CN113265488B

CN113265488B - 共同检测流行性出血病病毒和帕利亚姆血清群病毒的rpa-lfd引物、探针及试剂盒

Info

Publication number: CN113265488B
Application number: CN202110587459.6A
Authority: CN
Inventors: 李卓然; 廖德芳; 杨恒; 李占鸿; 杨振兴
Original assignee: Yunnan Animal Science and Veterinary Institute
Current assignee: Yunnan Animal Science and Veterinary Institute
Priority date: 2021-05-27
Filing date: 2021-05-27
Publication date: 2022-11-08
Anticipated expiration: 2041-05-27
Also published as: CN113265488A

Abstract

本发明涉及一种共同检测流行性出血病病毒和帕利亚姆血清群病毒的RPA‑LFD引物、探针及试剂盒，属于动物病毒分子生物学检测技术领域。本发明设计了共同检测EHDV和PALV的引物和nfo探针，并在此基础上构建一种能够共同检出流行于中国的EHDV和PALV核酸的RPA‑LFD检测试剂盒，该试剂盒具有特异、敏感、快速、高效以及能够等温扩增并用于现场快速诊断等优势，易于推广应用。

Description

共同检测流行性出血病病毒和帕利亚姆血清群病毒的RPA- LFD引物、探针及试剂盒

技术领域

本发明属于动物病毒分子生物学检测技术领域，具体涉及共同检测流行性出血病病毒和帕利亚姆血清群病毒的重组酶聚合酶-侧流层析试纸检测引物、探针及检测试剂盒。

背景技术

流行性出血病病毒(epizootic haemorrhagic disease virus,EHDV)和帕利亚姆血清群病毒(palyam serogroup virus,PALV)均为呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)成员，广泛流行于北纬49°至南纬35°之间的热带以及亚热带地区。EHDV和PALV主要通过雌性库蠓(Culicoides spp.)对反刍动物的吸血性叮咬进行传播。EHDV能够导致被感染的白尾鹿发生死亡，以前认为只有属于EHDV-2型的Ibaraki毒株可导致被感染牛出现类似蓝舌病的临床症状，但近年来EHDV-1、-6和-7型病毒在土耳其、以色列和日本流行并且引起奶牛大量减产。EHDV已于2008年被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告的跨境动物疫病。而PALV感染则主要导致妊娠动物的生产异常，主要表现为流产、早产、死产或产无脑畸形胎。1985年至1986年，PALV相关的疫情曾在日本暴发，其临床症状为新生牛先天性异常，并伴有水脑畸形和小脑发育不良综合征。EHDV和PALV都给畜牧业生产带来了巨大的经济损失。

EHDV和PALV基因组均由10个节段的双链RNA(Seg1～Seg10)构成，共编码7个结构蛋白(VP1～VP7)和4个非结构蛋白(NS1～NS3和NS3a)。EHDV和PALV具有双层衣壳结构，外层衣壳由Seg-2和Seg-6编码的VP2和VP5构成，内层衣壳则由Seg-3和Seg-7编码的VP3和VP7构成，而由Seg-1、Seg-4和Seg-9编码的VP1、VP4和VP6以及病毒基因组则共同构成病毒核心。世界范围存在9种EHDV血清型，分别为EHDV-1、-2、-4、-5、-6、-7、-8、-9和-10型。中国目前有5种血清型EHDV的流行(EHDV-1、-5、-6、-7和-10型)。PALV也具有多种不同的血清型，由于历史原因，不同血清型的PA LV往往以病毒首次分离地的地名进行命名，在亚洲存在Chuzanvirus(CHUV)、D’Aguilar virus(DAV)和Bunyip Creek virus(BCV)三种血清型PALV的流行。

2013年首次在广西壮族自治区设置的哨兵牛血液样本内分离获得EHDV-5型毒株，随后在广东省和云南省等省份分离到EHDV-1、-6、-7和-10型毒株。EHDV血清学调查显示，EHDV广泛流行于我国南方地区，并呈明显的地域和季节相关性，其中广东省和云南省牛血液样本中EHDV抗体阳性率分别高达65.08％和68.75％。CHUV于2012年首次分离于我国云南省的哨兵牛，此外多株BCV和DAV则于2012年至2018年在云南省、广西壮族自治区和广东省分离获得，提示多种血清型的PALV流行于我国南方地区。CHUV血清学调查则表明，CHUV已在我国呈广泛分布趋势，海南省牛羊血清抗体阳性率最高可达57.35％，甚至甘肃省牦牛血清内CHUV抗体阳性率也可达7.89％。为了掌握EHDV和PALV在我国的流行及分布情况，并制定科学的防控策略，非常有必要建立EHDV和PALV的现场快速诊断方法。

已有杨振兴等和李占鸿等分别开发了实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和竞争性ELISA(competitiveELISA,C-ELISA)方法用于EHDV和PALV的检测，但是上述两种检测方法都存在不足之处。

(1)qRT-PCR的不足之处：一方面该检测技术需要配置昂贵的仪器设备(约30万元)，另一方面需要训练有素的技术人员进行实验操作。此外，qRT-PCR检测过程需要经过变性(95℃)和延伸(72℃)等变温循环过程，而野外和现场检测难以提供稳定的电力供应。

(2)C-ELISA的不足之处：主要对动物血液内的抗体进行检测，而从动物感染EHDV或PALV到抗体产生，一般需要2～3周，因此，C-ELISA方法在抗体产生之前不能进行早期临床诊断。

综上，目前尚无兼具特异性、灵敏度和高效便捷等优点于一身的检测方法，特别是缺乏现场对临床样本进行早期快速诊断的手段。因此，建立适用于现场快速诊断的EHDV和PALV病原学检测方法和检测试剂盒，不仅能弥补现有技术的不足，而且能够为我国EHDV和PALV的诊断和防控提供技术支持和知识储备。

在过去的几十年里，多种等温扩增技术应运而生，例如目前应用较为广泛的环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)和重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)。以RPA为例，该扩增技术主要成分为三种蛋白，一种为用于解开DNA双链的重组酶，一种为稳定解链DNA的单链DNA结合蛋白，第三种为合成DNA的聚合酶。RPA仅需要一对引物和/或一条探针在39℃恒温下孵育20min即可完成扩增反应。此外，扩增反应完成后，不仅可以通过琼脂糖凝胶电泳对产物进行检测，还能够结合侧流层析试纸(lateral flow dipstick,LFD)通过肉眼直接判定检测结果，极大地方便了现场快速诊断。

已有李占鸿等开发了针对EHDV和PALV的LAMP可视化检测方法，但是该方法也存在一定的缺点。虽然LAMP与RPA同为等温扩增技术，也能够通过肉眼判定检测结果，然而该技术需要至少两对引物才能完成一个扩增反应。由于多对引物间容易形成引物二聚体而导致非特异性扩增，因此，LAMP很难用于两种及以上病原体的检测，严重降低了检测效率。

RPA已经被应用在包括病毒和细菌在内的等多种病原体检测中，具有特性强、灵敏度高、检测速度快和可进行等温扩增等优势，更为重要的是该技术可以用于临床样本检测，但是目前尚无共同检测EHDV和PALV的RPA-LFD方法面世。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供两对用于共同检测EHDV和PALV核酸的引物和两条特异性nfo探针及含有该引物和nfo探针的检测试剂盒，以实现对中国流行EHDV和PALV的现场快速诊断，从而弥补现有技术的不足。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

共同检测流行性出血病病毒和帕利亚姆血清群病毒的RPA-LFD引物，包括EHDV的RPA-LFD检测引物和PALV的RPA-LFD检测引物；

EHDV的RPA-LFD检测引物，包括上游引物EHDV_F和下游引物EHDV_R；

上游引物EHDV_F：tggattgcctgttttacatgattcaacttggga；(SEQ ID NO.1)

下游引物EHDV_R：Bio-taacgcttgacgaacgatgacataactttcacccctaaac；(SEQ IDNO.2)

PALV的RPA-LFD检测引物，包括上游引物PALV_F和下游引物PALV_R；

上游引物PALV_F：tactaaaatttcaagagggttttctcataaattgg；(SEQ ID NO.3)

下游引物PALV_R：Bio-ggtcataactatattaagcgattcataataagcccc。(SEQ ID NO.4)

本发明还提供与上述引物配合使用的nfo探针，所述的nfo探针核苷酸序列分别为：EHDV_Probe：DIG-tttattgaacaaagagcgaagaacgaaatg[THF]aaatatatggagaca[C3-spacer](SEQ ID NO.5)和PALV_Probe：FITC-tgaggatggttttactatgtatttaattcg[THF]gatccattgtgtgct[C3-spacer]。(SEQ ID NO.6)

本发明同时提供含有上述引物和/或上述nfo探针的检测试剂盒。

进一步，优选的是，还包括：阴性对照模板、阳性对照模板、反转录试剂、扩增试剂和PCRD Nucleic Acid Detector；

所述的阴性对照模板为RNase-free水；

所述的阳性对照模板为EHDV和PALV基因节段1(Seg-1)DNA片段；

进一步，优选的是，所述的阳性对照模板的拷贝数为：EHDV Seg-1 DNA片段7.1×10¹³拷贝/μL，PALV Seg-1 DNA片段6.8×10¹³拷贝/μL。

进一步，优选的是，所述的反转录试剂包括5×PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)和RNase-free水。

进一步，优选的是，所述的试剂盒的反转录体系为：

5×PrimeScript RT Master Mix，2.0μL；

抽提的总RNA，5.0μL；

RNase-free水，3.0μL；

总计10.0μL。

进一步，优选的是，所述的试剂盒的反转录程序为：

反转录37℃，15min，共1个循环；反转录酶的失活85℃，5s，共1个循环。

进一步，优选的是，所述的试剂盒的扩增体系为：

nfo Kit RPA扩增试剂冷冻干粉，1管；

Primer free rehydration buffer，29.5μL；

上游引物EHDV_F(10μmol/L)，2.1μL；

下游引物EHDV_R(10μmol/L)，2.1μL；

上游引物PALV_F(10μmol/L)，2.1μL；

下游引物PALV_R(10μmol/L)，2.1μL；

nfo探针EHDV_Probe(10μmol/L)，0.6μL；

nfo探针PALV_Probe(10μmol/L)，0.6μL；

反转录的cDNA模板，1.0μL；

RNase-free水，7.4μL；

Magnesium acetate(280mmol/L)，2.5μL；

总计50.0μL。

进一步，优选的是，所述的试剂盒的扩增程序为：

39℃，20min。

进一步，优选的是，所述的试剂盒的检测体系为：

RPA扩增产物，6μL；

PCRD extraction buffer，84μL；

共计90.0μL；

取75μL上述混合液加入PCRD检测孔。

进一步，优选的是，所述的试剂盒的检测程序为：

室温，10min。

本发明提供用于共同对EHDV和PALV进行现场快速检测的下游引物5’端均以生物素基团(Bio)标记。EHDV nfo探针5’端以地高辛基团(DIG)标记，PALV nfo探针5’端以异硫氰酸荧光素基团(FITC)标记；所述nfo探针3’端均添加阻断基团(C3-spacer)；所述nfo探针第31位均为四氢呋喃(THF)。

本发明提供用于共同检测EHDV和PALV的引物、nfo探针以及检测试剂盒，通过提取待检样品总RNA进行反转录，并结合RPA-LFD技术，可达到准确检测待检样品中EHDV和PALV核酸的目的。本发明所提供的引物、nfo探针和检测试剂盒可用于对EHDV和PALV的现场快速诊断，将在我国EHDV和PALV的防控工作中发挥重要作用。

本发明试剂盒提供RNase-free水作为阴性对照模板、EHDV Seg-1 DNA片段和PALVSeg-1 DNA片段作为阳性对照模板。即当RPA扩增体系以阴性对照模板进行反应时，所述的模板为RNase-free水；当RPA扩增体系以阳性对照模板进行反应时，所述的模板为EHDVSeg-1 DNA片段和/或PALV Seg-1DNA片段；当RPA扩增体系以待检样品模板进行反应时，所述的模板为从EHDV和PALV培养液、疑似EHDV和/或PALV感染的动物组织或血液中抽提总RNA反转录的cDNA。利用本发明提供的引物和nfo探针对阴性对照模板、阳性对照模板以及待检样品模板分别进行RPA扩增，然后利用PCRD Nucleic Acid Detector对扩增产物进行检测。如在PCRD Nucleic Acid Detector控制带(C)和检测带(1和/或2)上同时出现黑色控制线和与阳性对照模板类似的黑色检测线者为阳性，即同时出现黑色控制线(C)和1号检测线(1)为EHDV阳性，同时出现黑色控制线(C)和2号检测线(2)为PALV阳性，而黑色控制线(C)、1号以及2号检测线(1和2)三者同时出现则为EHDV和PALV阳性；在控制带(C)上出现黑色控制线而未在相应检测带(1和/或2)上出现黑色检测线者为阴性；未在控制带(C)上出现黑色控制线者均为无效结果，需要重新进行检测。

本发明的具体原理是，针对中国流行的EHDV和PALV Seg-1序列，设计用于RPA-LFD检测的特异性引物和nfo探针，利用Bio基团标记EHDV下游引物和PALV下游引物5’端；利用DIG和FITC基团分别标记EHDV nfo探针和PALV nfo探针的5’端；为防止扩增时被错误延伸，EHDV nfo探针和PALV nfo探针的3’端均添加阻断基团C3-spacer；EHDV nfo探针和PALVnfo探针的第31位均为THF。以cDNA或阳性对照为模板进行RPA扩增反应，

nfoKit RPA扩增试剂冷冻干粉内的大肠杆菌核酸酶识别nfo探针内的THF，并切断与THF相连的磷酸二酯键暴露自由羟基端。

nfo Kit RPA扩增试剂冷冻干粉内的聚合酶以切断的nfo探针为引物继续合成DNA，标记基团随扩增过程不断掺入扩增产物中。利用PCRDNucleic Acid Detector上的特异性膜载抗体识别同时含有Bio和DIG基团和/或Bio和FITC基团的扩增产物，在控制带(C)及相应检测带(1和/或2)上出现黑色控制线和黑色检测线。

以EHDV和PALV基因组cDNA为模板，扩增并回收纯化EHDV Seg-1 DNA片段和PALVSeg-1 DNA片段作为阳性对照模板。扩增引物如下：

EHDV Seg-1 F：5’-aaaatgcaatggtcgcaattaccgt-3’(SEQ ID NO.7)；

EHDV Seg-1 R：5’-tttttcacccacgcacgtcc-3’(SEQ ID NO.8)；

PALV Seg-1 F：5’-gtcatattgcttctgcttcaa-3’(SEQ ID NO.9)；

PALV Seg-1 R：5’-ccttacccgtgtgctcatcc-3’(SEQ ID NO.10)。

扩增产物长度分别为EHDV Seg-1 DNA片段1174bp，PALV Seg-1 DNA片段959bp。

扩增体系如下：

Q5 High-Fidelity 2×Master Mix，12.5μL；

上游引物(10μmol/L)，1.25μL；

下游引物(10μmol/L)，1.25μL；

病毒基因组cDNA模板，1.0μL；；

水，9.0μL；

总计25.0μL。

扩增程序如下：

预变性98℃，30s，共1个循环；变性98℃，10s，退火55.5℃(EHDV)/53.0℃(PALV)，20s，延伸72℃，30s，共35个循环；后延伸72℃，2min。

最终构建出适用于现场共同快速检测EHDV和PALV的RPA-LFD引物、nfo探针和检测试剂盒。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

(1)本发明设计了共同检测EHDV和PALV的引物和nfo探针，并在此基础上构建一种能够共同检出流行于中国的EHDV和PALV核酸的RPA-LFD检测试剂盒，该试剂盒具有特异、敏感、快速、高效以及能够等温扩增并用于现场快速诊断等优势。

(2)本发明涉及的共同检测EHDV和PALV的RPA-LFD引物、nfo探针和检测试剂盒特异性强。如附图1所示，本发明涉及的引物和nfo探针只对EHDV或PALV产生特异性黑色检测线(1或2)，而未与其它种属病毒发生交叉反应，包括非洲马瘟病毒(African horsesickness virus,AHSV)灭活疫苗、蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)、广西环状病毒(Guangxi Orbivirus,GXOV)、西藏环状病毒(Tibet Orbivirus,TIBOV)和云南环状病毒(Yunnan Orbivirus,YUOV)。

(3)动物感染EHDV和PALV早期，其血液内病毒含量较低，而本发明涉及的共同检测EHDV和PALV的RPA-LFD检测试剂盒具有良好的检测灵敏度，适用于早期临床样本的检测。灵敏度试验结果显示，本发明涉及的共同检测EHDV和PALV的RPA-LFD引物、nfo探针和检测试剂盒对EHDV和PALV的检出下限分别为7.1拷贝/μL和6.8拷贝/μL(附图2)。

(4)虽然已有Maan等和李占鸿等报道的针对EHDV Seg-9和PALV Seg-7设计的群特异性qRT-PCR检测方法，但由于qRT-PCR检测需要配置昂贵的仪器设备(约30万元)，实验操作过程需要专业的技术人员，并且qRT-PCR检测过程需要经过变性(95℃)和延伸(72℃)等变温循环过程，对稳定的电力供应具有较高要求，因此将qRT-PCR检测方法应用至现场快速诊断方面具有较大困难。本发明涉及的共同检测EHDV和PALV的RPA-LFD引物、nfo探针检测试剂盒不仅能够在低温、等温(39℃)环境下完成扩增反应，而且检测速度快，整个检测过程(包含反转录、RPA扩增和PCRD Nucleic Acid Dete ctor检测)在1小时内即可完成；并且，该检测试剂盒无需配备昂贵的仪器设备，直接通过肉眼即可判定检测结果，极大地方便了现场快速检测。

(5)由于EHDV和PALV的Seg-1序列均具有高度保守性，本发明针对中国流行EHDV和PALV毒株的Seg-1序列进行引物设计。应用实例A中利用本发明涉及的RPA-LFD检测试剂盒对中国流行的EHDV和PALV毒株进行检测，检测结果与病毒分离鉴定结果的吻合率为100％(表2)，表明本发明涉及的检测试剂盒可有效地检测我国分离的全部血清型EHDV和PALV毒株；应用实例B中利用本发明涉及的RPA-LFD检测试剂盒对2014年至2019年分离出EHDV和PALV毒株的血液样本进行检测，检测结果与EHDV和PALV的qRT-PCR检测方法结果的吻合率为96.2％(表3)；应用实例C中利用本发明涉及的RPA-LFD检测试剂盒对2020年感染EHDV和PALV的哨兵牛血液样本进行回溯检测，检测结果与EHDV和PALV的qRT-PCR检测方法结果全部吻合(附图3和附图4)；应用实例D中利用本发明涉及的RPA-LFD检测试剂盒对96份牛血液样本进行检测，与EHDV和PALV的qRT-PCR检测方法结果吻合率为94.8％(表4)，说明本发明涉及的共同检测EHDV和PALV的RPA-LFD引物、nfo探针和检测试剂盒不仅能够用于临床样本检测，而且具有良好的灵敏度、特异性和可靠性，能够用于EHD和PALV相关疫病的现场快速诊断。

(6)虽然RPA扩增产物能够通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，但PCRD Nucleic AcidDetector的检测下限为0.005ng DNA，而GoldViewⅡ对DNA的检测下限为0.1ng。应用实例C中，虽然部分样品能够被PCRD Nulceic Acid Detector检出，但琼脂糖凝胶电泳对应泳道内却无条带出现(附图3和附图4)。因此，RPA扩增与LFD检测技术联用能够大幅度提高检测灵敏度。

(7)本发明涉及的共同检测EHDV和PALV的RPA-LFD引物、nfo探针和检测试剂盒与C-ELISA方法相比具有能够进行早期临床诊断的优点。C-ELISA方法主要对被感染动物产生的抗体进行检测，从EHDV或PALV感染到产生可检测的抗体一般需要2～3周时间，但本发明涉及的检测试剂盒能够在抗体产生之前开展现场快速诊断。

(8)李占鸿等涉及的EHDV和PALV可视化LAMP检测方法，也能够实现对EHDV和PALV的现场快速诊断。本发明涉及的共同检测EHDV和PALV的RPA-LFD引物、nfo探针和检测试剂盒与上述EHDV和PALV可视化LAMP检测方法相比具有能够实现EHDV和PALV共同检测的优势，将工作效率提高了一倍。

附图说明

图1本发明涉及的RPA-LFD检测试剂盒特异性试验；上从左至右：分别以EHDV-1、-2、-5、-6、-7、-8、-10型毒株、BCV、CHUV、DAV、AHSV灭活疫苗、BTV-1、-16型毒株、GXOV、TIBOV和YUOV的基因组cDNA以及阴性对照为模板进行RPA-LFD特异性分析；下从左至右：上述RPA扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果，M：DNA Marker(DL5000)；

图2本发明涉及的RPA-LFD检测试剂盒灵敏度试验；上从左至右：以浓度分别为7.1×10⁵拷贝/μL～7.1×10⁰拷贝/μL的EHDV阳性对照和6.8×10⁵拷贝/μL～6.8×10⁰拷贝/μL的PALV阳性对照以及阴性对照为模板进行灵敏度分析；下从左至右：上述RPA扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果，M：DNA Marker(DL5000)；

图3本发明涉及的RPA-LFD检测试剂盒对感染EHDV哨兵牛血液样本的回溯检测；上从左至右：分别对2020年7月至10月采集自一头感染EHDV哨兵牛血液样本和阴性对照模板进行RPA-LFD检测的结果；中从左至右：对上述血液样本进行qRT-PCR检测的结果，结果以循环阈值(cycle threshold,CT)表示；下从左至右：上述血液样本和阴性对照模板的RPA扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果，M：DNA Marker(DL5000)；

图4本发明涉及的RPA-LFD检测试剂盒对感染PALV哨兵牛血液样本的回溯检测；上从左至右：分别对2020年5月至7月采集自一头感染PALV哨兵牛血液样本和阴性对照模板进行RPA-LFD检测的结果；中从左至右：对上述血液样本进行qRT-PCR检测的结果，结果以CT值表示；下从左至右：上述血液样本和阴性对照模板的RPA扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果，M：DNA Marker(DL5000)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

(1)实验材料

EHDV-1型毒株记载在2013—2019年中国流行性出血病病毒血清1型毒株的分离与遗传特征分析，李卓然，吴健敏，朱建波，王金萍，吕敏娜，肖雷，杨振兴，李华春，廖德芳，杨恒，《南方农业学报》2021年，第8期；EHDV-5型毒株记载在2013—2016年中国流行性出血病病毒血清5型的分离与遗传特征分析，杨振兴，李占鸿，王金萍，肖雷，寇美玲，朱建波，廖德芳，李华春，杨恒，《病毒学报》2020年，第36期；EHDV-6型毒株记载在云南和广东省流行性出血病病毒血清6型毒株(EHDV-6)的分离与遗传特性，李占鸿，杨振兴，林栩慧，吕敏娜，肖雷，寇美玲，廖德芳，朱建波，杨恒，李华春，《华南农业大学学报》2020年，第4期；EHDV-7型毒株记载在流行性出血病病毒(EHDV)血清7型毒株在中国的首次分离与鉴定，杨振兴，孟锦昕，肖雷，朱建波，廖德芳，高林，李占鸿，杨恒，李华春，《畜牧兽医学报》2019年，第50期；EHDV-10型毒株记载在牛源流行性出血病病毒(EHDV)血清10型毒株在我国的分离鉴定，李占鸿，肖雷，杨振兴，孟锦昕，廖德芳，高林，李华春，杨恒，《病毒学报》2019，第35期，上述EHDV血清型毒株公众可从云南省畜牧兽医科学院获得。PALV CHUV血清型、BCV血清型和DAV血清型毒株记载在2012—2016年中国南方地区帕利亚姆血清群病毒的分离与序列特征分析，杨恒，肖雷，李占鸿，孟锦昕，杨振兴，吕敏娜，林栩慧，廖德芳，牛保生，李华春，《畜牧兽医学报》2018年，第49期，公众可从云南省畜牧兽医科学院获得。蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)血清1型(BTV-1)和16型(BTV-16)记载在Sequence comparison of the L2 andS10genes of bluetongue vi ruses from the United States and the People’sRepublic of China，Bon neau KR，Zhang N，Zhu J，Zhang F，Maclachlan NJ，VirusResearch 1999年，第61期，公众可从云南省畜牧兽医科学院获得；广西环状病毒(GuangxiOrbivirus,GXOV)记载在牛血液中一株新型环状病毒的分离与全基因组序列分析，杨恒，李占鸿，张怡轩，高林，谢佳芮，廖德芳，吴健敏，李华春，《病毒学报》2018年，第34期，公众可从云南省畜牧兽医科学院获得；西藏环状病毒(Tibet Orbivirus,TIBOV)记载在Isolationof Tibet Orbivirus from Culicodies and associated infections in livestock inYunnan,China，Wang J，Li H，He Y，Zhou Y，Xin A，Liao D，Meng J，Virology Journal2017年，第14期，公众可从云南省畜牧兽医科学院获得；云南环状病毒(Yunnan Orbivirus,YUOV)记载在Yunnan Orbivirus,a new Orbivirus species isolated from Culextritaeniorhynchus mosquitoes in China，Attoui H，Journal of General Virology2005年，第86期，公众可从云南省畜牧兽医科学院获得。EHDV-2、-8型参考毒株和非洲马瘟病毒(African horse sickness virus,AHSV)灭活疫苗由世界动物卫生组织(OIE)参考实验室澳大利亚麦克阿瑟.伊丽莎白农业研究所友情赠送。EHDV Seg-1 DNA片段和PALVSeg-1DNA片段由云南省畜牧兽医科学院按本发明内阳性对照模板制备方法进行制备。

(2)试剂与仪器

MagMAX^TM-96Viral RNA Isolation Kit购自Thermo Fisher Scientific公司；

Vrial DNA/RNA Kit购自TransGen Biotech公司；Prime Script^TM RTMaster Mix和DNA Marker(DL5000)购自TaKaRa公司；

nfo Kit和PCRDNucleic Acid Detector购自默瑞(上海)生物科技有限公司；

High-Fidelity 2×Master Mix和

Universal Probe qPCR Master Mix购自NEB公司；Universal DNA纯化回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；GoldViewⅡ(100×)和琼脂糖购自索莱宝公司。

KingFisher Flex platform(Thermo Fisher Scientific)；梯度PCR仪Veriti96Well Thermal Cycler(ABI)；实时荧光定量PCR仪7500Fast(ABI)；电泳仪Power PacBasic(BIO-RAD)；水平电泳***DYCP-32B(北京六一)；紫外凝胶成像***Gel Doc XR⁺(BIO-RAD)；紫外分光光度计Nano Vue Plus(GE)；干式恒温金属浴OSE-96(天根生化科技有限公司)；台式离心机1-14(Sigma)。

(3)设计引物和nfo探针

针对中国流行的EHDV和PALV Seg-1序列，设计用于RPA-LFD共检测EHDV和PALV的特异性引物和nfo探针。以Bio基团标记所述两条下游引物5’端；以DIG和FITC基团分别标记EHDV nfo探针和PALV nfo探针5’端；所述两条nfo探针的3’端均添加阻断基团C3-spacer；所述两条nfo探针的第31位为TH F。引物和nfo探针序列如表1所示。

表1本发明涉及的RPA-LFD检测试剂盒所用引物和nfo探针序列信息

(4)阳性对照模板的制备

根据前期获得的中国流行的EHDV和PALV全基因组序列，设计两对特异性引物：EHDV Seg-1 F：5’-aaaatgcaatggtcgcaattaccgt-3’(SEQ ID NO.7)；EHDV Seg-1 R：5’-tttttcacccacgcacgtcc-3’(SEQ ID NO.8)；PALV Seg-1F：5’-gtcatattgcttctgcttcaa-3’(SEQ ID NO.9)；PALV Seg-1 R：5’-ccttacccgtgtgctcatcc-3’(SEQ ID NO.10)用于EHDVSeg-1 DNA片段和PALV Seg-1DNA片段的扩增，扩增产物长度分别为1174bp和959bp。所述通过PCR反应扩增所得核酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。

具体方法为：

使用病毒DNA/RNA抽提试剂盒“

Vrial DNA/RNA Kit”(Trans genBiotech)抽提我国分离到的EHDV和PALV基因组RNA，94℃变性3min后立即冰浴，并按照“PrimeScript^TM RT Master Mix(Perfect Real Time)”(Takara)说明书将上述病毒基因组RNA反转录为cDNA。

反转录体系为：

5×PrimeScript RT Master Mix，2.0μL；

抽提的病毒基因组RNA，5.0μL；

RNase-free水，3.0μL；

总计10.0μL。

反转录程序为：

利用上述EHDV Seg-1 DNA片段和PALV Seg-1 DNA片段扩增引物对，以EHDV和PALV全基因组cDNA为模板，按照“

High-Fidelity 2×Mast er Mix”(NEB)说明书分别扩增EHDV Seg-1 DNA片段和PALV Seg-1 DNA片段。

扩增体系为：

Q5 High-Fidelity 2×Master Mix，12.5μL；

上游引物(10μmol/L)，1.25μL；

下游引物(10μmol/L)，1.25μL；

病毒基因组cDNA，1.0μL；；

RNase-free水，9.0μL；

总计25.0μL。

扩增程序为：

按照“Universal DNA纯化回收试剂盒”(天根生化科技有限公司)说明书对扩增产物进行回收纯化，得到的EHDV Seg-1 DNA片段和PALV Seg-1 DNA片段即为阳性对照模板，其浓度分别为91.5ng/μL和71.3ng/μL。根据DNA拷贝数计算公式：拷贝数(拷贝/μL)＝DNA浓度(g/μL)×6.02×10²³(拷贝/mol)/(660×DNA碱基对数)计算EHDV和PALV阳性对照模板的拷贝数，分别为7.1×10¹³拷贝/μL和6.8×10¹³拷贝/μL。

(5)特异性分析

利用病毒DNA/RNA抽提试剂盒“

Vrial DNA/RNA Kit”(Trans genBiotech)抽提EHDV-1、-2、-5、-6、-7、-8、-10型毒株、BCV、CHUV、DAV、AHSV灭活疫苗、BTV-1、-16型毒株、GXOV、TIBOV和YUOV基因组RNA，94℃变性3min后立即冰浴。按照按照“PrimeScript^TM RT Master Mix”(Takara)说明书将上述病毒基因组RNA反转录为cDNA。

反转录体系为：

5×PrimeScript RT Master Mix，2.0μL；

抽提的病毒RNA，5.0μL；

RNase-free水，3.0μL；

总计10.0μL。

反转录程序为：

以上述病毒基因组cDNA为模板按照“

nfo Kit”(Twist)说明书进行RPA扩增反应。

扩增体系为：

nfo Kit RPA扩增试剂冷冻干粉，1管；

Primer free rehydration buffer，29.5μL；

上游引物EHDV_F(10μmol/L)，2.1μL；

下游引物EHDV_R(10μmol/L)，2.1μL；

上游引物PALV_F(10μmol/L)，2.1μL；

下游引物PALV_R(10μmol/L)，2.1μL；

nfo探针EHDV_Probe(10μmol/L)，0.6μL；

nfo探针PALV_Probe(10μmol/L)，0.6μL；

病毒基因组cDNA模板，1.0μL；

RNase-free水，7.4μL；

Magnesium acetate(280mmol/L)，2.5μL；

总计50.0μL。

扩增程序为：

39℃，20min。

取上述RPA扩增反应产物按“PCRD Nucleic Acid Detector(”ABINGDON HEALTH)说明书进行扩增产物检测和结果判定。

检测体系为：

RPA扩增产物，6μL；

PCRD extraction buffer，84μL；

共计90.0μL。

取75μL上述混合液。加入PCRD检测孔，于室温放置10min之内判定检测结果，超过10min者为无效结果。

利用本发明所涉及的共同检测EHDV和PALV的RPF-LFD检测试剂盒，取1μL上述病毒基因组cRNA为模板于39℃进行RPA扩增反应20min，以PCRD Nucleic Acid Detector检测扩增产物并进行RPA-LFD特异性分析，本发明涉及的共同检测EHDV和PALV的RPA-LFD引物、nfo探针和检测试剂盒能够特异性检出EHDV-1、-2、-5、-6、-7、-8和-10型毒株以及BCV、CHUV和DAV，而与AHSV灭活疫苗、BTV-1和-16型毒株、GXOV、TIBOV以及YUOV没有交叉反应(附图1)。

(6)灵敏性分析

利用本发明所涉及的共同检测EHDV和PALV的RPA-LFD检测试剂盒，以1μL拷贝数分别为7.1×10⁵拷贝/μL、7.1×10⁴拷贝/μL、7.1×10³拷贝/μL、7.1×10²拷贝/μL、7.1×10¹拷贝/μL和7.1×10⁰拷贝/μL的EHDV Seg-1 DNA片段、1μL拷贝数分别为6.8×10⁵拷贝/μL、6.8×10⁴拷贝/μL、6.8×10³拷贝/μL、6.8×10²拷贝/μL、6.8×10¹拷贝/μL和6.8×10⁰拷贝/μL的PALV Seg-1 DNA片段以及阴性对照模板进行RPA-LFD敏感性分析，本发明涉及的共同检测EHDV和PALV的RPA-LFD引物、nfo探针和检测试剂盒的检出下限为EHDV Seg-1 DNA片段7.1拷贝/μL和PALV Seg-1 DNA片段6.8拷贝/μL(附图2)。

所述扩增体系为：

nfo Kit RPA扩增试剂冷冻干粉，1管；

Primer free rehydration buffer，29.5μL；

上游引物EHDV_F(10μmol/L)，2.1μL；

下游引物EHDV_R(10μmol/L)，2.1μL；

上游引物PALV_F(10μmol/L)，2.1μL；

下游引物PALV_R(10μmol/L)，2.1μL；

nfo探针EHDV_Probe(10μmol/L)，0.6μL；

nfo探针PALV_Probe(10μmol/L)，0.6μL；

EHDV阳性对照模板，1.0μL；

PALV阳性对照模板，1.0μL；

RNase-free水，6.4μL；

Magnesium acetate(280mmol/L)，2.5μL；

总计50.0μL。

(7)应用实例

A.应用本发明涉及的共同检测EHDV和PALV的RPA-LFD检测试剂盒对EHDV和PALV毒株进行检测

利用本发明所涉及的共同检测EHDV和PALV的RPA-LFD检测试剂盒对39株EHDV和29株PALV进行检测。本发明涉及的共同检测EHDV和PLAV的RPA-LFD引物、nfo探针和检测试剂盒能够有效地检出所有EHDV和PALV毒株，与病毒分离鉴定结果的吻合率为100％，具体见表2。

表2利用本发明涉及的RPA-LFD检测试剂盒对EHDV和PALV毒株进行检测的结果

B.利用本发明涉及的RPA-LFD检测试剂盒对分离EHDV和PALV的血液样本进行检测

按照“MagMAX^TM-96Viral RNA Isolation Kit”(Thermo Fisher Scientifi c)说明书提取2014年至2019年分离EHDV和PALV的血液样本总RNA，94℃变性3min后立即冰浴。按照“PrimeScript^TM RT Master Mix(Perfect Real Time)”(Takara)说明书将总RNA反转录为cDNA。取1μL cDNA为模板，按照“

nfo Kit”(Twist)说明书进行RPA扩增反应，并以“PCRD Nucleic Acid Detector”(ABINGDON HEALTH)检测扩增产物。同时以Maan等和李占鸿等报道的EHDV qRT-PCR和PALV qRT-PCR引物和探针按照“

UniversalProbe qPCR Master Mix”(NEB)说明书同时对上述血液样本进行检测，检测结果以CT值范围表示。本发明涉及的共同检测EHDV和PALV的RPA-LFD引物、nfo探针和检测试剂盒能够有效地检出分离EHDV和PALV的血液样本，与qRT-PCR检测结果的吻合率为96.2％，具体见表3。

表3利用本发明涉及的RPA-LFD检测试剂盒和qRT-PCR方法对分离EHDV和PALV血液样本进行检测的结果

C.利用本发明涉及的RPA-LFD检测试剂盒对哨兵牛血液样本进行回溯检测

取2020年5月至10月采集的感染EHDV和PALV哨兵牛的24份血液样本进行RPA-LFD检测，其中感染EHDV的血液样本12份，感染PALV的血液样本12份。同时以Maan等和李占鸿等报道的EHDV qRT-PCR和PALV qRT-PCR引物和探针同时对上述血液样本进行检测(附图3和附图4)。RPA-LFD检测结果显示，采集自2020年5月14日感染PALV哨兵牛的血液样本未出现阳性检测线，但该样本的CT值为39.3，根据PALV qRT-PCR回归方程进行计算，PALV的拷贝数仅为0.39拷贝/μL，说明该样本的qRT-PCR检测结果应为阴性。因此，利用本发明涉及的共同检测EHDV和PALV的RPA-LFD引物、nfo探针和检测试剂盒对感染EHDV和PALV哨兵牛血液样本进行回溯检测的结果与qRT-PCR检测结果一致。

D.利用本发明涉及的RPA-LFD检测试剂盒对临床血液样本进行检测

采集牛血液样本共计96份，利用本发明涉及的RPA-LFD检测试剂盒对上述血液样本进行EHDV和PALV的共同检测。同时以Maan等和李占鸿等报道的EHDV qRT-PCR和PALVqRT-PCR引物和探针同时对上述血液样本进行检测。本发明涉及的RPA-LFD检测试剂盒能够有效地检出感染EHDV或PALV以及共同感染EHDV和PALV的血液样本，与qRT-PCR检测结果的吻合率为94.8％，具体见表4。综上，本发明涉及的共同检测EHDV和PALV的RPA-LFD引物、nfo探针和检测试剂盒具有良好的敏感性和可靠性。

表4利用本发明涉及的RPA-LFD检测试剂盒和qRT-PCR方法对临床血液样本进行检测的结果

由本发明引物对和nfo探针衍生的引物序列和nfo探针序列也属于本发明的保护范围。所述衍生序列是指在SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6的基础上经过一至十个碱基的取代、缺失或添加得到的引物序列。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

SEQ ID NO.11

SEQ ID NO.12

序列表

<110> 云南省畜牧兽医科学院

<120> 共同检测流行性出血病病毒和帕利亚姆血清群病毒的RPA-LFD引物、探针及试剂盒

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

tggattgcct gttttacatg attcaacttg gga 33

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

taacgcttga cgaacgatga cataactttc acccctaaac 40

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

tactaaaatt tcaagagggt tttctcataa attgg 35

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

ggtcataact atattaagcg attcataata agcccc 36

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

tttattgaac aaagagcgaa gaacgaaatg aaatatatgg agaca 45

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

tgaggatggt tttactatgt atttaattcg gatccattgt gtgct 45

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

aaaatgcaat ggtcgcaatt accgt 25

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

tttttcaccc acgcacgtcc 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

gtcatattgc ttctgcttca a 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

ccttacccgt gtgctcatcc 20

<210> 11

<211> 1174

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

aaaatgcaat ggtcgcaatt accgtgcaag gtgcacagct cattaaacga gtggttgaaa 60

gaatatatca aggaataaca ttcgagttag ataatggcat cacagagttt tataaatttt 120

cagaacatat caggcgcata agagaaaaac acggagtgat atataagaga aaagcagaag 180

agatagagca caacattaaa atgaggaagg aacaactgtt tggattgcct gttttacatg 240

attcagcttg ggaagaaatc tttaatattg actataaaga tgatagtgtt ttacaggtgt 300

acatgaattc agtgctacgc cagggagaat tggatccgga ggaagagttc ctgcgaaatt 360

ataaggtgca aggcgagcat gctgggttga cgcaatttat tgaacaaaga gcgaagaacg 420

aaatgcaaat atatggagac ataccaatca aagtttgggc cgcatttcta attgaattgg 480

attcagaagt taaccaccag agtttagggg tgaaagttat gtcatcgttc gtcaagcgct 540

atggagagcc cttccatcag ggttttcgag atttatcgaa cttagaaagg tttaacgtat 600

catactcaac gccgctgttg tttgaaatgt gttgtatgga atcaatatta gagcataata 660

ttataatgcg catgaaggag gaggggatac acaatttgga gtttggggat gagaaaattg 720

atccgatagc gttgctgcgc gaattgttta ttatatgttt gcctcatccg aagaaaatta 780

ataatatgtt aagatcgcca tattcatggt ttgttaaatt atggggggtg ggcgctgacc 840

aagttacagt attgacgtcg ggtgcaggcg acgatcgtaa ttcgaaagac gttttttatg 900

acaaatatca gacaaatgca aatcgttacg tcaacatttt taaatgtaaa ttttataccg 960

aatcgcagaa atcgaattcg gagaaggttg aagaggcgat cttatattca caagagctcg 1020

gaatgcatca ttatagctta cccgtgtttc aatcaatgtt acgaaatgta tatacaaggc 1080

ccttttatcc gttcaaacag agcaatttga tgttggcatc attcttgcta agcttacagg 1140

taataacagg ttacggacgt gcgtgggtga aaaa 1174

<210> 12

<211> 959

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

gtcatattgc ttctgcttca aaaacaatca tagctccctt ttccgttgag aagacgcaaa 60

cacatgctaa acaaggaata tatatacccc aggatagaat gatgttgatc tcgtctgaaa 120

gacgaaagga tattgaggat gtccgaggct atcttaaatc acaagttcaa actttgacta 180

ctaaaatttc aagagggttt tctcataaat tggcgagaat gattttaatg ttgaaaacat 240

cattagttgg ctttcggaaa ttgaaacgga ctatttttgc cgacggagtg tatagggata 300

gacgctttga ttctgatgat gaggatggtt ttactatgta tttaattcga gatccattgt 360

gtgcttttct cccagttgaa tggaatggag ttggggctta ttatgaatcg cttaatatag 420

ttatgaccga agatatattc ttagatctct tacaaacggg aaatgagttt gttcgacacc 480

tagctggttt tattaatggt actttaccgt tttggaatga aacagaagcg gataaacggc 540

agataggtac tgatgcgaag atgagtttct ttaccaagat ggcaagaccc gctgttcaaa 600

gcgtgctgaa tagcgacgaa ctaacagatt tagtgaaaca attaccgtta ggagattata 660

gtccaacgaa catatcgaaa actatgatgc attcagcttt attgaaagag tcgtcagcgc 720

gtagcatatt gacgccaact tatgaatcgg aatatcagcg actcctgaat gtccgggagg 780

aaaaaagttt caaaatgttt agtcacgatc tagaactgag tacgaactac attaaaatgt 840

ttgacgttca gtattcgtct ggggtgcagc gccattttta ttttccagat caaaatttat 900

cgccttcttt tttcttacag aagaatttat tagggccaag gatgagcaca cgggtaagg 959

Claims

1.共同检测流行性出血病病毒和帕利亚姆血清群病毒的RPA-LFD引物和探针，其特征在于：

引物包括EHDV的RPA-LFD检测引物和PALV的RPA-LFD检测引物；

EHDV的RPA-LFD检测引物，包括上游引物EHDV_F和下游引物EHDV_R，核苷酸序列如下：

上游引物EHDV_F：tggattgcctgttttacatgattcaacttggga；（SEQ ID NO.1）；

下游引物EHDV_R：Bio-taacgcttgacgaacgatgacataactttcacccctaaac；（SEQ IDNO.2）；

PALV的RPA-LFD检测引物，包括上游引物PALV_F和下游引物PALV_R，核苷酸序列如下：

上游引物PALV_F：tactaaaatttcaagagggttttctcataaattgg；（SEQ ID NO.3）；

下游引物PALV_R：Bio-ggtcataactatattaagcgattcataataagcccc；（SEQ ID NO.4）；

与所述引物配合使用的探针为nfo探针，其核苷酸序列分别为：

EHDV_Probe：DIG-tttattgaacaaagagcgaagaacgaaatg[THF]aaatatatggagaca[C3-spacer]；（SEQ ID NO.5）；

PALV_Probe：FITC-tgaggatggttttactatgtatttaattcg[THF]gatccattgtgtgct[C3-spacer]；（SEQ ID NO.6）。

2.含有权利要求1所述引物和探针的试剂盒。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括：阴性对照模板、阳性对照模板、反转录试剂、扩增试剂和PCRD Nucleic Acid Detector。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的阴性对照模板为RNase-free水；所述的阳性对照模板为EHDV Seg-1 DNA片段和PALV Seg-1 DNA片段。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照模板的拷贝数为：EHDVSeg-1 DNA片段 7.1×10¹³拷贝/μL，PALV Seg-1 DNA片段 6.8×10¹³拷贝/μL。

6.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，反转录试剂包括5×PrimeScript RTMaster Mix和RNase-free水。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒的反转录体系为：5×PrimeScript RT Master Mix，2.0 μL；

总RNA，5.0 μL；

RNase-free水，3.0 μL；

总计10.0 μL；

反转录程序为：反转录37 ℃，15 min，共1个循环；反转录酶的失活85 ℃，5 s，共1个循环。

8.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：

所述的试剂盒的扩增体系为：

TwistAmp

nfo Kit RPA扩增试剂冷冻干粉，1 管；

Primer free rehydration buffer，29.5 μL；

上游引物EHDV_F，10 μmol/L，2.1 μL；

下游引物EHDV_R，10 μmol/L，2.1 μL；

上游引物PALV_F，10 μmol/L，2.1 μL；

下游引物PALV_R，10 μmol/L，2.1 μL；

nfo探针EHDV_Probe，10 μmol/L，0.6 μL；

nfo探针PALV_Probe，10 μmol/L，0.6 μL；

反转录的cDNA模板，1.0 μL；

RNase-free水，7.4 μL；

Magnesium acetate，280 mmol/L，2.5 μL；

总计50.0 μL；

扩增程序为：39 ℃，20 min。

9.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：

所述的试剂盒的检测体系为：

RPA扩增产物，6 μL；

PCRD extraction buffer，84 μL；

共计90.0 μL；

取75 μL上述混合液加入PCRD检测孔进行检测；

检测程序为：室温，10 min。