CN110452951A - 监测mRNA Ploy(A)尾长度的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种监测mRNA Ploy(A)尾长度的方法及应用，涉及生物技术领域，本发明提供的监测mRNA Ploy(A)尾长度的方法，包括在mRNA加尾反应中，测定ATP消耗量和/或PPi生成量得到mRNA Ploy(A)加尾长度。该方法适用于任何类型的mRNA，普适性广，能够有效替代现有技术中所使用的毛细管电泳等复杂的检测方法而对mRNA加尾长度进行快速且有效的检测，使检测更加简单高效，并且，利用ATP的消耗量与mRNA加尾长度的关系监测mRNA Ploy(A)尾长度，结果更直观、准确。同时，对ATP消耗量的检测无需昂贵的仪器，检测成本较低。

Description

监测mRNA Ploy(A)尾长度的方法及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种监测mRNA Ploy(A)尾长度的方法及应用。
背景技术
信使RNA(mRNA)是一种极具潜力的新治疗方案，在免疫学、肿瘤学和疫苗等领域都有广泛前景。mRNA包含着细胞制造蛋白质并将其送到身体各个部位的指令，因此mRNA作为药物使用可指导细胞内蛋白质表达或者细胞外蛋白分泌。有效的mRNA疗法需要将mRNA有效递送至患者体内并且在患者体内有效生成由该mRNA编码的蛋白。为了防止mRNA降解、增强其稳定性，通常在mRNA的3'端需要进行适当的加尾。因此，准确反映Ploy(A)尾长度对于mRNA在生产过程中的质量控制十分重要。
传统的方法为通过电泳检测加尾前后mRNA分子量的变化来反映加尾长度，此方法耗时长并且成本高。目前还没有简单、快速并且实时监测的方法来控制mRNA生产过程中的加尾长度。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种监测mRNA Ploy(A)尾长度的方法，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。
本发明的第二个目的在于提供上述一种监测mRNA Ploy(A)尾长度的方法在mRNA质量控制中的应用。
本发明提供了一种监测mRNA Ploy(A)尾长度的方法，所述方法包括：在mRNA加尾反应中，通过测定ATP消耗量和/或PPi生成量，得到mRNA Ploy(A)尾长度；
所述mRNA Ploy(A)尾长度＝ATP消耗量/mRNA的反应浓度；
所述mRNA Ploy(A)尾长度＝PPi生成量/mRNA的反应浓度。
进一步地，通过测定标准加尾反应中不同反应时间点的ATP消耗量，建立标准mRNA加尾长度和反应时间的标准曲线，利用所述标准曲线，在mRNA加尾反应中得到mRNA Ploy(A)尾长度；
优选地，通过测定标准加尾反应中不同时间点的PPi生成量，建立标准mRNA加尾长度和反应时间的标准曲线，利用所述标准曲线，在mRNA加尾反应中得到mRNA Ploy(A)尾长度。
进一步地，ATP消耗量的测定方法包括：高效液相色谱法、凝胶电泳法、毛细管电泳法、分光光度法或生物发光法，优选为生物发光法。
进一步地，在标准加尾反应中，所述标准mRNA的反应浓度恒定；
优选地，在mRNA加尾反应中，所述mRNA的反应浓度恒定。
进一步地，在标准加尾反应中，所述标准mRNA的反应浓度为0.1μM-1μM，优选为0.2μM-0.8μM，更优选为0.6μM。
进一步地，在标准加尾反应中，所述ATP的起始浓度为50μM-5mM，优选为200μM-2mM，更优选为500μM。
进一步地，所述mRNA Ploy(A)尾长度＝ATP消耗量/mRNA的反应浓度，所述ATP消耗量＝ATP的起始浓度×ATP消耗量百分比/mRNA的反应浓度。
进一步地，ATP消耗量百分比＝(C0-Ct)/C0；
所述C0为反应时间为0分钟时的ATP实时检测浓度，所述Ct为不同反应时间点的ATP实时检测浓度。
进一步地，所述监测mRNA Ploy(A)尾长度的方法包括以下步骤：
(a)搭建标准mRNA的加尾反应，分别在0分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟和35分钟取样，终止加尾反应后测定ATP消耗量，得到ATP消耗量与时间的对应关系；
其中，ATP消耗量＝ATP的起始浓度×ATP消耗量百分比；
所述ATP消耗量百分比＝(C0-Ct)/C0；
所述C0为反应时间为0分钟时的ATP实时检测浓度，所述Ct为不同反应时间点的ATP实时检测浓度；
(b)根据mRNA Ploy(A)尾长度＝ATP消耗量/mRNA的反应浓度，其中，ATP消耗量＝ATP的起始浓度×ATP消耗量百分比/mRNA的反应浓度，通过步骤(a)得到的ATP消耗量与时间的对应关系，建立标准mRNA加尾长度和反应时间的标准曲线；
(c)根据步骤(b)得到的标准mRNA加尾长度和反应时间的标准曲线，在mRNA加尾反应中，通过mRNA Ploy(A)尾长度＝(ATP的起始浓度×(C0-Ct)/C0)/mRNA的反应浓度监测mRNA Ploy(A)尾长度；
优选地，在标准mRNA的加尾反应中，所述标准mRNA的反应浓度恒定为0.6μM；
优选地，在标准mRNA的加尾反应中，所述ATP的起始浓度为500μM。
本发明还提供了上述的监测mRNA Ploy(A)尾长度的方法在mRNA质量控制中的应用。
另外，本发明还提供了一种监测mRNA Ploy(A)尾长度的仪器，所述监测mRNA Ploy(A)尾长度的仪器利用上述的监测mRNA Ploy(A)尾长度的方法监测mRNA Ploy(A)的尾长度。
本发明提供的监测mRNA Ploy(A)尾长度的方法，包括在mRNA加尾反应中，测定ATP消耗量和/或PPi生成量，通过mRNA Ploy(A)尾长度＝ATP的消耗量/mRNA的反应浓度、mRNAPloy(A)尾长度＝PPi生成量/mRNA的反应浓度，即可得到mRNA Ploy(A)尾长度。该方法适用于任何类型的mRNA，普适性广，能够有效替代现有技术中所使用的毛细管电泳等复杂的检测方法而对mRNA加尾长度进行快速且有效的检测，使检测更加简单高效，并且，利用ATP消耗量和/或PPi生成量与mRNA加尾长度的关系监测mRNA Ploy(A)尾长度，结果更直观、准确。同时，对ATP消耗量和/或PPi生成量的检测无需昂贵的仪器，检测成本较低。
此外，通过对mRNA Ploy(A)尾长度的控制，能够直接影响mRNA产品对目标蛋白质的表达能力，基于此，本发明提供的监测mRNA Ploy(A)尾长度的方法能够用于mRNA生产过程中的质量控制。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的mRNA加尾反应的机理示意图；
图2为本发明提供的采用生物发光法检测ATP的消耗量的反应机理示意图；
图3为本发明实施例1提供的时间与ATP消耗量的线性关系结果图；
图4为本发明实施例1提供的加尾长度与时间的对应关系的结果图；
图5为本发明实施例2提供的不同样品加尾长度的结果图；
图6为本发明实施例2提供的不同加尾长度的mRNA细胞转染蛋白表达水平的结果图；
图7为本发明对比例1提供的通过毛细管电泳检测mRNA加尾10分钟后分子量变化的结果图；
图8为本发明对比例1提供的通过毛细管电泳检测mRNA加尾20分钟后分子量变化的结果图；
图9为本发明对比例1提供的通过毛细管电泳检测mRNA加尾30分钟后分子量变化的结果图；
图10为本发明实验例1提供的两种方法的检测结果对比图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
大多数真核生物的mRNA 3’末端都有由100～200个A组成的Poly(A)尾巴，即mRNAPloy(A)尾。该mRNA Poly(A)尾不是由DNA编码的，而是转录后的前mRNA以ATP为前体，由RNA末端腺苷酸转移酶，即Ploy(A)聚合酶催化聚合到3’末端的。已知mRNA Poly(A)尾的功能是：①可能有助mRNA从核到细胞质转运；②避免在细胞中受到核酶降解，增强mRNA的稳定性；③担任核糖体的一个识别信号。因此，对mRNA加尾及对加尾长度的控制具有重要意义。
基于此，本发明提供了一种监测mRNA Ploy(A)尾长度的方法，所述方法包括：在mRNA加尾反应中，通过测定ATP消耗量和/或PPi生成量，得到mRNA Ploy(A)尾长度；
所述mRNA Ploy(A)尾长度＝ATP的消耗量/mRNA的反应浓度；
所述mRNA Ploy(A)尾长度＝PPi生成量/mRNA的反应浓度。
本发明提供的监测mRNA Ploy(A)尾长度的方法，适用于任何类型的mRNA，普适性广，能够有效替代现有技术中所使用的毛细管电泳等复杂的检测方法而对mRNA加尾长度进行快速且有效的检测，使检测更加简单高效，并且，利用ATP消耗量和/或PPi生成量与mRNA加尾长度的关系监测mRNA Ploy(A)尾长度，结果更直观、准确。同时，对ATP消耗量的检测无需昂贵的仪器，检测成本较低。
可以理解的是，mRNA Ploy(A)尾长度指的是由Ploy(A)聚合酶催化聚合到mRNA 3’末端的碱基A的长度，1个碱基A为1nt。
mRNA加尾反应指的是转录后的前mRNA以ATP为前体，由Ploy(A)聚合酶催化ATP转化为碱基A聚合到mRNA 3’末端的反应。通过图1可知，每消耗一个单位ATP，mRNA的Ploy(A)尾可以延长一个碱基A，同时生成一个单位的反应副产物PPi，因此通过对ATP消耗量和/或PPi生成量的检测，可以得到加尾长度。
具体地，“和/或”指的是，可以仅通过测定ATP消耗量，并利用mRNA Ploy(A)尾长度＝ATP消耗量/mRNA的反应浓度的对应关系，得到mRNA Ploy(A)尾长度；或者仅通过测定PPi生成量，并利用mRNA Ploy(A)尾长度＝PPi生成量/mRNA的反应浓度的对应关系，得到mRNAPloy(A)尾长度；或者同时测定ATP消耗量和PPi生成量，并相应地利用mRNA Ploy(A)尾长度＝ATP消耗量/mRNA的反应浓度和mRNA Ploy(A)尾长度＝PPi生成量/mRNA的反应浓度的对应关系，得到mRNA Ploy(A)尾长度。
对ATP消耗量的测定方法不做限定，现有技术中凡是能够准确测得ATP消耗量的方法均可。例如可以为，但不限于高效液相色谱法、凝胶电泳法、毛细管电泳法、分光光度法或生物发光法等。同样地，对PPi生成量的测定方法也不做限定，现有技术中凡是能够准确测得PPi生成量的方法均可。
需要说明的是，在本发明中mRNA Ploy(A)尾长度＝ATP消耗量/mRNA的反应浓度，其中，ATP消耗量的单位为浓度单位，mRNA的反应浓度单位也为浓度单位，二者之比即为mRNA Ploy(A)尾长度，典型的mRNA Ploy(A)尾长度的单位为“nt”，ATP消耗量单位为“μM”，mRNA的反应浓度单位为“μM”。
同样地，在本发明中，mRNA Ploy(A)尾长度＝PPi生成量/mRNA的反应浓度，其中，PPi生成量的单位为浓度单位，mRNA的反应浓度单位也为浓度单位，二者之比即为mRNAPloy(A)尾长度，典型的mRNA Ploy(A)尾长度的单位为“nt”，PPi生成量单位为“μM”，mRNA的反应浓度单位为“μM”。
在一些优选的实施方式中，通过测定标准加尾反应中不同反应时间点的ATP消耗量，建立标准mRNA加尾长度和反应时间的标准曲线，利用所述标准曲线，在mRNA加尾反应中得到mRNA Ploy(A)尾长度；
优选地，通过测定标准加尾反应中不同时间点的PPi生成量，建立标准mRNA加尾长度和反应时间的标准曲线，利用所述标准曲线，在mRNA加尾反应中得到mRNA Ploy(A)尾长度。
可以理解的是，通过测定标准加尾反应中不同时间点的ATP的消耗量和/或PPi的生成量，能够建立ATP消耗量和/或PPi生成量与反应时间的标准曲线，由mRNA Ploy(A)尾长度＝ATP消耗量/mRNA的反应浓度、所述mRNA Ploy(A)尾长度＝PPi生成量/mRNA的反应浓度，即可得出标准mRNA加尾长度和反应时间的标准曲线。在本实施方式中对不同取样时间点不做限定，足够准确得出建立ATP消耗量和/或PPi生成量与反应时间的标准曲线即可，例如可以为0分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟，或0分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟等。
其中，标准加尾反应可以为预实验反应或者小试反应，通过预实验反应或小试反应建立标准曲线，能够有效降低检测成本。
在放大的生产过程中，利用预实验反应或小试反应建立起来的标准曲线，通过代入放大生产所经过的时间，即可得到实时的加尾长度，从而对放大生产的进程和所生产的加尾mRNA的质量有一个实时的回馈和把控。
需要说明的是，在本实施方式中，放大生产所用的实验试剂优选与建立标准曲线的预实验反应或小试实验反应所用的实验试剂相同，避免不同批次或不同厂家所生产的实验试剂之间的误差导致监测结果不准确。
在一些优选的实施方式中，ATP消耗量的测定方法包括：高效液相色谱法、凝胶电泳法、毛细管电泳法、分光光度法或生物发光法，优选为生物发光法。
可以理解的是，生物发光法是一种经过简化的生物化学方法，利用ATP与荧光素-荧光素酶复合物的反应来对ATP进行定性或定量检测。该方法简单快速，仅需要约一分钟的时间且不需要样品预制就可以得到ATP消耗量的信号，后通过简单计算得到加尾长度。
本实施方式采用生物发光法检测ATP的消耗量，其原理是萤火虫荧光素酶催化荧光素产生荧光时消耗ATP提供能量，当萤火虫荧光素酶和荧光素都过量时，在一定的浓度范围内，荧光产生的信号强度和ATP的浓度成正比，因此可以直接反映检测溶液中的ATP的含量(化学发光信号)。具体反应机理如图2所示。其中，luciferin底物、Luciferase酶和反应buffer预先配置好作为检测工作液。在加尾反应过程中，实时取样并加入配置好的检测工作液，通过检测发光信号得到实时的加尾反应的ATP含量信号(化学发光值)，其中，光学信号可以被酶标仪检测。
在一些优选的实施方式中，在标准加尾反应中，所述标准mRNA的反应浓度恒定；优选地，在mRNA加尾反应中，所述mRNA的反应浓度恒定。
由于mRNA Ploy(A)尾长度＝ATP的消耗量/mRNA的反应浓度，因此，控制标准mRNA的反应浓度恒定和/或mRNA的反应浓度恒定，能够更有效地保证监测结果的准确性。
在一些优选的实施方式中，在标准加尾反应中，所述标准mRNA的反应浓度为0.1μM-1μM，例如可以为，但不限于0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM或1μM，优选为0.2μM-0.8μM，更优选为0.6μM。
通过对标准mRNA的反应浓度进行进一步的调整和优化，能够使得每单位加尾酶的催化效率最优，节约生产成本。
在一些优选的实施方式中，在标准加尾反应中，所述ATP的起始浓度为50μM-5mM，例如可以为，但不限于50μM、100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM、900μM、1mM、2mM、3mM、4mM或5mM，优选为200μM-2mM，更优选为500μM。
通过对ATP的起始浓度进行进一步的调整和优化，能够满足在标准加尾反应时间15-30分钟左右，稳定可控地实现加尾长度150-200碱基。
在一些优选的实施方式中，所述mRNA Ploy(A)尾长度＝(ATP的起始浓度×ATP消耗量百分比)/mRNA的反应浓度。
需要说明的是，ATP的起始浓度指反应开始时ATP的浓度，即整个反应过程中ATP的最高浓度。
在一些优选的实施方式中，ATP消耗量百分比＝(C0-Ct)/C0；
所述C0为反应时间为0分钟时的ATP实时检测浓度，即ATP的起始浓度检测信号值，所述Ct为不同反应时间点的ATP实时检测浓度。
通过上述公式即可简单快速地通过不同时间点ATP实时浓度检测得到ATP消耗量百分比。
当使用生物发光法对ATP消耗量进行检测时，不同加尾反应时间点的ATP消耗量计算方法如下：
ATP消耗量百分比(％)＝(I0-It)/I0；
其中，I0为时间为0分钟时的化学发光强度，即ATP的起始化学发光强度，It为不同检测时间t的化学发光强度。
在一些优选的实施方式中，所述监测mRNA Ploy(A)尾长度的方法包括以下步骤：
(a)搭建标准mRNA的加尾反应，分别在0分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟和35分钟取样，终止加尾反应后测定ATP的消耗量，得到ATP消耗量与时间的对应关系；
其中，ATP消耗量＝ATP的起始浓度×ATP消耗量百分比；
所述ATP消耗量百分比＝(C0-Ct)/C0；
所述C0为反应时间为0分钟时的ATP实时检测浓度，即ATP的起始浓度检测信号值，所述Ct为不同反应时间点的ATP实时检测浓度；
(b)根据mRNA Ploy(A)尾长度＝ATP消耗量/mRNA的反应浓度，其中，ATP消耗量＝ATP的起始浓度×ATP消耗量百分比/mRNA的反应浓度，通过步骤(a)得到的ATP消耗量与时间的对应关系，建立标准mRNA加尾长度和反应时间的标准曲线；
(c)根据步骤(b)得到的标准mRNA加尾长度和反应时间的标准曲线，在mRNA加尾反应中，通过mRNA Ploy(A)尾长度＝(ATP的起始浓度×(C0-Ct)/C0)/mRNA的反应浓度监测mRNA Ploy(A)尾长度。
当使用生物发光法对ATP消耗量进行检测时，在步骤(a)前还包括配制ATP检测工作液的步骤。
当使用生物发光法对ATP消耗量进行检测时，在步骤(a)中，将不同时间点所取的样品放入-80℃冰箱急冻至少30秒使加尾反应酶失活，从而终止加尾反应，停止ATP消耗。终止加尾反应后，在十秒内加入10倍体积的室温检测工作液，并在十秒内转移检测液至96孔板，检测化学发光值。
另外，本发明还提供了上述的监测mRNA Ploy(A)尾长度的方法在mRNA质量控制中的应用。
通过对mRNA Ploy(A)尾长度的控制，能够直接影响mRNA产品对目标蛋白质的表达能力，基于此，本发明提供的监测mRNA Ploy(A)尾长度的方法能够用于mRNA生产过程中的质量控制，进而用于对治疗应用质量的评估。
本发明还提供了一种监测mRNA Ploy(A)尾长度的仪器，所述监测mRNA Ploy(A)尾长度的仪器利用上述的监测mRNA Ploy(A)尾长度的方法监测mRNA Ploy(A)的尾长度。
可以理解的是，对本发明中监测mRNA Ploy(A)尾长度的仪器的具体结构不做限定，凡是利用基于本发明提供的监测mRNA Ploy(A)尾长度的方法的发明构思达到监测mRNAPloy(A)的尾长度的仪器均在本发明的保护范围之内。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本发明实施例中用到的主要试剂信息如下：
主要试剂：
主要仪器：
本实验使用Molecular Devices公司的型号为SpectraMax M5的酶标仪进行化学发光检测。
实施例1使用生物发光法检测ATP消耗量控制加尾长度
1、标准加尾反应
S1、配制ATP检测工作液
按照每个样品需要100μl ATP检测工作液的比例配制适当量的ATP检测工作液。取适量的ATP检测试剂，按照1:9的比例用ATP检测试剂稀释液稀释ATP检测试剂。例如100μlATP检测试剂加入900μl ATP检测试剂稀释液配制成1ml ATP检测工作液。该检测工作液在使用前，于室温放置3-5分钟。
S2、搭建标准加尾反应
在浓度恒定为0.6μM mRNA的加尾反应中加入500μM的ATP进行反应，分别在反应时间为0、5、10、15、20、25、30、35min时取样10μl加入EP管后，放入-80℃冰箱急冻30秒，然后迅速将100μl的ATP检测工作液分别加入EP管，迅速转移检测液与样品混合液至96孔板，检测化学发光值。
通过三次测量后取平均值建立标准曲线，根据ATP消耗量百分比(％)＝(I0-It)/I0得出时间与ATP消耗量的关系。其中，I0为时间为0分钟时的化学发光强度，It为不同检测时间t的化学发光强度。结果如图3所示，图3显示了根据信号值建立的时间与ATP消耗量的线性关系。
以加尾反应进行35分钟消耗的ATP含量为例，在35分钟取样，使用上述方法测得ATP消耗量为39.5％。
由于反应体系中的mRNA浓度恒定为0.6μM，起始ATP为500μM，可得35分钟ATP消耗浓度为500μM×39.5％＝197.5μM。根据图1的反应机理，每消耗1个ATP，尾部长度增加1，因此加尾长度为197.5μM÷0.6μM＝329。
综上所诉，在标准加尾反应条件下，根据图3可建立起加尾长度与时间的对应关系，如图4所示。由此说明本实施例提供的使用生物发光法检测ATP消耗量可用于有效控制mRNA样品的加尾长度。
S3、监测mRNA Ploy(A)尾长度
使用S2所建立的标准曲线，对一个中试反应进行了加尾长度的检测。在中试反应中，在反应进行到第15、17和20分钟分别取样(在实际生产中的平均目标加尾长度范围为150-200左右)。通过本发明的ATP消耗检测法，得到15、17和20分钟的加尾长度平均值为150、170和190左右。该结果和上述步骤中得到的加尾和时间关系的标准曲线所预测的结果十分接近，符合实际生产要求。结果如下表1所示：
表1加尾长度监测结果
从上述结果可以看出，通过检测mRNA加尾过程中ATP的消耗量可准确反映加尾长度。
对比例1使用毛细管电泳检测加尾长度
在0.03nmol mRNA的加尾反应中加入25nmol的ATP进行反应，分别在反应时间为0、10、20、30min取10μl样品进行加热变性前处理。配制毛细管电泳凝胶，将凝胶-染料混合物装入检测芯片中，在样品槽中加入内标与待测样品，在涡旋混匀器上混合检测芯片后，放置在Agilent 2100 Bioanalyzer中进行电泳分析。
此方法通过毛细管电泳检测mRNA加尾前后分子量的变化来评估加尾长度，如图7(其中1719为mRNA加尾反应前序列长度，1865为mRNA加尾反应10min后序列长度)、图8(其中1719为mRNA加尾反应前序列长度，1952为mRNA加尾反应20min后序列长度)和图9(其中1719为mRNA加尾反应前序列长度，2070为mRNA加尾反应30min后序列长度)分别为mRNA加尾10、20、30min后分子量的变化。
实验例1
本实验例使用Bioanalyzer对在上述中试反应中的第15、17和20分钟的样品取样后，进行分析，将两种方法的检测结果进行对比，结果如表2和图10所示，从图10中可以看出，实施例1与对比例1提供的两种检测方法所得数值十分接近。从表2中可以看出，在对比例提供的检测方法中，在样品检测前需要进行前处理，需要使用的技术包括毛细管电泳等，这些技术需要比较复杂的样品准备过程，仪器相比昂贵，成本较高，而且整个检测过程耗时很长，达不到实时质量反馈，进而对产品质量进行控制的目的。而本发明实施例1提供的检测方法快速、简单、高效，监测结果准确且成本较低。
表2两种方法的检测结果进行对比
实施例2加尾长度对细胞内蛋白稳定表达的影响
本实施示例评价了加尾长度对细胞内蛋白稳定表达的影响及其对基于mRNA疗法效力的潜在影响。具体评价了不同加尾长度mRNA在细胞内的蛋白表达水平。通过体外转录从编码基因的质粒DNA模板合成mRNA，添加了5′帽结构和不同长度Ploy(A)尾。
HEK293细胞铺板，铺板密度为8×105个/孔，在37℃，5.0％CO2培养箱中过夜。随后进行培养基更换，取出细胞板吸去培养基，再加入新鲜培养基，放入37℃，5.0％CO2培养箱。A液：将2μg mRNA混合于100μl Opti-MEM培养基中，B液：将3μl Lipo MessengerMax混合于100μl Opti-MEM培养基中，A液和B液混合均匀后室温静置20min，随后加入到细胞板中，轻晃混匀，置于37℃，5.0％CO2培养箱中培养24h。然后轻轻吸去培养液上清，加入1ml PBS/孔洗涤一次再加入裂解液150μl，用细胞刮刀刮下转移至1.5ml离心管中，振荡混匀，17000g离心力下4℃离心1-2小时，吸取上清做蛋白检测。
通过酶联免疫(ELISA)方法检测相应蛋白的表达。采用该蛋白单克隆抗体作为包被抗体，结合了辣根过氧化物酶(HRP)的另一种抗体作为检测抗体，TMB作为显色底物溶液避光反应10min后加入2M H2SO4终止反应，在450nm具有最大吸收，使用Molecular Devices读板器读数。
通过样品平均吸收值对比蛋白表达水平，如图5、图6所示，本实施例说明了加尾长度会影响蛋白稳定高效表达并可能影响mRNA的治疗效力，证明了控制加尾长度在产品质量控制中的重要性。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种监测mRNA Ploy(A)尾长度的方法，其特征在于，所述方法包括：在mRNA加尾反应中，通过测定ATP消耗量和/或PPi生成量，得到mRNA Ploy(A)尾长度；
所述mRNA Ploy(A)尾长度＝ATP消耗量/mRNA的反应浓度；
所述mRNA Ploy(A)尾长度＝PPi生成量/mRNA的反应浓度。
2.根据权利要求1所述的监测mRNA Ploy(A)尾长度的方法，其特征在于，通过测定标准加尾反应中不同反应时间点的ATP消耗量，建立标准mRNA加尾长度和反应时间的标准曲线，利用所述标准曲线，在mRNA加尾反应中得到mRNA Ploy(A)尾长度；
优选地，通过测定标准加尾反应中不同时间点的PPi生成量，建立标准mRNA加尾长度和反应时间的标准曲线，利用所述标准曲线，在mRNA加尾反应中得到mRNA Ploy(A)尾长度。
3.根据权利要求1或2所述的监测mRNA Ploy(A)尾长度的方法，其特征在于，ATP消耗量的测定方法包括：高效液相色谱法、凝胶电泳法、毛细管电泳法、分光光度法或生物发光法，优选为生物发光法。
4.根据权利要求2所述的监测mRNA Ploy(A)尾长度的方法，其特征在于，在标准加尾反应中，所述标准mRNA的反应浓度恒定；
优选地，在mRNA加尾反应中，所述mRNA的反应浓度恒定；
优选地，在标准加尾反应中，所述标准mRNA的反应浓度为0.1μM-1μM，优选为0.2μM-0.8μM，更优选为0.6μM。
5.根据权利要求2所述的监测mRNA Ploy(A)尾长度的方法，其特征在于，在标准加尾反应中，所述ATP的起始浓度为50μM-5mM，优选为200μM-2mM，更优选为500μM。
6.根据权利要求2所述的监测mRNA Ploy(A)尾长度的方法，其特征在于，所述mRNAPloy(A)尾长度＝ATP消耗量/mRNA的反应浓度，所述ATP消耗量＝ATP的起始浓度×ATP消耗量百分比/mRNA的反应浓度。
7.根据权利要求6所述的监测mRNA Ploy(A)尾长度的方法，其特征在于，所述ATP消耗量百分比＝(C0-Ct)/C0；
所述C0为反应时间为0分钟时的ATP实时检测浓度，所述Ct为不同反应时间点的ATP实时检测浓度。
8.根据权利要求1或2所述的监测mRNA Ploy(A)尾长度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)搭建标准mRNA的加尾反应，分别在0分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟和35分钟取样，终止加尾反应后测定ATP消耗量，得到ATP消耗量与时间的对应关系；
其中，ATP消耗量＝ATP的起始浓度×ATP消耗量百分比；
所述ATP消耗量百分比＝(C0-Ct)/C0；
所述C0为反应时间为0分钟时的ATP实时检测浓度，所述Ct为不同反应时间点的ATP实时检测浓度；
(b)根据mRNA Ploy(A)尾长度＝ATP消耗量/mRNA的反应浓度，其中，ATP消耗量＝ATP的起始浓度×ATP消耗量百分比/mRNA的反应浓度，通过步骤(a)得到的ATP消耗量与时间的对应关系，建立标准mRNA加尾长度和反应时间的标准曲线；
(c)根据步骤(b)得到的标准mRNA加尾长度和反应时间的标准曲线，在mRNA加尾反应中，通过mRNA Ploy(A)尾长度＝(ATP的起始浓度×(C0-Ct)/C0)/mRNA的反应浓度监测mRNAPloy(A)尾长度；
优选地，在标准mRNA的加尾反应中，所述标准mRNA的反应浓度恒定为0.6μM；
优选地，在标准mRNA的加尾反应中，所述ATP的起始浓度为500μM。
9.如权利要求1-8任一项所述的监测mRNA Ploy(A)尾长度的方法在mRNA质量控制中的应用。
10.一种监测mRNA Ploy(A)尾长度的仪器，其特征在于，所述监测mRNA Ploy(A)尾长度的仪器利用权利要求1-8任一项所述的监测mRNA Ploy(A)尾长度的方法监测mRNA Ploy(A)的尾长度。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114891808A (zh) * 2022-06-21 2022-08-12 珠海丽凡达生物技术有限公司 编码ALDH2多肽的mRNA分子、应用及mRNA药物
CN117778523A (zh) * 2024-02-26 2024-03-29 苏州近岸蛋白质科技股份有限公司 一种Poly(A)聚合酶活性测定方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1656219A (zh) * 2002-05-29 2005-08-17 雅玛山酱油株式会社 新的多磷酸amp磷酸转移酶
CN102596200A (zh) * 2009-11-07 2012-07-18 默克专利有限公司 作为TGF-β受体激酶抑制剂的杂芳基氨基喹啉类
CN105136762A (zh) * 2015-09-06 2015-12-09 常州大学 一种毛细管内检测酶动力学的方法
WO2016174271A1 (en) * 2015-04-30 2016-11-03 Curevac Ag Immobilized poly(n)polymerase

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1656219A (zh) * 2002-05-29 2005-08-17 雅玛山酱油株式会社 新的多磷酸amp磷酸转移酶
CN102596200A (zh) * 2009-11-07 2012-07-18 默克专利有限公司 作为TGF-β受体激酶抑制剂的杂芳基氨基喹啉类
WO2016174271A1 (en) * 2015-04-30 2016-11-03 Curevac Ag Immobilized poly(n)polymerase
CN105136762A (zh) * 2015-09-06 2015-12-09 常州大学 一种毛细管内检测酶动力学的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ROYO L J等: "325 RETINOID-DEPENDENT POLY(A) MRNA CONTENTS IN BOVINE OOCYTES PREMATURED AND/OR MATURED IN VITRO", 《REPRODUCTION FERTILITY & DEVELOPMENT》 *
雍克岚: "《食品分子生物学基础》", 31 August 2008 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114891808A (zh) * 2022-06-21 2022-08-12 珠海丽凡达生物技术有限公司 编码ALDH2多肽的mRNA分子、应用及mRNA药物
CN114891808B (zh) * 2022-06-21 2023-10-27 珠海丽凡达生物技术有限公司 编码ALDH2多肽的mRNA分子、应用及mRNA药物
CN117778523A (zh) * 2024-02-26 2024-03-29 苏州近岸蛋白质科技股份有限公司 一种Poly(A)聚合酶活性测定方法

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