CN103454268B - 一种基于点击反应的还原糖定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分析化学领域，涉及一种基于点击反应的还原糖定量检测方法。本发明利用巯基丙酸修饰纳米金，进而通过酰胺反应分别固定炔基、叠氮基；以葡萄糖为目标检测物，利用葡萄糖的还原性将二价铜还原为一价铜，后者充当点击反应的催化剂，促使炔基与叠氮基之间发生环加成反应，从而改变纳米金间距，使纳米金聚集变色。根据纳米金的聚集程度，判断催化剂一价铜的含量，进而实现对生物样品中还原糖的定量检测。该方法操作简单，成本低廉，不需要特殊的仪器设备，重现性，灵敏度相较于以往还原糖检测手段有明显提高，是一种在食品科学、分析化学、医学等领域中具有广阔应用前景的检测方法。

Description

一种基于点击反应的还原糖定量检测方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，涉及一种基于点击反应的还原糖定量检测方法。

背景技术

近半个世纪，关于还原糖的研究和应用己有了很大的发展，在食品分析、发酵控制、临床检验等方面发挥着重要的作用。但由于糖类物质自身的结构复杂性以及研究手段的局限性，使得多年来糖类物质的研究明显落后于蛋白质和核酸的研究。葡萄糖作为一种最常见的还原糖，是生物体中许多生化反应的指标物质，具有供给能量、补充血糖、强心利尿、促进解毒功能的作用，因此，以葡萄糖为代表的还原糖的快速检测和识别对食品安全、糖生物学、医学等领域的发展具有重要意义。

纳米金（AuNPs）独特的高活性、易修饰性、高比表面积以及极强的表面等离子体共振效应等特点，使其具有常规大尺寸材料所不具备的优越性能，因此在分析化学领域得到迅速发展，并受到了越来越多的重视，成为分析化学的有力工具。为实现对特定物质的选择性检测,对AuNPs的表面进行适当的修饰显得尤为重要。由于金能够和巯基形成稳定的共价键（Au-S），因此纳米金表面很容易通过化学修饰固定上特异性的识别基团。过去几年来，以AuNPs为探针的传感器被广泛用于检测核酸、蛋白质、病毒、金属离子、等。当纳米金用于光学检测时，由于具有良好的光学和电子学特性，能够实现信号的放大，从而提高检测的灵敏度。

点击反应（Click-reaction）是由Sharpless等提出的一种新型的组合化学合成方法，其中最典型的反应是通过叠氮化合物与末端炔基通过环加成反应生成1,2,3-***，该反应条件温和、高效和高控制性、产物单一，并且具有很好的生物兼容性等特点。这些独特的性质，对活体内（invivo）和活体外（invitro）生物的共轭修饰起到了重要作用。同时，点击反应还被广泛应用于有机体中蛋白质和DNA的标记、功能材料的合成与修饰等。必须指出的是，这种环加成反应在一价铜催化条件下，反应速率能提高10⁶倍，因此，使得我们利用点击反应构建的还原糖比色传感器能在不到10min完成整个检测过程。

传统的还原糖检测手段主要有红外光谱法、高效液相色谱法、气质联用以及各式各样的酶传感器，这些检测手段通常伴随着繁琐的样品前处理，大型仪器以及受过培训的操作人员，费时费力；传统的比色检测方法：斐林试剂检测则需要对检测样品进行加热至沸的处理，同时检测灵敏度不高，重复性差，无法进行微量还原糖的检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便快速定量检测微量还原糖的方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种基于点击反应的还原糖定量检测方法，先用巯基丙酸修饰纳米金，然后通过酰胺作用在纳米金表面分别固定上炔基和叠氮基，再加入还原糖和新配置的二价铜，通过还原糖还原二价铜到一价铜提供点击反应所需的催化剂，完成叠氮化合物与末端炔基通过环加成反应，从而拉近了纳米金之间的距离，引起纳米金的聚集变蓝；通过检测还原糖的吸光度，实现对样品中还原糖的定量检测。

所述的基于点击反应的还原糖定量检测方法优选包括以下步骤：

（1）用巯基丙酸修饰纳米金，然后通过酰胺反应在纳米金表面分别固定炔基和叠氮官能团，得到表面修饰了炔基的功能性纳米金溶液和表面修饰了叠氮基的功能性纳米金溶液；

（2）将两种功能性纳米金溶液混合，向其中加入一系列浓度的还原糖标准品，再加入新配置的氯化铜溶液，将混合溶液于70℃保温反应10min；

（3）将上述混合溶液通过微孔板检测***SpectraMaxM3进行光学扫描，得到不同浓度的还原糖标准品溶液对应的紫外-可见光谱；使用吸光度比值A_650/520作为纵坐标，还原糖浓度为横坐标，绘制标准曲线；

（4）按照上述方法测定样品的紫外-可见光谱，将其吸光度比值A_650/520带入上述标准曲线，计算得到样品中还原糖的浓度。

其中，步骤（1）所述的表面修饰了炔基的功能性纳米金溶液和表面修饰了叠氮基的功能性纳米金溶液的制备方法：在纳米金溶液中加入巯基丙酸，使最终溶液中纳米金溶液与巯基丙酸的浓度分别为1.0-2.3nM与0.1-0.5μM，静止1-24h；在10μL浓度分别为4mM和1mM的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺（EDC/NHS）的催化条件下，加入18μL20μM的炔丙胺或18μL20μM的1-氨基-11-叠氮-3,6,9-三氧杂十一烷，反应1-3h，通过形成酰胺键得到表面修饰了炔基或叠氮基的功能性纳米金溶液。

功能性纳米金溶液的制备中，巯基丙酸与炔基或叠氮基的摩尔比为1：1。

所述的还原糖选自葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、木糖或核糖中的任意一种或多种。

所述的纳米金使用柠檬酸钠还原法制备：（1）称取HAuCl₄.4H₂O溶于蒸馏水中，然后移取一定量的HAuCl₄溶液加入到烧瓶，剧烈搅拌，加热回流。（2）称取一定的二水合柠檬酸钠配成溶液，用容量瓶定容。（3）在沸腾状态下，用移液器移取一定体积的柠檬酸钠溶液，快速的加入到烧瓶中。（4）溶液由无色变为灰色再到酒红色，继续加热30min，冷却至室温。

有益效果：

本发明利用巯基丙酸修饰纳米金，进而通过酰胺反应分别固定炔基、叠氮基；以还原糖为目标检测物，利用还原糖的还原性将二价铜还原为一价铜，后者充当点击反应的催化剂，促使炔基与叠氮基之间发生环加成反应，从而改变纳米金间距，使纳米金聚集变色。根据纳米金的聚集程度，判断催化剂一价铜的含量，进而实现对生物样品中还原糖的定量检测。该方法操作简单，成本低廉，不需要特殊的仪器设备，重现性，灵敏度相较于以往还原糖检测手段有明显提高，是一种在食品科学、分析化学、医学等领域中具有广阔应用前景的检测方法。与现有技术相比，本发明的优势在于：

1、本发明操作简单，相对于传统的斐林试剂检测和蒽酮检测，本发明的方便快速，无需任何受训的技术人员，具有很好的普遍适用性。

2、本发明快速高效，整个检测过程在10min之内就能完成，大大减少了检测时间和工作量。

3、本发明实现可视化检测，通过观察纳米金溶液由红变蓝的速度和程度，来可视化辨别样品中还原糖的多少。

附图说明

图1为本发明的方案原理图；

图2为纳米金表面不同巯基丙酸和炔基/叠氮基的修饰比；

图3为不同浓度葡萄糖条件下对应的紫外可见光谱；

图4为不同葡萄糖浓度时的吸光度之比；

图5功能化的纳米金溶液中只有还原糖没有氯化铜提供催化剂来源和有催化剂来源没有还原糖时的紫外可见光谱。内嵌图中的A、B、C分别与紫外光谱a、b、c一一对应。裸纳米金呈现酒红色A，其对应的紫外吸收光谱在520nm处有最大吸收峰a；含糖以及修饰过炔基和叠氮基的纳米金混合溶液在没有二价铜时，无法发生点击反应，溶液仍旧呈酒红色B，吸收峰基本不变；体系中既含有还原糖又有催化铜源时，还原糖还原二价铜从而提供一价铜，使得点击反应得以完成，纳米金发生聚集呈蓝紫色C，溶液在520nm处的紫外吸收峰有所下降，650nm有新峰；

图6为定量糖条件下，点击反应在各个温度下的反应效率；随着反应温度的升高，点击反应的效率提高，当温度达到70℃时，反应效率基本趋于稳定；

图7为定量糖条件下，点击反应程度随时间的变化；随着反应时间的延长，反应不断进行，当时间达到9min时，反应达到饱和；

图8为不同还原糖条件下的吸光度的比值；

具体实施方式

实施例1

纳米金的制备与表征

所有玻璃仪器都需要使用王水浸泡以出去玻璃容器中残留的还原性物质。首先，在250mL固定好的三口烧瓶中加入100mL去离子水，准确称取HAuCl₄.4H₂O0.0123μL溶于其中。剧烈搅拌，加热回流。再准确称取柠檬酸钠0.2849g于25mL容量瓶中定容。水浴加热到50℃后用移液器准确移取一定体积的柠檬酸钠溶液快速加入烧瓶中。溶液由无色变为浅蓝色再到紫色最后成为酒红色后，继续加热10min后停止加热，继续搅拌10min后冷却到室温即制得所需13±2.5nm金胶。纳米金的直径最后利用投射电子显微镜（JEOLJEM-200CX,Japan）确定。

纳米金表面修饰炔基或叠氮化

首先，取50μM的巯基丙酸7μL加入800μL纳米金溶液，充分震荡，静置14h；加入18、8.7、5.8、4.4、3.5μL浓度为20μM的1-氨基-11-叠氮-3,6,9-三氧杂十一烷或炔丙胺。通过图2可以看出，当加入18μL浓度为20μM的1-氨基-11-叠氮-3,6,9-三氧杂十一烷或炔丙胺时，纳米金表面修饰的巯基丙酸与炔基或者叠氮基的配比为1：1，对葡萄糖想响应越大，所以本发明的最适修饰量为1：1。

葡萄糖的检测

将上述最佳条件下制备的表面修饰了炔基的功能性纳米金溶液和表面修饰了叠氮基的功能性纳米金溶液混合，向混合溶液中分别加入50μL0.002、0.006、0.025、0.045、0.06、0.07、0.09和0.1μM不同浓度的葡萄糖溶液，然后再加入10μL新配置的0.1mM氯化铜溶液，70℃保温10min后检测溶液中的紫外可见光谱，得到不同浓度葡萄糖对应的紫外可见光谱（图3）。然后使用吸光度比值A_650/520作为纵坐标，糖浓度为横坐标，绘制糖物质的标准曲线（图4），标准曲线方程为y=3.31821x+0.33148，R²=0.99816。

未知样的检测

在炔基化和叠氮化的纳米金混合溶液中加入50μL未知样品，然后再加入10μL新配置的0.1mM氯化铜溶液，10min后检测溶液中的紫外可见光谱，得到A_650/520值带入上述标准曲线方程，计算还原糖含量。同时，用手工斐林试剂法同时测定未知样中的还原糖含量。实验重复5次，以未知样中还原糖的质量百分数进行对比，本法得到的结果为13.13%，而通过手工斐林试剂法测得的百分含量为12.68%，表面本法检测还原糖的准确度高。

实施例2

发明方案的可行性验证

在400μL修饰了炔基和叠氮基的纳米金混合溶液中分别加入50μL浓度为1mM的葡萄糖没有氯化铜提供催化剂来源和有10μL的0.1mM催化剂来源没有葡萄糖的样品，调节温度为70℃，放置10min后，用紫外可见分光光度计扫描（图5）。有图5可见：裸纳米金（A）呈现酒红色，其对应的紫外吸收光谱（a）在520nm处有最大吸收峰；含糖以及修饰过炔基和叠氮基的纳米金混合溶液（B）在没有二价铜时，无法发生点击反应，溶液仍旧呈酒红色，吸收峰基本不变；体系中既含有还原糖又有催化铜源（C）时，还原糖还原二价铜从而提供一价铜，使得点击反应得以完成，纳米金发生聚集呈蓝紫色，溶液在520nm处的紫外吸收峰有所下降，650nm有新峰。

温度的影响

在含有50μL的0.1μM葡萄糖的功能性纳米金混合溶液中加入10μL新制氯化铜，放入水浴锅，分别在20、30、40、50、60、70、80、90和100℃条件下反应，放置10min后，用紫外可见分光光度计扫描，结果见图6，由图6可见反应的最佳温度为70℃。

时间的影响

在含有50μL的0.1μM葡萄糖的功能性纳米金混合溶液中加入10μL新制氯化铜，调节温度为70℃，分别在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和15min时检测其吸光度，结果见图7，由图6可见反应的最佳时间为10min。

实施例3

在400μL修饰了炔基和叠氮基的纳米金混合溶液中分别加入50μL浓度为1mM的蔗糖、果糖、木糖，调节温度为70℃，放置10min后，用紫外可见分光光度计扫描，各还原糖A_650/520值见图8。

本发明提出了一种新的、简便的可视化检测还原糖的方法。通过对其最适条件等的研究，发现该发明能快速、灵敏地的检测，整个检测过程在10min以内完成，同时，本发明所涉及到的物质价格便宜，操作简单，为其实际应用检测奠定了重要的基础。

Claims (4)

1.一种基于点击反应的还原糖定量检测方法，其特征在于先用巯基丙酸修饰纳米金，然后通过酰胺作用在纳米金表面分别固定上炔基和叠氮基，再加入还原糖和新配置的二价铜，通过还原糖还原二价铜到一价铜提供点击反应所需的催化剂，完成叠氮化合物与末端炔基通过环加成反应，从而拉近了纳米金之间的距离，引起纳米金的聚集变蓝；通过检测还原糖的吸光度，实现对样品中还原糖的定量检测；其中，巯基丙酸与炔基或叠氮基的摩尔比为1：1；所述的还原糖选自葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、木糖或核糖中的任意一种或多种。

2.根据权利要求1所述的基于点击反应的还原糖定量检测方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）用巯基丙酸修饰纳米金，然后通过酰胺反应在纳米金表面分别固定炔基和叠氮官能团，得到表面修饰了炔基的功能性纳米金溶液和表面修饰了叠氮基的功能性纳米金溶液；

（2）将两种功能性纳米金溶液混合，向其中加入一系列浓度的还原糖标准品，再加入新配置的氯化铜溶液，将混合溶液于70℃保温反应10min；

（3）将上述混合溶液通过微孔板检测***SpectraMaxM3进行光学扫描，得到不同浓度的还原糖标准品溶液对应的紫外-可见光谱；使用吸光度比值A650/520作为纵坐标，还原糖浓度为横坐标，绘制标准曲线；

（4）按照上述方法测定样品的紫外-可见光谱，将其吸光度比值A650/520带入所述标准曲线，计算得到样品中还原糖的浓度。

3.根据权利要求2所述的基于点击反应的还原糖定量检测方法，其特征在于步骤（1）所述的表面修饰了炔基的功能性纳米金溶液和表面修饰了叠氮基的功能性纳米金溶液的制备方法为：在纳米金溶液中加入巯基丙酸，使最终溶液中纳米金溶液与巯基丙酸的浓度分别为1.0-2.3nM与0.1-0.5μM，静置1-24h；在10μL浓度为4mM和1mM的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺的催化条件下，加入18μL20μM的炔丙胺或18μL20μM的1-氨基-11-叠氮-3,6,9-三氧杂十一烷，反应1-3h，通过形成酰胺键得到表面修饰了炔基的功能性纳米金溶液和表面修饰了叠氮基的功能性纳米金溶液。

4.根据权利要求1或2所述的基于点击反应的还原糖定量检测方法，其特征在于所述的纳米金使用柠檬酸钠还原法制备。