mammalian orthoreovirus，MRV)是广泛传播并感染几乎所有哺乳动物，且通常具有低致病性。包括人类、水貂、猪、牛、蝙蝠和狗等，具有人畜共患性。2005年曾智勇等(曾智勇,郭万柱,徐志文,宋振辉,殷华平,王新,王小玉.仔猪腹泻粪样中猪呼肠孤病毒的分离鉴定,畜牧兽医学报2007,38(6):574～580)从疑似“冬痢”的仔猪腹湾粪样中检出呼肠孤病毒，预示猪呼肠孤病毒可能与该类疾病有关，对猪具有一定的致病性。因此，快速检测该病原能为该病的早期防控提供科学依据。
猪嵴病毒(Porcine kobuvirus，PKV)是小RNA病毒科嵴病毒属成员，该病毒主要危害3周龄以下的仔猪，可引起仔猪胃肠炎，出现严重腹泻，甚至死亡。国内从2009年开始PKV阳性检出率呈逐年递增的趋势。PKV与其他病毒混合感染现象也较普遍，同时还会加重病情，其感染也不仅仅局限于肠道，从而导致所谓的“疫苗使用效果不佳”。
目前检测猪腹泻病病原的方法有病毒分离与鉴定、血清学方法及分子生物学方法等，猪腹泻病引起的症状均以腹泻为特征，仅依据临床症状和流行病学很难进行鉴别诊断，因此必须依靠实验室检测技术。其中病毒分离、血清学技术等常用诊断技术均存在操作复杂，难度较大等问题，并且很难在疾病早期得出诊断结论；而血清学方法准确率较低，单一PCR方法检测效率低。因此，针对猪腹泻病病原建立一种敏感、快速、高效的能同时检测猪德尔塔冠状病毒、哺乳动物呼肠孤病毒和猪嵴病毒三种病原的方法是猪腹泻病病原快速鉴别与早期防控的关键。
发明内容
本发明的目的在于提供同时检测猪德尔塔冠状病毒、呼肠孤病毒和猪嵴病毒的核酸组合物、试剂盒及检测方法，采用本发明提供的核酸组合物可以同时快速、方便、高效地检测猪德尔塔冠状病毒、呼肠孤病毒和猪嵴病毒这三种病原，提高检测灵敏度。
本发明提供了一种同时检测猪德尔塔冠状病毒、呼肠孤病毒和猪嵴病毒的核酸组合物，包括针对猪德尔塔冠状病毒的正向引物PDCoV-F、反向引物PDCoV-R和探针PDCoV-P，针对呼肠孤病毒的正向引物PKV-F、反向引物PKV-R和探针PKV-P以及针对猪嵴病毒的正向引物MRV-R、反向引物MRV-R和探针MRV-P；
所述针对猪德尔塔冠状病毒的正向引物序列如SEQ ID NO.1所示；
所述针对猪德尔塔冠状病毒的反向引物序列如SEQ ID NO.2所示；
所述针对猪德尔塔冠状病毒的探针序列如SEQ ID NO.3所示；
所述针对呼肠孤病毒的正向引物序列如SEQ ID NO.4所示；
所述针对呼肠孤病毒的反向引物序列如SEQ ID NO.5所示；
所述针对呼肠孤病毒的探针序列如SEQ ID NO.6所示；
所述针对猪嵴病毒的正向引物序列如SEQ ID NO.7所示；
所述针对猪嵴病毒的反向引物序列如SEQ ID NO.8所示；
所述针对猪嵴病毒的探针序列如SEQ ID NO.9所示。
优选的，所述针对猪德尔塔冠状病毒的探针序列、针对呼肠孤病毒的探针序列以及针对猪嵴病毒的探针序列的5’端均采用荧光报告基团修饰，3’端均采用荧光淬灭基团修饰。
优选的，所述针对猪德尔塔冠状病毒的探针序列的5’端、针对呼肠孤病毒的探针序列的5’端以及针对猪嵴病毒的探针序列的5’端分别采用不同荧光波长的报告基团修饰。
本发明还提供了一种同时检测猪德尔塔冠状病毒、呼肠孤病毒和猪嵴病毒的试剂盒，包括上述技术方案所述的核酸组合物。
本发明还提供了上述技术方案所述的核酸组合物或试剂盒在制备同时检测猪德尔塔冠状病毒、呼肠孤病毒和猪嵴病毒的产品中的应用。
本发明还提供了一种同时检测猪德尔塔冠状病毒、呼肠孤病毒和猪嵴病毒的方法，包括以下步骤：
提取检测样本的总RNA，反转录得cDNA；
以所述cDNA模板，利用上述技术方案所述的核酸组合物进行荧光PCR反应，并收集荧光信号及Ct值，当Ct值大于36时判定为阴性。
优选的，所述荧光PCR反应的反应体系以25μL计包括：12.5μL 2×Premix Ex Taq，10μmol/L PDCoV-F、PDCoV-R、PKV-F、PKV-R、MRV-F和MRV-R各0.5μL～1.4μL，10μmol/LPDCoV-P、PKV-P和MRV-PcDNA各0.3μL～0.8μL，4μL cDNA和余量的水。
优选的，所述荧光PCR反应的的程序为：第一阶段95℃预变性3min；第二阶段94℃变性10s，55.8℃延伸30s，共40个循环，在延伸阶段收集荧光信号。
本发明提供了同时检测猪德尔塔冠状病毒、呼肠孤病毒和猪嵴病毒的核酸组合物，包括针对猪德尔塔冠状病毒的正向引物PDCoV-F、反向引物PDCoV-R和探针PDCoV-P，针对呼肠孤病毒的正向引物PKV-F、反向引物PKV-R和探针PKV-P以及针对猪嵴病毒的正向引物MRV-R、反向引物MRV-R和探针MRV-P。本发明根据GenBank中登录的猪德尔塔冠状病毒、呼肠孤病毒和猪嵴病毒的保守基因序列，并兼顾不同毒株间的差异，选择保守的核苷酸序列作为扩增区域，设计了三对特异性引物和探针。本发明三对特异性的引物和探针能够同时快速、方便、高效地特异性识别并检测猪德尔塔冠状病毒、呼肠孤病毒和猪嵴病毒。
本发明还建立了德尔塔冠状病毒、猪嵴病毒和哺乳动物呼肠孤病毒的三重荧光定量PCR检测方法，具有快速、方便、高效、灵敏度高的特点，可广泛应用于猪腹泻病流行病学调查、实验室鉴别检测和相关科学研究，具体很高的实际应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为利用本发明三重荧光定量PCR检测方法检测猪德尔塔冠状病毒标准品的扩增结果；
图2为利用本发明三重荧光定量PCR检测方法检测猪嵴病毒标准品的扩增结果；
图3为利用本发明三重荧光定量PCR检测方法检测哺乳动物呼肠孤病毒标准品的扩增结果；
图4为利用本发明三重荧光定量PCR检测方法检测猪德尔塔冠状病毒的标准曲线；
图5为利用本发明三重荧光定量PCR检测方法检测猪嵴病毒的标准曲线；
图6为利用本发明三重荧光定量PCR检测方法检测哺乳动物呼肠孤病毒的标准曲线；
图7为猪德尔塔冠状病毒、猪嵴病毒和哺乳动物呼肠孤病毒的三重荧光定量PCR检测方法的特异性试验结果；
图8为利用本发明三重荧光定量PCR检测方法检测猪德尔塔冠状病毒标准品的敏感性试验结果；
图9为利用本发明三重荧光定量PCR检测方法检测猪嵴病毒标准品的敏感性试验结果；
图10为利用本发明三重荧光定量PCR检测方法哺乳动物呼肠孤病毒标准品的敏感性试验结果；
图11为利用本发明三重荧光定量PCR检测方法检测猪德尔塔冠状病毒标准品的重复性试验结果；
图12为利用本发明三重荧光定量PCR检测方法检测猪嵴病毒标准品的重复性试验结果；
图13为利用本发明三重荧光定量PCR检测方法哺乳动物呼肠孤病毒标准品的重复性试验结果。
具体实施方式
本发明提供了一种同时检测猪德尔塔冠状病毒、呼肠孤病毒和猪嵴病毒的核酸组合物，包括针对猪德尔塔冠状病毒的正向引物PDCoV-F、反向引物PDCoV-R和探针PDCoV-P，针对呼肠孤病毒的正向引物PKV-F、反向引物PKV-R和探针PKV-P以及针对猪嵴病毒的正向引物MRV-R、反向引物MRV-R和探针MRV-P；
所述针对猪德尔塔冠状病毒的正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：5’-GTTCTGATATACCAGGGTG-3’；
所述针对猪德尔塔冠状病毒的反向引物序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：5’-ATATACTTATACAGGCGAGC-3’；
所述针对猪德尔塔冠状病毒的探针序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：5’-GCTTCAAACGCTGGACTTCACACCATAACC-3’；
所述针对呼肠孤病毒的正向引物序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：5’-CCAAACTCCTACCCGACA-3’；
所述针对呼肠孤病毒的反向引物序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：5’-TCTACTCATGGGCGAGCC-3’；
所述针对呼肠孤病毒的探针序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：5’-CGTGTCCGCGTGCTGAGTAATGGGAT-3’；
所述针对猪嵴病毒的正向引物序列如SEQ ID NO.7所示，具体为：5’-TGCAGAATCCGGAGTTAAAGT-3’；
所述针对猪嵴病毒的反向引物序列如SEQ ID NO.8所示，具体为：5’-TCGAATAATGACGGAGGGTT-3’；
所述针对猪嵴病毒的探针序列如SEQ ID NO.9所示，具体为：5’-GTAGTGAGTGGGAGAARTATGGAGCGGGDA-3’。本发明SEQ ID NO.9所示序列中D为简并碱基，具体可以为G或A或T。
在本发明中，所述针对猪德尔塔冠状病毒的探针序列、针对呼肠孤病毒的探针序列以及针对猪嵴病毒的探针序列的5’端优选均采用荧光报告基团修饰，3’端均采用荧光淬灭基团修饰；所述针对猪德尔塔冠状病毒的探针序列的5’端、针对呼肠孤病毒的探针序列的5’端以及针对猪嵴病毒的探针序列的5’端进一步优选分别采用不同荧光波长的报告基团修饰。本发明所述针对猪德尔塔冠状病毒的探针序列的5’端优选采用红色荧光基团修饰，针对呼肠孤病毒的探针序列的5’端优选采用绿色荧光基团修饰，针对猪嵴病毒的探针序列的5’端优选采用紫色荧光基团修饰。
本发明所述呼肠孤病毒优选为哺乳动物呼肠孤病毒。
本发明根据GenBank中登录的猪德尔塔冠状病毒、呼肠孤病毒和猪嵴病毒的保守基因序列(猪德尔塔冠状病毒登录号KY065120.1；呼肠孤病毒登录号KC462151.1和猪嵴病毒登录号MT125685)，并兼顾不同毒株间的差异，选择保守的核苷酸序列作为扩增区域，设计了三对特异性引物和探针。本发明三对特异性的引物和探针能够特异性识别猪德尔塔冠状病毒、呼肠孤病毒和猪嵴病毒，能够同时快速、方便、高效地检测这三种病原。猪德尔塔冠状病毒、猪嵴病毒和哺乳动物呼肠孤病毒的三重荧光定量PCR检测方法的敏感性试验结果表明，该引物应用于德尔塔冠状病毒、猪嵴病毒和哺乳动物呼肠孤病毒病原的PCR检测，其最低检测限分别为2.7×101copies·μL-1、1.22×101copies·μL-1和1.26×102copies·μL-1，具有高敏感性。
本发明还提供了一种同时检测猪德尔塔冠状病毒、呼肠孤病毒和猪嵴病毒的试剂盒，包括上述技术方案所述的核酸组合物。
本发明对所述试剂盒中含有的其余成分不做严格要求，检测猪德尔塔冠状病毒、呼肠孤病毒和猪嵴病毒的可用试剂都属于本发明的保护范围，例如酶混合物和PCR反应试剂等。本发明所述酶混合物优选包括DNA聚合酶和逆转录酶；所述PCR反应试剂包括PCR缓冲液、dNTPs和阳离子。
本发明还提供了上述技术方案所述的核酸组合物或试剂盒在制备同时检测猪德尔塔冠状病毒、呼肠孤病毒和猪嵴病毒的产品中的应用。
本发明还提供一种同时检测猪德尔塔冠状病毒、呼肠孤病毒和猪嵴病毒的方法，包括以下步骤：
提取检测样本的总RNA，反转录得cDNA；
以所述cDNA模板，利用上述技术方案所述的核酸组合物进行荧光PCR反应，并收集荧光信号及Ct值，当Ct值大于36时判定为阴性。
本发明所述总RNA优选提取自待检测对象的粪便和/或肠道，本发明对所述总RNA的提取方法并没有特殊限定，优选利用试剂盒进行提取。本发明对核酸提取试剂盒的具体来源不做严格要求，可常规购买获得，例如瑞基海洋生物科技股份有限公司生产的DNA/RNA萃取试剂盒。
本发明对提取得到的总RNA进行反转录前，优选还包括纯化，更优选的包括去除总RNA中的DNA；所述去除总RNA中的DNA的反应体系以10μL计，优选包括：5×gDNA EraserBuffer 2.0μL，gDNA Eraser 1.0μL，总RNA 5.0μL，RNase Free dH2O补足至10μL；反应过程：42℃酶解2min。本发明对所述反应体系中使用的试剂来源不做严格要求，常规购买即可。本发明具体实施过程中，使用的试剂购买自宝生物工程(大连)有限公司。
本发明对纯化后的总RNA进行反转录得cDNA，所述反转录使用的反应体系以20μL计，优选包括：
Figure BDA0003544374530000071
Buffer 4.0μL，PrimeScriptRT Enzyme Mix 1.0μL，RTPrimerMix Total RNA 1.0μL，去除DNA的总RNA 10.0μL，RNase Free ddH2O补足至20.0μL；反应过程优选包括：37℃延伸15min，85℃逆转录5sec，4℃保存。本发明对所述反应体系中使用的试剂来源不做严格要求，常规购买即可。本发明具体实施过程中，使用的试剂购买自宝生物工程(大连)有限公司。
得cDNA后，本发明优选以所述cDNA为模板，利用上述技术方案所述的核酸组合物配制反应体系进行荧光PCR反应，并收集荧光信号及Ct值，当Ct值大于36时判定为阴性。本发明所述反应体系以25μL计，优选包括：12.5μL2×Premix Ex Taq，10μmol/LPDCoV-F、PDCoV-R、PKV-F、PKV-R、MRV-F和MRV-R各0.5μL～1.4μL，10μmol/L PDCoV-P、PKV-P和MRV-P各0.3μL～0.8μL，4μL cDNA和余量的水。本发明所述PDCoV-F、PDCoV-R、PKV-F、PKV-R、MRV-F和MRV-R的体积分别优选为0.8～1.2μL，进一步优选为1.2μL；所述PDCoV-P、PKV-P和MRV-P的体积分别优选为0.4μL～0.6μL，进一步优选为0.45μL。本发明在配制反应体系的过程中，优选将2×Premix Ex Taq，PDCoV-F，PDCoV-R，PKV-F，PKV-R，MRV-F，MRV-R，PDCoV-P，PKV-P，MRV-P和水混合得到预混液后再与cDNA混合得到所述PCR反应体系。本发明对所述反应体系中使用的试剂来源不做严格要求，常规购买即可。本发明具体实施过程中，使用的试剂购买自宝生物工程(大连)有限公司生产。本发明在具体实施过程中，根据需要调整反应体系的体积，只需保证所述预混液和cDNA的体积比为21：4即可。
本发明对所述cDNA的浓度没有严格要求，保证所述cDNA的OD260/OD280比值为1.8～2.0即可。本发明在具体实施过程中，优选按照上述浓度和体积，将2×Premix Ex Taq、PDCoV-F、PDCoV-R、PKV-F、PKV-R、MRV-F、MRV-R、PDCoV-P、PKV-P和MRV-P混合后再与cDNA混合，500r/min～1000r/min离心30s后，进行荧光PCR反应。本发明所述荧光PCR反应优选在Gentier 96E全自动医用PCR仪(西安天隆科技有限公司)中进行。
本发明所述荧光PCR反应的程序优选为：
第一阶段：95℃预变性3min；
第二阶段：94℃变性10s，55.8℃退火30s，共40个循环。
本发明在所述荧光PCR反应完成后，收集延伸阶段荧光信号及Ct值，根据Ct值的大小判断是否含有PDCoV、MRV及PKV。当所述Ct值大于36时判定为阴性，即不含有PDCoV、MRV及PKV。
只要待检测样品中含有猪德尔塔冠状病毒、呼肠孤病毒和猪嵴病毒这3种病毒的任何一种病毒，均可以采用本发明提供的同时检测猪德尔塔冠状病毒、呼肠孤病毒和猪嵴病毒的方法进行检测，不能理解为只能检测同时含有这3种病毒的样品。本发明所述方法在提高检测的灵敏度的同时减少了常规PCR的工作量，从而提高工作效率。为猪腹泻病的科学研究、实验室检测和临床防控提供有效的技术手段。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、三重荧光定量PCR检测方法反应体系及反应程序
(1)引物及探针设计
从NCBI分别下载PDCoV、PKV及MRV的基因组序列，经MEGA7(version7.0.21)进行序列分析后，使用引物设计软件NDASTAR Lasergene的PrimerSelect(version 7.1.0(44))在保守区进行引物及探针的设计，并委托苏州金唯智生物科技有限公司合成，引物及探针的核苷酸序列如下表1。
表1引物及探针的核苷酸序列
Figure BDA0003544374530000081
(2)质粒标准品的制备
根据已经分析PDCoV、PKV及MRV基因组序列的信息和表1引物及探针的设计位置，委托苏州金唯智生物科技有限公司分别合成质粒pPDCoV-M、pPKV，和pMRV。计算其拷贝数，将这三个质粒标准品用ddH2O进行梯度稀释，得到七个浓度(分别为2.7×107copies·μL-1至2.7×101copies·μL-1、1.22×107copies·μL-1至1.22×101copies·μL-1和1.26×107copies·μL-1至1.26×101copies·μL-1)的重组质粒标准品，储存在-20℃中备用。
(3)三重荧光定量PCR检测方法反应退火的温度试验
应用制备的质粒作为模板进行荧光定量PCR试验，进行反应退火温度的摸索，所用的三个质粒浓度分别为2.7×105copies·μL-1、1.22×105copies·μL-1和1.26×105copies·μL-1。
该反应体系使用的2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)为宝生物工程(大连)有限公司生产。
应用荧光PCR方法进行，在反应混合物配制区进行反应液的配制。
反应体系配制建议按n+1个反应进行配制。样品检测反应体系为25.0μL：2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.5μL，PDCoV-F(10μmol/L)、PDCoV-R(10μmol/L)、PKV-F(10μmol/L)、PKV-R(10μmol/L)、MRV-F(10μmol/L)、MRV-R(10μmol/L)分别是1.2μL，PDCoV-P(10μmol/L)、PKV-P(10μmol/L)、MRV-P(10μmol/L)分别是0.45μL。
将以上配制的荧光PCR反应液充分混匀，按照每管21.0μL分装于透明荧光PCR管内，按照加样顺序做好标识，转移至核酸提取区进行加样。
在每个荧光PCR反应管内加入4.0μL的质粒，500r/min～1000r/min离心30s。转移至检测区，分别将退火温度设置为54.0℃、55.8℃、58.0℃、60.5℃和62.0℃，下面以55.8℃为例说明具体的反应程序。
样品检测的反应程序：95℃预变性3min，随后进行二步法，94℃变性10s，55.8℃延伸30s，40个循环，在延伸阶段收集荧光信号。PCR仪荧光通道设置为：通道1：FAM，通道2：CY5，通道3：ROX。反应在Gentier 96E全自动医用PCR仪(西安天隆科技有限公司)中进行，不同退火温度对应的检测结果如下表2。
表2不同退火温度对应的检测结果
Figure BDA0003544374530000091
Figure BDA0003544374530000101
根据表2可以看出，随着退火温度的逐渐升高，MRV的Ct值会有明显的变化，总和考量同时检测PDCoV、PKV和MRV的检测效果，确定55.8℃为最佳退火温度。
(4)三重荧光定量PCR检测方法反应体系的试验
应用制备的质粒作为模板进行最佳反应体系的摸索。
该反应体系使用的2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)为宝生物工程(大连)有限公司生产。
应用荧光PCR方法进行，在反应混合物配制区进行反应液的配制。
反应体系配制建议按n+1个反应进行配制。
样品检测反应体系为25.0μL：2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.5μL，PDCoV-F(10μmol/L)、PDCoV-R(10μmol/L)、PKV-F(10μmol/L)、PKV-R(10μmol/L)、MRV-F(10μmol/L)、MRV-R(10μmol/L)的体积范围分别是0.5μL～1.4μL，PDCoV-P(10μmol/L)、PKV-P(10μmol/L)和MRV-P(10μmol/L)体积范围分别是0.3μL-0.8μL。ddH2O补足至21.0μL(引物和探针的具体使用情况如下表3)。
将以上配制的荧光PCR反应液充分混匀，按照每管21.0μL分装于透明荧光PCR管内，按照加样顺序做好标识，转移至核酸提取区进行加样。
在每个荧光PCR反应管内加入4.0μL的质粒，500r/min～1000r/min离心30s。转移至检测区。
反应程序：95℃预变性3min，随后进行二步法，94℃变性10s，55.8℃延伸30s，40个循环，在延伸阶段收集荧光信号。PCR仪荧光通道设置为：通道1：FAM，通道2：CY5，通道3：ROX。反应在Gentier 96E全自动医用PCR仪(西安天隆科技有限公司)中进行，每组设计两个重复，不同反应体系对应的平均检测结果如表3。
表3不同反应体系对应的检测结果
Figure BDA0003544374530000102
Figure BDA0003544374530000111
根据表3中Ct值的综合分析结果，可确定PDCoV-F(10μmol/L)、PDCoV-R(10μmol/L)、PKV-F(10μmol/L)、PKV-R(10μmol/L)、MRV-F(10μmol/L)、MRV-R(10μmol/L)分别是1.2μL，PDCoV-P(10μmol/L)、PKV-P(10μmol/L)、MRV-P(10μmol/L)分别是0.45μL的反应体系下，反应结果最佳。
(5)标准曲线的建立
应用三重荧光定量PCR反应对每个病原的六个浓度标准品质粒(PDCoV、PKV和MRV的质粒标准品(浓度分别为2.7×107copies·μL-1至2.7×102copies·μL-1、1.22×107copies·μL-1至1.22×101copies·μL-1和1.26×107copies·μL-1至1.26×102copies·μL-1))进行扩增。
该反应体系使用的2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)为宝生物工程(大连)有限公司生产，在反应混合物配制区进行反应液的配制，反应体系同步骤(4)，其中PDCoV-F(10μmol/L)、PDCoV-R(10μmol/L)、PKV-F(10μmol/L)、PKV-R(10μmol/L)、MRV-F(10μmol/L)、MRV-R(10μmol/L)分别是1.2μL，PDCoV-P(10μmol/L)、PKV-P(10μmol/L)、MRV-P(10μmol/L)分别是0.45μL，按照步骤(4)的程序进行扩增，退火温度为55.8℃，结果如图1～6和表4。
表4标准曲线扩增效率结果统计
Figure BDA0003544374530000112
根据图1～6和表4可知，三重荧光PCR方法已经成功建立。
(6)特异性试验
应用本发明的三重荧光定量PCR方法进行特异性试验，以PRRSV、CSFV、PCV2、PRV、PEDV、TGEV、RV、PDCoV、PKV、MRV等阳性样品的核酸为毒株进行特异性检测，具体使用的毒株如下表5。
表5检测用毒株种类和来源
Figure BDA0003544374530000121
注：天津市农业科学院畜牧兽医研究所畜禽疫病防控团队实验室地址：天津市西青区津静公路17公里处天津市农业科学院畜牧兽医研究所。
利用步骤(4)反应体系和反应程序进行荧光定量PCR检测，检测结果如图7和表6所示。
表6三重荧光PCR的特异性试验结果
Figure BDA0003544374530000122
Figure BDA0003544374530000131
根据图7和表6可以看出，应用本发明的检测方法检测PRRSV、CSFV、PCV2、PRV、PEDV+TGEV+RV、PDCoV、PKV、MRV，只有PDCoV、PKV和MRV检测结果为阳性，其它病原的核酸检测结果都为阴性。说明此三重荧光定量PCR方法的特异性好。
(7)敏感性试验
PDCoV、PKV、MRV三个质粒标准品的七个浓度(2.7×107copies·μL-1至2.7×101copies·μL-1、1.22×107copies·μL-1至1.22×101copies·μL-1和1.26×107copies·μL-1至1.26×101copies·μL-1，分别10倍稀释)，用三重荧光定量PCR反应对每个病原的七个浓度标准品质粒进行扩增。同时进行三个重复，应用本发明的三重荧光定量PCR方法进行敏感性试验，检测反应体系和程序同步骤(4)，实验结果如图11～13所示。
根据图11～13记载的内容可以看出，本发明的三重荧光定量PCR方法检测PDCoV、PKV和MRV的最低检测限分别为2.7×101copies·μL-1、1.22×101copies·μL-1和1.26×102copies·μL-1，说明本发明检测用引物和检测方法灵敏度高。
(8)重复性试验
将用PDCoV、PKV和MRV的质粒(浓度分别为2.7×107copies·μL-1至2.7×102copies·μL-1、1.22×107copies·μL-1至1.22×102copies·μL-1和1.26×107copies·μL-1至1.26×102copies·μL-1)作为模板，应用本发明的三重荧光定量PCR方法分别进行批内(三个重复)和批间试验(三次重复)，统计检测结果，根据变异系数(CV％)分析该方法的重复性，检测反应体系和程序同步骤(4)，实验结果如图11～13和表7～9所示。
表7 PDCoV三重荧光PCR的重复性试验结果
Figure BDA0003544374530000132
Figure BDA0003544374530000141
表8 PKV三重荧光PCR的重复性试验结果
Figure BDA0003544374530000142
Figure BDA0003544374530000151
表9 MRV三重荧光PCR的重复性试验结果
Figure BDA0003544374530000152
注：CV％＝(标准偏差SD/平均值Mean)×100％。
根据图11～13和表7～9记载的内容可以看出，批内和批间试验的变异系数(CV％)处于0.004～0.02之间，本发明三重荧光定量PCR方法具有很好的稳定性。
本发明提供了的同时检测猪德尔塔冠状病毒、呼肠孤病毒和猪嵴病毒的核酸组合物能够特异性识别猪德尔塔冠状病毒、呼肠孤病毒和猪嵴病毒，能够同时快速、方便、高效地检测这三种病原；利用核酸组合物建立的三重荧光定量PCR检测方法，具有快速、方便、高效、灵敏度高的特点，可广泛应用于猪腹泻病流行病学调查、实验室鉴别检测和相关科学研究，具体很高的实际应用价值。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
序列表
<110> 天津市农业科学院
<120> 同时检测猪德尔塔冠状病毒、呼肠孤病毒和猪嵴病毒的核酸组合物、试剂盒及检测方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gttctgatat accagggtg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atatacttat acaggcgagc 20
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcttcaaacg ctggacttca caccataacc 30
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccaaactcct acccgaca 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tctactcatg ggcgagcc 18
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgtgtccgcg tgctgagtaa tgggat 26
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgcagaatcc ggagttaaag t 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcgaataatg acggagggtt 20
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtagtgagtg ggagaartat ggagcgggda 30

Claims (8)

1.一种同时检测猪德尔塔冠状病毒、呼肠孤病毒和猪嵴病毒的核酸组合物，其特征在于，包括针对猪德尔塔冠状病毒的正向引物PDCoV-F、反向引物PDCoV-R和探针PDCoV-P，针对呼肠孤病毒的正向引物PKV-F、反向引物PKV-R和探针PKV-P以及针对猪嵴病毒的正向引物MRV-R、反向引物MRV-R和探针MRV-P；
所述针对猪德尔塔冠状病毒的正向引物序列如SEQ ID NO.1所示；
所述针对猪德尔塔冠状病毒的反向引物序列如SEQ ID NO.2所示；
所述针对猪德尔塔冠状病毒的探针序列如SEQ ID NO.3所示；
所述针对呼肠孤病毒的正向引物序列如SEQ ID NO.4所示；
所述针对呼肠孤病毒的反向引物序列如SEQ ID NO.5所示；
所述针对呼肠孤病毒的探针序列如SEQ ID NO.6所示；
所述针对猪嵴病毒的正向引物序列如SEQ ID NO.7所示；
所述针对猪嵴病毒的反向引物序列如SEQ ID NO.8所示；
所述针对猪嵴病毒的探针序列如SEQ ID NO.9所示。
2.根据权利要求1所述的核酸组合物，其特征在于，所述针对猪德尔塔冠状病毒的探针序列、针对呼肠孤病毒的探针序列以及针对猪嵴病毒的探针序列的5’端均采用荧光报告基团修饰，3’端均采用荧光淬灭基团修饰。
3.根据权利要求2所述的核酸组合物，其特征在于，所述针对猪德尔塔冠状病毒的探针序列的5’端、针对呼肠孤病毒的探针序列的5’端以及针对猪嵴病毒的探针序列的5’端分别采用不同荧光波长的报告基团修饰。
4.一种同时检测猪德尔塔冠状病毒、呼肠孤病毒和猪嵴病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～3任一所述的核酸组合物。
5.权利要求1～3任一所述的核酸组合物或权利要求4所述的试剂盒在制备同时检测猪德尔塔冠状病毒、呼肠孤病毒和猪嵴病毒的产品中的应用。
6.一种同时检测猪德尔塔冠状病毒、呼肠孤病毒和猪嵴病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取检测样本的总RNA，反转录得cDNA；
以所述cDNA模板，利用权利要求1～3任一项所述的核酸组合物进行荧光PCR反应，并收集荧光信号及Ct值，当Ct值大于36时判定为阴性。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述荧光PCR反应的反应体系以25μL计包括：12.5μL 2×Premix Ex Taq，10μmol/L PDCoV-F、PDCoV-R、PKV-F、PKV-R、MRV-F和MRV-R各0.5μL～1.4μL，10μmol/L PDCoV-P、PKV-P和MRV-PcDNA各0.3μL～0.8μL，4μL cDNA和余量的水。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述荧光PCR反应的的程序为：第一阶段95℃预变性3min；第二阶段94℃变性10s，55.8℃延伸30s，共40个循环，在延伸阶段收集荧光信号。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115927761A (zh) * 2022-12-22 2023-04-07 苏州药明检测检验有限责任公司 一种检测呼肠孤病毒3型的引物和探针及其应用

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102925586A (zh) * 2012-08-02 2013-02-13 四川农业大学 一种用于检测猪Kobu病毒的检测试剂盒
CN108060272A (zh) * 2018-02-08 2018-05-22 河南省农业科学院畜牧兽医研究所 一种快速区分猪德尔塔冠状病毒和猪嵴病毒的多重pcr检测引物组及试剂盒
CN108715906A (zh) * 2018-06-04 2018-10-30 广西大学 五种猪肠道病毒多重rt-pcr快速检测试剂盒及其应用
CN108842001A (zh) * 2018-07-10 2018-11-20 山东新希望六和集团有限公司 用于检测猪德尔塔冠状病毒的引物及探针、荧光定量pcr试剂盒及方法和应用
CN108866243A (zh) * 2018-08-31 2018-11-23 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种猪肠道冠状病毒4重荧光定量pcr检测试剂盒
CN109439797A (zh) * 2018-08-07 2019-03-08 广西壮族自治区兽医研究所 一种快速区分PEDV、PDCoV和PReoV的多重RT-PCR检测引物组及试剂盒
CN110093461A (zh) * 2019-06-13 2019-08-06 安徽农业大学 四种猪腹泻病毒的四重rt-pcr检测引物及试剂盒
US20190381165A1 (en) * 2014-11-17 2019-12-19 Virginai Tech Intellectual Properties, Inc. Vaccines and Diagnostics for Novel Porcine Orthoreoviruses
CN111363850A (zh) * 2020-04-15 2020-07-03 西南民族大学 检测正呼肠孤病毒的染料荧光定量引物及试剂盒

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102925586A (zh) * 2012-08-02 2013-02-13 四川农业大学 一种用于检测猪Kobu病毒的检测试剂盒
US20190381165A1 (en) * 2014-11-17 2019-12-19 Virginai Tech Intellectual Properties, Inc. Vaccines and Diagnostics for Novel Porcine Orthoreoviruses
CN108060272A (zh) * 2018-02-08 2018-05-22 河南省农业科学院畜牧兽医研究所 一种快速区分猪德尔塔冠状病毒和猪嵴病毒的多重pcr检测引物组及试剂盒
CN108715906A (zh) * 2018-06-04 2018-10-30 广西大学 五种猪肠道病毒多重rt-pcr快速检测试剂盒及其应用
CN108842001A (zh) * 2018-07-10 2018-11-20 山东新希望六和集团有限公司 用于检测猪德尔塔冠状病毒的引物及探针、荧光定量pcr试剂盒及方法和应用
CN109439797A (zh) * 2018-08-07 2019-03-08 广西壮族自治区兽医研究所 一种快速区分PEDV、PDCoV和PReoV的多重RT-PCR检测引物组及试剂盒
CN108866243A (zh) * 2018-08-31 2018-11-23 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种猪肠道冠状病毒4重荧光定量pcr检测试剂盒
CN110093461A (zh) * 2019-06-13 2019-08-06 安徽农业大学 四种猪腹泻病毒的四重rt-pcr检测引物及试剂盒
CN111363850A (zh) * 2020-04-15 2020-07-03 西南民族大学 检测正呼肠孤病毒的染料荧光定量引物及试剂盒

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHONGZHOU PAN等: "Development of a TaqMan-probe-based multiplex real-time PCR for the simultaneous detection of emerging and reemerging swine coronaviruses", vol. 11, no. 1, pages 1 *
苗艳;陈亮;朱庆贺;李阳;兰世捷;徐馨;李丹;: "PEDV、TGEV、PoRV和PKV多重RT-PCR检测方法的建立及初步应用", no. 03, pages 70 - 74 *
谢荣辉;刘霞;赵灵燕;倪柏锋;柴娟;王雅婷;吴;徐辉;: "猪嵴病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立和应用", no. 04, pages 40 - 44 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115927761A (zh) * 2022-12-22 2023-04-07 苏州药明检测检验有限责任公司 一种检测呼肠孤病毒3型的引物和探针及其应用

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