CN105821119A - 一种辅助诊断川崎病的核酸标记物及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于疾病检测试剂盒，具体涉及利用miRNA作为生物学标记物辅助诊断川崎病的试剂盒。所述核酸标记物为hsa‑miR‑223‑3p，所述试剂盒中包括对hsa‑miR‑223‑3p进行实时定量聚合酶链反应（RT‑qPCR）的引物。本发明所述试剂盒结合血常规、高敏C反应蛋白、血沉、心脏超声检查，有助于辅助诊断川崎病及预测冠状动脉损害。

Description

一种辅助诊断川崎病的核酸标记物及试剂盒
本发明属于疾病检测试剂盒，具体涉及利用miRNA作为生物学标记物辅助诊断川崎病的试剂盒。
背景技术
川崎病(Kawasaki disease,KD)是一种急性血管炎综合征，多发于婴幼儿，是儿童最常见的后天性心脏病，病变主要累及中小动脉，尤其是冠状动脉，可形成冠状动脉扩张或冠状动脉瘤，是成年后缺血性心脏病的危险因素之一。KD的病因及发病机制仍不十分清楚，目前研究趋势认为KD是在一定遗传易患性的基础上，由外源性抗原触发，引起机体免疫功能紊乱所致，免疫***的高度活化及血管炎是KD的基本病理特征。KD的诊断目前亦无特异性的实验室指标，主要根据临床表现做出诊断，虽然心脏超声检查对KD的诊断起重要作用，但仍缺乏更为敏感及特异性的诊断指标。未经治疗的KD患儿中25％可发展成冠状动脉永久性损害，最终导致冠状动脉瘤的形成。使用大剂量的静脉丙种球蛋白(intravenous immuneglobulin，IVIG)(2g/kg)联合阿斯匹林治疗已成为KD的标准治疗，可以使冠状动脉损害的发生率降至5％左右，但仍有部分患儿对IVIG治疗无反应。因此，虽然人们对KD的认识和处理不断深入，但如何减轻KD血管炎症从而减轻血管内皮损伤，以及如何早期诊断川崎病并及时干预，一直是有待解决的问题。
申请号为201280024575.6的发明提供了用于诊断和治疗川崎病的组合物和方法。更具体地，KD患者的蛋白质组富集安眠蛋白A、细丝蛋白B和细丝蛋白C，所述蛋白用作KD的生物标志物(和潜在的治疗靶点)。因此，使用本发明中提供的组合物和方法检测这些生物标志物可为递送至受试者的疗法提供信息。
申请号为201280070975.0的发明提供了川崎病(KD)的生物标志物。在某些方面，本发明提供了用于检测KD生物标志物的方法，如用于检测升高的PDGFC表达。同样地，本发明描述了治疗具有KD的生物标志物的受试者的方法。
申请号为201310217292.X的发明提供了PPP3CC基因或其表达产物在治疗川崎病中的应用。具体地，涉及一种钙调神经磷酸酶3催化亚基γ亚型蛋白(PPP3CC)基因、蛋白、或其促进剂的用途，用于制备(i)提高1，4，5三磷酸肌醇3激酶C(ITPKC)的表达量和/或活性；和/或(ii)治疗川崎病(Kawasaki disease)的药物组合物。本发明有益于了解川崎病的发病机制和路径，并开发治疗川崎病的药物。
申请号为201410709423.0发明公开了快速诊断川崎病的核酸标记物及其试剂盒，该核酸标记物为4种miRNAs(小分子RNA miR-1246、miR-4436b-5p、miR-197-3p和miR-671-5p)，所述试剂盒中含有针对这4种miRNAs进行荧光定量PCR检测的引物；诊断川崎病就只需定量分析血清中exosome里的这4种miRNA含量，然后对这4种miRNA的Ct值进行特定的分析即可。本发明具有取材方便、操作简单、特异性强、时间花费少、快速准确、结果稳定等优点，能及时、快速、客观、准确诊断川崎病患儿，尤其是通过一次实验即可将川崎病与常见易混淆症状的病毒感染分开，有传统诊断方法所不具备的优势。因此，本发明对川崎病患儿的快速诊断具有极大的临床应用价值，为进一步研制出在川崎病患儿上使用的快速诊断试剂盒提供了方向性。
microRNA(miRNA)是一种内源性非编码的单链小分子RNA，约由21～25个核苷酸组成。miRNA通过与靶基因mRNA的3'-非编码区(3'-untranslated region，3'-UTR)特异性结合，能够使mRNA降解或抑制其翻译，从而发挥其抑制靶mRNA，达到调控蛋白水平的作用。当前认为miRNAs可以调控30％人类编码蛋白质的基因，且一个miRNA可以调控多个靶基因表达，而同一个基因也可受多种miRNA调控。miRNA参与细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学过程，其表达水平的改变可引起多种疾病的发生，包括心血管疾病。以往普遍认为，miRNA作为细胞内内源性的RNA调控转录后水平的基因表达。然而，最近的研究表明，miRNA能够在循环血液中被检测到，并可作为疾病的生物学标志物(参见：Mitchell PS,Parkin RK,Kroh EM,et al.Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancerdetection[J].Proc Natl Acad Sci USA.2008；105:10513–10518；Skog J,Wurdinger T,van Rijn S,et al.Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins thatpromote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.[J].Nat CellBiol.2008；10:1470–1476)。并且，miRNA以一个非常稳定的状态存在于血清或血浆中，即使是经受反复冷冻/解冻，也可免受核糖核酸酶的降解。血浆中的miRNA有特异的表达谱，在心血管疾病，如心肌损害、冠状动脉疾病、心脏衰竭等，其循环中的miRNA已被证实。川崎病作为最常见的后天性儿童心血管疾病，表现为全身免疫性中小血管炎及血管内皮功能障碍，然而其血浆中miRNA的表达及其作用机制，国内外报道甚少。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速辅助诊断川崎病的核酸标记物。
本发明的另一目的是提供一种快速辅助诊断川崎病的试剂盒。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案为：一种辅助诊断川崎病的核酸标记物，所述核酸标记物为hsa-miR-223-3p，具有如SEQ 6所示的核苷酸序列TGGGGTATTTGACAAACTGAC。
优选的技术方案中，所述核酸标记物hsa-miR-223-3p为血浆中的miRNA。
因此，本发明要求保护血浆中的miRNA作为川崎病的核酸标记物的应用。
本发明同时要求保护一种辅助诊断川崎病的试剂盒，所述试剂盒包括对血浆中的hsa-miR-223-3p进行定量检测的试剂。
优选的技术方案中，所述试剂盒中包括对hsa-miR-223-3p进行实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)的引物。更优选的技术方案中，所述引物如SEQ 4所示，5′TGTCAGTTTGTCAAATACCCCA 3′。
优选的技术方案中，所述试剂盒中包括阳性参照试剂与隐形参照试剂。
本发明同时要求保护所述具有SEQ 6所述核苷酸序列的miRNA在制备减轻川崎病的血管炎症反应的药物中的应用。
由于上述技术方案的应用，本发明和现有技术相比具有以下优点：
1、本发明有助于川崎病和普通发热性疾病的鉴别，通过定量分析血浆中miR-223-3p的含量，能及时、快速、客观、准确诊断川崎病患儿，尤其是通过一次实验即可将川崎病与常见易混淆症状的病毒感染分开，有传统诊断方法所不具备的优势。因此，本发明对川崎病患儿的快速诊断具有极大的临床应用价值，并且为进一步研制出在川崎病患儿上使用的快速诊断试剂盒提供了方向性。
2、由于miRNA芯片和RT-qPCR验证结果共同表明：hsa-miR-223-3p在KD急性期血浆中表达显著性上调，因此，本发明所述快速辅助诊断川崎病的核酸标记物结合血常规、高敏C反应蛋白、血沉、心脏超声检查，有助于辅助诊断川崎病及预测冠状动脉损害。
3、川崎病在病程2周左右为冠状动脉损害的高发期，在早期检测川崎病血浆中miR-223-3p及IL-6的含量，有助于预测是否并发冠状动脉损害。
4、本发明具有取材方便、操作简单、特异性强、时间花费少、快速准确、结果稳定等优点。
附图说明
图1为实施例一中单荧光芯片样品数据两两比较的散点图列阵绘制成矩阵图(散点图中每一个点代表芯片上的探针点，该点在二维平面中的位置由其X轴坐标和Y轴坐标确定。X轴：对照组数据/实验组数据；Y轴：实验组数据/对照组数据。落在图形中y＝x直线上的点，代表这个探针点在两张芯片中准化信号值(Fold change，FC)差异＝1；落在图形中位线两侧45°线之外的点，其代表这个探针点在两张芯片中信号值差异FC>2)；
图2为实施例一所得火山图(灰色点：FC绝对值＜2，p＞0.05的miRNA。红色点：FC绝对值≥2，p≤0.05的miRNA，这些miRNA为显著性差异miRNA。)；
图3为实施例一中芯片结果中差异表达miRNAs的聚类分析图；
图4为实施例一中hsa-miR-16扩增曲线和溶解曲线；
图5为实施例一中hsa-miR-33b-3p扩增曲线和溶解曲线；
图6为实施例一中hsa-miR-223-3p扩增曲线和溶解曲线；
图7为实施例一中hsa-miR-765扩增曲线和溶解曲线；
图8为实施例一中KD组与对照组hsa-miR-765、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-33b-3p表达量均值比较；
图9为实施例二中IL-6浓度曲线；
图10为实施例二中hsa-miR-16扩增曲线和溶解曲线；
图11为实施例二中hsa-miR-223-3p扩增曲线和溶解曲线；
图12为实施例二中各组血浆hsa-miR-223-3p相对表达量比较；
图13为实施例二中KD急性期与亚急性期CAL组与nCAL组血浆hsa-miR-223-3p相对表达量比较；
图14为实施例二中各组血浆IL-6水平比较；
图15为实施例二中KD急性期与亚急性期CAL组与nCAL组血浆IL-6水平比较。
具体实施例
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
实施例一，选取苏州大学附属儿童医院就诊的急性期KD患儿6例，及健康儿童6例作为对照，清晨抽取空腹血，分离血浆，提取血浆中总RNA，采用miRNA芯片杂交技术检测川崎病组及正常对照组血浆中差异表达的miRNAs。再选取急性期KD患儿及健康儿童各8例，采用实时定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)技术验证芯片结果。利用TargetScan,PITA和microRNAorg三个数据库对差异miRNAs进行靶基因预测，使用DAVID生物信息学分析软件对共同的靶基因进行GO和KEGG分析，寻找与KD血管炎症相关的靶基因。
1.实施例中涉及的仪器
1.1血浆分离及保存的主要仪器
1.2基因芯片检测需主要仪器
1.3 RT-qPCR检测所需主要仪器
2.实施例中涉及的主要试剂
2.1基因芯片检测需主要试剂
2.2 RT-qPCR检测所需主要试剂及引物
Nuclease-free H2O(无RNA酶水)(公司)
Cell Disruption Buffer(细胞破碎缓冲液)
酚/氯仿
无水乙醇
miScript HiSpec Buffer
Nucleics Mix
miScript Reverse Transcriptase Mix(miScript逆转录酶混合物)
由miRNA(http://www.mirbase.org/)基因数据库中获得hsa-miR-16、hsa-miR-765、hsa-miR-33b-3p、hsa-miR-223-3p的基因序列，采用Primer Primier 5软件(美国AppliedBiosystem Inc)进行引物设计。miRNA上游特异性引物序列如下，见下表。下游引物由Qiagen试剂盒自带。
引物核酸序列表
基因名称 上游引物序列 温度(℃)
hsa-miR-16(内参) SEQ 1 60
hsa-miR-765 SEQ 2 60
hsa-miR-33b-3p SEQ 3 60
hsa-miR-223-3p SEQ 4 60
3.靶基因预测软件及数据分析软件
靶基因预测软件：TargetScan(http://www.targetscan.org/)
PITA(http://genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/mir07_data.html/)
microRNAorg(http://www.microrna.org/microrna/home.do/)
数据分析软件：Venn(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)
DAVID功能注释基因芯片生物信息学分析软件(Functional AnnotationBioinformatics Microarray Analysis,DAVID)是一种生物信息数据库，整合了生物学数据和分析工具，为大规模的基因或蛋白列表(成百上千个基因ID或蛋白ID列表)提供***综合的生物功能注释信息；可以从分子功能(molecular function，MF)、生物学过程(biological process，BP)、细胞组成(cellular component，CC)三个方面对基因进行功能分析，我们采用DAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov/，version:6.7)在Gene Ontology(细胞组成、分子功能、生物学过程)、KEGG通路等方面对miRNA靶基因进行功能注释。
4.临床资料
4.1基因芯片检测所用的临床资料
(1)KD组：2013年5月至2013年8月我院收治的急性期KD患儿6例，均符合我国在2006年召开的KD专题讨论会中修订的诊断标准，其中男2例，女4例，年龄7月至3岁10月，中位年龄2岁。
(2)正常对照组：同年龄组健康体检儿童6例。男3例，女3例，年龄1岁5月至3岁1月，中位年龄1岁11月。见下表。
KD患儿及对照组临床资料表
4.2 RT-qPCR检测所用的临床资料
(1)KD组：2013年9月至2013年10月我院收治的急性期KD患儿8例，诊断标准同前，其中男5例，女3例，年龄11月至4岁8月，中位年龄1岁11月。
(2)正常对照组：同年龄组健康体检儿童8例。男6例，女2例，年龄2月至4岁1月，中位年龄1岁7月。见下表。
KD患儿及对照组临床资料表
实施例一的具体操作步骤包括：
1.血浆的分离：所有病例均于清晨空腹抽取肘静脉血2ml，迅速转入乙二胺四乙酸钾(EDTA-K2)抗凝管中，充分混匀，在2小时内4℃条件下820g离心10min。吸取约1ml上清液转至洁净的1.5ml离心管中，4℃条件下16000g离心10min，吸取上清至新的离心管中，置于-80℃冰箱保存备用。
2. Agilent miRNA 19.0芯片筛选血浆中差异表达的miRNAs，包括以下步骤：
2.1血浆总RNA提取：使用mirVanaTM RNA分离试剂盒(Applied Biosystem p/nAM1556)提取总RNA；
2.2 miRNA芯片操作流程：取100ng总RNA起始，定容到2μL，然后去磷酸化，使样品变性，连接标记。
2.3芯片洗涤：取出芯片于洗液1中洗涤5min；再将芯片放入洗液2中洗涤5min(37℃)。
2.4芯片扫描：利用Agilent Scanner G2505C(Agilent Technologies)扫描仪中选择相应的参数扫描，得到原始图像。
上述血浆RNA样品检测和实验评估的结果表明：
A)样品总RNA利用NanoDrop ND-2000定量并经Agilent Bioanalyzer 2100检测RNA完整性，所用标本质量符合要求。
B)实验结果评估，median CV(％)代表重复性探针变异系数，median CV(％)值越小，实验精度越高，芯片内重复探针的％CV值应小于15％，各样本重复性比较好，见下表。
KD组与对照组实验结果评估表
KD组 芯片号 CV(％) 对照组 芯片号 CV(％)
1 12003-2-2 11.3983 1 12003-2-1 9.72617
2 11920-1-1 9.04963 2 12003-2-3 10.4688
3 11920-1-2 8.97566 3 12003-2-4 7.96456
4 12885-2-4 8.44535 4 12885-2-1 8.36837
5 12887-1-1 8.29865 5 12885-2-2 8.69797
6 12887-1-2 7.79005 6 12885-2-3 10.4861
C)然后进行数据分析：
I.采用Feature Extraction软件(version10.7.1.1,Agilent Technologies)处理原始图像提取原始数据。接着利用Genespring软件(version 12.5；AgilentTechnologies)进行quantile标准化和后续处理。单荧光芯片的原始数据经过标准化处理，转化为log以2为底的对数后，在一个二维直角坐标系平面中，绘制散点图，见图1。芯片数据的散点图常用于评估两组数据总体分布集中趋势。
II.在筛选差异miRNA之前，先进行探针过滤，用于比较的每组样本中至少有一组75％标记为Detected的探针留下进行后续分析。对于有生物学重复的分析，利用T检验得到的差异显著性p值和标准化信号值的差异倍数，FC值进行筛选，标准为FC≥2.0且p≤0.05。差异筛选结果，见下表。
KD组与对照组差异筛选结果
III.将比较所产生的差异表达情况反映到火山图中去，X轴是差异倍数以2为底取对数的值，Y轴是p值以10为底取负对数的值。在设生物学重复的情况下(即使用统计分析法分析差异表达)，给出火山图，见图2。
IV.对差异miRNA进行非监督层次聚类。计算多个样品两两之间的距离，构成距离矩阵，合并距离最近的两类为一新类，计算新类与当前各类的距离，再合并、计算，直至只有一类为止，用挑选的差异miRNA的表达情况来计算样品直接的相关性，一般来说，同一类样品能通过聚类出现在同一个簇中，聚在同一个簇中的miRNA可能具有相似的生物学功能。用热图(Heatmap)展示，见图3。
3. RT-qPCR验证血浆中差异表达的miRNAs，包括以下步骤：
3.1 RNA提取：同芯片提取总RNA。
3.2逆转录合成(cDNA第一链)：利用miScript Ⅱ Reverse Transcription Kit(Qiagen，Germany)将待测RNA逆转录成cDNA。逆转录体系：总RNA，1μg；5×miScript HiSpecBuffer，4μl；10×Nucleics Mix,2μl；miScript Reverse Transcriptase Mix,2μl；Nuclease-free H2O，加至20μl。反应程序：37℃60min，95℃5min。逆转录完毕后加入80μlNuclease-free H2O储存在-20℃冰箱备用。
(1)从-80℃冰箱中取出RNA，室温下解冻，按下表在0.2ml PCR管中配制逆转录反应体系。
反应体系 浓度 容积(μl)
总RNA Conc.μg/μl 0.5μg/Conc【注】
miScript HiSpec缓冲液 5× 2
核酸混合液 5× 1
miScript逆转录酶混合液 - 0.5
无RNA酶水 - 至10
总容积 - 10
【注】若RNA总量不足0.5μg，则取体系所能容纳最大体积(6.5μl)
(2)ABI 9700型PCR仪上37℃保温60min使逆转录反应完全后，95℃5min终止反应。
(3)加入90μl Nuclease-free H2O稀释至100μl储存在-20℃冰箱，用于后续实验。
3.3引物设计：上海欧易生物医学科技有限公司设计并由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
3.4荧光定量PCR：利用480 SYBR Green I Master试剂盒(Roche，Swiss)在480 Ⅱ型荧光定量PCR仪(Roche，Swiss)上进行反应。体系：2×480 SYBR Green I Master，5μl；10μM Universal primer,0.2μl；10μMmicroRNA-specific primer，0.2μl；cDNA，1μl；Nuclease-free H2O，3.6μl。PCR程序：95℃10min；95℃10s，60℃30s，40个循环。循环结束后利用熔解曲线检测产物特异性：从60℃缓慢升温至97℃，每℃采集5次荧光信号。
(1)配制PCR反应体系
(2)荧光定量PCR循环条件
上述RT-qPCR验证血浆中差异表达的miRNAs的结果显示：
A)总RNA质检结果：提取总RNA，利用NanoDrop 2000分光光度计测定浓度及OD260/OD280，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。所用标本质量符合要求，可用于RT-qPCR检测。
B)定量判定：RT-qPCR中每个样本重复3次，取平均值为Ct值，用SPSS计算出各段各基因表达的平均Ct值，采用相对表达量2-ΔΔCt法比较各基因的表达差异：ΔCt＝Ct目的基因-Ct内参基因；ΔΔCt＝ΔCt实验组样品－ΔCt对照组样品。
C)RT-qPCR测定KD患儿血浆中hsa-miR-765、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-33b-3p相对表达量。在RT-qPCR过程中，以hsa-miR-16(内参)、hsa-miR-765、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-33b-3p荧光值和循环数作图，自动得到扩增曲线和溶解曲线(图4、5、6、7)。基因所得熔解曲线均为单一峰，PCR扩增特异性较好，三次技术重复的重复性较好。
D)两组间hsa-miR-765、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-33b-3p相对表达量的比较表明：KD组hsa-miR-223-3p、hsa-miR-33b-3p的相对表达量明显高于正常对照组(p<0.05)；KD组hsa-miR-765相对表达量较正常对照组差异无统计学意义(p>0.50)，见下表，图8。
KD组miRNAs表达量与正常对照组的相对比值()
hsa-miR-765 hsa-miR-33b-3p hsa-miR-223-3p
KD组 0.99±0.84 2.84±1.99a 3.38±2.07a
p值 9.71E-01 3.92E-02 1.40E-02
注：a.KD组与正常对照组比较p<0.05。
4.靶基因预测
分别用TargetScan，PITA，microRNAorg数据库对差异表达的miRNA进行靶基因预测，对三个数据库预测到的靶基因进行Venny分析取交集，使用DAVID生物信息学分析软件对共同的靶基因进行GO和KEGG分析。
靶基因预测结果：分别用TargetScan，PITA，microRNAorg数据库对差异hsa-miR-223-3p进行靶基因预测，对三个数据库预测到的靶基因进行Venny分析取交集，结果发现预测的共同靶基因共有415个，见下表。
hsa-miR-223-3p经由TargetScan，PITA，microRNAorg预测所得的部分靶基因
Gene ID Gene symbol Gene ID Gene symbol
54522 ANKRD16 136319 MTPN
158586 ZXDB 27347 STK39
57659 ZBTB4 6198 RPS6KB1
5903 RANBP2 7170 TPM3
60682 SMAP1 8899 PRPF4B
431707 LHX8 10365 KLF2
22828 RBM16 3480 IGF1R
5997 RGS2 65055 REEP1
57600 FNIP2 6602 SMARCD1
54467 ANKIB1 57151 LYZL6
对靶基因进行GO分析，从而对这个基因的功能进行描述。GO包括三大板块，生物学过程(BP)，细胞组成(CC)和分子功能(MF)，所以有三类结果。统计每个GO条目中所包括的靶基因个数，并用统计检验的方法计算每个GO条目中靶基因富集的显著性。计算的结果会返回一个富集显著性的p值，小的p值表示靶基因在该GO条目中出现了富集。可以根据GO分析的结果结合生物学意义从而挑选用于后续研究的基因，针对以上415个靶基因，利用DAVID软件，进行GO分析，将这些基因分别投射至GO的三大应用功能上(即分子功能、生物学过程、细胞组分)，结果显示hsa-miR-223-3p预测靶基因集合分别富集在转录调节、转录激活等分子功能，转录、代谢过程的负调控、发育进程等生物学过程及轴突、内膜、质膜等细胞组成上(p<0.05)，见下表。
hsa-miR-223-3p预测靶基因GO生物学过程分类(部分)
hsa-miR-223-3p预测靶基因GO细胞组成分类(部分)
hsa-miR-223-3p预测靶基因GO分子功能分类
利用KEGG数据库对预测得到的靶基因进行Pathway分析，并且用统计检验的方法计算每个Pathway条目中基因富集的显著性。计算的结果会返回一个富集显著性的p值，小的p值表示基因在该Pathway中出现了富集。Pathway分析对实验结果有提示的作用，通过靶基因的Pathway分析，可以找到富集靶基因的Pathway条目，寻找不同样品的靶基因可能和哪些细胞通路的改变有关。对415个预测靶基因进行生物通路富集分析，结果显示，在KEGG通路中hsa-miR-223-3p显著富集于肿瘤通路，以及泛素介导的蛋白水解信号通路中(p<0.05)，见下表。
hsa-miR-223-3p预测靶基因的KEGG通路数据库富集分析
与炎症有关的靶基因：应用DAVID软件分析发现与炎症相关的靶基因共7个，为IL6ST、F3、EPHA3、SMAD1、HDAC9、NLRP3、HHEX。其GO ID为(GO:0050727、GO:0050741、GO:0002675、GO:0050729、GO:0002673、GO:0002526、GO:0006954、GO:0030948、GO:0010574、GO:0030947、GO:0010575)，其主要生物学功能包括调控及监管炎症反应，参与活化急性炎症反应的血浆蛋白及调控血管内皮生长因子信号途径。其中IL6ST涉及了其中大部分生物学功能。
因此，实施例一表明：miRNA芯片在KD急性期血浆中筛选到7个显著上调的miRNAs(hsa-let-7b-5p,hsa-miR-223-3p,hsa-miR-4485,hsa-miR-4644,hsa-miR-4800-5p,hsa-miR-6510-5p和hsa-miR-765)和3个显著下调的miRNAs(hsa-miR-33b-3p,hsa-miR-4443和hsa-miR-4515)。结合RT-qPCR验证结果，发现hsa-miR-223-3p表达显著性上调与芯片结果一致。靶基因预测分析共获得415个共同的靶基因，使用DAVID软件分析发现与炎症有关的靶基因共7个，分别为IL6ST、F3、SMAD1、HDAC9、NLRP3、EPHA3和HHEX。结合微阵列芯片技术与RT-qPCR技术我们获得川崎病急性期血浆中差异表达的miRNAs。hsa-miR-223-3p可能参与了KD的病理生理过程。
实施例二，以hsa-miR-223-3p为研究对象，探讨hsa-miR-223-3p在KD丙种球蛋白治疗前后血浆中的表达及其与炎性细胞因子IL-6的相关性，初步探讨hsa-miR-223-3p检测对KD的临床意义。选择30例KD患儿，其中冠状动脉损伤者10例，非冠状动脉损伤者20例。发热及正常对照组各12例。采用RT-qPCR技术检测KD急性期和亚急性期血浆中hsa-miR-223-3p的表达量，采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法检测血浆中IL-6水平，比较各组间差异，并分析hsa-miR-223-3p与IL-6的相关性。
1.实施例涉及的仪器
分析软件：Ascent software for Multiskan
2.实施例中涉及的主要试剂
RT-qPCR检测同第一部分real time PCR检测所需主要试剂及引物
酶标抗体工作液(Enzyme Conjugate)(公司)
标本稀释液(Sample Buffer)
浓缩洗涤液(Wash Buffer)
标准品(Standards)
底物工作液(TMB Solution)
第一抗体工作液(Biotinylated Antibody)
终止液(Stop Solution)
3.实施例中涉及的临床资料
(1)KD组：2013年8月至2014年8月我院收治的KD患儿30例，均符合我国在2006年召开的KD专题讨论会中修订的诊断标准，其中男18例，女12例，年龄4月至7岁6月，中位年龄1岁6月。根据KD患儿按病程分为急性期(IVIG治疗前，病程第1～11天)，亚急性期(IVIG治疗后，体温正常，病程第11～21天)。根据心脏彩色多普勒检测结果将期分为两组：合并CAL者10例，无冠状动脉损害(non-Coronary artery lesion，nCAL)者20例。KD冠状动脉损伤(CAL)标准：(1)冠状动脉扩张：冠状动脉内径<3岁>2.5mm，3～9岁>3.5mm；(2)冠状动脉瘤：不同形状的冠状动脉扩张，内径>4mm，或者冠状动脉局部扩张与相邻内径比值超过1.5倍；(3)冠状动脉内膜回声增强。
(2)发热对照组：同期同年龄组急性期发热住院患儿12例，男7例，女5例，年龄8月至6岁9月，中位年龄2岁5月，血清CRP正常，并排除其他***疾病如幼年性特发性关节炎、结节性多动脉炎等。
(3)正常对照组：同年龄组健康体检儿童12例。男8例，女4例，年龄12月至7岁，中位年龄2岁6月。
实施例二具体包括以下步骤：
1.血浆的分离：所有病例均于清晨空腹抽取2ml肘静脉血，迅速转入乙二胺四乙酸钾(EDTA-K2)抗凝管中，充分混匀，在2小时内4℃条件下820g离心10min。吸取约1ml上清液转至洁净的1.5ml离心管中，4℃条件下16000g离心10min，吸取上清至新的离心管中，分为A、B组，置于-80℃冰箱保存备用，A组用于RT-qPCR检测，B组用于ELISA检测。
2. RT-qPCR检测血浆中hsa-miR-223-3p表达量：方法同实施例一中RT-qPCR检测血浆中差异表达的miRNAs。
3. ELISA法检测血浆中IL-6水平：血浆在冰上混合物中解冻，用抗人IL-6单抗包被于酶标板上，每孔各加入标准品及血浆100ul，将反应板充分混匀后置37℃40min，用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，在滤纸上印干，每孔加入蒸馏水和第一抗体工作液各50ul(空白除外)，将反应板充分混匀后置37℃20min。再次用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，滤纸上印干，每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃10min。再次用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，滤纸上印干，每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15min，之后每孔加入100ul终止液硫酸混匀。30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值，记录OD值，IL-6浓度与OD值成正比，通过绘制标准曲线(图9)，计算出血浆中IL-6浓度。
4.统计学分析
利用SPSS17.0统计学软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差或中位数(范围)表示，组间比较采用T检验或Kruskal-Wallis H秩和检验，两两比较采用Nemenyi检验，计数资料采用卡方检验。相关性分析采用Spearman’s秩相关分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
5.结果及分析
1.一般情况比较：下表为各组研究对象的临床资料，经统计学分析，KD组与发热对照组及正常对照组在性别比例、年龄构成上差异无统计学意义(p>0.05)。
KD患儿及对照组临床资料
基本特点 KD急性期 KD亚急性期 发热对照组 正常对照组 p值
例数 30 30 12 12
年龄(月) 18(4-90) 18(4-90) 29(8-81) 30(12-84) p＝0.898
性别(男/女) 18/12 18/12 7/5 8/4 p＝0.31
2. KD患儿急性期及亚急性期血浆hsa-miR-223-3p的相对表达量。
2.1 KD患儿及对照组儿童血浆hsa-miR-223-3p表达水平检测
2.1.1总RNA质检结果
提取总RNA，利用NanoDrop 2000分光光度计测定浓度及OD260/OD280，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。所用标本质量符合要求，可用于RT-qPCR检测。
2.1.2定量判定
RT-qPCR中每个样本重复3次，取平均值为Ct值，用SPSS计算出各段各基因表达的平均Ct值，采用相对表达量2-ΔΔCt法比较各基因的表达差异：ΔCt＝Ct目的基因-Ct内参基因；ΔΔCt＝ΔCt实验组样品－ΔCt对照组样品。
2.1.3 RT-qPCR测定KD患儿血浆中hsa-miR-223-3p表达量。
在RT-qPCR过程中，以hsa-miR-16(内参)、hsa-miR-223-3p荧光值和循环数作图，自动得到扩增曲线和溶解曲线(图10、图11)。基因所得熔解曲线均为单一峰，PCR扩增特异性较好，三次技术重复的重复性较好。
2.2各组间hsa-miR-223-3p相对表达量的比较
KD组患儿急性期血浆hsa-miR-223-3p相对表达量明显高于发热对照组(p<0.05)及正常对照组(p<0.05)，差异有统计学意义；发热对照组及正常对照组间血浆hsa-miR-223-3p表达量差异无统计学意义(p>0.05)。
KD组患儿亚急性血浆hsa-miR-223-3p相对表达量与发热对照组及正常对照组间差异无统计学意义(p>0.05)。
KD-CAL组急性期血浆hsa-miR-223-3p相对表达量明显低于KD-nCAL组，差异有统计学意义(p<0.05)。KD-CAL组亚急性期血浆hsa-miR-223-3p相对表达量低于KD-nCAL组，但差异无统计学意义(p>0.05)，见以下各表格以及图12、图13。
KD急性期、亚急性期及发热对照组血浆hsa-miR-223-3p表达量与正常对照组的相对比值( )
KD急性期 KD亚急性期 发热对照组
hsa-miR-223-3p 5.10±5.11a 1.01±0.85b 1.29±0.63c
注：a.KD急性期与正常对照组、发热对照组比较p<0.05；b.KD急性期与亚急性期比较p<0.05；c.两对照组间比较无统计学意义p>0.05。
KD中CAL组与nCAL组血浆hsa-miR-223-3p相对表达量()
注：A表示CAL组，B表示nCAL组，a.急性期KD-CAL组与KD-nCAL比较p<0.05；b.亚急性期KD-CAL组与KD-nCAL比较差异无统计学意义p>0.05。
3. KD患儿急性期和亚急性期血浆IL-6水平并与正常对照组、发热对照组间的比较KD组患儿急性期血浆IL-6水平明显高于发热对照组(p<0.05)及正常对照组(p<0.05)，差异有统计学意义；发热对照组及正常对照组间血浆IL-6水平差异无统计学意义(p>0.05)。KD组患儿亚急性血浆IL-6水平与发热对照组及正常对照组间差异无统计学意义(p>0.05)。KD-CAL组急性期血浆IL-6水平明显高于KD-nCAL组，差异有统计学意义(p<0.05)。KD-CAL组亚急性期血浆IL-6水平高于KD-nCAL组，但差异无统计学意义(p>0.05),见以下各表格以及图14、图15。
KD各期与两对照组血浆IL-6水平(x±s)
KD急性期 KD亚急性期 发热对照组 正常对照组
IL-6 184.01±38.09a 85.75±18.26b 71.30±24.78c 65.86±26.94
注：a.KD急性期与正常对照组、发热对照组比较，p<0.05；b.KD急性期与亚急性期比较p<0.05；c.两对照组间比较无统计学意义，p>0.05。
KD中CAL组与nCAL组血浆IL-6水平比较(x±s)
注：A表示CAL组，B表示nCAL组，a.急性期KD-CAL组与KD-nCAL比较，p<0.05；b.亚急性期KD-CAL组与KD-nCAL比较差异无统计学意义，p>0.05。
4. hsa-miR-223-3p与IL-6相关性分析
KD急性期血浆中hsa-miR-223-3p表达量及血浆IL-6水平之间采用Spearman’s秩相关分析，结果显示hsa-miR-223-3p表达量与IL-6水平呈负相关，r＝-0.563，p＝0.089。
实施例二通过对KD急性期和亚急性期血浆中的hsa-miR-223-3p和IL-6进行了分析，结果发现hsa-miR-223-3p的表达量在急性期KD患儿血浆中明显升高，差异有统计学意义；在亚急性期KD患儿血浆中hsa-miR-223-3p的表达量与两对照组间无明显差异。KD-CAL组急性期血浆hsa-miR-223-3p表达量明显低于KD-nCAL组，差异有统计学意义；KD-CAL组亚急性期血浆hsa-miR-223-3p表达量低于KD-nCAL组，但差异无统计学意义。提示hsa-miR-223-3p在KD血管炎症中可能具有保护作用，急性期低水平的hsa-miR-223-3p可能是冠状动脉损害的高危因素。
IL-6水平在急性期KD患儿血浆中明显升高，差异有统计学意义，与文献[31-32]报道一致；在亚急性期KD患儿血浆中IL-6水平与两对照组间无明显差异。KD-CAL组急性期血浆IL-6水平明显高于KD-nCAL组，差异有统计学意义。KD-CAL组亚急性期血浆IL-6水平高于KD-nCAL组，但差异无统计学意义。提示IL-6的过多表达可能参与了KD患儿血管炎症损伤机制。
相关性分析发现KD患儿急性期血浆中hsa-miR-223-3p表达量与IL-6水平存在负相关。因此，我们推测，hsa-miR-223-3p可能在急性期可能通过抑制靶基因IL6ST的转录后表达，进一步抑制IL-6/STAT信号通路活化，从而减轻KD的血管炎症反应。

Claims (7)

1.一种辅助诊断川崎病的核酸标记物，其特征在于，所述核酸标记物为hsa-miR-223-3p，具有如SEQ 6所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的辅助诊断川崎病的核酸标记物，其特征在于，所述核酸标记物hsa-miR-223-3p为血浆中的miRNA。
3.一种辅助诊断川崎病的试剂盒，所述试剂盒包括对血浆中的hsa-miR-223-3p进行定量检测的试剂。
4.根据权利要求3所述的辅助诊断川崎病的试剂盒，所述试剂盒中包括对hsa-miR-223-3p进行实时定量聚合酶链反应的引物。
5.根据权利要求4所述的辅助诊断川崎病的试剂盒，所述引物具有SEQ 4所示的核苷酸序列。
6.具有SEQ 6所述核苷酸序列的miRNA作为川崎病的核酸标记物的应用。
7.具有SEQ 6所述核苷酸序列的miRNA在制备减轻川崎病的血管炎症反应的药物中的应用。
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