CN112662655B - 头孢菌素c酰化酶突变体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种头孢菌素C酰化酶突变体及其制备方法和应用。头孢菌素C酰化酶突变体具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列是通过对SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的第245‑247位氨基酸进行替换突变得到；其中，第245位酪氨酸突变为苯丙氨酸，第246位的精氨酸突变为蛋氨酸，第247位的亮氨酸突变为丝氨酸。本发明的头孢菌素C酰化酶突变体相比于野生型GL‑7‑ACA酰化酶SED ID NO：1酶活力提高了210倍以上，可以应用于7‑氨基头孢烷酸(7‑ACA)的一步酶法生产。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种头孢菌素C酰化酶突变体及其制备方法和应用。
背景技术
7-氨基头孢烷酸(7-ACA)是β-内酰胺类抗生素合成的主要前体，工业上主要以化学法和酶法合成为主。但由于化学合成法工艺复杂、污染严重、能量消耗高，近些年已被生物酶法所代替，生物酶法工艺简单、反应条件温和，制得的产品质量稳定。化学法工艺成熟，生物酶法相比于化学法有很大的上升空间。随着国家对于绿色环保的要求逐渐提升，生物酶法将有更加美好的未来前景。
目前生物酶法主要分为一步酶法和二步酶法。二步酶法涉及D-氨基酸氧化酶和戊二酰基转移酶分步催化，已有应用于工业上生产的报道。一步酶法则涉及利用头孢菌素C酰化酶对底物CPC直接进行催化产生7-ACA。相较于二步酶法，一步酶法具有工艺更加简单、设备要求低、生产成本低等优势。但是，相比于二步酶法的GL-7-ACA酰化酶，一步酶法的头孢菌素C酰化酶对CPC的催化效率很低，仅有催化GL-7-ACA的2％～4％。
中国专利CN 108220276A公开一种头孢菌素C酰化酶突变体及其在7-氨基头孢烷酸生产中的应用，头孢菌素C酰化酶突变体能够催化头孢菌素C生成7-氨基头孢烷酸，所述头孢菌素C酰化酶突变体与野生型头孢菌素C酰化酶相比表现出更高的催化活性，酶活提高约8.6倍。通过引物A获取基因序列、重组表达蛋白、检测酶活和制备7-氨基头孢烷酸。
中国专利CN 110129305A公开一种用于制备7-ACA的头孢菌素C酰化酶突变体，头孢菌素C酰化酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，相比假单胞菌GK16(Pseudomonas sp.GK16)来源的野生型GL-7-ACA酰化酶SEQ ID NO:1，酶活力提高了52倍，可用于一步酶法生产7-氨基头孢烷酸(7-ACA)。
虽然上述两件专利提供的头孢菌素C酰化酶突变体的酶活力比野生型头孢菌素C酰化酶分别提高了8.6倍和52倍，但其酶活力仍然较低，工业化生产效率低。
发明内容
本发明的目的是提供一种头孢菌素C酰化酶突变体，酶活力高、工业化生产效率高；本发明同时提供了头孢菌素C酰化酶突变体的制备方法和应用。
本发明所述的头孢菌素C酰化酶突变体，其具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列是通过对SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的第245-247位氨基酸进行替换突变得到；其中，第245位酪氨酸突变为苯丙氨酸，第246位的精氨酸突变为蛋氨酸，第247位的亮氨酸突变为丝氨酸。
SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的编码基因为SEQ ID NO：3所示的DNA序列。
SEQ ID NO：3所示的DNA序列是通过对SEQ ID NO：4所示的DNA序列的第215、232、239、250、252、268和327位碱基进行替换突变得到；其中，第215位腺嘌呤突变为胸腺嘧啶，第232位腺嘌呤突变为胸腺嘧啶，第239位鸟嘌呤突变为胞嘧啶，第250位胞嘧啶突变为鸟嘌呤，第252位胸腺嘧啶突变为腺嘌呤，第268位腺嘌呤突变为胸腺嘧啶，第327位鸟嘌呤突变为胞嘧啶。
本发明所述的头孢菌素C酰化酶突变体的制备方法，包括如下步骤：
(1)将SEQ ID NO：4所示的DNA序列进行双点突变得到SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的编码基因；
(2)将编码基因克隆进质粒载体得到重组质粒；
(3)将重组质粒导入大肠杆菌感受态细胞中得到重组菌；
(4)重组菌进行诱导发酵得到头孢菌素C酰化酶突变体。
步骤(1)中双点突变的步骤是以SEQ ID NO：4所示的DNA序列为模板，加入引物进行PCR扩增；
引物序列如下：
上游引物F1：GGGAATTCCATATGCT F2：GAGAGTTCTGCACCG，
下游引物R1：CCCGGAATTCTCATGG R2：CTTGAAGTTGAAGTTGAAGG，
其中，F1与R2含有20bp同源臂，F2与R1含有20bp同源臂。
PCR扩增体系如下：
PCR反应条件为98℃预变性3min；98℃变性10s，45℃退火5s，72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸10min。
步骤(2)中质粒载体为PET-28a+。
步骤(4)中诱导发酵是加入IPTG进行诱导发酵。
本发明所述的头孢菌素C酰化酶突变体的应用是头孢菌素C酰化酶突变体用于制备7-氨基头孢烷酸。
本发明的有益效果如下：
为了克服一步酶法催化CPC催化效率低下的缺陷，得到具有更高酶活效率的CPC酰化酶，本发明通过点突变等基因工程技术对假单胞菌GK16来源的野生型GL-7-ACA酰化酶(SED ID NO：1)进行基因突变、筛选，制备更高酶活效率的头孢菌素C酰化酶突变体。
本发明的头孢菌素C酰化酶突变体相比于野生型GL-7-ACA酰化酶SED ID NO：1酶活力提高了210倍以上，可以应用于7-氨基头孢烷酸(7-ACA)的一步酶法生产。
附图说明
图1是实施例1的真阳性转化子电泳验证图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1
(1)以CPC酰化酶野生型基因SEQ ID NO：4为模板克隆目的基因，引物序列为：上游引物F1：GGGAATTCCATATGCT F2：GAGAGTTCTGCACCG下游引物R1：CCCGGAATTCTCATGG R2：CTTGAAGTTGAAGTTGAAGG，其中F1与R2含有20bp同源臂，F2与R1含有20bp同源臂，从而进行双点突变。
(2)PCR扩增体系如下：
PCR反应条件为98℃预变性3min；98℃变性10s，45℃退火5s，72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸10min。
(3)后续采用纯化试剂盒对PCR产物进行纯化提纯，所获得的目的基因采用BamHⅠ和HinDⅢ内切酶进行双酶切，对于质粒载体PET-28a+进行同样的双酶切，获得重组质粒PET-28a+-CPCA。大肠杆菌TG1采用氯化钙法制成大肠杆菌感受态细胞，将所获得的重组质粒导入大肠杆菌感受态细胞中，得到的转化子命名为TG1/PET-28a+-CPCA。将TG1/PET-28a+-CPCA均匀涂布在LB平板(含有氨苄抗性)上，37℃培养过夜，对于平板上生长出的单菌落提取质粒。
设计重组质粒的引物序列为：F：CGAAATCTTTGTTGGTGGG R：ATGAAGGATACATAAACGGCTAC。
PCR扩增体系如下：
PCR反应条件为98℃预变性3min；98℃变性10s，45℃退火5s，72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸10min。
将扩增产物进行核酸电泳验证，电泳结果见图1，证实挑取的单菌落为真阳性转化子。
(4)挑取上述经过验证的真阳性转化子的菌落至含有氨苄抗生素的LB液体培养基中，37℃，200rpm，并加入0.1mM IPTG，促进目的蛋白表达，过夜摇菌至OD值为0.6-0.8，得到菌液；菌液4000rpm离心10min，弃上清，保留沉淀，置于-20℃冷冻1h，常温下化冻，加入200ul 0.9％生理盐水，用超声波细胞破碎机裂解菌体，37℃孵育1h，采用4000rpm离心10min获得头孢菌素C酰化酶突变体，留取20ul上清液进行CPC活力测定。
(5)将步骤(4)中获得的菌液用50ml缓冲液重悬，超声裂解，破碎后的菌体在4℃下，12000rpm，离心20min，收集上清液。上清液以1ml/min速率过镍柱，用30mM咪唑清洗镍柱，用300mM咪唑清洗杂蛋白，收集目的蛋白，至反应液不再变蓝为止，收集峰值洗脱液。所得洗脱液过10KD的超浓缩柱脱盐，除去酰化酶，得纯化酶。采用Protein Assay Kit试剂盒测定纯化酶的蛋白浓度，从而获得纯化酶的比活力。野生型CPC酰化酶(wtCPC)与各种CPC酰化酶突变体的酶活测定结果见表1。
表1野生型CPC酰化酶与各种CPC酰化酶突变体的酶活测定结果
由表1可知，通过对野生型CPC酰化酶上氨基酸进行替换，得到了相对比活提高了210.1倍的突变菌种ED4(实施例1制得的CPC酰化酶突变体)。
本发明成功构建了CPC酰化酶突变体，将野生型酰化酶的比活成功提高了210倍之多，用该种CPC酰化酶突变体生产7-ACA反应效率更快，具有广阔的工业化前景。
(6)底物反应液为含有2wt.％CPC钠盐的0.1M磷酸钾盐缓冲液(pH8.0)，
终止反应液：0.05M NaOH，20v/v％冰醋酸，
显色剂：含0.5wt％的PDAB甲醇溶液，
酶活力定义：每分钟催化CPC产生1uM7-ACA所需要的酶量定义为一个单位(U)。
将步骤(5)中的野生型CPC酰化酶与各种CPC酰化酶突变体各20ul加入底物反应液中，在37℃下过夜培养，加入200ul终止反应液，5000rpm离心10min，加入40ul显色剂，反应10min后，检测415nm吸光度下的7-ACA产率，结果见表2。
表2野生型CPC酰化酶与各种CPC酰化酶突变体的7-ACA产率测定结果
| 菌种编号 | wtCPC | ED1 | ED2 | ED3 | ED4 |
| 7-ACA产率(ug/min) | 0.15 | 0.69 | 17.8 | 23.1 | 32 |
(7)培养基pH值对于头孢菌素C酰化酶分泌表达的影响
将步骤(4)中获得的菌液分别于pH值为7.5、8.0、8.5、9.0、9.5的LB培养基中培养24h后，测定各自的完整细胞的头孢菌素C酰化酶活力，结果见表3。
表3头孢菌素C酰化酶活力测定结果
由表3可知，在pH值为8.0的培养基中培养时，其酶活力最大，表达量最高。
序列表
<110> 山东金城柯瑞化学有限公司
<120> 头孢菌素C酰化酶突变体及其制备方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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aagctgtggt aaaggtgctg aatactgggg tccggactac gaacagacca ccgtttggct 240
gctgaccaac ggtgttccgg aacgtgctca gcagtggtac gctcagcagt ctccggactt 300
cctgtctaac ctggacgctt tcgctgctgg tatcaacgca gaacccggac gacatctctc 360
cggaagttcg tcaagttctg ccggtaagcg gtgctgacgt tgttgctcac gctcacgctc 420
accgtctgat gaacttcctg tacgttgctt ctccgggtcg taccctgggt gaaggtgacc 480
cgccggacct ggctgaccag ggttctaact cttgggctgt tgctccgggt aaaaccgcta 540
acggtaacgc tctgctgctg ctgcagaacc cgcacctgtc ttggaccacc gactactcta 600
cctactacga agctcacctg gttaccccgg acttcgaagt ttacggtgct acccagatcg 660
gtctgccggt tatccgtgtt gctttcaacc agcgtatggg tatcaccaac accttcaacg 720
gtatggttgg gtgctaccaa ctaccgctac tgggacgtgg acggtggtta cctgtacgac 780
ggtcaggttc gtccgttcga acgtcgtcag gcttcttacc gtctgcgtca ggctgacggt 840
accaccgttg acaaaccgct ggaaatccgt tcttctgttc acggtccggt tttcgaacgt 900
gctgacgcat gccatgcgct gttgctgttg ctgttcgtgt tgctggtctg gaccgtccgg 960
gtatgctgga acagaccttc gacatgatca ccgctgactc tttcgacgac tacgaagctg 1020
ctctggctcg tatgcaggtt ccgaccttca acatcgttta cgctgaccgt gaaggtacca 1080
tcaactactc tttcaacgca caagctccga aacgtgctga aggtgacatc gctttctggc 1140
agggtctggt tccgggtgac tcttctcgtt acctgtggac cgaaacccac ccgctggacg 1200
acctgccgcg tgttaccaac ccgccgttcg ccgagaccga cctttccttc gattgcctga 1260
cgcggatgcc gggcgcatcg accgtggcgc agctttacga cgcgacgcgc ggctggggcc 1320
tgatcgacca taatcgacca taatctcgtc gccggggatg tcgcgggctc gatcggccat 1380
ctggtccgcg cccgcgtccc gtcccgcccg cgcgagaacg gctggctgcc ggtgccgggc 1440
tggtccggcg tggtccggcg agcatgaatg gcgcggctgg attccgcacg aggcgatgcc 1500
gcgcgtcatc gatccgccgg gcggcctcat cgtcacggcg aacaaccgcg tcgtggccga 1560
tgatcatccc gattatctct gtaccgattg ccatccgccc taccgcgccg aacggatcat 1620
ggagcgcctg gtcgccagtc cggctttcgc cgtcgacgat gcggccgcga tccacgccga 1680
tacgctgtcc cccatgtcgg cttgctgcgc gcgaggctcg aagcgctcgg aatccagggc 1740
agtctccctg ccgaagagtt gaggcagacc ctcatcgcct gggacggccg catggatgct 1800
ggctcgcagg cggcttccgc ttataatgcg ttccgcaggg cgctgacgcg gctggtaacg 1860
gcccgcagcg ggctggagca agcgatagcg catcccttcc tgcgcaacga cgatgccggg 1920
atgctgaaag gctggagctg ggacgaggcc ttgtcggagg ccctgtccgt cgcgacgcag 1980
aacctgaccg ggcgcggctg gggcgaggag catcggccgc gtttcacgca cccgctctcc 2040
gcgcagttcc cggcctgggc cgcgctgctg aacccggttt cgcgcccgat cggcggcgat 2100
ggcgacaccg tgctggcgaa cgggctcgtc ccatcggccg gacctgaggc gacctatggc 2160
gccctgtcgc gctacgtctt cgatgtcggc aattgggaca atagccgctg ggtcgtcttc 2220
cacggcgcct cggggcactc ggccagcccc cactatgccg accagaatgc gccatggagc 2280
gactgcgcga tggtgccgat gctctatagc tgggacagga tcgccgcgga ggccgtgacc 2340
tcgcaggaac tcgtcccggc ctga 2364
Claims (5)
1.一种头孢菌素C酰化酶突变体，其特征在于其氨基酸序列为SEQ ID NO：2。
2.一种权利要求1所述的头孢菌素C酰化酶突变体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）将SEQ ID NO：4所示的DNA序列进行双点突变得到SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的编码基因；
（2）将编码基因克隆进质粒载体得到重组质粒；
（3）将重组质粒导入大肠杆菌感受态细胞中得到重组菌；
（4）重组菌进行诱导发酵得到头孢菌素C酰化酶突变体。
3.根据权利要求2所述的头孢菌素C酰化酶突变体的制备方法，其特征在于步骤（2）中质粒载体为PET-28a+。
4.根据权利要求2所述的头孢菌素C酰化酶突变体的制备方法，其特征在于步骤（4）中诱导发酵是加入IPTG进行诱导发酵。
5.一种权利要求1所述的头孢菌素C酰化酶突变体的应用，其特征在于头孢菌素C酰化酶突变体用于制备7-氨基头孢烷酸。
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