CN109112171A - 一种基于海洋微生物的抗菌活性物质的制备方法 - Google Patents

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何燕玲
陈艳红
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/188—Heterocyclic compound containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen atoms and oxygen atoms as the only ring heteroatoms

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Abstract

本发明公开了一种基于海洋微生物的抗菌活性物质的制备方法，具体包括以下步骤：S1、菌株的分离纯化：得到了单一的曲霉属真菌；S2、发酵培养；S3、菌株次生代谢产物的提取；S4、菌株次生代谢产物的纯化，分离得到了2个抗菌活性化合物A和B；经抑菌活性测试，化合物A和B对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均表现出了良好的抑菌活性；经抗肿瘤活性实验，发现化合物A、B的有效浓度IC50分别为16.6μM、18.2μM表现出抗肿瘤活性，对包括乳腺管癌细胞T‑47D、人乳腺癌细胞MCF‑7、人肝癌细胞SMC‑7721、***细胞Hela、人肺癌细胞A549有抑制活性。

Description

一种基于海洋微生物的抗菌活性物质的制备方法
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种基于海洋微生物的抗菌活性物质的制备方法。
背景技术
在过去的半个多世纪里，由于抗生素的广泛使用，特别是不合理的临床误用,造成耐药性致病菌种类的不断增加,对人类生命健康带来极大威胁。为了减少细菌耐药性的产生，急需开发新的高敏抗菌药物，以提高临床用药的有效性。
海洋微生物分布范围广，物种多样性丰富，生长周期短，代谢易于调控，菌种较易选育和可以大规模发酵实现工业化生产等特点，且海洋微生物的开发不至于导致海洋物种与海洋生境失衡，更具有自然资源的可持续利用性，海洋高盐、高压、低光照等条件使海洋微生物能够产生大量结构新颖、活性独特的次级代谢产物，其中许多化合物具有抗菌活性，为寻找潜在的抗菌药物先导化合物提供了重要来源。
海洋是个巨大的宝库。现在已经有大量先导化合物从海洋资源中分离出来，它们具有各种生物活性，如：抗肿瘤、抗菌、抗虫、抗污浊等。同时海洋也滋养着大量的未被发现的微生物，它们是活性次生代谢产物的潜在制造者。真菌是活性天然产物与创新药物的重要来源。随着对真菌次级代谢产物研究的不断深入，相比过去几年，已报道的从真菌中分离得到的活性天然产物的数量增长迅速。但是从整体水平上来看，化合物的出新率却略有下降，重复研究的几率在不断上升。所以，能否从真菌中分离得到具有显著活性和新颖结构的天然产物，除了分离手段外，样品采集地点的多样性、菌株的分离和筛选手段以及菌株的培养基组成和培养方式都起了至关重要的作用。
近年来，随着海洋天然药物化学的发展，越来越多的抗菌活性化合物从海洋微生物中不断分离获得，为寻找新型抗菌剂提供了物质基础。采用人工培养发酵的方法，从海洋微生物中获得有重要抗菌活性的次级代谢产物，具有环境友好、可持续发展等特点，能有效解决药物开发过程中的药源等关键性问题，具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于海洋微生物的抗菌活性物质的制备方法，得到了新颖结构的抗菌活性物质A和B，经抑菌活性测试，抗菌活性物质A和B具有良好的抑菌活性和抗肿瘤活性。
本发明需解决的技术问题为：
(1)如何分离纯化出单一的真菌菌种；
(2)如何得到新颖结构的抗菌活性物质；
(3)如何评价分离得到的化合物的生物活性。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种基于海洋微生物的抗菌活性物质的制备方法，具体包括以下步骤：
S1、菌株的分离纯化
取10g印度洋深海沉积物样品于灭菌的试管中，加入100mL无菌海水，振荡混匀得到匀浆，此为10-1稀释度，按照此方法依次做梯度稀释，得到10-2、10-3、10-4稀释度，依次吸取100μL各个不同稀释度的海水放于固体培养基平板上，用无菌涂布棒将液体均匀涂布在整个平板表面，然后置于20℃培养箱中培养4-7天；从固体培养基上选取长有单一菌落的真菌菌丝体，采用平板划线法，挑取一环真菌菌丝或孢子，在新平板表面划线5-6下，然后倒置于20℃培养箱中培养7天，即得到了曲霉属真菌；将纯化好的曲霉属真菌菌株接种于斜面固体培养基保种管内，待曲霉属真菌菌落长成后保存备用；
S2、发酵培养
将曲霉属真菌菌株从保种管斜面接种到真菌液体培养基平板上，于26℃培养7天作为种子板，从液体平板培养基上用接种针挑取真菌菌落接种到30个含有400ml发酵真菌液体培养基的1000ml锥形瓶中，在26℃、静置无光照条件下发酵培养40天，获得发酵培养液；
S3、菌株次生代谢产物的提取
将步骤S2得到的发酵培养液用纱布抽滤，滤液用等体积乙酸乙酯萃取三次，得到发酵粗浸液；菌丝体滤渣先用75％乙醇超声提取，所得的提取液浓缩至没有乙醇后，再用等体积的乙酸乙酸萃取三次，得到菌丝体粗浸液，将发酵粗浸液与菌丝体粗浸液合并，即得到了菌株次生代谢产物粗提液；
S4、菌株次生代谢产物的纯化
往菌株次生代谢产物粗提液中加入硅胶，混合均匀后过Rp-18反相硅胶柱，使用石油醚：乙酸乙酯梯度洗脱，收集各个洗脱液，减压浓缩、合并，分离得到了2个抗菌活性化合物A和B；
所述的抗菌活性化合物A和B的结构式为：
进一步，所述的固体培养基为：小麦粉17g，可溶性淀粉5g、葡萄糖3g，蛋白胨3g，琼脂20g，氯霉素0.1g，无菌海水1L，各组分混合均匀后，采用pH调节剂调节固体培养基pH为7.0-7.5。
进一步，所述的pH调节剂为20％的磷酸二氢钾水溶液。
进一步，步骤S1中，培养箱中培养7天后，若菌落不纯，继续反复划线分离，直至得到单一菌落为止。
进一步，步骤S1中，曲霉属真菌菌菌落长成后置于冰箱0-3℃保存。
进一步，所述的液体培养基为：小麦粉17g，酵母粉2g，葡萄糖3g，蛋白胨3g，无菌海水1L，各组分混合均匀后，采用pH调节剂调节固体培养基pH为7.0-7.5。
进一步，所述的pH调节剂为10％的磷酸二氢钾水溶液。
进一步，步骤S4所述的梯度洗脱的具体过程为：首先采用石油醚：乙酸乙酯＝9:1，进行洗脱3-4h,接着以石油醚：乙酸乙酯＝1:1，收集洗脱液浓缩后得到抗菌活性化合物A；继续以石油醚：乙酸乙酯＝1:7.5，收集洗脱液浓缩后得到抗菌活性化合物B。
本发明的有益效果：
(1)通过将印度洋深海沉积物进行梯度稀释培养，从固体培养基上选取长有单一菌落的真菌菌丝体，采用平板划线法，挑取一环真菌菌丝或孢子，在新平板表面划线5-6下，然后倒置于20℃培养箱中培养7天，若菌落不纯，继续反复划线分离，直至得到单一菌落为止，最后得到了单一的曲霉属真菌；
(2)曲霉属真菌通过发酵培养得到发酵培养液，发酵培养液用纱布抽滤，滤液和菌丝体滤渣先分别采用有机溶剂进行萃取，萃取效率高，得到的次生代谢产物的提取率高，最后采用硅胶过柱梯度洗脱，得到了新颖结构的抗菌活性物质A和B，经核磁和质谱表征，验证了抗菌活性物质A和B的结构，迄今为止，尚未发现有专利或文献报道；
(3)经抑菌活性测试，化合物A和B对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均表现出了良好的抑菌活性；经抗肿瘤活性实验，发现化合物A、B的有效浓度IC50分别为16.6μM、18.2μM表现出抗肿瘤活性，对包括乳腺管癌细胞T-47D、人乳腺癌细胞MCF-7、人肝癌细胞SMC-7721、***细胞Hela、人肺癌细胞A549有抑制活性。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种基于海洋微生物的抗菌活性物质的制备方法，具体包括以下步骤：
S1、菌株的分离纯化
取10g印度洋深海沉积物样品于灭菌的试管中，加入100mL无菌海水，振荡混匀得到匀浆，此为10-1稀释度，按照此方法依次做梯度稀释，得到10-2、10-3、10-4稀释度，依次吸取100μL各个不同稀释度的海水放于固体培养基平板上，用无菌涂布棒将液体均匀涂布在整个平板表面，然后置于20℃培养箱中培养7天；从固体培养基上选取长有单一菌落的真菌菌丝体，采用平板划线法，挑取一环真菌菌丝或孢子，在新平板表面划线5下，然后倒置于20℃培养箱中培养7天，若菌落不纯，继续反复划线分离，直至得到形态和颜色一致的单一菌落为止，即得到了曲霉属真菌；将纯化好的曲霉属真菌菌株接种于斜面固体培养基保种管内，菌落长成后置于冰箱3℃保存；
所述的固体培养基为：
小麦粉17g，可溶性淀粉5g、葡萄糖3g，蛋白胨3g，琼脂20g，氯霉素0.1g，无菌海水1L，各组分混合均匀后，采用20％的磷酸二氢钾水溶液调节固体培养基pH为7.2；
S2、发酵培养
将曲霉属真菌菌株从保种管斜面接种到真菌液体培养基平板上，于26℃培养7天作为种子板，从液体平板培养基上用接种针挑取真菌菌落接种到30个含有400ml发酵真菌液体培养基的1000ml锥形瓶中，在26℃、静置无光照条件下发酵培养40天，获得发酵培养液；
所述的液体培养基为：
小麦粉17g，酵母粉2g，葡萄糖3g，蛋白胨3g，无菌海水1L，各组分混合均匀后，采用10％的磷酸二氢钾水溶液调节固体培养基pH为7.5。
S3、菌株次生代谢产物的提取
将步骤S2得到的发酵培养液用纱布抽滤，滤液用等体积乙酸乙酯萃取三次，得到发酵粗浸液；菌丝体滤渣先用75％乙醇超声提取，所得的提取液浓缩至没有乙醇后，再用等体积的乙酸乙酸萃取三次，得到菌丝体粗浸液，将发酵粗浸液与菌丝体粗浸液合并，即得到了菌株次生代谢产物粗提液；
S4、菌株次生代谢产物的纯化
往菌株次生代谢产物粗提液中加入硅胶，混合均匀后过Rp-18反相硅胶柱，使用石油醚：乙酸乙酯梯度洗脱，收集各个洗脱液，减压浓缩、合并，分离得到了2个抗菌活性化合物A和B；
所述的梯度洗脱的具体过程为：首先采用石油醚：乙酸乙酯＝9:1，进行洗脱3-4h,接着以石油醚：乙酸乙酯＝1:1，收集洗脱液浓缩后得到抗菌活性化合物A；继续以石油醚：乙酸乙酯＝1:7.5，收集洗脱液浓缩后得到抗菌活性化合物B；
所述的抗菌活性化合物A和B的结构式为：
所述的抗菌活性化合物A结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ9.64(s,1H),8.22(s,1H),8.05(s,1H),7.75(t,J＝7.1Hz,1H),7.39(d,J＝8.1Hz,1H),7.24(d,J＝8.0Hz,1H),7.14(t,J＝8.5Hz,1H),6.51(s,1H),4.89(t,1H),3.11(d,1H),2.85(d,2H),2.52(m,1H),1.25(m,2H),1.11(d,3H),0.75(t,3H)；
13C NMR(101MHz,CDCl3):δ175.9,168.8,165.4,161.1,153.4,150.5,146.7,140.3,136.1,128.6,121.5,119.3,117.0,110.6,59.5,57.4,38.7,36.0,23.9,15.1,12.6ppm；
HRMS m/z(ESI+)calcd for C21H21N3O5([M]+),395.1523,found 395.1503。
所述的抗菌活性化合物B结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ9.71(s,1H),8.23(s,1H),8.02(s,1H),7.86(t,J＝7.1Hz,1H),7.41(d,J＝8.1Hz,1H),7.24(d,J＝8.0Hz,1H),7.14(t,J＝8.5Hz,1H),6.51(s,1H),4.89(t,1H),3.13(d,1H),2.88(d,2H),2.52(m,1H),1.25(m,2H),1.12(d,3H),0.77(t,3H)；
13C NMR(101MHz,CDCl3):δ178.4,169.1,165.4,162.7,161.1,146.7,143.4,140.3,136.1,127.6,125.5,119.3,117.0,110.6,59.5,57.4,38.7,36.5,23.4,15.0,12.1ppm；
HRMS m/z(ESI+)calcd for C21H21N3O6([M]+),411.1435,found 411.1412。
实施例2
抑菌活性测试：
采用微量稀释法测定化合物A、B对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌这三株致病菌的抑菌活性，测试结果如表一所示；
表一、化合物A、B对细菌的抑制活性测试结构
由表一可知，化合物A、B对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均表现出了良好的抑菌活性。
实施例3
抗肿瘤活性实验：
抗肿瘤采用MTT法检测化合物A、B对人乳腺管癌细胞T-47D、人乳腺癌细胞MCF-7、人肝癌细胞SMC-7721、***细胞Hela、人肺癌细胞A549抑制活性，发现化合物A、B的有效浓度IC50分别为16.6μM、18.2μM表现出抗肿瘤活性。
以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种基于海洋微生物的抗菌活性物质的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
S1、菌株的分离纯化
取10g印度洋深海沉积物样品于灭菌的试管中，加入100mL无菌海水，振荡混匀得到匀浆，此为10-1稀释度，按照此方法依次做梯度稀释，得到10-2、10-3、10-4稀释度，依次吸取100μL各个不同稀释度的海水放于固体培养基平板上，用无菌涂布棒将液体均匀涂布在整个平板表面，然后置于20℃培养箱中培养4-7天；从固体培养基上选取长有单一菌落的真菌菌丝体，采用平板划线法，挑取一环真菌菌丝或孢子，在新平板表面划线5-6下，然后倒置于20℃培养箱中培养7天，即得到了曲霉属真菌；将纯化好的曲霉属真菌菌株接种于斜面固体培养基保种管内，待曲霉属真菌菌落长成后保存备用；
S2、发酵培养
将曲霉属真菌菌株从保种管斜面接种到真菌液体培养基平板上，于26℃培养7天作为种子板，从液体平板培养基上用接种针挑取真菌菌落接种到30个含有400ml发酵真菌液体培养基的1000ml锥形瓶中，在26℃、静置无光照条件下发酵培养40天，获得发酵培养液；
S3、菌株次生代谢产物的提取
将步骤S2得到的发酵培养液用纱布抽滤，滤液用等体积乙酸乙酯萃取三次，得到发酵粗浸液；菌丝体滤渣先用75％乙醇超声提取，所得的提取液浓缩至没有乙醇后，再用等体积的乙酸乙酸萃取三次，得到菌丝体粗浸液，将发酵粗浸液与菌丝体粗浸液合并，即得到了菌株次生代谢产物粗提液；
S4、菌株次生代谢产物的纯化
往菌株次生代谢产物粗提液中加入硅胶，混合均匀后过Rp-18反相硅胶柱，使用石油醚：乙酸乙酯梯度洗脱，收集各个洗脱液，减压浓缩、合并，分离得到了2个抗菌活性化合物A和B；
所述的抗菌活性化合物A和B的结构式为：
2.根据权利要求1所述的一种基于海洋微生物的抗菌活性物质的制备方法，其特征在于：所述的固体培养基为：小麦粉17g，可溶性淀粉5g、葡萄糖3g，蛋白胨3g，琼脂20g，氯霉素0.1g，无菌海水1L，各组分混合均匀后，采用pH调节剂调节固体培养基pH为7.0-7.5。
3.根据权利要求2所述的一种基于海洋微生物的抗菌活性物质的制备方法，其特征在于：所述的pH调节剂为20％的磷酸二氢钾水溶液。
4.根据权利要求1所述的一种基于海洋微生物的抗菌活性物质的制备方法，其特征在于：步骤S1中，培养箱中培养7天后，若菌落不纯，继续反复划线分离，直至得到单一菌落为止。
5.根据权利要求1所述的一种基于海洋微生物的抗菌活性物质的制备方法，其特征在于：步骤S1中，曲霉属真菌菌菌落长成后置于冰箱0-3℃保存。
6.根据权利要求1所述的一种基于海洋微生物的抗菌活性物质的制备方法，其特征在于：所述的液体培养基为：小麦粉17g，酵母粉2g，葡萄糖3g，蛋白胨3g，无菌海水1L，各组分混合均匀后，采用pH调节剂调节固体培养基pH为7.0-7.5。
7.根据权利要求6所述的一种基于海洋微生物的抗菌活性物质的制备方法，其特征在于：所述的pH调节剂为10％的磷酸二氢钾水溶液。
8.根据权利要求1所述的一种基于海洋微生物的抗菌活性物质的制备方法，其特征在于：步骤S4所述的梯度洗脱的具体过程为：首先采用石油醚：乙酸乙酯＝9:1，进行洗脱3-4h,接着以石油醚：乙酸乙酯＝1:1，收集洗脱液浓缩后得到抗菌活性化合物A；继续以石油醚：乙酸乙酯＝1:7.5，收集洗脱液浓缩后得到抗菌活性化合物B。
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