CN104212757A

CN104212757A - 利用大肠杆菌产γ-谷氨酰甲胺合成酶高效生产L-茶氨酸的方法

Info

Publication number: CN104212757A
Application number: CN201410316269.0A
Authority: CN
Inventors: 马承国; 程占冰; 王开成
Original assignee: Kai Sheng Bio Tech Ltd Shanghai
Current assignee: Kai Sheng Bio Tech Ltd Shanghai
Priority date: 2014-07-04
Filing date: 2014-07-04
Publication date: 2014-12-17

Abstract

本发明是一种基因工程菌，含重组质粒pET28a-GMAS，质粒大小6585bp，GMAS片段大小1308bp，命名为大肠埃希氏菌Escherichiacoli，具有卡纳青霉素抗性，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导表达γ-谷酰胺甲胺合成酶基因，是一种具有茶氨酸生物合成能力的基因工程菌。本发明以谷氨酸和乙胺为底物，操作方法简单，便于生产控制，茶氨酸转化生产效率高，具有良好的工业化应用前景。

Description

利用大肠杆菌产γ - 谷氨酰甲胺合成酶高效生产 L- 茶氨酸的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种利用大肠杆菌基因工程菌生产的γ-谷氨酰甲胺合成酶来催化合成L-茶氨酸的方法。

背景技术

茶氨酸（N-乙基-γ-谷氨酰胺）是茶叶特有的一种氨基酸，也是茶叶的呈味物质之一，其含量直接决定着茶叶的品质。同时，茶氨酸具有放松神经、抗抑郁、抗肿瘤、降血压、提高免疫力等医药作用，也可以应用与食品领域、如作为功能食品的添加剂等。因此越来越受到人们的重视，国内外市场需求量不断增大。

目前，茶氨酸的生产方法，主要有三种。一种是从茶叶中提取。茶叶中茶氨酸含量低，而且原料来源受限，茶氨酸产量很低，最终导致生产成本过高。第二种方法，便是化学合成的方法。该方法会导致毒性物质残留，而且生成物中会形成D、L-型茶氨酸异构体，拆分精制工艺复杂。第三种是利用微生物酶法生产L-茶氨酸。目前，专利和文献所报道的生产茶氨酸的酶主要是谷氨酰胺酶（CN1688705A,2005;JP2007185132A）、γ-谷氨酰转肽酶（CN101343618A,2008;茶叶科学，2007,27（1），61-66；食品工业科技，2008,29（2）166-169）或者谷氨酰胺合成酶等，反应底物为谷氨酰胺和乙胺，与化学合成法相比，不会产生消旋现象，转化率高，反应条件温和。已受到了广泛研究，并已进入工业化应用领域。然而未见利用基因工程来源的γ-谷氨酰甲胺合成酶为催化剂，以更低成本的谷氨酸和乙胺为底物，高效酶法制备茶氨酸的文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效转化谷氨酸和乙胺合成茶氨酸的大肠杆菌菌种，以及该菌种在制备L-茶氨酸中的应用。

本发明的技术方案如下：

总体技术方案是自然环境土壤细菌基因组DNA的提取，γ-谷氨酰甲胺合成酶基因的克隆，采用合适的表达载体和限制性内切酶，构建重组表达载体，将γ-谷氨酰甲胺合成酶基因克隆到合适的宿主细胞，包括但不限于大肠杆菌。

1. 自然环境土壤细菌基因组DNA的提取:在多处茶树根际取样，按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂盒方法提取土壤环境微生物DNA。

2. γ-谷氨酰甲胺合成酶基因的克隆: 根据γ-谷氨酰甲胺合成酶基因的保守序列，设计引物，按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂配制方法，通过PCR扩增γ-谷氨酰甲胺合成酶基因。

3. 表达载体的构建、转化和转化子筛选：按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂、完全可与从商业途径获得的载体、限制性内切酶和方法，将目标基因克隆到载体，转化宿主细胞，筛选转化子。

4. 重组菌的摇瓶发酵：按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂、方法，进行摇瓶发酵，利用SDS-PAGE分析蛋白表达情况。

5. 茶氨酸酶法转化合成工艺:根据酶本身的活性特征，按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂、方法，进行酶法转化合成实验，参考文献报道，利用液相检测茶氨酸的合成情况。

发明效果

本发明的有益效果体现在，通过构建高效表达γ-谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌工程菌，在有效获得高产量重组酶的同时，能有效利用谷氨酸和乙胺合成L-茶氨酸，且转化率在70%左右，为今后充分利用低成本的谷氨酸工业化成产L-茶氨酸提供了有效的生产菌株。

附图说明

图1重组质粒（pET-GMAS）图谱

图2 SDS-PAGE凝胶电泳图谱

附序列 γ-谷氨酰甲胺合成酶基因核苷酸序列。

具体实施方式

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒

大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、BL21（DE3）菌株及质粒载体pMD18-T simple vector,pET28a均为本实验室保藏。

1.2试剂和材料

实验试剂：DNA聚合酶 (Taq DNA Polymerase，PrimeSTAR^® HS DNA Polymerase)，限制性内切酶(NcoI和BamH I)，T4 DNA Ligase, dNTP，DNA marker DL10,000，Premixed Protein Marker (Low ) 均购自Takara公司；Power Soil DNA Isolation Kit 购自 MOBIO Laboratories公司，质粒小量提取试剂盒、DNA纯化试剂盒购自北京鼎国生物技术有限公司；硫酸卡纳霉素、氨苄青霉素、IPTG购自Genview公司；其余化学试剂均为分析纯。

1.3 实验方法

细菌基因组提取、质粒提取以及DNA纯化回收等均按照试剂盒使用说明，大肠杆菌感受态的制备、酶切、酶连、载体的转化，琼脂糖凝胶电泳和SDS-PAGE等常规分子生物学操作参考《分子克隆实验指南》第三版(科学出版社，2002)。

1.3.1环境微生物基因组DNA的提取

收集茶园茶树根际土壤，按照试剂盒Power Soil DNA Isolation Kit使用说明，提取根际土壤微生物基因组DNA。

1.3.2目标基因γ-谷氨酰甲胺合成酶编码序列的扩增

根据Genbank登录的Hyphomicrobium sp. MC1（登录号NC_015717.1）编码序列设计一对引物(上海英骏生物技术有限公司合成)，引物序列及其酶切位点如下：

PF：5’-CATG CCATGG CTCAGGATCTTGCCCAGCTC-3’(下划线为Nco I酶切位点)

PR: 5’-CGC GGATCC TTAGCAGTCCAGCGTATGTGC-3’ (下划线为BamH I酶切位点)。

1.3.3反应体系及条件：

PCR反应体系(50 μl)： 5×PCR buffer 10 μl , dNTP 4 μl，引物PF和PR(10 μM)各1 μl，模板0.5 μl，PrimeSTAR^® HS DNA Polymerase 0.5 μl，水至50 μl。

PCR反应条件(Touch down PCR)：95℃ 5min；98℃ 10 sec，60-51 ℃ 10 sec，72 ℃延伸1.5 min ，10个循环；98 ℃ 10 sec，55 ℃ 10 sec，72 ℃延伸1.5 min，20个循环；72℃ 10 min反应终止。0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测及纯化PCR产物。

PCR产物加A反应体系(20 μl)：取14.5 μl PCR产物，加入2μl 10×Taq Buffer，3μl dNTP，2 U Taq DNA Polymerase，72 ℃反应20~30 min后直接纯化回收。

1.3.4目标基因克隆载体的构建与鉴定

按照pMD18-T simple vector 试剂盒操作说明，连接目标基因与T载体，转化E. coli DH5α，利用蓝白斑筛选阳性转化子，并选择部分转化子送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.3.5目标基因克隆及鉴定

在相关克隆子的测序结果中，选择携带兴趣基因的转化子，37 ℃过夜摇瓶培养，提取重组质粒，利用NcoI和BamH I双酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收目标基因。

同时利用NcoI和BamH I双酶切pET28a载体，并琼脂糖凝胶回收载体产物。

然后，利用T4连接酶16 ℃过夜酶连pET28a载体和目标基因，产物转化E. coli DH5α(CaCl₂法)，选择部分转化子经生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

选择测序结果正确的转化子，提取重组质粒(pET-GMAS)转化E. coli BL21(CaCl₂法)。

1.3.6 重组蛋白的表达

挑取重组菌E. coli BL21接种于含有硫酸卡纳霉素的LB培养基中，37 ℃振荡过夜培养。将培养物接种于新鲜的含有硫酸卡纳霉素的LB培养基中，接种量2%，500 mL摇瓶37 ℃振荡培养至OD₆₀₀=0.6~0.8。30℃ IPTG诱导(终浓度0.3mM)，3h后离心收集细胞；20 mMTris-Cl (pH8.0) 重悬细胞，超声破碎，离心分别收集上清和沉淀。SDS-PAGE分析上清和沉淀。带有空载的E. coli BL21作为阴性对照。

1.3.7酶法转化生产茶氨酸

如1.3.6，发酵完毕，5000r/min，离心10min收集菌体。100mL发酵液菌体浓缩至10mL，溶解于20mM的Tris-Cl缓冲液(pH8.0)，超声破碎10min。茶氨酸合成反应体系参考文献（Biosci. Biotechnol.Biochem. , 71(2), 545–552, 2007），含有50mM谷氨酸，150mM乙胺盐酸盐，7.5mMATP、30mM MgCl₂，100mM 咪唑缓冲液（pH7.75），适量的细胞破碎后酶液，30℃温育。茶氨酸的检测方法参考文献（Process Biochemistry,45 ,1330–1333,2010）。

2实验结果

2.1 以环境微生物基因组DNA为模板的γ-谷氨酰甲胺合成酶基因的PCR扩增

以PF和PR为引物，以土壤环境基因组DNA为模板，PCR扩增到约1300 bp左右的DNA片段。

2.2 目标基因克隆文库的构建

将PCR产物与pMD18-T simple 载体酶连，转化E. coli DH5α，并利用蓝白斑筛选阳性克隆，收获了大约500个左右的转化子。

2.3目标基因的克隆及表达载体的构建

选择经过测序的兴趣基因转化子，提取克隆载体，并双酶切收获目标基因，酶连双酶消化的pET28a载体，转化E. coli DH5α。选择阳性克隆子，提取重组质粒，并进行PCR及双酶切验证，结果表明酶连成功，重组载体图谱如图1。

2.4 重组蛋白的表达

重组大肠杆菌BL21(pET-GMAS)，在 IPTG诱导后，表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳分析，在大约44.3kDa左右出现清晰的蛋白条带(图2)，即为γ-谷氨酰甲胺合成酶；诱导后，菌体经超声破碎后取样上清SDS-PAGE电泳，可见该蛋白在上清中存在，具有良好的可溶性。

2.5酶法转化生产茶氨酸

按照1.3.7所述转酶化方法，离心收集菌体，细胞破碎，进行转化实验。经8小时连续转化，12000rpm离心。按照1.3.7所述进行液相检测，谷氨酸转化率为69.8%，表明重组酶具有良好的酶转化活性。

序列表

Claims

1.一种生产γ-谷氨酰甲胺合成酶的菌株，该菌株为大肠杆菌基因工程菌，其特征在于该菌株为用重组基因工程质粒pET28-GMAS转化大肠杆菌得来。

2.如权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，其宿主菌选自大肠杆菌BL21、DH5α。

3.如权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，重组基因工程质粒pET28-GMAS含有如说明书中野生γ-谷氨酰甲胺合成酶基因核苷酸序列。

4.如权利要求1-3所述的任一权利要求所述基因工程菌主要用于生产L-茶氨酸。