CN115287332A - 一种Poly(A)聚合酶活性测定方法 - Google Patents

一种Poly(A)聚合酶活性测定方法 Download PDF

Info

Publication number
CN115287332A
CN115287332A CN202211025669.7A CN202211025669A CN115287332A CN 115287332 A CN115287332 A CN 115287332A CN 202211025669 A CN202211025669 A CN 202211025669A CN 115287332 A CN115287332 A CN 115287332A
Authority
CN
China
Prior art keywords
poly
polymerase
rna
product
activity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211025669.7A
Other languages
English (en)
Inventor
邓汉卿
陈雅
陆青
燕东平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mona Wuhan Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Mona Wuhan Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mona Wuhan Biotechnology Co ltd filed Critical Mona Wuhan Biotechnology Co ltd
Priority to CN202211025669.7A priority Critical patent/CN115287332A/zh
Publication of CN115287332A publication Critical patent/CN115287332A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • G01N2333/91205—Phosphotransferases in general
    • G01N2333/91245—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)

Abstract

本发明公开了一种Poly(A)聚合酶活性测定方法，所述方法步骤为，使用Poly(A)聚合酶对RNA进行加尾反应，会生成PPi产物，对PPi水解得到产物Pi，通过测定Pi生成量计算出PPi产物量，根据酶活定义计算出Poly(A)聚合酶活性。本方案较其他测定Poly(A)聚合酶方案中底物的消耗或者产物加尾长度的方案相比，无需使用放射性同位素或者昂贵的毛细管电泳仪器，检测成本低，结果更直观准确、且简单高效。

Description

一种Poly(A)聚合酶活性测定方法
技术领域
本发明属于酶活性检测技术领域，具体涉及一种Poly(A)聚合酶活性测定方法。
背景技术
Poly(A)Polymerase以RNA为模板，催化ATP以AMP的形式依次掺入到RNA的3'末端，即在RNA的3'末端加多聚A尾。其反应方程式为：
Figure BDA0003815441020000011
3'端Poly(A)尾结构对mRNA稳定性最重要的结构之一，而且大多数的mRNA降解是从Poly(A)尾开始的。Poly(A)尾的添加可提高RNA在真核细胞中的稳定性并增强其在转染或显微注射后的翻译效率。mRNA疫苗生产过程中需要使用Poly(A)Polymerase对合成的RNA添加poly(A)尾以增加RNA的稳定性，对mRNA的保护起到重要作用，而且可以增强mRNA疫苗进入人体后翻译效率，从而提高疫苗的保存性能和mRNA疫苗性能。
此外，Poly(A)尾还可以为合成cDNA时提供通用的引物结合位点，用于RNA的末端标记或microRNA的定量。miRNA长约20～24nt，参与各种调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、信号通路、细胞增殖和凋亡、细胞代谢等。而对于miRNA靶基因预测、mRNA-miRNA互作、miRNA的表达量检测等也是不可缺少的一环。由于miRNA长度过短，可以通过Poly(A)聚合酶向miRNA的3’末端添加Poly(A)尾，增加其长度。之后，逆转录引物Oligo(dT)n结合到Poly(A)序列上，可获得逆转录产物cDNA，再进行后续的定量检测。Poly(A)Polymerase在miRNA检测试剂盒(加尾法)中是主要试剂成分。
准确确定Poly(A)酶活，对于相关产品性能有重要意义。标准Poly(A)酶活力测定法采用放射性底物掺入法易产生放射性污染、步骤多、周期长的缺陷，且使用放射性同位素需取得相关实验室许可资质，使用门槛高。而采用毛细管电泳仪或者PAGE胶凝胶电泳的方式对加A尾长度进行检测的方案，存在需使用昂贵的仪器，或精度不高的缺陷的问题。另有通过检测底物ATP消耗量的方案，实验步骤较多，实验设计复杂，不便于操作。
因此有必要设计一种操作简单，周期短，且多次测定误差较低的Poly(A)聚合酶活性测定方法。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提供一种Poly(A)聚合酶活性测定方法，解决现有技术测定方法不便于操作，周期长及精度低等缺陷。
为解决上述问题，本发明方案如下：
一种Poly(A)聚合酶活性测定方法，步骤包括：先使用RNA进行PAP酶催化的加尾反应，反应完成后将PPi水解为Pi，测定产物中Pi含量并计算Poly(A)聚合酶活性。
进一步地，所述Pi的测定采用孔雀石绿-磷钼酸分光光度法。
优选地，所述Poly(A)聚合酶预先稀释，使水解产物Pi的浓度在测量曲线线性范围内。
优选地，所述加尾反应过程根据酶活定义进行；所述计算公式为：酶活＝Pi摩尔数÷2×稀释倍数÷酶投入体积。
进一步地，所述RNA采用人工合成的RNA，或生物体提取的RNA。
优选地，所述人工合成的RNA长度为3-1000bp。
优选地，所述人工合成的RNA序列为包含AUCG四种碱基的任意排列顺序。
优选地，所述人工合成的RNA投入量范围为1-100nmol。
进一步地，所述PPi水解为Pi过程使用焦磷酸水解酶对产物PPi进行充分水解。
本发明还提供以上所述测定方法在Poly(A)聚合酶质量控制中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1.本发明所述测定方法对Poly(A)聚合酶加尾反应后生成的焦磷酸产物进行水解，通过测定磷酸根的含量即可计算酶活，操作简单，两小时内即可完成结果测定，多次测定误差较低且满足产品要求。
2.本发明所述测定方法使用化学试剂都为常规化学品，不使用放射性物质，不使用昂贵仪器，成本低廉，具有较强推广使用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明Poly(A)聚合酶测定中拟合的磷含量-OD值标准曲线。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明的方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
本方案中，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的手段。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的手段。
本方案提供一种Poly(A)聚合酶活性测定方法，步骤为：先使用RNA进行PAP酶催化的加尾反应，反应完成后将PPi水解为Pi，测定产物中Pi含量并计算Poly(A)聚合酶活性。
在优选的实施例中，对PPi水解为Pi的方法不做限定，现有技术中凡是能够将PPi水解为Pi的方法均可，例如焦磷酸水解酶等。同样地，可选择常见的针对Pi生成量的测定方法，现有技术中凡是能够准确测得Pi生成量的方法均可。
在优选的实施例中，采用孔雀石绿-磷钼酸分光光度法进行Pi生成量的测定。酶活测定前需要对Poly(A)聚合酶进行稀释，使得其产物Pi的范围可以落在本次采用方案的磷标准曲线线性区间范围内。
在优选的实施例中，可采用人工合成的RNA或生物体提取的RNA或其他来源的RNA，人工合成的RNA底物序列可为任意的AUCG的排列，长度在3-1000bp，且投入量需要在1-100nmol范围内保证加尾速度不受底物分子量限制。本方案中选用的RNA主要考虑作为与Poly(A)聚合酶加A尾反应的底物，并不限定其作为核酸物质的遗传信息和功能。
本方案测定Poly(A)聚合酶活性的基本原理如下：
1.加A尾反应
Poly(A)聚合酶(Poly(A)polymerase，PAP)可以催化ATP以AMP的形式依次掺入到RNA的3'末端，其反应方程式为：
Figure BDA0003815441020000051
2.焦磷酸水解反应
焦磷酸可以在过量的焦磷酸水解酶(Inorganic Pyrophosphatase，IPP)的作用下分解为磷酸：
Figure BDA0003815441020000052
3.孔雀石绿-磷钼酸分光光度法
磷酸根与钼酸根在酸性条件下形成磷钼杂多酸缔合物，然后与孔雀石绿形成的弱键复合物为显色复合物，在酸性条件下，显色复合物则保持稳定，在一定浓度范围内颜色的深浅与磷酸盐的含量成正比。孔雀石绿定磷法是分析无机磷的一种灵敏度很高的方法，用这种方法可以测定水、土、血液等溶液痕量磷的含量。从磷的浓度可以计算出Poly(A)聚合酶加尾活性。
在优选的实施例中，由于加尾反应与酶活定义反应相同，因此优选在酶活定义的反应体系及条件下进行，获取标准的酶活，也便于计算酶活结果。
本方案的测定方法对于厂家而言，可用于产品酶活的控制，制备不同酶活的产品；对于用户而言，可以实时测定酶活，为实验提供依据。
实施例
1.Poly(A)聚合酶加尾反应
所需反应体系按照表1进行建立。
表1：
Figure BDA0003815441020000053
Figure BDA0003815441020000061
反应条件：37℃，10min；85℃，15min。
2.焦磷酸水解反应
将加尾反应完成后产物加入过量无机焦磷酸酶，轻弹混匀后离心。25℃，1h。
3.孔雀石绿-磷钼酸分光光度法测量Pi含量
1)磷标准曲线样品制备
按表2制备无机磷标准溶液。
表2：
Figure BDA0003815441020000062
2)孔雀石绿显色反应
取20μl水解反应完成溶液及磷标准曲线溶液，每管加入180μl孔雀石绿染液，室温放置20min。
3)吸光值读取
吸取180μl显色反应完全的溶液至透明比色皿中，660nm波长处读取吸光值OD值，根据OD值判断选择落在磷标准曲线线性范围内稀释梯度作为有效读值。无机磷标准溶液OD值读取结果如表3所示，标准曲线拟合如图1所示。
表3:
Figure BDA0003815441020000063
Figure BDA0003815441020000071
4.计算酶活(37℃，10分钟，20μl反应体系中，将1nmolATP掺入RNA oligo所需要的酶量定义为1个单位)。
计算公式为：酶活＝磷浓度÷2×20×10÷1000×稀释倍数÷酶投入体积。
式中，20×10代表的意思为：20μl为水解反应完成溶液进行孔雀石绿显色反应的体积，10为20μl水解产物加入显色液后体积增大至200μl的稀释倍数，也可以直接理解为：磷浓度÷2×200μl。将μM折算为nM，因此除以1000。
对同一样本通过多次重复实验，通过读取OD值得到磷浓度，在多次独立实验间保持稳定。实验结果如表4所示。
表4：
重复 酶活数据U/μl
1 5.4931
2 4.8005
3 5.1544
4 5.3738
5 4.4317
6 4.7171
多次重复测定酶活数据平均值如表5所示。
表5：
Figure BDA0003815441020000072
从表5中不难看出，采用本方案测定酶活性时，多次重复误差较小。而整个酶活性测定过程仅需要2个小时的时间即可完成，所有反应体系试剂市售易得，无需使用价格高昂的设备或仪器，简单便捷，测定结果可靠性强。并且本方案实施例中使用的Poly(A)聚合酶厂家酶活数据为5U/μl，采用本方案的测定方法与传统方法所得酶活数据一致，可以验证其精度和可靠性。
另外，本方案中，采用实施例的实验手段用于检测Poly(A)聚合酶活性极限值为0.2U，具有较高的灵敏度。
特别地，本方案的测定方法从方式上克服了现有技术或传统方法从底物入手进行测定的技术偏见，从分子学上对应的摩尔比产物生成量入手测定Poly(A)聚合酶的活力，简单便捷，成本低廉，相对于传统测定方法具有显著的推广意义。
本发明并不仅仅限于说明书和实施方式中所描述，因此对于熟悉领域的人员而言可容易地实现另外的优点和改进，故在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念的精神和范围的情况下，本发明并不限于特定的细节、代表性的方案和这里示出与描述的图示示例。

Claims (10)

1.一种Poly(A)聚合酶活性测定方法，其特征在于，步骤包括：先使用RNA进行PAP酶催化的加尾反应，反应完成后将PPi水解为Pi，测定产物中Pi含量并计算Poly(A)聚合酶活性。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述Pi的测定采用孔雀石绿-磷钼酸分光光度法。
3.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述Poly(A)聚合酶预先稀释，使水解产物Pi的浓度在测量曲线线性范围内。
4.根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于，所述加尾反应过程根据酶活定义进行；所述计算公式为：酶活＝Pi摩尔数÷2×稀释倍数÷投入酶体积。
5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述RNA采用人工合成的RNA，或生物体提取的RNA。
6.根据权利要求5所述的测定方法，其特征在于，所述人工合成的RNA长度为3-1000bp。
7.根据权利要求5所述的测定方法，其特征在于，所述人工合成的RNA序列为包含AUCG四种碱基的任意排列顺序。
8.根据权利要求5所述的测定方法，其特征在于，所述人工合成的RNA投入量范围为1-100nmol。
9.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述PPi水解为Pi过程使用焦磷酸水解酶对产物PPi进行充分水解。
10.权利要求1-9任意一项所述测定方法在Poly(A)聚合酶质量控制中的应用。
CN202211025669.7A 2022-08-25 2022-08-25 一种Poly(A)聚合酶活性测定方法 Pending CN115287332A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211025669.7A CN115287332A (zh) 2022-08-25 2022-08-25 一种Poly(A)聚合酶活性测定方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211025669.7A CN115287332A (zh) 2022-08-25 2022-08-25 一种Poly(A)聚合酶活性测定方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115287332A true CN115287332A (zh) 2022-11-04

Family

ID=83832033

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211025669.7A Pending CN115287332A (zh) 2022-08-25 2022-08-25 一种Poly(A)聚合酶活性测定方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115287332A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117778523A (zh) * 2024-02-26 2024-03-29 苏州近岸蛋白质科技股份有限公司 一种Poly(A)聚合酶活性测定方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117778523A (zh) * 2024-02-26 2024-03-29 苏州近岸蛋白质科技股份有限公司 一种Poly(A)聚合酶活性测定方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Møller et al. Harmonising measurements of 8-oxo-7, 8-dihydro-2′-deoxyguanosine in cellular DNA and urine
CN115287332A (zh) 一种Poly(A)聚合酶活性测定方法
Jiao et al. A method to directly assay circRNA in real samples
CN106399457B (zh) 基于纳米模拟酶的可视化快速检测生物酶、蛋白质及其抑制剂的方法
CN106755467B (zh) 一种检测ffpe样本dna含量及完整性的方法
CN111829999B (zh) 钙钛矿荧光微球和多巴胺体系的应用方法
CN110452951B (zh) 监测mRNA Poly(A)尾长度的方法及应用
CN113621692B (zh) 人类fgfr1基因拷贝数变异核酸标准物质及其制备方法、及试剂盒
Delmar et al. Mixture model on the variance for the differential analysis of gene expression data
CN110408612A (zh) 一种低浓度dna标准物质的保护剂、保存方法及应用
CN1908628A (zh) 血清中肌酸激酶同工酶的化学发光测定方法
CN104391028A (zh) 利用微生物电解池技术在线监测氨态氮浓度的方法与装置
CN101639445A (zh) 一种用化学发光法体外检测血液丙酮酸的方法
CN205301178U (zh) 一种定量加样的胆固醇检测芯片
CN109632780B (zh) 一种检测atp的比色方法及试剂盒
CN103940870B (zh) 一种基于酶催化的细胞内嘌呤电化学检测方法
US8124418B2 (en) Method for electrochemically measuring phosphoric acid and/or phosphate
CN108517348B (zh) 一种基于dna的可视化检测碱性磷酸酶的试剂盒
Wang et al. Comparison of uric acid quantity with different food in human urine by flow injection chemiluminescence analysis
JP2857607B2 (ja) 魚介類の鮮度測定方法及び装置
CN116837142B (zh) 一种断裂点簇集区艾贝尔逊白血病病毒校准品及其制备方法和应用
CN1908631A (zh) 血清中脂肪酶的化学发光测定方法
CN107192697A (zh) 一种检测核酸外切酶i的荧光传感方法
CN204028038U (zh) 利用微生物电解池技术在线监测氨态氮浓度的装置
O'MELIA Quantitative measurement of rates of 5S RNA and transfer RNA synthesis in sea urchin embryos

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination