CN108486011B - 一种三联苯化合物、制备方法及其应用 - Google Patents

一种三联苯化合物、制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种三联苯化合物、制备方法及其应用，从黄柄壁泥蜂共生放线菌的发酵液中提取到一种三联苯类化合物2,5‑二苯基‑3‑甲氧基‑6‑羟基‑6‑丙酮基环己二烯酮，黄柄壁泥蜂共生放线菌属于内生链霉菌属，2,5‑二苯基‑3‑甲氧基‑6‑羟基‑6‑丙酮基环己二烯酮对肿瘤细胞有一定的抑制作用，因此2,5‑二苯基‑3‑甲氧基‑6‑羟基‑6‑丙酮基环己二烯酮可作为抗肿瘤药物先导化合物的应用。2,5‑二苯基‑3‑甲氧基‑6‑羟基‑6‑丙酮基环己二烯酮对骨肉瘤细胞U2OS、骨肉瘤细胞Saos2、口腔表皮样癌细胞、耐长春碱细胞，具有抑制活性的作用。

Description

一种三联苯化合物、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及微生物工程技术领域，具体涉及从一株放线菌的发酵液中提取到新的三联苯类化合物2,5-二苯基-3-甲氧基-6-羟基-6-丙酮基环己二烯酮及制法和应用。
背景技术
在自然界中，对三联苯类化合物(p-Terphenyls)是一类比较稀有的天然产物，对三联苯是一类主要分布于地衣和真菌的重要天然产物，现已发现的三联苯类化合物具有多种生物活性，包括抑制肿瘤细胞增殖、特异性抑制5-脂氧合酶、抗细菌、抗氧化等。
到目前为止大多数的三联苯化合物从真菌里分离得到，从链霉菌分离得到的三联苯化合物不到10个，所以，对于新型三联苯的发现，链霉菌是一个很好的未被充分利用的来源。
共生放线菌存在于植物体内、动物体内，目前共生放线菌多数是从植物体内分离得到的，共生放线菌从昆虫体内被发现的还比较少，昆虫生活环境复杂多变，取食不同种类的食物等因素赋予了昆虫肠道微生物多样性和复杂性的特点，因此从昆虫体内分离放线菌，从放线菌新种中寻找天然产物具有广阔的前景。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明从黄柄壁泥蜂的体内分离得到的一株共生放线菌，利用不同比例的正己烷和丙酮的混合物为洗脱剂，制备得到三联苯化合物(2,5-二苯基-3-甲氧基-6-羟基-6-丙酮基环己二烯酮)，进行三联苯化合物(2,5-二苯基-3-甲氧基-6-羟基-6-丙酮基环己二烯酮)抗肿瘤细胞活性测试，测定肿瘤细胞株的半数抑制浓度研究三联苯化合物(2,5-二苯基-3-甲氧基-6-羟基-6-丙酮基环己二烯酮)的抗肿瘤作用。
本发明的目的之一是提供一种含有三联苯化合物的黄柄壁泥蜂共生放线菌为链霉菌1510-2(Streptomyces sp.1510-2)，该菌株已于2018年03月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址为：武汉洛伽山武汉大学内)，保藏编号为CCTCC NO:M 2018111。
本发明所用的链霉菌1510-2是2015年从山东省德州市郊取得的黄柄壁泥蜂的体内分离得到的一株链霉菌，菌株编号N1510-2。其在高氏一号琼脂培养基上气丝灰白色，基丝黄褐色。
黄柄壁泥蜂内链霉菌1510-2的分离和纯化方法：
在无菌条件下，将黄柄壁泥蜂的体表用60-80％的酒精消毒，将蜂放在无菌研钵中加少量的无菌水进行研磨，用无菌水对研磨液梯度稀释，分别取各梯度稀释液于高氏培养基和YMS培养基中，置于34-40℃恒温箱中培养，待菌落长出后，挑取孢子纯化培养，得到黄柄壁泥蜂体内共生放线菌N1510-2。
优选的，酒精浓度为70％；培养箱的温度为37℃。
本发明的目的之二在于提供上述共生放线菌的发酵培养方法，所述方法为：从黄柄壁泥蜂的体内分离纯化得到的链霉菌1510-2，菌体接种到高氏一号固体培养基上，于培养箱中培养；
具体的，所述高氏一号固体培养基由可溶性淀粉、KNO3、K2HPO4、MgSO4·7H2O、NaCl、FeSO4·7H2O、琼脂、蒸馏水组成。
优选的，所述培养箱的温度为26-30℃，培养时间为5-7天。
本发明的目的之三是提供一种具有抗肿瘤活性的三联苯化合物：2,5-二苯基-3-甲氧基-6-羟基-6-丙酮基环己二烯酮，其结构式为：
Figure GDA0001645588670000021
所述三联苯化合物为从链霉菌1510-2的固体培养基中分离提取出来的。
本发明的目的之四是提供一种三联苯化合物2,5-二苯基-3-甲氧基-6-羟基-6-丙酮基环己二烯酮的制备方法，具体步骤如下：
将链霉菌1510-2的固体培养基收集剪碎，用乙酸乙酯萃取，在0.07-0.11MPa、42-47℃条件下减压蒸馏干燥浓缩得浸膏；将乙酸乙酯可溶部分用硅胶柱层析分离，以正己烷-丙酮为洗脱剂，将洗脱之后的溶液在0.07-0.11MPa、42-47℃条件下减压蒸馏收集含三联苯化合物2,5-二苯基-3-甲氧基-6-羟基-6-丙酮基环己二烯酮的馏分，将收集到的馏分重结晶得2,5-二苯基-3-甲氧基-6-羟基-6-丙酮基环己二烯酮，正己烷-丙酮的比例为4-6:1。
优选的，萃取之后减压蒸馏的压强和温度为0.09MPa、45℃；
优选的，洗脱之后减压蒸馏的压强和温度为0.09MPa、45℃；
所述三联苯化合物2,5-二苯基-3-甲氧基-6-羟基-6-丙酮基环己二烯酮在开发抗肿瘤药物的先导化合物中的应用。
所述肿瘤细胞为骨肉瘤细胞(U2OS)、骨肉瘤细胞(Saos2)、口腔表皮样癌细胞(KB)、耐长春碱(KB)细胞(KB/VCR)。
一种抗肿瘤药物由三联苯化合物2,5-二苯基-3-甲氧基-6-羟基-6-丙酮基环己二烯酮及辅料组成，所述辅料的成分包括淀粉、羧甲基纤维素钠滑石粉。
所述抗肿瘤药物包括活性成分及辅料；活性成分三联苯化合物占0.01-99.9％。
本发明的有益效果：
1)本发明首次从黄柄壁泥蜂的体内分离得到一种链霉菌，从这种链霉菌的发酵液中分离提取一种三联苯化合物(2,5-二苯基-3-甲氧基-6-羟基-6-丙酮基环己二烯酮)，2,5-二苯基-3-甲氧基-6-羟基-6-丙酮基环己二烯酮是结构新颖的化合物，可以作为抗肿瘤先导化合物，可以制备成抗肿瘤药物；
2)2,5-二苯基-3-甲氧基-6-羟基-6-丙酮基环己二烯酮可以利用微生物进行固体发酵生产，工艺简便，周期短；
3)本发明的一种三联苯化合物生物2,5-二苯基-3-甲氧基-6-羟基-6-丙酮基环己二烯酮的制备方法中，分别用洗脱剂正己烷-丙酮的五种比例20:1-1:1对用硅胶柱层析分离的产物进行洗脱，洗脱结果对比正己烷-丙酮的比例4-6：1时的洗脱效果最好；
4)本发明的一种三联苯化合物(2,5-二苯基-3-甲氧基-6-羟基-6-丙酮基环己二烯酮)的结构的鉴定，利用质谱、核磁共振谱(1H-NMR、13C-NMR、DEPT、HMQC、HMBC、COSY、NOE、X-RAY)进行检测，得到三联苯化合物(2,5-二苯基-3-甲氧基-6-羟基-6-丙酮基环己二烯酮)的光谱学数据为：2,5-二苯基-3-甲氧基-6-羟基-6-丙酮基环己二烯酮，黄色晶体，易溶于丙酮，在254和365nm紫外下有荧光吸收；
5)三联苯化合物(2,5-二苯基-3-甲氧基-6-羟基-6-丙酮基环己二烯酮)对四种肿瘤细胞进行测定半数抑制浓度，四种肿瘤细胞分别为：骨肉瘤细胞(U2OS)、骨肉瘤细胞(Saos2)、口腔表皮样癌细胞(KB)、耐长春碱(KB)细胞(KB/VCR)由山东大学(威海)实验室提供，结果表明三联苯化合物对四种肿瘤细胞具有较强的抑制活性。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
图1为链霉菌1510-2在高氏一号培养基上的形态特征；
图2为链霉菌1510-2的孢子在显微镜下的形态特征；
图3为链霉菌1510-2菌株的***发育树。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明涉及一种黄柄壁泥蜂链霉菌1510-2，具体涉及内生链霉菌属的分离鉴定、固体发酵、三联苯化合物的提取与分离、抗肿瘤细胞的活性测试。
本发明提供如下实施方案：
(1)本发明所述的黄柄壁泥蜂链霉菌1510-2，通过严格的表面消毒，从黄柄壁泥蜂的体内分离出来。
(2)本发明所述的黄柄壁泥蜂链霉菌1510-2，在高氏一号固体培养基的菌落上呈气丝粉状，灰褐灰色。初步确定为链霉菌属。
(3)本发明所述的黄柄壁泥蜂链霉菌1510-2，在高氏一号琼脂培养基上气丝灰白色，基丝黄褐色，孢子丝长而直，成簇丛。孢子近球形至椭圆形，表面光滑。经鉴定为链霉菌属。
(4)本发明所述的黄柄壁泥蜂链霉菌1510-2，已于2018年03月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址:武汉洛伽山武汉大学内)，保藏号为CCTCC NO:M 2018111。
实施例1
黄柄壁泥蜂链霉菌1510-2的分离和纯化
本发明所用得链霉菌是2015年从山东省德州市郊取得黄柄壁泥蜂的体内分离得到的一株共生放线菌，菌株编号N1510-2。
在无菌条件下，将黄柄壁泥蜂的体表用70％的酒精消毒，将蜂放在无菌研钵中加少量的无菌水进行研磨，用无菌水对研磨液梯度稀释成10-1,10-2,10-3，分别取各梯度稀释液100微升于高氏培养基和YMS培养基中，置于37℃恒温箱中培养，待菌落长出后，挑取孢子纯化培养，得到黄柄壁泥蜂体内共生放线菌。
实施例2：黄柄壁泥蜂链霉菌1510-2的鉴定
(1)形态鉴定：
链霉菌1510-2在高氏一号培养基上的菌落表面呈灰白色，菌落圆形如图1所示。光学显微镜镜检，孢子丝长而直，成簇丛。孢子近球形至椭圆形，表面光滑，初步确定为链霉菌属如图2所示。
(2)分子鉴定：菌丝体按照生工细菌基因组DNA快速抽提试剂盒说明书提取DNA，使用正向引物为Fd2：5’-GAGTTTGATCATGGCTCAG-3，和反向引物16Sr：5’-TTGCGGGACTTAACCCAACAT-3，进行PCR扩增16SrDNA序列，将PCR产物纯化后送华大公司测序，测序结果进行BLAST比对分析，选取相似序列，利用MEGA5.0软件构建***发育树，确定1512-16菌株的种属分类地位。在GenBank数据库中进行Blast比对后，选择同源性高于97％的菌株进行***发育分析(图3)，结果发现，1510-2与Streptomyces antibioticusFJ883742.1和Streptomyces griseoruber FJ919750.1聚在同一分支中，序列的相似性达到99％。因此，将共生放线菌1510-2鉴定为链霉菌属。
综合上述特征，依据《链霉菌鉴定手册》和分子鉴定，本发明菌株1510-2确定为链霉菌属。该菌株于2018年03月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2018111。
实施例3
黄柄壁泥蜂链霉菌1510-2的固体发酵
将活化的链霉菌1510-2以划线的方式用接种环接种到高氏一号固体培养基上，在28℃恒温箱中培养5-7天。
实施例4
2,5-二苯基-3-甲氧基-6-羟基-6-丙酮基环己二烯酮的提取与分离
将实施例3的固体琼脂搜集剪碎，用乙酸乙酯萃取，减压蒸馏浓缩回收溶剂，得到总浸膏，将乙酸乙酯可溶部分用硅胶柱层析分离，以正己烷-丙酮(20:1-1:1)为洗脱剂，在正己烷-丙酮4-6:1段收集含三联苯化合物2,5-二苯基-3-甲氧基-6-羟基-6-丙酮基环己二烯酮的馏分，重结晶得2,5-二苯基-3-甲氧基-6-羟基-6-丙酮基环己二烯酮纯品。
实施例5
2,5-二苯基-3-甲氧基-6-羟基-6-丙酮基环己二烯酮的结构鉴定
2,5-二苯基-3-甲氧基-6-羟基-6-丙酮基环己二烯酮的结构根据质谱、核磁共振谱(1H-NMR、13C-NMR、DEPT、HMQC、HMBC、COSY、NOE、X-RAY)而确定的。
2,5-二苯基-3-甲氧基-6-羟基-6-丙酮基环己二烯酮光谱学数据如下:
2,5-二苯基-3-甲氧基-6-羟基-6-丙酮基环己二烯酮，黄色晶体，易溶于丙酮，在254和365nm紫外下有荧光吸收，1H和13C-NMR数据见表1
表1 1H和13C-NMR数据
Figure GDA0001645588670000051
Figure GDA0001645588670000061
实施例6
2,5-二苯基-3-甲氧基-6-羟基-6-丙酮基环己二烯酮抗肿瘤细胞的活性测试
骨肉瘤细胞(U2OS)、骨肉瘤细胞(Saos2)、口腔表皮样癌细胞(KB)、耐长春碱(KB)细胞(KB/VCR)由山东大学(威海)实验室提供。细胞培养于199培养液中，内加10％小牛血清，培育在37℃,5％CO2培养箱内。单体化合物是经化学结构鉴定的三联苯化合物2,5-二苯基-3-甲氧基-6-羟基-6-丙酮基环己二烯酮。
试验方法采用MTT比色法，测定本发明化合物的半数抑制浓度IC50。根据细胞生长速率，收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度至3-5×104/ml，接种于96孔培养板中，每孔100ul,5％CO2，37℃条件下培养24小时，加入浓度梯度的药物,设3个复孔，孵育48小时后，每孔加入20ul 0.5％MTT溶液，继续培养4h，小心吸去孔内培养液，PBS洗一遍，每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪OD570nm处测量各孔的吸光值，计算IC50。
表2. 2,5-二苯基-3-甲氧基-6-羟基-6-丙酮基环己二烯酮对肿瘤细胞的抑制作用
Figure GDA0001645588670000062
IC50(μM)：表明本发明三联苯化合物的半数有效抑制浓度。
上述结果表明2,5-二苯基-3-甲氧基-6-羟基-6-丙酮基环己二烯酮对四种肿瘤细胞，特别是口腔表皮样癌细胞(KB)有较强的抑制活性。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种黄柄壁泥蜂共生放线菌为链霉菌1510-2，该菌株已于2018年03月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2018111。
2.权利要求1所述链霉菌1510-2的发酵培养方法，其特征在于：从黄柄壁泥蜂的体内分离纯化得到的链霉菌1510-2菌体接种到高氏一号固体培养基上，于培养箱中培养。
3.权利要求2所述链霉菌1510-2的发酵培养方法，其特征在于：所述培养箱的温度为26-30℃，培养时间为5-7天。
4.一种三联苯化合物，其特征在于：所述三联苯化合物为从权利要求2的链霉菌1510-2的培养基中分离提取得到，结构式为：
Figure FDA0002360855170000011
5.权利要求4所述三联苯化合物的制备方法，其特征在于：将链霉菌1510-2的固体培养基收集剪碎，用乙酸乙酯萃取，在0.07-0.11MPa、42-47℃条件下减压蒸馏干燥浓缩得浸膏；将乙酸乙酯可溶部分用硅胶柱层析分离，以正己烷-丙酮为洗脱剂，将洗脱之后的溶液在0.07-0.11MPa、42-47℃条件进行减压蒸馏后收集含三联苯化合物的馏分，将收集到的馏分重结晶得2,5-二苯基-3-甲氧基-6-羟基-6-丙酮基环己二烯酮纯品。
6.权利要求5所述三联苯化合物的制备方法，其特征在于：萃取之后的减压蒸馏的压强为0.09MPa；减压蒸馏的温度为45℃。
7.权利要求5所述三联苯化合物的制备方法，其特征在于：洗脱之后的减压蒸馏的压强为0.09MPa；减压蒸馏的温度为45℃。
8.根据权利要求5所述的一种三联苯化合物的制备方法，其特征在于：洗脱剂正己烷-丙酮的比例4-6:1。
9.权利要求4所述的一种三联苯化合物或权利要求5所述制备方法得到的三联苯化合物作为先导化合物制备抗肿瘤药物的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述三联苯化合物对肿瘤细胞具有抑制活性，所述肿瘤细胞为骨肉瘤细胞U2OS、骨肉瘤细胞Saos2、口腔表皮样癌细胞、耐长春碱细胞。
11.一种抗肿瘤药物，其特征在于：包括权利要求4所述的三联苯化合物及辅料；所述辅料的成分包括淀粉、滑石粉、羧甲基纤维素钠。
12.根据权利要求11所述抗肿瘤药物，其特征在于：三联苯化合物占0.01-99.9％。
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