CN105296595B

CN105296595B - 一种基于纳米金生长的生物酶活性检测方法

Info

Publication number: CN105296595B
Application number: CN201510711739.8A
Authority: CN
Inventors: 沈丽; 王超; 刘艳; 陈静; 芮嘉明
Original assignee: Beijing Wuzi University
Current assignee: Beijing Wuzi University
Priority date: 2015-10-29
Filing date: 2015-10-29
Publication date: 2019-04-09
Anticipated expiration: 2035-10-29
Also published as: CN105296595A

Abstract

本发明涉及一种基于纳米金生长的生物酶活性检测方法。生物酶催化底物水解后所产生的糖类化合物具有还原性，在一定条件下，能与氯金酸反应生成纳米金，使溶液显色，根据溶液吸光度的大小可以推测酶活力的大小。该方法包括以下步骤：第一步，工作曲线的绘制；第二步，酶解反应；第三步，生物酶活性的测定。本发明所述的检测方法准确可靠、实用性强、仪器要求简单，适用于常规条件下的操作，是测定生物酶活力显色法中一种可靠的方法。

Description

一种基于纳米金生长的生物酶活性检测方法

技术领域

本发明涉及纳米科技领域和酶活性检测方法领域，尤其涉及纳米材料在生物酶活性检测中的应用。

背景技术

酶制剂生产、应用和研究等各个环节都离不开酶活性的测定，如在发酵过程中通过测定酶的活性以达到最大产酶量；在提炼过程中通过测定酶活性掌握酶的去向，以达到最好的收率；在酶的应用过程中通过测定酶活性，以掌握好用酶量。因此，在酶制剂的生产、应用和研究过程中准确测定酶活性都是十分重要的，开发简便、精确、快速的酶活性测定研究方法具有重要的意义。

目前，分光光度法是检测生物酶活性最普遍的方法，一般选用3，5-二硝基水杨酸(DNS)作为显色剂。此方法的原理是：生物酶将底物降解为还原糖，还原糖在沸水浴条件下与DNS试剂发生显色反应，反应液颜色的深度与酶解产生的还原糖量成正比，还原糖的生成量又与反应液中生物酶的活力成正比，通过分光光度计测定反应液的吸光度，从而计算出反应液中生物酶的活力。虽然此法具有很好的操作性，但仍存在不足之处，例如显色剂DNS溶液配制繁琐且等待时间长，需具备一定技术水平的专业人员配制，若试剂配制不成功，直接影响实验结果。因此，寻找合适的试剂代替DNS显色剂，建立一种新的分光光度法来检测生物酶的活性仍然是需要解决的问题。

纳米材料是近年来的研究热点之一，以其独特的性能被广泛应用于物理、化学、电子、材料等各个领域。其中，由于纳米金具有优异的光学性能，在生化分析领域得到广泛应用。研究表明，在一定条件下，一些具有还原性的待测物能与氯金酸反应生成纳米金，使溶液由无色或淡黄色转变为酒红色或紫色，且纳米金溶液的吸光度与待测物的浓度存在定量关系。采用这种方法实现了神经递质、过氧化氢、抗氧化剂、β-***以及四环素类抗生素等多种物质的检测。本发明在上述工作的启发下，提出利用纳米金生长的反应检测生物酶的活性。其原理是：生物酶将底物降解为还原糖，还原糖在一定反应条件下与氯金酸反应生成纳米金，在紫外-可见光谱中，纳米金溶液的吸光度与酶解产生的还原糖量成正比，还原糖的量又与反应液中生物酶的活力成正比，从而计算出反应液中生物酶的活力。本发明所建立的检测方法，可以作为现有生物酶活性检测方法的补充，丰富了酶活性的检测方法，为酶的活性检测提供更多的选择。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于纳米金生长的生物酶活性检测方法。

本发明的目的通过如下技术措施来实现：

a、工作曲线的绘制：将糖类化合物标准品稀释成一系列的标准液，将一系列的标准液分别与氯金酸反应形成不同浓度的纳米金溶液，通过测定各反应液的吸光度，得到糖类化合物浓度与吸光度关系工作曲线。

b、酶解反应：在试管中加入以乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制的底物溶液V₁mL，置于水浴中预热5min，加入酶稀释液V2mL得到混合液，将混合液在水浴中反应30min后，取V₃μL混合液加入1支新的试管中，然后与氯金酸反应，并使溶液的总体积为V₄μL；上述酶解反应做3次平行实验，测定结果取平均值。

c、生物酶活性的测定：酶解反应完成后用紫外可见分光光度计测量适宜波长条件下混合溶液的吸光度值，根据溶液吸光度与工作曲线确定酶催化底物水解所产生的还原糖的浓度；定义1g固体酶粉(或者1mL液体酶)在适宜条件下，每分钟水解底物溶液释放1μmol还原糖所需的酶量为一个活力单位(IU)，根据如下公式计算生物酶的活力：

其中，X为生物酶的活力(IU)；P为标准曲线上对应的还原糖的浓度(g/L)；C为酶液的原始浓度(g/L)；t为酶反应时间(min)；M为还原糖的摩尔质量；V₁、V₂、V₃、V₄如上文b所述；10⁶为转化因子；D_f为酶液稀释倍数。

优选的，本发明所述的糖类化合物与氯金酸反应的条件为：反应混合液中含氯金酸1-2mM，十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)或十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)3.6-12mM，以及氢氧化钠3-5M；反应混合液于70℃反应10-15min。其中，氯金酸的量与还原糖相比大过量，以保证还原糖反应完全；CTAC或CTAB能防止生成的纳米金聚沉，起到增敏剂的作用；氢氧化钠对于还原糖与氯金酸的反应起到关键作用，在氢氧化钠存在的条件下氯金酸能将还原糖中的醛基氧化为羧基，而自身被还原为纳米金。

优选的，本发明所述的酶活性检测方法适用于满足下列条件的所有生物酶活性的检测，即在一定反应条件下，底物不与氯金酸反应，而酶解产物与氯金酸反应生成纳米金。例如，采用本发明所述的酶活性检测方法测定纤维素酶的活性，底物为羧甲基纤维素钠，以葡萄糖代表还原糖做工作曲线；测定木聚糖酶的活性，底物为木聚糖，以木糖代表还原糖做工作曲线；测定淀粉酶的活性，底物为淀粉，以麦芽糖代表还原糖做工作曲线；测定甘露聚糖酶的活性，底物为甘露聚糖，以甘露糖代表还原糖做工作曲线。

优选的，本发明所述的糖类化合物标准品、底物、生物酶样品均以pH＝4.5-5.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制，以满足酶催化底物反应的最佳pH条件。

附图说明

图1是发明原理示意图。

图2是不同浓度葡萄糖与氯金酸反应后，溶液颜色变化图(从左到右葡萄糖的浓度分别为：0.025，0.042，0.058，0.075，0.092g/L)

图3是不同浓度葡萄糖与氯金酸反应后，溶液吸光度变化图(从a到e葡萄糖的浓度分别为：0.025，0.042，0.058，0.075，0.092g/L)

图4是葡萄糖浓度与溶液吸光度线性关系图。

具体实施方式

实施例1

实施例1用于说明当本发明所提供的方法用于检测纤维素酶活性的效果。

a、工作曲线的绘制：将葡萄糖标准品稀释成一系列的标准液，在70℃水浴条件下，与含有氯金酸1mM，十六烷基三甲基氯化铵3.6mM，以及氢氧化钠4M的溶液混合反应15min，得到深浅不同的紫色溶液(图2)。待冷却至室温后测定波长为550nm处各反应液的吸光度A_max，得到葡萄糖浓度与吸光度关系工作曲线(图4)。

b、酶解反应：以pH值4.6的乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制浓度为1％的羧甲基纤维素钠溶液。称取纤维素酶样品0.1000g，以pH值4.6的乙酸-乙酸钠缓冲溶液溶解，在常温下磁力搅拌30min左右，定容至100mL，备用。取3支试管，分别加入1％的羧甲基纤维素钠溶液1.5mL，置于40℃水浴中预热5min，加入酶稀释液0.5mL，将混合液在40℃水浴中反应30min后，各取200μL混合液分别加入3支新的试管中，在步骤a的反应条件下与氯金酸反应，并使溶液的总体积为2400μL。

c、生物酶活性的测定：酶解反应完成后用紫外可见分光光度计测量波长为550nm处反应液的吸光度为0.328±0.0114。定义1g固体酶粉在适宜条件下，每分钟水解羧甲基纤维素钠溶液释放1μmol还原糖所需的酶量为一个活力单位(IU)，则根据公式可以计算出被测纤维素酶的活性为695±19IU。

d、对照实验：为了验证以上纤维素酶活性检测方法的可靠性，选择大家普遍接受的DNS法进行对照实验。向不同浓度的葡萄糖标准液中加入适量DNS试剂，沸水浴加热5min，自然冷却到室温后定容，用紫外可见分光光度计测量各反应液的吸光度A_max，得到葡萄糖浓度与吸光度关系工作曲线。然后，取3支试管，分别加入以乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制的1％的羧甲基纤维素钠溶液1.5mL以及酶稀释液0.5mL，将混合液在40℃水浴中反应30min后，各取200μL混合液分别加入3支新的试管中，加入适量DNS试剂，反应后定容。以标准空白样做空白对照，测定其最大吸光度。利用DNS法得到纤维素酶的活性为700±15IU，与上述基于纳米金生长的纤维素酶活性检测方法所测定的结果保持一致。由此可见，本发明所建立的生物酶活性检测方法用于纤维素酶活性的检测是准确可靠的。

实施例2

实施例2用于说明当本发明所提供的方法用于检测木聚糖酶活性的效果。

a、工作曲线的绘制：将木糖标准品稀释成一系列的标准液，在70℃水浴条件下，与含有氯金酸1mM，十六烷基三甲基氯化铵3.6mM，以及氢氧化钠3M的溶液混合反应12min，得到深浅不同的紫色溶液。待冷却至室温后测定波长为546nm处各反应液的吸光度A_max，得到木糖浓度与吸光度关系工作曲线。

b、酶解反应：称取木聚糖0.25g，加入0.08g氢氧化钠，加入22mL水，磁力搅拌，缓慢加热，至木聚糖完全溶解，停止加热，继续搅拌30min，加入0.125mL冰乙酸，继续磁力搅拌，测定pH值，使其pH值为5.5，用乙酸-乙酸钠缓冲溶液定容至25mL，配成浓度为100mg/mL的木聚糖溶液。称取木聚糖酶样品(活力在2500-3500IU范围内)0.1000g，加入40mL pH值为5.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，磁力搅拌30min，再加入缓冲溶液定容至100mL，在4℃条件下避光保存1h～2h。离心3-5min，取上清液，用缓冲溶液稀释25倍，备用。取3支试管，分别加入木聚糖溶液1mL，置于37℃水浴中预热5min，加入木聚糖酶液1mL，将混合液在37℃水浴中反应30min后，各取600μL混合液分别加入3支新的试管中，在步骤a的反应条件下与氯金酸反应，并使溶液的总体积为2400μL。

c、生物酶活性的测定：酶解反应完成后用紫外可见分光光度计测量波长为546nm处反应液的吸光度为0.561±0.0238。定义1g固体酶粉在适宜条件下，每分钟水解木聚糖溶液释放1μmol还原糖所需的酶量为一个活力单位(IU)，则根据公式可以计算出被测木聚糖酶的活性为2876±38IU。

d、对照实验：为了验证以上木聚糖酶活性检测方法的可靠性，选择大家普遍接受的DNS法进行对照实验。向不同浓度的木糖标准液中加入适量DNS试剂，沸水浴加热5min，自然冷却到室温后定容，用紫外可见分光光度计测量各反应液的吸光度A_max，得到木糖浓度与吸光度关系工作曲线。然后，取3支试管，分别加入木聚糖溶液1mL以及酶稀释液1mL，将混合液在37℃水浴中反应30min后，各取600μL混合液分别加入3支新的试管中，加入适量DNS试剂，反应后定容。以标准空白样做空白对照，测定其最大吸光度。利用DNS法得到木聚糖酶的活性为2609±42IU，与上述基于纳米金生长的木聚糖酶活性检测方法所测定的结果保持一致。由此可见，本发明所建立的生物酶活性检测方法用于木聚糖酶活性的检测是准确可靠的。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种基于纳米金生长的生物酶活性检测方法，该方法适用于满足下列条件的所有生物酶活性的检测，即生物酶作用底物不与氯金酸反应，酶催化底物生成的产物中含有糖类化合物，且这些糖类化合物在特定条件下能与氯金酸反应生成纳米金。其特征在于：

a、工作曲线的绘制：将糖类化合物标准品稀释成一系列的标准液，将一系列的标准液分别与氯金酸反应形成不同浓度的纳米金溶液，通过测定各反应液的吸光度，得到糖类化合物浓度与吸光度关系工作曲线。糖类化合物与氯金酸反应的条件为：反应混合液中含氯金酸1-2mM，十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)或者十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)3.6-12mM，以及氢氧化钠3-5M；反应混合液于70℃反应10-15min。

b、酶解反应：在试管中加入以乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制的底物溶液V₁mL，置于水浴中预热5min，加入酶稀释液V₂mL得到混合液，将混合液在水浴中反应30min后，取V₃μL混合液加入1支新的试管中，然后与氯金酸反应，并使溶液的总体积为V₄μL；上述酶解反应做3次平行实验，测定结果取平均值。

c、生物酶活性的测定：酶解反应完成后用紫外可见分光光度计测量适宜波长条件下混合溶液的吸光度值，根据溶液吸光度与工作曲线确定酶催化底物水解所产生的还原糖的浓度；定义1g生物酶在适宜条件下，每分钟水解底物溶液释放1μmol还原糖所需的酶量为一个活力单位，以IU表示。根据如下公式计算生物酶的活力：

其中，X为生物酶的活力，以IU表示；P为标准曲线上对应的还原糖的浓度，单位为g/L；C为酶液的原始浓度，单位为g/L；t为酶反应时间，单位为min；M为还原糖的摩尔质量；V₁、V₂、V₃、V₄如上文b所述；10⁶为转化因子；D_f为酶液稀释倍数。

2.根据权利要求1所述的基于纳米金生长的生物酶活性检测方法，其特征在于，糖类化合物标准品、底物、生物酶样品均以pH＝4.5-5.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制。