CN104651538A - 一种同时检测四种腹泻病毒的引物组及试剂盒 - Google Patents

一种同时检测四种腹泻病毒的引物组及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一组基于高分辨率熔解曲线分析技术同时检测四种腹泻病毒的引物组及含有上述引物的四联检测试剂盒，所述试剂盒可以特异性检测四种腹泻病毒：轮状病毒、星状病毒、诺如病毒、札如病毒。本发明通过对四种病毒基因组分别的同源性比对分析，寻找各自高度同源的保守序列设计引物，并利用高分辨率熔解曲线分析技术，同时检测四种腹泻病毒，具有简便快速、廉价、安全、灵敏度高、特异性强的特点，可以为腹泻病的防控和临床诊断提供有力的技术支持。

Description

一种同时检测四种腹泻病毒的引物组及试剂盒
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于高分辨率熔解曲线分析技术(High Resolution MeltingAnalysis,HRMA)的腹泻病毒快速检测试剂盒，及所述试剂盒中使用的对于四种腹泻病毒(轮状病毒、星状病毒、诺如病毒、札如病毒)具有特异性的四对引物。
背景技术
腹泻病(diarrhea diseases)是严重影响人类健康的一个重要公共卫生问题，在发展中国家如亚、非、拉地区尤为严重。世界卫生组织(WHO)统计数据显示，全球5岁以下婴幼儿，每年有10亿患腹泻，其中500万死亡。在中国，腹泻病是仅次于呼吸道疾病的第二位多发病，也是婴幼儿死亡的两大病因之一。病毒性腹泻在腹泻中占有重要的比例，轮状病毒(Rotavirus，RV)、星状病毒(Astrovirus，AV)、诺如病毒(Norovirus,NV)和扎如病毒(Sapovirus，SLV)等是主要的病原体。它们通过粪口途径在儿童和成人中引起急性胃肠炎的散发和暴发，甚至大流行，如2008年初在英国出现的诺如病毒大暴发，每周约有10万人感染该病毒，严重影响了人们的健康和社会的发展。因此，一套简便快速、特异性强的腹泻病毒检测技术，可以为腹泻病的防控和临床诊断提供有力的技术支持。
目前，针对腹泻病毒的检测，经典的方法有电镜观察、病毒分离培养、核酸杂交、酶联免疫等。电镜观察不但敏感度低，而且价格昂贵，设备和技术条件要求甚高，无法应用于临床常规检测和大规模的流行病学调查；病毒分离培养法的缺陷是操作繁琐，耗时很长，通常需要一周左右的时间才能观察到细胞病理变化，不适于快速检测和临床紧急病情处理；核酸杂交及酶联免疫检测因技术本身的限制，其灵敏度均比较低，漏检率高。较为现代的方法包括普通核酸扩增技术(PCR)和实时荧光核酸扩增技术(Real time PCR)等。PCR技术是终点法分析，需要反复升降温的循环扩增和PCR后的凝胶电泳分析结果，耗时较长，容易产生携带污染，使用的染料(EB等)具有致癌性，且其检测灵敏度仍有待提高。实时荧光核酸扩增技术无需电泳分析，但是需要使用较为昂贵的特异性探针，成本较高，不利于大规模使用。
近年来，一种全新的高分辨率熔解曲线分析技术(HRMA)被开发出来。HRMA使用了最新一代的饱和荧光染料，如LCGreen I或EvaGreen等，在常规PCR循环结束后设定温度从65℃逐渐上升到95℃。在此过程中，扩增子逐渐解链，在到达熔解温度(Tm)时，DNA链完全分开。在HRMA分析的初期，荧光强度很高，随着温度升高，双链DNA逐渐减少，荧光强度也就下降了。荧光PCR仪记录下荧光变化的整个过程，通过对数据的作图，就生成了高分辨率熔解曲线，其精度可达0.01℃。然后通过对这些曲线的分析实现高通量基因突变分析、基因分型、单核苷酸多态性分析、病原体检测等。相对于传统的PCR技术或实时荧光PCR技术而言，操作步骤大大简化，而且无需使用昂贵的探针，时间和成本也降低了不少，并且样品经PCR扩增后直接进行HRMA分析，无需转移，真正实现了闭管操作，降低了污染的风险。
目前针对腹泻病毒建立的HRMA分析技术极少，能搜索到的只有2篇报道，包括Etsuko Tajiri-Utagawa等人建立的用于检测诺如病毒的HRMA分析，以及Akihiko Hata等人建立的用于星状病毒检测的HRMA分析。但是尚无针对轮状病毒和札如病毒的HRMA分析技术，更没有同时检测这四种病毒的HRMA技术开发的报道。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一批对四种腹泻病毒具有特异性检测作用的引物；在此基础上，提供了一种基于HRMA技术，利用上述引物实现对四种腹泻病毒同时、快速、高特异性、高灵敏性检测的试剂盒。
本发明的技术方案为：
一组基于高分辨率熔解曲线分析技术同时检测四种腹泻病毒的引物组，包括，
用于检测轮状病毒的引物：
正向F1：5’-GATACNTTRCCTGAYGGAGA-3’(SEQ ID NO.1)，
反向R1：5’-CATCYTGAAAKATDGCATCACA-3’(SEQ ID NO.2)；
用于检测星状病毒的引物：
正向F2：5’-AAAAYGTDCGAHTGAAGGA-3’(SEQ ID NO.3)，
反向R2：5’-ABACAGTTCTYAACCAATG-3’(SEQ ID NO.4)；
用于检测诺如病毒的引物：
正向F3：5’-AGRGTBGTCGTHTGGGACGA-3’(SEQ ID NO.5)，
反向R3：5’-TGNGGGGTGTTNCCRTTCTT-3’(SEQ ID NO.6)；
用于检测札如病毒的引物：
正向F4：5’-ACTGTNMAYGGKTTCCATGT-3’(SEQ ID NO.7)，
反向R4：5’-CAGGRGANCGGTGTGTRCCAAT-3’(SEQ ID NO.8)；
所述引物的病毒核酸变异位点使用简并碱基，R为A/G，K为G/T，M为A/C，W为A/T，Y为C/T，S为C/G，V为A/C/G，B为C/G/T，H为A/T/C，D为A/G/T，N为A/G/T/C。
本发明的内容还包括一组基于高分辨率熔解曲线分析技术同时检测四种腹泻病毒的四联检测试剂盒，含有上述的引物组。
进一步地，所述的四联检测试剂盒中包括2X扩增反应液、5X酶混合液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。
进一步地，所述2X扩增反应液包括：Tris-HCl、KCl、MgCl2、DTT、亚精胺、Tween-20、牛血清白蛋白、dNTP、荧光染料、和权利要求1所述引物组。
进一步地，所述荧光染料为EvaGreen。
进一步地，所述5X酶混合液包括反转录酶、RNases抑制剂和HS-Taq酶。
进一步地，所述阳性对照品分别为轮状病毒、星状病毒、诺如病毒和札如病毒体外转录的RNA片段。
进一步地，所述阴性对照品为无菌生理盐水。
进一步地，所述空白对照为DEPC处理的无核酸酶的超纯水。
本发明中一种基于HRMA技术的腹泻病毒检测用试剂盒所采用的技术方案是，所述的四联检测试剂盒扩增反应液组分如下表1所示：
表1 2X扩增反应液组分
酶混合液组分如下表2所示：
表2 5X酶混合液组分
本发明通过对轮状病毒、诺如病毒、星状病毒和札如病毒四种病毒基因组分别的同源性比对分析，寻找高度同源的保守序列设计引物，并利用高分辨率熔解曲线分析技术，同时检测四种腹泻病毒，具有简便快速、廉价、安全、灵敏度高、特异性强的特点，可以为腹泻病的防控和临床诊断提供有力的技术支持。
为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
图1是实施例三中灵敏度分析结果。A-D分别为轮状病毒、诺如病毒、星状病毒和札如病毒样本采用本发明所述HRMA试剂盒检测时的灵敏度，E-H分别为轮状病毒、诺如病毒、星状病毒和札如病毒样本采用普通RT-PCR检测时的灵敏度。样本1：1×108拷贝；2：1×107拷贝；3：1×106拷贝；4：1×105拷贝；5：1×104拷贝；6：1×103拷贝；7：1×102拷贝；8：1×101拷贝；9：1×100拷贝；10：NTC(阴性对照)。M：100bp DNAMarker。
图2是实施例四中特异性分析结果。其中样本1：轮状病毒，2：星状病毒，3：诺如病毒，4：札如病毒，5：肠病毒EV71，6：柯萨奇病毒A16型，7：霍乱弧菌，8：沙门氏菌，9为阴性对照。
图3是实施例五中临床样本检测结果。图A为HRMA检测结果，图B为普通RT-PCR检测结果。M：50bp DNAMarker。
具体实施方式
下面通过具体的腹泻病毒检测过程来对本发明进行说明。
实施例一：特异性引物设计
首先从美国NCBI的基因库下载尽量多的轮状病毒、星状病毒、诺如病毒和札如病毒的基因组DNA序列，然后利用分子生物学软件Bioedit对下载的序列进行同源比对分析，寻找高度同源的保守序列作为引物和探针设计的候选区，同时结合软件PrimerSelect进行引物设计。核心设计思想是：综合考虑对腹泻病毒检测的特异性和通用性(在病毒核酸变异位点用简并碱基处理)、引物设计应遵循的普遍性原则(如Tm值、3’末端自由能、GC含量、避免出现内部二级结构及形成二聚体等)，以及多重扩增反应时各引物之间的相互影响等。对于设计出的引物合成回来后再通过临床样本进行筛选验证，最后本发明优选出如下引物：
轮状病毒正向引物F1：5’-GATACNTTRCCTGAYGGAGA-3’(其在GenBank参考序列KF907285的位置为502-521)，反向引物R1：5’-CATCYTGAAAKATDGCATCACA-3’(其在GenBank参考序列KF907285的位置为667-688)；
星状病毒正向引物F2：5’-AAAAYGTDCGAHTGAAGGA-3’(其在GenBank参考序列L23513的位置为492-510)，反向引物R2：5’-ABACAGTTCTYAACCAATG-3’(其在GenBank参考序列L23513的位置为785-803)；
诺如病毒正向引物F3：5’-AGRGTBGTCGTHTGGGACGA-3’(其在GenBank参考序列AB447442的位置为1620-1639)，反向引物R3：5’-TGNGGGGTGTTNCCRTTCTT-3’(其在GenBank参考序列AB447442的位置为1977-1996)；
札如病毒正向引物F4：5’-ACTGTNMAYGGKTTCCATGT-3’(其在GenBank参考序列NC_006269的位置为3460-3479)，反向引物R4：5’-CAGGRGANCGGTGTGTRCCAAT-3’(其在GenBank参考序列NC_006269的位置为3913-3934)。
所述引物的病毒核酸变异位点使用简并碱基，R为A/G，K为G/T，M为A/C，W为A/T，Y为C/T，S为C/G，V为A/C/G，B为C/G/T，H为A/T/C，D为A/G/T，N为A/G/T/C。
实施例二：基于HRMA技术检测四种腹泻病毒的试剂盒组成和检测方法
1.试剂盒的组成(保存于-20℃)
(1)2X扩增反应液：其组分为：100mM Tris-HCl(pH8.3)、100mM KCl、20mM MgCl2、20mM DTT、1mM Spermidine、0.1％Tween-20、0.2mg/L BSA、0.4mM dNTP、2.4μM EvaGreen、1.2μM引物F1、1.2μM引物R1、0.4μM引物F2、0.4μM引物R2、1.6μM引物F3、1.6μM引物R3、1.6μM引物F4、1.6μM引物R4；其中引物F1是序列编号为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，引物R1是序列编号为SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，引物F2是序列编号为SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，引物R2是序列编号为SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，引物F3是序列编号为SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，引物R3是序列编号为SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列，引物F4是序列编号为SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，引物R4是序列编号为SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列；
(2)5X酶混合液：其组分为：1.5U/μLAMV反转录酶、5U/μL RibonucleaseInhibitor、5U/μL HS-Taq酶；
(3)阳性对照：分别为轮状病毒、星状病毒、诺如病毒和札如病毒体外转录的RNA片段；
(4)阴性对照：为无菌生理盐水，在核酸提取时与标本同时平行提取以作为阴性对照使用；
(5)空白对照：为DEPC处理的无核酸酶的超纯水。
2.阳性对照品的制备
随机选择轮状病毒、星状病毒、诺如病毒和札如病毒感染临床腹泻样本各一份，提取病毒RNA。在本试剂盒发明的引物的外侧设计特异性引物扩增一段基因片段，并进行序列测定。测序结果与GenBank中随机选择的10条上述四种病毒基因序列进行同源比对分析，保证其同源性达到95％以上。然后利用T7RNA聚合酶进行体外转录获得单链RNA，转录后用DNase I消化去除其中的DNA分子，然后利用QIAGEN RNeasy MiniElute Cleanup kit进行过柱纯化。利用微量紫外分光光度计测定纯化后RNA的浓度，通过其分子量计算出拷贝数。分装后于-80℃保存，作为试剂盒的阳性对照。
3.试剂盒的检测方法如下：
(1)提取样品的RNA，即模板RNA：本发明试剂盒未提供RNA样本提取试剂，用户可根据样本类型选用合适的商品化试剂盒提取病毒核酸；
(2)按照以下方法配制反应液：反应体积为25μL；取12.5μL 2X扩增反应液、5μL 5X酶混合液、2.5μL超纯水加入0.2ml光学PCR反应管，再加入5μL样本RNA或阳性对照、阴性对照和空白对照，振荡混匀后瞬时离心数秒；
(3)上机检测：将反应管置于荧光PCR仪上进行扩增和检测。反应条件是：42℃10分钟；94℃2分钟；40个循环的94℃30秒-56℃30秒-72℃30秒；55℃到95℃逐步上升，每次上升0.1℃并维持2秒，持续收集荧光信号(FAM通道)。
(4)结果判定：首先是质控***判断，即阳性对照的熔解曲线必须要均匀分布且呈现标准的反S形曲线，阴性对照和空白对照无典型反S形熔解曲线，否则***检测无效。当***检测是有效时，判断待检样本结果，当待检样本的熔解曲线同阳性对照样本的一致时判断为阳性样本，当待检样本无典型反S形熔解曲线或同阴性对照和空白对照的一致时判断为阴性样本。
(5)注意事项：实验全过程都应使用无粉手套。为了避免实验中的交叉污染，在加模板的过程中，应首先加空白和阴性对照，其次加待检样本，最后加阳性对照。
实施例三：基于HRMA技术检测四种腹泻病毒的试剂盒的灵敏度分析
1.方法：
(1)样本处理：以上述体外转录的病毒RNA作为检测用的模板，利用微量紫外分光光度计测定纯化后RNA的浓度，通过分子量计算出初始RNA模板的拷贝数,然后将其依次做10倍梯度稀释至个位拷贝数，共计9个梯度，拷贝数为：1×108至1×100。
(2)平行对照实验：分别选择本发明所述HRMA检测试剂盒和普通RT-PCR技术(基础试剂购自宝生物工程(大连)有限公司，货号DRR055A)对上述9个梯度稀释样本和1个阴性对照进行扩增检测。
HRMA检测：采用实施例二所述检测方法进行反应液配制，然后将反应管置于荧光PCR仪上进行扩增和检测。反应条件是：42℃10分钟；94℃2分钟；40个循环的94℃30秒-56℃30秒-72℃30秒；55℃到95℃逐步上升，每次上升0.1℃并维持2秒，持续收集荧光信号(FAM通道)。反应完成后观察荧光曲线图谱，分析本发明所述试剂盒所能检测到的模板拷贝数最低限。
普通RT-PCR检测：20μL RT-PCR反应体系中含有2×One Step RT-PCRBuffer 10μL，20μM正向引物和反向引物各0.8μL，PrimeScript One StepEnzyme Mix 0.8μL。RT-PCR的反应条件为：50℃30min；94℃3min；(94℃30sec，56℃30sec，72℃30sec)×35个循环，72℃7min。扩增片段大小分别为轮状病毒186bp，星状病毒311bp，诺如病毒376bp，札如病毒474bp。整个RT-PCR上机运行时间约150分钟。RT-PCR反应结束后，取5μL产物在2.0％的琼脂糖凝胶中进行电泳，电泳时间为40分钟，电泳结束后用凝胶成像***观察结果并拍照。
2.结果：平行对照实验的检测结果表明，本发明所述HRMA试剂盒的检测下限分别为：轮状病毒1×100拷贝(图1A)；星状病毒1×102拷贝(图1B)；诺如病毒1×100拷贝(图1C)；札如病毒1×103拷贝(图1D)。普通RT-PCR反应的检测最低限则分别为1×103拷贝(图1E)、1×103拷贝(图1F)、1×103拷贝(图1G)、1×104拷贝(图1H)。因此，本发明所述HRMA试剂盒的灵敏度比普通RT-PCR高1000倍(对轮状病毒和诺如病毒而言)或10倍(对星状病毒和札如病毒而言)。可见，本发明所述HRMA检测试剂盒安全、高效，灵敏度高，能在快速应急检测和微量样本检测中发挥重要作用。
实施例四：基于HRMA技术检测四种腹泻病毒的试剂盒的特异性分析
1.样本：选择一组腹泻相关病原体的临床阳性样本，依次编号，分别为1：轮状病毒，2：星状病毒，3：诺如病毒，4：札如病毒，5：肠病毒EV71，6：柯萨奇病毒A16型，7：霍乱弧菌，8：沙门氏菌；9为阴性对照。
2.方法：使用本发明所述HRMA检测试剂盒，采用实施例二所述方法对以上9份样本进行检测，观察该试剂盒是否会发生非特异性的检测结果。
3.结果：根据HRMA检测试剂盒扩增的荧光图谱进行高分辨率熔解曲线分析，本发明所述试剂盒仅对1-4号样本的检测结果为阳性，其它病原体和阴性对照的检测均为阴性，证明该方法有较好的特异性。结果见图2。
实施例五：基于HRMA技术检测四种腹泻病毒的试剂盒对临床样品的检测
1.样本：全部来源于本实验室保存的粪便标本。其中从300份腹泻粪便标本中随机选择10份，从30份正常粪便标本中选择1份，同时进行检测。
2.方法：采用双盲法将随机选择的11份标本打乱编号，再进行核酸提取，分别采用本发明所述HRMA检测试剂盒和普通RT-PCR技术进行检测，最后对比检测结果的符合率。
3.检测步骤：
(1)病毒核酸提取：挑取100mg粪便标本于800μL生理盐水中振荡混匀，8000rpm离心5分钟，取200μL上清用于RNA提取，采用德国QIAGEN公司的试剂盒QIAamp MinElute Virus SpinKit(货号：57704)，按试剂盒说明书进行操作；
(2)HRMA检测：按实施例二的方法进行操作；
(3)普通RT-PCR检测：按实施例三的方法进行操作。
4.检测结果：利用本发明提供的HRMA检测试剂盒可检出全部10份病毒阳性样本，与普通RT-PCR的检测结果完全一致，两种方法的符合率为100％，检测结果见图3和表3。
表3 11份临床样本检测结果
注：R：轮状病毒；A：星状病毒；N：诺如病毒；S：札如病毒。
本发明通过对四种病毒基因组分别的同源性比对分析，寻找高度同源的保守序列设计引物，并利用高分辨率熔解曲线分析技术，同时检测四种腹泻病毒，具有简便快速、廉价、安全、灵敏度高、特异性强的特点，可以为腹泻病的防控和临床诊断提供有力的技术支持，可广泛应用于临床和口岸的常规检测和疾病防控领域。
需要注意的是，上述仅以优选实施例对本发明进行了说明，并不能就此局限本发明的权利范围，因此在不脱离本发明思想的情况下，凡运用本发明说明书和附图部分的内容所进行的等效变化，均应包含在本发明的权利要求范围内。

Claims (9)

1.一组基于高分辨率熔解曲线分析技术同时检测四种腹泻病毒的引物组，包括，
用于检测轮状病毒的引物：
正向F1：5’-GATACNTTRCCTGAYGGAGA-3’(SEQ ID NO.1)，
反向R1：5’-CATCYTGAAAKATDGCATCACA-3’(SEQ ID NO.2)；
用于检测星状病毒的引物：
正向F2：5’-AAAAYGTDCGAHTGAAGGA-3’(SEQ ID NO.3)，
反向R2：5’-ABACAGTTCTYAACCAATG-3’(SEQ ID NO.4)；
用于检测诺如病毒的引物：
正向F3：5’-AGRGTBGTCGTHTGGGACGA-3’(SEQ ID NO.5)，
反向R3：5’-TGNGGGGTGTTNCCRTTCTT-3’(SEQ ID NO.6)；
用于检测札如病毒的引物：
正向F4：5’-ACTGTNMAYGGKTTCCATGT-3’(SEQ ID NO.7)，
反向R4：5’-CAGGRGANCGGTGTGTRCCAAT-3’(SEQ ID NO.8)；
所述引物的病毒核酸变异位点使用简并碱基，R为A/G，K为G/T，M为A/C，W为A/T，Y为C/T，S为C/G，V为A/C/G，B为C/G/T，H为A/T/C，D为A/G/T，N为A/G/T/C。
2.一组基于高分辨率熔解曲线分析技术同时检测四种腹泻病毒的四联检测试剂盒，含有权利要求1所述的引物组。
3.根据权利要求2所述的四联检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括2X扩增反应液、5X酶混合液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。
4.根据权利要求3所述的四联检测试剂盒，其特征在于：所述2X扩增反应液包括：Tris-HCl、KCl、MgCl2、DTT、亚精胺、Tween-20、牛血清白蛋白、dNTP、荧光染料和权利要求1所述引物组。
5.根据权利要求4所述的四联检测试剂盒，其特征在于：所述荧光染料为EvaGreen。
6.根据权利要求3所述的四联检测试剂盒，其特征在于：所述5X酶混合液包括反转录酶、RNases抑制剂和HS-Taq酶。
7.根据权利要求3所述的四联检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照品分别为轮状病毒、星状病毒、诺如病毒和札如病毒体外转录的RNA片段。
8.根据权利要求3所述的四联检测试剂盒，其特征在于：所述阴性对照品为无菌生理盐水。
9.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述空白对照为DEPC处理的无核酸酶的超纯水。
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