CN108727265A - 一种检测甲醛和pH的双功能荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

一种检测甲醛和pH的双功能荧光探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测甲醛和pH的双功能荧光探针及其制备方法及应用。所述荧光探针的结构如式(I)所示，其制备方法为：化合物(II)和化合物(III)在碳酸铯的作用下，生成化合物(IV)；化合物(IV)在碱性条件下，将叠氮还原为氨基，最终生成化合物(I)。本发明提供了所述荧光探针在检测甲醛和/或pH值中的应用。本发明提供了能同时检测细胞内甲醛和pH的荧光探针，为研究细胞中甲醛和pH的生理作用提供一种有效的研究工具。

Description

一种检测甲醛和pH的双功能荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种检测甲醛和pH的双功能荧光探针及其制备方法和应用
背景技术
1、甲醛属于活性碳簇，是一种公认的致癌物质。甲醛源于细胞内氧化酶和去甲基酶产生的内源性代谢物，在正常的细胞中，甲醛的浓度可达到0.4mM左右。体内过高的甲醛能够引起神经退行性疾病、阿兹海默病和各种癌症等等。然而目前的甲醛检测方法大多不能实时监测细胞内的甲醛浓度，因此，发展一种新型荧光探针以检测细胞内的甲醛势在必行。
2、pH和甲醛的浓度水平在生理环境下是相互依赖的，pH通过改变赖氨酸特异性脱甲基酶的活性，以影响甲醛的产生，而FA和酸性微环境可以协同诱导骨癌疼痛。因此，在复杂的生物体内同时对pH和甲醛成像，将可能有助于进一步了解相互之间的关系。近年来，荧光探针的发展可用于活细胞或组织中的pH或甲醛成像。但是，没有单一的探针可以同时对同一***中的两种分析物成像。
3、荧光探针由于其高灵敏度、实时检测、生物损伤小等优点而受到研究者的关注。本发明目的在于开发一个新型的甲醛和pH荧光探针，可以精确检测细胞内的甲醛浓度和pH值。
发明内容
本发明目的是提供一种能检测甲醛浓度和pH值的双功能荧光探针。
本发明第二个目的是提供一种所述荧光探针制备方法。
本发明第三个目是提供所述荧光探针在甲醛和pH检测中的应用。
本发明为实现上述目的采用以下技术方案：
一种荧光探针，其结构如式(I)所示：
一种所述的荧光探针的制备方法，所述制备方法为：
化合物(II)和化合物(III)在碳酸铯的作用下，生成化合物(IV)；化合物(IV)在碱性条件下，将叠氮还原为氨基，最终生成化合物(I)；
反应路线如下：
进一步，所述制备方法具体按照如下步骤进行：
(1)将化合物(III)、Cs2CO3按物质的量比1:1～1.5(优选为1:1)，混合在无水DMF中的溶液中滴加化合物(II)，并将该混合物在N2保护下于40℃～50℃搅拌过夜；旋蒸除去溶剂，并通过二氧化硅柱色谱法(优选以体积比为1:10的乙酸乙酯/石油醚为洗脱试剂)纯化所得残余物，即得化合物(IV)；
(2)将二氯化锡、三乙胺、苯硫酚按物质的量比1:2～3.5:2～3.5(优选为1:3:3)加入到乙腈溶剂中，在30℃～40℃下搅拌15min～30min，然后加入化合物(IV)，其中化合物(IV)与二氯化锡二水合物的物质的量比为0.5～1：1(优选0.7：1)，并在30℃～40℃下继续搅拌12h～14h；将反应物减压浓缩，通过二氧化硅柱层析(优选以体积比1：3的乙酸乙酯/石油醚作为洗脱试剂)进行纯化，得到化合物(I)。
本发明化合物(II)为公开的化合物，其制备方法可参考文献(K.J.Bruemmer,R.R.Walvoord,T.F.Brewer,G.Burgos-Barragan,N.Wit,L.B.Pontel,K.J.Patel andC.J.Chang,Development of a General Aza-Cope Reaction Trigger Applied toFluorescence Imaging of Formaldehyde in Living Cells,J.Am.Chem.Soc.,2017,139,5338.)
本发明化合物(III)为公开的化合物，其制备方法可参考文献(2.H.
Park,S.-K.Chang,Signaling of water content in organic solvents bysolvatochromism of a hydroxynaphthalimide-based merocyanine dye.Dyes andPigments,2015,122,324.)
本发明提供所述的荧光探针在检测甲醛中的应用。
进一步，所述甲醛优选为细胞内甲醛，浓度不高于1mmol/L。
更进一步，所述细胞为人***细胞Hela细胞。
本发明还提供了所述的荧光探针在检测pH值中的应用。
进一步，所述pH值优选为细胞内溶酶体的pH值，浓度为pH4.5-5.5。
更进一步，所述细胞为人***细胞Hela细胞。
本发明进一步提供了所述的荧光探针在检测甲醛和pH值中的应用。
进一步，所述甲醛为细胞内甲醛，浓度不高于1mmol/L；所述pH值为细胞内溶酶体的pH值，浓度为pH4.5-5.5。
更进一步，所述细胞为人***细胞Hela细胞。
本发明所述化合物(I)作为一种荧光探针，可应用于甲醛的荧光定量检测。所述的定量甲醛浓度的荧光检测原理为：化合物(I)在与甲醛进行反应后，反应基团脱去，生成荧光物质化合物(III)，测定在激发为455nm时发射波长555nm处探针的荧光强度变化，从而获得甲醛浓度。使用本发明的荧光探针检测甲醛浓度的原理如下所示：
本发明所述化合物(I)作为一种荧光探针，可应用于pH的荧光定量检测。所述的定量pH浓度的荧光检测原理为：化合物(I)在与pH进行反应后，氨基作为pH敏感基团，得到一个质子，形成NH3 +反应基团，荧光强度增加，测定在激发为365nm时，发射波长455nm处探针的荧光强度变化，从而获得pH值。使用本发明的荧光探针检测pH浓度的原理如下所示：
共聚焦荧光显微镜成像实验很好地证明了本发明所述荧光探针能够在细胞中检测甲醛浓度的变化，以及细胞内的酸碱环境，为研究细胞内的代谢机制提供了新的工具，在生物领域具有很好的前景。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明提供了能同时检测细胞内甲醛和pH的荧光探针，为研究细胞中甲醛和pH的生理作用提供一种有效的研究工具。
附图说明
图1为本发明中实施例1制备的化合物(I)的核磁氢谱。
图2为本发明中实施例1制备的化合物(I)的核磁碳谱。
图3为本发明中实施例1制备的化合物(I)，在DMSO/PBS缓冲液(pH＝7.4，v/v＝1/199)条件下，加入不同当量的甲醛溶液时的荧光吸收光谱图。
图4为本发明中实施例1制备的化合物(I)，在pH分别为3.5、7.5的DMSO/PBS缓冲液(v/v＝1/199)中的荧光吸收光谱图。
图5为本发明中实施例1制备的化合物(I)，在DMSO/PBS缓冲液(pH＝7.4，v/v＝1/199)条件下，加入不同当量的甲醛溶液时的荧光发射光谱图。图5激发波长455nm，发射波长555nm。
图6为本发明中实施例1制备的化合物(I)(0.5μM)，在DMSO/PBS缓冲液(pH＝7.4，v/v＝1/199)条件下，与甲醛(0.5mM)作用过程中的随时间变化的荧光图。图6激发波长455nm，发射波长555nm。
图7为本发明中实施例1制备的化合物(I)，在DMSO/PBS缓冲液(pH＝7.4，v/v＝1/199)条件下，选择性结果的荧光图。1-15分别为PBS、乙醛、苯甲醛、对硝基苯甲醛、对羟基苯甲醛、丙酮、甲酸、葡萄糖、谷胱甘肽、同型半胱氨酸、半胱氨酸、硫酸氢钠、双氧水、叔丁基过氧化氢、甲醛。图7激发波长455nm，发射波长555nm。
图8为本发明中实施例1制备的化合物(I)，在DMSO/PBS缓冲液(pH＝7.4，v/v＝1/199)条件下，加入甲醛前后的的高效液相色谱图以及质谱图。
图9为本发明中实施例1制备的化合物(I)对***细胞中甲醛荧光成像。
图10为本发明中实施例1制备的化合物(I)对***细胞中内源性甲醛荧光成像。
图11为本发明中实施例1制备的化合物(I)，加入到不同pH的DMSO/PBS缓冲液(v/v＝1/199)中的荧光发射光谱图，以及荧光强度与pH的线性关系。激发波长365nm，发射波长455nm。
图12为本发明中实施例1制备的化合物(I)，在DMSO/PBS缓冲液(v/v＝1/199)，pH分别4、7.4的条件下，探针的荧光强度随时间的变化。激发波长365nm，发射波长455nm。
图13为本发明中实施例1制备的化合物(IV)(0.5μM)，在DMSO/PBS缓冲液(pH＝7.4，v/v＝1/199)条件下，不同pH的值与荧光强度的变化点状图。激发波长365nm，发射波长455nm。
图14为本发明中实施例1制备的化合物(I)，在DMSO/PBS缓冲液(pH＝7.4，v/v＝1/199)条件下，选择性结果的荧光图。1-15分别为PBS、乙醛、苯甲醛、对硝基苯甲醛、对羟基苯甲醛、丙酮、甲酸、葡萄糖、谷胱甘肽、同型半胱氨酸、半胱氨酸、硫酸氢钠、双氧水、叔丁基过氧化氢、pH。图7激发波长365nm，发射波长455nm。
图15为本发明中实施例1制备的化合物(I)与商品化的Lyso-Tracker Red的细胞成像图。
图16为本发明中实施例1制备的化合物(IV)(0.5μM)，在DMSO/PBS缓冲液(pH＝7.4，v/v＝1/199)条件下，不同pH的值与荧光强度的变化点状图。激发波长365nm，发射波长455nm。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1
(1)化合物(IV)的制备
将化合物(III)(0.65g,2.4mmol)和Cs2CO3(0.78g，2.4mmol)混合在10ml无水DMF中的溶液中滴加化合物(II)(0.67g,2mmol)，并将该混合物在N2下于40℃～50℃搅拌过夜。在高真空下除去溶剂，并通过使用洗脱剂乙酸乙酯/石油醚(v/v，1:10)的二氧化硅柱色谱法纯化所得残余物，即得0.57g化合物(IV)(收率30％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.50–8.34(m,3H),7.59(dd,J＝8.3,7.4Hz,1H),6.94(d,J＝8.3Hz,1H),6.00(dd,J＝17.5,10.9Hz,1H),5.20–5.03(m,2H),4.34(t,J＝6.7Hz,2H),4.17–4.02(m,2H),2.22(dd,J＝13.8,6.9Hz,1H),2.10(dt,J＝14.2,7.0Hz,1H),1.67(tt,J＝7.7,6.6Hz,2H),1.45(s,3H),1.41(dt,J＝14.2,7.2Hz,2H),1.13(s,6H),0.95(t,J＝7.4Hz,3H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ164.18,163.58,159.52,143.42,133.07,131.20,129.08,128.22,125.69,123.19,122.23,114.94,114.06,105.61,67.10,65.70,45.53,39.89,34.57,30.13,22.31,22.13,20.29,18.01,13.75.C25H30N4O3(M+H)435.2,found 435.2.
(2)化合物(I)的制备
将二氯化锡二水合物(1g，0.33mmol)加入到圆底烧瓶中，然后加入苯硫酚(0.11g，1mmol)和三乙胺(0.10g，1mmol)混合于5ml乙腈溶剂中，并将混合物在30-40℃下搅拌15min，然后将化合物(IV)(0.1g，0.23mmol)加入乙腈溶剂中，并在30-40℃下再搅拌12h。将反应物减压浓缩，通过使用洗脱剂乙酸乙酯/石油醚(v/v，1：3)的二氧化硅柱层析进行纯化，得到120mg最终化合物(I)探针DPFP。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.47(s,3H),7.58(s,1H),7.09(d,J＝8.3Hz,1H),6.07(dd,J＝17.4,10.8Hz,1H),5.29–5.06(m,2H),4.56(s,1H),4.45(dd,J＝15.8,8.2Hz,1H),4.30–4.00(m,2H),2.21(s,1H),1.71(ddd,J＝12.7,8.6,6.7Hz,2H),1.47(dt,J＝15.1,7.4Hz,2H),1.35–1.16(m,9H),0.99(t,J＝7.4Hz,3H).13CNMR(126MHz,CDCl3)δ164.38,163.89,133.31,131.35,128.30,125.69,122.35,115.06,106.09,58.47,53.43,40.09,30.28,20.43,18.45,13.88.C25H30N4O3(M+H)409.2413,found409.2492.
实施例2化合物(I)(5μM)在不同甲醛浓度下的荧光光谱检测。
准确称取一定量实施例1制备的化合物(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为0.1mM的探针母液，移液枪吸取2μL加入到0.394mL PBS缓冲液(pH＝7.4)中，分别加入4μL不同当量甲醛溶液(使最终甲醛在混合溶液中的浓度分别为0、0.0025、0.0075、0.01、0.025、0.04、0.05、0.06、0.075、0.1、0.15、0.25、0.4、0.5、0.6、0.75、1、2、5mM)，在37℃下反应3h后，加入到比色皿中，然后测定化合物(I)的荧光吸收光谱。
实验结果表明，随着甲醛浓度的提高，化合物(I)在455nm波长处的吸收增强。说明，化合物(I)与甲醛发生反应，产生“turn-on”现象，荧光图谱见图3。
实施例3化合物(I)(5μM)在不同pH值下的荧光吸收检测。
准确称取一定量实施例1制备的化合物(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为0.1mM的探针母液，移液枪吸取2μL加入到0.398mL不同pH值的PBS缓冲液(使最终混合溶液pH值为3.5、7.5)；另使用移液枪吸取2μL探针母液，加入到0.394mL PBS缓冲液(pH＝7.4)中，再加入4μL甲醛溶液(使最终混合溶液中甲醛浓度为2mM)在37℃下反应3h后，加入到比色皿中，然后测定化合物(I)的荧光吸收光谱。
实验结果表明，在pH＝3.5时，化合物(I)在365nm波长处增强，说明化合物(I)在酸性环境中产生“turn on”现象。当探针与甲醛发生反应后，化合物(I)在455nm波长处的吸收增强，产生“turn-on”现象，荧光图谱见图4。
实施例4本发明中化合物(I)(5μM)在DMSO/PBS缓冲液(pH＝7.4，v/v＝1/199)条件下加入不同当量甲醛下的荧光光谱检测。
准确称取一定量实施例1制备的化合物(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为0.1mM的探针母液，移液枪吸取2μL加入到0.394mL PBS缓冲液(pH＝7.4)中，分别加入4μL不同当量甲醛溶液(使甲醛的最终浓度分别为0、0.0025、0.0075、0.01、0.025、0.04、0.05、0.06、0.075、0.1、0.15、0.25、0.4、0.5、0.6、0.75、1、2、5mM)，37℃下反应3h后，加入到96孔板中，然后测定化合物(I)的荧光光谱。
实验结果表明，在以455nm波长激发时，随着甲醛浓度的提高，化合物(I)在555nm处的荧光强度增加。说明，化合物(I)与甲醛发生反应，越来越多的化合物(I)的产生“turn-on”现象。甲醛荧光探针的检测下限为10μM，R2＝0.99，符合细胞内甲醛检测的要求，荧光图谱见图5。
实施例5本发明中化合物(I)(5μM)在DMSO/PBS缓冲液(pH＝7.4，v/v＝1/199)条件下加入0.5mmol甲醛，荧光强度随时间变化的线性关系。
准确称取一定量实施例1制备的化合物(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为0.1mM的探针母液，移液枪吸取2μL加入到0.394mL PBS缓冲液(pH＝7.4)中，加入4μL甲醛溶液，使最终甲醛在缓冲液的浓度为0.5mmol，加入到96孔板中，在37℃下每反应5min，即测一次荧光强度，共反应3h，统计数据，并做线性关系的相关曲线。荧光激发波长为455nm，发射波长为555nm。
数据表明，甲醛荧光探针的荧光强度，随时间的增加而增强。荧光图谱见图6。
实施例6本发明中化合物(I)(5μM)在DMSO/PBS缓冲液(pH＝7.4，v/v＝1/199)条件下选择性结果的荧光光谱检测。
准确称取一定量的探针(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为0.1mM的母液，移液枪吸取2μL加入到0.394mL PBS缓冲液(pH＝7.4)中，分别加入4μL甲醛水溶液(最终甲醛在水中的浓度均1mM)和生物相关活性小分子水溶液(乙醛、丙酮、甲酸、4-羟基苯甲醛、4-硝基苯甲醛、苯甲醛、双氧水、叔丁基过氧化氢、硫氢化钠、谷胱甘肽、半胱氨酸、高半胱氨酸、葡萄糖，最终浓度均为1mM)，37℃下反应3h，测定其荧光值。荧光激发波长为455nm，发射波长为555nm。
实验结果表明，除了甲醛，化合物(I)在其它相关生物活性分子存在下荧光强度基本没有变化，表明其抗干扰能力十分好，即对甲醛的专一性比较好。荧光图谱见图7。
实施例7本发明中化合物(I)(5μM)在DMSO/PBS缓冲液(pH＝7.4，v/v＝1/199)条件下与甲醛反应后的机理证明。
准确称取一定量的探针(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为0.1mM的母液，移液枪吸取2μL加入到0.394mL PBS缓冲液(pH＝7.4)中，分别加入4μL甲醛水溶液(最终甲醛在水中的浓度均1mM)，反应过夜，然后利用高效液相色谱分析。高效液相谱图见图8。
实验证明，我们描述的化合物(I)与甲醛反应的机理是正确的。化合物(I)与甲醛生成中间体，并最终转化为化合物(III)，从而信号turn-on的效果。
实施例8本发明中化合物(I)在***细胞中外源性甲醛的成像分析
准确称取一定量的探针(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为10mM的母液，移液枪吸取2μL加入到1.998mLDMEM培养基中。取1mL加入到Hela细胞中，37℃下孵化0.5h，用新鲜DMEM培养基洗涤两次，然后用不同甲醛浓度(最终甲醛浓度分别为0、0.3mM、0.6mM、1mM、2mM)孵化3h，新鲜DMEM培养基洗涤两次，最终用Olympus Fluoview FV 1200共聚焦显微镜成像。图10为细胞共聚焦荧光成像效果图：(a)PBS(pH＝7.4)，(b)甲醛浓度为0.3mM，(c)甲醛浓度为0.6mM，(d)甲醛浓度为1mM，or(e)甲醛浓度为2mM，荧光图谱见图9
实施例9本发明中化合物(I)在***细胞中内源性甲醛的成像分析
准确称取一定量的探针(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为0.1mM的母液，移液枪吸取2μL加入到0.198mLDMEM培养基中。取1mL含有抑制剂NaHSO3(最终NaHSO3浓度为0.2mmol)或NAC(最终NAC浓度为0.2mmol)分别在37℃下孵化0.5h。随后将化合物(I)的培养液加入到Hela细胞中,37℃下孵化0.5h，用DMEM培养基洗涤两次，最终用Olympus Fluoview FV 1200共聚焦显微镜成像。图10为细胞共聚焦荧光成像效果图：(a)不加抑制剂的空白探针对照,(b):NaHSO3浓度为0.2mmol；(c):NAC浓度为0.2mmol；基准尺,20μm。荧光图谱见图10。
实验结果表明，随着细胞内甲醛浓度的不断增加，能观察到细胞内的荧光强度不断增强，说明化合物(I)能够检测细胞内的甲醛浓度的变化。
实施例10化合物(I)(5μM)在不同pH下的荧光发射光谱图。激发波长为365nm，发射波长为455nm。
准确称取一定量实施例1制备的化合物(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为0.1mM的探针母液，移液枪吸取2μL加入到0.398mL不同pH值的PBS缓冲液(最终在水中的pH值为3.5到10)中，37℃下反应3h后，加入到96孔板中，然后测定化合物(I)的荧光发射光谱。
实验结果表明，在以365nm波长激发时，在pH值较低时，化合物(I)在455nm处的荧光强度较强；当pH呈中性和碱性时，化合物(I)在455nm处的荧光强度较弱。说明探针对pH敏感，荧光图谱见图11。
实施例11化合物(I)，在DMSO/PBS缓冲液(v/v＝1/199)，pH分别4、7.4的条件下，探针的荧光强度随时间的变化。
准确称取一定量实施例1制备的化合物(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为1mM的探针母液，移液枪吸取2μL加入到0.398mL不同pH值的PBS缓冲液(最终pH的值分别为4、7.4)，37℃下反应0.5h后，加入到96孔板中，然后测定化合物(I)的荧光光谱。
数据表明，化合物(I)在25min左右完全反应。且在pH＝4和pH＝7.4时，具有较大的荧光强度的差异。荧光图谱见图12。
实施例12本发明中实施例1制备的化合物(IV)(5μM)，在DMSO/PBS缓冲液(pH＝7.4，v/v＝1/199)条件下，不同pH的值与荧光强度的变化点状图。
准确称取一定量实施例1制备的化合物(IV)，用二甲基亚砜配制成浓度为1mM的探针母液，移液枪吸取2μL加入到0.398mL不同pH值的PBS缓冲液(使最终pH在缓冲液的值分别从3.5到9.5)，加入到96孔板中，在37℃下反应3h，统计数据，并做线性关系的相关曲线。荧光激发波长为365nm，发射波长为455nm。
数据表明，化合物(IV)没有对pH的敏感性，可以进一步说明是化合物(I)的氨基基团对pH的敏感，才产生的“turn on”现象。荧光图谱见图13。
实施例13本发明中化合物(I)(5μM)在DMSO/PBS缓冲液(pH＝7.4，v/v＝1/199)条件下选择性结果的荧光光谱检测。
准确称取一定量实施例1制备的化合物(IV)，用二甲基亚砜配制成浓度为1mM的探针母液，移液枪吸取2μL加入到0.394mL，随后分别加入4μL生物相关活性小分子水溶液(乙醛、丙酮、甲酸、4-羟基苯甲醛、4-硝基苯甲醛、苯甲醛、双氧水、叔丁基过氧化氢、硫氢化钠、谷胱甘肽、半胱氨酸、高半胱氨酸、葡萄糖，最终浓度均为1mM)，37℃下反应0.5h，测定其荧光值。荧光激发波长为365nm，发射波长为455nm。
实验结果表明，除了pH，化合物(I)在其它相关生物活性分子存在下荧光强度基本没有显著的变化，表明其抗干扰能力十分好，即对pH的专一性比较好。荧光图谱见图14。
实施例14本发明中化合物(I)与商品化的Lyso-Tracker Red的细胞成像图。
准确称取一定量的探针(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为10mM的母液，移液枪吸取2μL加入到1.998mLDMEM培养基中。取1mL含有化合物(I)的培养液加入到Hela细胞中，37℃下孵化0.5h，用DMEM培养基洗涤两次，然后用商品化的Lyso-Tracker Red(0.5μmol)，37℃孵化20min，使用1ml PBS缓冲液(pH＝7.4)洗涤两次，最终用Olympus Fluoview FV 1200共聚焦显微镜进行荧光成像。图7为细胞共聚焦荧光成像效果图：(a)化合物(I)激发波长为405nm，接收波长范围为430–480nm，(b)Lyso-Tracker Red，激发波长为543nm，接收波长范围为590–640nm；(c)混合通道；基准尺，20μm。
实验结果表明，化合物(I)可以检测细胞内溶酶体的pH，使用Fiji软件对两组细胞内的荧光强度进行对比分析，得出皮尔逊相关系数为0.88，说明化合物(I)可以较为准确的检测溶酶体pH。荧光图谱见图15。
对比例1
参考文献(X.F.Wu,L.H.Li,W.Shi,Q.Y.Gong,X.H.Li,and H.M.Ma，Sensitive andSelective Ratiometric Fluorescence Probes for Detection of IntracellularEndogenous Monoamine Oxidase A,Anal.Chem.,2016,88,1440)公开了下列化合物(1)：
化合物(1)作为荧光探针，在细胞内只能实现单一的单胺氧化酶检测，无法实现对pH和甲醛的双功能检测。
对比例2：本发明中实施例1制备的化合物(IV)(5μM)，在DMSO/PBS缓冲液(pH＝7.4，v/v＝1/199)条件下，不同pH的值与荧光强度的变化点状图。
准确称取一定量实施例1制备的化合物(IV)，用二甲基亚砜配制成浓度为1mM的探针母液，移液枪吸取2μL加入到0.398mL不同pH值的PBS缓冲液(使最终pH在缓冲液的值分别从3.5到9.5)，加入到96孔板中，在37℃下反应3h，统计数据，并做线性关系的相关曲线。荧光激发波长为365nm，发射波长为455nm。
数据表明，化合物(IV)没有对pH的敏感性，可以进一步说明是化合物(I)的氨基基团对pH的敏感，才产生的“turn on”现象。荧光图谱见图16。
对比例3
为考察本发明探针的独特性，本发明还考察了与探针结构相似化合物(2)能否用于pH检测：
用化合物(2)替换对比例2中的化合物(IV)，结果表明，化合物(2)在同等检测条件下对pH不敏感。

Claims (10)

1.一种荧光探针，其结构如式(I)所示：
2.一种如权利要求1所述的荧光探针的制备方法，所述制备方法为：
化合物(II)和化合物(III)在碳酸铯的作用下，生成化合物(IV)；化合物(IV)在碱性条件下，将叠氮还原为氨基，最终生成化合物(I)；
反应路线如下：
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述制备方法具体按照如下步骤进行：
(1)将化合物(III)、Cs2CO3按物质的量1:1～1.5，混合在无水DMF中的溶液中滴加化合物(II)，并将该混合物在N2保护下于40℃～50℃搅拌过夜；旋蒸除去溶剂，并通过二氧化硅柱色谱法纯化所得残余物，即得化合物(IV)；
(2)将二氯化锡、三乙胺、苯硫酚按物质的量比1:2～3.5:2～3.5加入到乙腈溶剂中，在30℃～40℃下搅拌15min～30min，然后加入化合物(IV)，其中化合物(IV)与二氯化锡二水合物的物质的量比为0.5～1：1，并在30℃～40℃下继续搅拌12h～14h；将反应物减压浓缩，通过二氧化硅柱层析进行纯化，得到化合物(I)。
4.如权利要求1所述的荧光探针在检测甲醛中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述甲醛为细胞内甲醛，浓度不高于1mmol/L。
6.如权利要求1所述的荧光探针在检测pH值中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述pH值为细胞内溶酶体的pH值，浓度为pH4.5-5.5。
8.如权利要求1所述的荧光探针在检测甲醛和pH值中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述甲醛为细胞内甲醛，浓度不高于1mmol/L；所述pH值为细胞内溶酶体的pH值，浓度为pH4.5-5.5。
10.如权利要求5或7或9所述的应用，其特征在于：所述细胞为人***细胞Hela细胞。
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