CN112111472B

CN112111472B - 一种新型β-木糖苷酶及其制备

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Publication number: CN112111472B
Application number: CN202011029392.6A
Authority: CN
Inventors: 刘逸寒; 王凤华; 葛秀琪; 路福平
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2020-09-27
Filing date: 2020-09-27
Publication date: 2022-03-18
Anticipated expiration: 2040-09-27
Also published as: CN112111472A

Abstract

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及一种酶活力提高的β‑木糖苷酶突变体及其制备。本发明通过分子生物学技术手段获得短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)野生型的β‑木糖苷酶基因，利用易错PCR技术对野生型β‑木糖苷酶基因进行随机突变，得到β‑木糖苷酶突变体E455G，及其编码基因xylm，重新构建重组质粒，并实现了其在枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌中的高效表达，通过发酵、提取等技术获得高活力的β‑木糖苷酶。

Description

一种新型β-木糖苷酶及其制备

技术领域：

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及通过易错PCR技术体外定向进化获得酶活力提高的β-木糖苷酶突变体及其制备。

背景技术：

β-木糖苷酶(β-xylosidase,XYL,EC 3.2.1.37)是木聚糖降解酶系的重要组成部分，以外切的方式水解低聚寡糖和木糖苷底物的非还原性末端残基，生成木糖，通过与木聚糖酶协同作用，已在多个领域中具有广泛应用。在食品应用方面，木聚糖酶和β-木糖苷酶的添加，可使长链的***木聚糖分解成短链，降低啤酒的粘度。在面包生产过程中适量的添加一些β-木糖苷酶可使面包的机械性能，质地等方面得到很大的改善；在能源应用方面，自然界中的木聚糖含量丰富，可利用木聚糖酶系将其水解生成木寡糖和木糖，进而利用酿酒酵母等菌株发酵生成生物质乙醇等能源；在环境保护方面，β-木糖苷酶可使一些农业及工业等生产过程中产生的垃圾及废弃物降解，从而有效的改善环境，同时β-木糖苷酶的使用减少了许多有害的有机或者无机化学试剂的应用，这样就更有利于实现环境社会的可持续发展的目标；在饲料生产方面，β-木糖苷酶作为饲料添加剂，能够使其中所含的的木聚糖部分水解，从而使与其相连的纤维素等更容易被瘤胃消化，达到改善饲料营养价值的目的。

根据氨基酸序列的相似性，β-木糖苷酶分为多个糖苷水解酶(GH)家族，包括GH1、GH2、GH3、GH5、GH30、GH39、GH43、GH52、GH54、GH120，这与木聚糖的异质性相适应，而目前已报道的β-木糖苷酶大部分存在于GH3、GH39和GH43中。β-木糖苷酶的来源较广泛，于细菌、放线菌、古细菌、真菌(包括酵母)等微生物以及小麦等高等植物中均有发现，目前研究较多的是来自于细菌和真菌的β-木糖苷酶。其中，β-木糖苷酶的分子量从26kDa到400kDa之间不等，产生的酶蛋白有单体、二聚体、三聚体和四聚体等。据报道，大多数的细菌和酵母中的β-木糖苷酶为胞内酶，而一些真菌中的β-木糖苷酶则为胞外酶。

酶分子体外定向进化属于蛋白质的非理性进化，是改善蛋白质功能和活性的重要手段之一，属于蛋白质工程的范畴。在事先不了解蛋白质的高级结构以及催化位点等因素的情况下，可以人为创造条件模拟自然选择的进化机制，通过分子生物学手段在体外快速建立含大量目的蛋白编码基因的突变体文库，并通过高通量的定向筛选方法，快速得到符合某些预期效果的蛋白突变体。定向进化的核心步骤主要包括构建具有多样性的突变体文库和高通量的筛选方法。常用的包括：易错PCR、饱和突变、DNA改组、交错延伸PCR等。与之不同，当已知蛋白质的空间结构、活性位点、催化机制等因素时，在此基础上有的放矢对基因进行改造的是定点突变，即理性设计。因它只能对天然酶蛋白质中的少数氨基酸进行替换、删除或***，对酶功能的改造有限。因此，对于结构与功能未知的酶，定向进化可在一定程度上弥补理性设计的不足。

芽孢杆菌表达***作为一种安全、高效、多功能和极具开发潜力的微生物菌种已广泛地应用于工业、农业、医药、卫生、食品、畜牧业、水产及科研领域。它与常用的大肠杆菌表达***相比有着独特的优势，即可将目的基因表达的产物分泌到胞外，从而降低进一步收集、分离、纯化基因表达产物的成本和工作量。芽孢杆菌中枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌等均可作为表达宿主菌。在微生物遗传学领域，芽孢杆菌属背景研究也十分清楚，具有密码子偏爱性不明显、发酵简单、生长迅速、不产生致病毒素、对培养基无特殊要求等优点。随着分子生物学技术的发展和芽孢杆菌研究的深入，使用芽孢杆菌表达***已经克隆和表达了大量基因，有些已进行大规模工业生产，多种酶和临床需要的化学药品或者工业产品都通过芽孢杆菌来表达生产。

在本发明中，对原始β-木糖苷酶基因定向进化获得高活力的β-木糖苷酶突变基因，并且实现了其在枯草芽孢杆菌表达***、解淀粉芽孢杆菌表达***和地衣芽孢杆菌表达***中的高效表达，得到了产高活力β-木糖苷酶的突变体菌株。

发明内容：

基于现有技术存在的问题，为了进一步推动β-木糖苷酶在工业领域的应用，需对其现有性质进一步的提升，本发明的目的在于提供一种高活力β-木糖苷酶的突变体。

实现本发明目的的技术路线概述如下：

通过基本的分子生物学技术手段获得来自短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)TCCC 11573的野生型β-木糖苷酶XYL，通过酶切、连接等构建重组载体之后，经测序获得野生型β-木糖苷酶XYL编码基因xyl(序列如SEQ ID NO.2所示)，利用易错PCR技术对野生型xyl基因进行随机突变，利用枯草芽孢杆菌表达***筛选得到XYL突变体E455G，及其编码基因xylm，重新构建重组载体，并实现了其在枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌中的高效表达，通过发酵、提取等技术获得酶活力提高的XYL突变体。

在本发明中采用如下定义：

1.氨基酸和DNA核酸序列的命名法

使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。

2.β-木糖苷酶突变体的标识

采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示XYL突变体中突变的氨基酸。如Glu455Gly，表示位置455的氨基酸由野生型XYL的Glu替换成Gly，位置的编号对应于SEQ IDNo.1中野生型XYL的氨基酸序列编号。

在本发明中，小写斜体xyl表示野生型XYL的编码基因，小写斜体xylm表示突变体E455G的编码基因，信息如下表。

β-木糖苷酶	氨基酸突变位点	基因突变位点	氨基酸SEQ ID No.	核苷酸SEQ ID No.
					野生型	—	—	1	2
E455G	Glu455Gly	GAG→GGG	3	4

本发明还提供包含所述突变体编码基因的重组质粒或重组菌；

优选地,所述的XYL突变体E455G编码基因的表达载体为pBSA43；宿主细胞可以为枯草芽孢杆菌WB600、解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218或地衣芽孢杆菌TCCC11965。

本发明的实验方案具体如下：

1、所述XYL突变体编码基因的获得，包括如下步骤：

(1)以短小芽孢杆菌野生型XYL编码基因xyl(SEQ ID No.2)为模板进行易错PCR随机突变野生型XYL编码基因；

(2)将随机突变后的XYL编码基因，通过酶切、连接等构建重组质粒后转入枯草芽孢杆菌WB600中，筛选获得酶活力提高的XYL突变体，经测序获得XYL突变体编码基因xylm，将含有酶活力提高的XYL突变体编码基因的质粒pET22b-xylm保存。

2、一株含有β-木糖苷酶编码基因的枯草芽孢杆菌重组菌株及以其制备酶活力提高的β-木糖苷酶的过程，包括如下步骤：

(1)将XYL突变体编码基因xylm与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pBSA43通过连接得到新的重组质粒pBSA43-xylm；

(2)将重组质粒转入枯草芽孢杆菌WB600中，经卡那霉素(Kan)抗性筛选，酶切验证得到重组菌株，之后将重组菌株进行培养发酵，得到β-木糖苷酶。

3、一株含有β-木糖苷酶编码基因的解淀粉芽孢杆菌重组菌株及以其制备酶活力提高的β-木糖苷酶的过程，包括如下步骤：

(1)将重组质粒pBSA43-xylm转入解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218，得到的重组菌株经过Kan抗性筛选和β-木糖苷酶的酶活测定，得到β-木糖苷酶高产菌株；

(2)之后进行发酵，制备β-木糖苷酶。

4、一株含有β-木糖苷酶编码基因的地衣芽孢杆菌重组菌株及以其制备酶活力提高的β-木糖苷酶的过程，包括如下步骤：

(1)将重组质粒pBSA43-xylm转入宿主菌株地衣芽孢杆菌TCCC11965中，经过Kan抗性筛选得到β-木糖苷酶重组菌株；

(2)将重组菌株发酵后,制备β-木糖苷酶。

所述XYL突变体E455G的酶学特性如下：

(1)比活：XYL突变体E455G的比活为281.66U/mg。

(2)最适反应温度：30℃。

(3)温度稳定性：在pH 7.0条件下，分别于0、10、20、30和40℃水浴保温2h。在0、10和20℃保温2h后，XYL突变体E455G及野生型的残余活力均保持在95％以上；在30℃和40℃保温2h后，XYL突变体E455G的残余活力分别为91.02％和60％，与之对应，野生型的残余活力为90.08％和63.98％。

(4)最适pH：7.0。

(5)pH稳定性：在4℃下，分别于pH 6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的缓冲液中保温7d，野生型和XYL突变体E455G在pH 7.0、8.0和9.0条件下的稳定性较好，XYL突变体E455G的残余活力分别为79.55％，83.27％和70.19％，而野生型的残余活力分别为83.4％、84.85％和65.92％。与之相比，在pH 6.0和pH 10.0条件下，二者的残余活力分别在3％和19％左右。

有益效果：

1、本发明利用易错PCR技术对野生型XYL进行随机突变，得到酶活力提高的突变体E455G。高活力β-木糖苷酶在各表达***内发酵酶活最高值分别为28428U/mL、37122U/mL、41407U/mL(g·细胞干重)，较野生型提高230％左右。

2、本发明分别使用了枯草芽孢杆菌表达***、解淀粉芽孢杆菌表达***、地衣芽孢杆菌***，实现酶活力提高的XYL突变体不同方式的高效表达。

附图说明：

图1为本发明野生型xyl基因的PCR扩增电泳图

其中：M为DNA Marker，1为xyl基因；

图2为本发明重组质粒pBSA43-xylm酶切验证图其中：M为DNAMarker，1为枯草芽孢杆菌中重组质粒pBSA43-xylm经BamH I和NotI双酶切电泳图，2为解淀粉芽孢杆菌中重组质粒pBSA43-xylm经BamH I和NotI双酶切电泳图，3为地衣芽孢杆菌中重组质粒pBSA43-xylm经BamH I和NotI双酶切电泳图；

图3为野生型XYL及本发明突变体E455G蛋白纯化样品的SDS-PAGE图其中：M为Protein Marker，1为野生型XYL纯化样品，2为突变体E455G纯化样品；

图4为本发明野生型XYL与突变体E455G最适温度曲线

其中：WT为本发明野生型XYL，E455G为本发明突变体；

图5为本发明野生型XYL与突变体E455G最适pH曲线

其中：WT为本发明野生型XYL，E455G为本发明突变体；

图6为温度稳定性曲线

其中：WT为本发明野生型XYL，E455G为本发明突变体；

图7为pH稳定性曲线

其中：WT为本发明野生型XYL，E455G为本发明突变体。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明，但本发明不只限于这些实施例，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明所使用的地衣芽胞杆菌为TCCC11965，公开于：Development andapplication of a CRISPR/Cas9 system for Bacillus licheniformis genome editing[J].International Journal of Biological Macromolecules,2019,122:329-337，目前保存于天津科技大学微生物菌种保藏管理中心，公众可从该中心获取菌种。

本发明实施例所用培养基如下：

LB培养基(g/L)：酵母提取物5.0，胰蛋白胨10.0，NaCl 10.0。

10×SP盐溶液(g/L)：K₂HPO₄ 91.7，KH₂PO₄ 30，(NH4)₂SO₄ 10，柠檬酸钠5，MgSO_4·7H₂O10。

SP I培养基：1×SP 97.6mL，5％酪蛋白水解物400μL，10％酵母汁1mL，50％葡萄糖1mL。(5％酪蛋白水解物：0.5g酸水解酪蛋白溶于10mL ddH₂O；10％酵母汁：1g酵母提取物溶于10mL ddH₂O；50％葡萄糖：5g葡萄糖溶于10mL ddH₂O)。

SP II培养基：SP I培养基99mL，100mM CaCl₂ 500μL，500mM MgCl₂ 500μL。

LBS培养基(g/L)：山梨醇91.085，NaCl 10，酵母抽提物5，胰蛋白胨10。

种子培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L；

发酵培养基：玉米粉64g/L，豆饼粉40g/L，磷酸氢二钠4g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，高温淀粉酶0.7g/L。

上述培养基的固态培养基均添加2％琼脂。

以下将通过具体实施例对本发明作进一步解释说明。

实施例1：野生型XYL编码基因xyl的获得

1.野生型XYL编码基因xyl来自实验室保存的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)TCCC 11573菌株，利用美国OMEGA公司的Bacterial DNA Kit提取基因组。

(1)菌株活化：用接种环从甘油管中蘸取短小芽孢杆菌菌液，接种于LB固体培养基平板，三区划线，37℃恒温培养12h；

(2)转接：从培养菌体的平板上挑取边缘整齐、表面光滑的单菌落接种于5mL液体LB培养基中，220r/min、37℃条件下培养12h；

(3)收集菌体：取适量培养菌液分装于1.5mL EP管，12000r/min离心2min，弃上清；

(4)加入250μL ddH₂O重悬菌体，并加入50μL的50mg/mL溶菌酶，37℃水浴10min；

(5)加入100μL BTL Buffer和20μL蛋白酶K，旋涡振荡；

(6)55℃水浴40-50min，每隔20-30min，振荡混匀；

(7)加入5μL RNA酶，颠倒混匀数次，室温放置5min；

(8)12000rpm离心2min，去掉未消化部分，将上清部分转移至新的1.5mL EP管；

(9)加入220μL BDL Buffer，振荡混匀，65℃水浴10min；

(10)加入220μL无水乙醇，吹吸混匀；

(11)转移至吸附柱，静置1min，12000rpm离心1min，弃滤液；

(12)加入500μL HBC Buffer，12000rpm，离心1min，弃滤液；

(13)加入700μL DNA Wash Buffer，12000rpm，离心1min，弃滤液；

(14)加入500μL DNA Wash Buffer，12000rpm，离心1min，弃滤液；

(15)12000rpm，空离2min，55℃金属浴10min，晾干；

(16)加入40μL ddH₂O洗脱基因组。

2.扩增野生型XYL编码基因xyl

设计野生型XYL编码基因xyl的扩增引物，序列如下：

上游P1(SEQ ID No.5)：

CGCGGATCCGATGAAAATTACCAATCCAGTGC(划线部分为BamH I酶切位点)

下游P2(SEQ ID No.6)：

AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTCTGTTTCCTCATAACGGAAA(划线部分为Not I酶切位点)

PCR扩增的反应体系为50μL，其组成为：

PrimeSTAR Max	25μL
		上游引物P1(20μmol/L)	2μL
下游引物P2(20μmol/L)	2μL
		基因组	2μL
ddH<sub>2</sub>O	19μL
		总体积	50μL

注：上述所需试剂来自宝生物工程有限公司Takara。

扩增程序的设置为：

a.预变性:98℃30s；

b.变性：98℃10s；

c.退火：56℃45s；

d.延伸：72℃10s；

e.b-d反应30个循环；

f.延伸:72℃10min。

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，可以看到短小芽孢杆菌野生型XYL编码基因xyl的条带，约1600bp(见图1)，再由DNA切胶回收试剂盒回收PCR产物，通过酶切、连接构建重组质粒pET22b-xyl，送测序公司进行测序，获得野生型xyl基因序列(SEQ ID NO.2所示)。

实施例2：XYL突变体E455G的获得

1.易错PCR：以野生型编码基因xyl为模板进行易错PCR，其反应体系如下：

ddH<sub>2</sub>O	10μL
		重组质粒pET22b-xyl(5ng/μL)	2μL
上游引物P1(10μmol/L)	2μL
		下游引物P2(10μmol/L)	2μL
Taq DNA聚合酶	0.5μL
		10×Taq buffer	5μL
dATP(10mmol/L)	1μL
		dGTP(10mmol/L)	1μL
dTTP(10mmol/L)	5μL
		dCTP(10mmol/L)	5μL
MgCl<sub>2</sub>(25mmol/L)	14μL
		MnCl<sub>2</sub>(10mmol/L)	2.5μL

注：上述所需试剂来自宝生物工程有限公司Takara。

体系完成后，进行易错PCR反应，程序设置如下：

a.预变性:95℃5min；

b.变性：95℃30s；

c.退火：56℃45s；

d.延伸：72℃90s；

e.b-d反应35个循环；

f.延伸:72℃10min。

PCR反应结束后，将PCR产物与载体质粒进行BamH I和Not I双酶切，经过纯化回收，易错PCR产物与同样经过双酶切的载体质粒pBSA43进行连接，通过转化枯草芽孢杆菌WB600，涂布于含Kan(100μg/mL)的LB固体培养基，37℃培养箱静置培养12h，得到转化子。

3.筛选方法：采用对硝基苯酚(pNP)比色法进行活性检测。pNPX在β-木糖苷酶的作用下水解产生pNP和木糖，结束后用Na₂CO₃终止反应。生成的pNP是一种黄色化合物，它的最大光吸收波长是405nm。因此在一定范围内pNP的生成量与反应液的颜色强度具有一定的比例关系，只要利用比色法测定出pNP的生成量就可测定出β-木糖苷酶活力。由于发酵上清存在目的蛋白，可以直接用发酵上清进行筛选。

4.突变体文库的筛选：在96孔板中每个孔中加入200μL含Kan(100μg/mL)的LB液体培养基，随后，用灭过菌的牙签挑取每一个转化子的单克隆至96孔板中，挑取过程中尽可能使得每次都刚好沾到少量的菌。将96孔板转移至摇床培养，160rpm，37℃培养48h。然后采用低温离心机(4℃)，4000rpm离心10min，取50μL发酵上清加入到50μL反应液的96孔板1中，30℃反应10min，然后加入100μL2 mol/L碳酸钠溶液，检测405nm处的吸光值。

注：反应液：0.8mmol/L对硝基苯酚-β-D-木糖苷(pNPX)溶液：准确称取21.7mg对硝基苯酚-β-D-木糖苷，定容至100mL，置于棕色瓶中，4℃冰箱保藏。

2mol/L碳酸钠溶液：准确称取106g无水碳酸钠，加入约450mL去离子水，搅拌溶解后定容至500mL。

5.选取酶活力提高的突变体。根据板1的情况，计算每个突变体的残余酶活，选取相较于野生型酶活力提高的突变体，将该突变体接入平板，并送出菌样进行测序。

经过上述步骤的易错PCR，选取出酶活力提高的突变体，测序后得到其中含有一个氨基酸突变，即E455G(GAG→GGG)，从而获得XYL突变体E455G(SEQ ID NO.3)，及其编码基因xylm(SEQ ID NO.4)。

实施例3：β-木糖苷酶枯草芽孢杆菌重组菌的构建

1.构建表达质粒pBSA43-xylm

将xylm与枯草芽孢杆菌表达载体pBSA43都经BamHI和NotI双酶切，随后进行连接，构建得到重组质粒pBSA43-xylm，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性转化子，提取质粒进行酶切验证并测序，确定构建成功，即获得重组表达质粒pBSA43-xylm。

2.表达质粒pBSA43-xylm转化枯草芽孢杆菌WB600

(1)枯草芽孢杆菌WB600菌种活化，在无抗LB平板上三区划线，培养12h；

(2)挑取单菌落，接种于含有5mL LB培养基的试管中，37℃，220rpm培养12h；

(3)按2％的接种量，取100μL种子液接种于含有5mL SPI培养基的试管中，37℃，220rpm，培养3-4h至OD₆₀₀＝1.2；

(4)快速取200μL接种于2mL SPII培养基，37℃，100rpm，培养1.5h；

(5)加入20μL的10mM EGTA，37℃，100rpm，培养10min；

(6)加入1-2μL重组质粒pBSA43-xylm，37℃，100rpm，培养30min后，转速调至220rpm，继续培养1-2h；

(7)将菌液转移至已灭菌的1.5mL EP管中，5000rpm离心5min，弃上清，留50μL培养液重悬菌体，菌液涂布于含Kan的平板；

(8)挑转化子，提质粒、酶切验证(如图2中1泳道所示)，得到枯草芽孢杆菌重组菌株WB600/pBSA43-xylm。

实施例4：β-木糖苷酶解淀粉芽孢杆菌重组菌株的构建

(1)制备解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218感受态

①菌种活化，在无抗LB固体培养基上三区划线，37℃培养24h；

②挑单菌落接种于LBS培养基，37℃，220rpm，培养12h；

③以2％的接种量，将种子液接种于100mL LBS培养基中，37℃，220rpm，培养2-3h至OD₆₀₀＝0.4-0.6；

④用低温离心机(4℃),5000rpm，离心10min，弃上清；

⑤菌体用30mL洗涤缓冲液(0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10％甘油)重悬，用低温离心机(4℃),5000rpm，离心10min，弃上清；

⑥重复步骤⑤，共洗涤3次；

⑦用10mL缓冲液重悬菌体(0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10％甘油，14％PEG6000)；

⑧分装感受态，每管100μL，-80℃保存备用。

(2)电转解淀粉芽孢杆菌

①75％酒精清洗电转杯；

②将10ng重组质粒pBSA43-xylm和100μL感受态混匀后转移至电转杯中，冰浴2min；

③2100-2500V，电击4-6ms后，立即加入1mL复苏液(LB+0.5M山梨醇+0.38M甘露醇)，37℃，220rpm复苏3h，涂布于含Kan抗性的平板；

④挑转化子，提质粒，酶切验证(如图2中2泳道所示)，得到解淀粉芽孢杆菌重组菌株CGMCC No.11218/pBSA43-xylm。

实施例5：构建β-木糖苷酶地衣芽孢杆菌重组菌株

向预冷的1mL电转杯中加入60μL TCCC11965感受态细胞和1μL(50ng/μL)pBSA43-xylm，混匀并冰浴5min，设置参数(25μF，200Ω，4.5-5.0ms)，电击一次，随后立即加入1mL复苏培养基(LB+0.5mol/L山梨醇+0.5mol/L甘露醇)，混匀后吸取至1.5mLEP管中，37℃摇床震荡培养3h，离心后留取200μL复苏物涂布在具有Kan抗性的LB平板上，37℃培养24h，挑取转化子，提质粒、酶切验证(如图2中3泳道所示)，得到地衣芽孢杆菌重组菌株TCCC11965/pBSA43-xylm。

实施例6：酶活力提高的β-木糖苷酶在枯草芽孢杆菌重组菌中的表达及制备

1.将枯草芽孢杆菌重组菌株WB600/pBSA43-xylm接种于含卡纳霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃，220r/min培养过夜；

2.按1％接种量转接于50mL的LB培养基中，37℃，220r/min培养48h，离心收集发酵上清，即得到酶活力提高的E455G粗酶液；

3.将收集到的发酵液上清，先以25％饱和度的硫酸铵盐析除去杂蛋白，再把饱和度加大到65％，沉淀目的蛋白。利用0.02mol/L Tris-HCl(pH7.0)溶解，透析除盐，再将透析脱盐后得到的活性组分上样至纤维素离子交换层析柱，用同样的缓冲液先洗脱未吸附的蛋白，再用含0.1～1mol/L NaCl的0.02mol/L Tris-HCl(pH7.0)缓冲液梯度洗脱，收集目的蛋白。离子交换得到的活性组分先用含0.15mol/L NaCl的0.02mol/L Tris-HCl(pH7.0)缓冲液平衡，上样至sephadex g25凝胶层析柱后用相同的缓冲液以0.5mL/min的速度洗脱，获得纯化后的酶液，取纯化后酶液进行SDS-PAGE分析，结果如图3泳道2所示，获得大小为61kDa的单一条带。纯化后的酶液，经冷冻干燥制得高活力E455G酶粉。

实施例7：酶活力提高的β-木糖苷酶在解淀粉芽孢杆菌中的表达及制备

1.平板三区划线活化重组菌株CGMCC No.11218/pBSA43-xylm；

2.挑取单菌落接种于50mL含Kan的抗性种子培养基中，37℃、220r/min振荡培养12h；

3.以2％的接种量转接于含有卡那霉素抗性的发酵培养基中，于37℃、220r/min发酵培养48h。

4.12000rpm，离心10min，收集发酵上清，即得到XYL突变体E455G的粗酶液；

5.收集发酵上清，采用实施例6的方法，使用分级盐析法沉淀酶蛋白，收集蛋白质沉淀，溶解后，透析除盐，再经离子交换层析、凝胶层析后，获得洗脱后的酶液，并经过真空冷冻干燥制得高活力E455G酶粉。

实施例8：地衣芽孢杆菌制备酶活力提高的β-木糖苷酶

1.平板三区划线活化重组菌株TCCC11965/pBSA43-xylm；

2.挑取单菌落接种于50mL含Kan的抗性种子培养基中，37℃，220r/min振荡培养12h；

3.以2％的接种量转接于含有卡那霉素抗性的发酵培养基中，于37℃，220r/min发酵培养48h。

5.然后收集发酵上清，采用实施例6的方法，使用分级盐析法沉淀酶蛋白，收集蛋白质沉淀，溶解后，透析除盐，再经离子交换层析、凝胶层析后，获得洗脱后的酶液，并经过真空冷冻干燥制得高活力E455G酶粉。

实施例9：β-木糖苷酶酶活力测定

1.β-木糖苷酶酶活测定原理

在一定条件下，β-木糖苷酶能够将对硝基苯基-β-D-木糖苷(pNPX)中的糖苷键进行水解，生成对硝基苯酚(即pNP),对硝基苯酚在碱性的条件下呈现黄色，利用酶标仪测定405nm处吸光度,计算对应对硝基苯酚含量，进而计算出β-木糖苷酶的酶活力。

2.β-木糖苷酶酶活的定义

一个酶活性单位(U)定义为在一定反应条件下，每分钟水解底物pNPX生成1μmol对硝基苯酚(pNP)所需的酶量。

酶活公式：酶活(U)＝[c×V/(t×V₁)]×N

注：V：反应体系的总体积，本研究中为0.2mL；

V₁：所取酶液的体积，本研究中为0.05mL；

c：代表pNP的浓度(μmol/mL)；

t：代表从反应开始到结束所用时间，本研究中为10min；

N：酶液的稀释倍数。

3.本发明采用的β-木糖苷酶酶活测定方法与步骤50μL反应液于30℃，pH7.0下保温1min，吸取50μL酶液加入其中，30℃反应10min后向反应体系中加入100μL2 mol/L碳酸钠溶液来终止反应，采用酶标仪在405nm检测OD值。样品均含有3组平行实验。

空白对照：100℃处理酶液10min使酶失活，使用热失活的酶液作为对照，反应体系及方法同上。

4.酶活测定结果如下表(以实施例6、7和8制备的E455G粗酶液以及同样方法制备的野生型XYL粗酶液为实验对象)：

注：野生型XYL粗酶液的制备中，首先采用实施例3、4、5同样的方法构建野生酶重组菌株，之后采用实施例6、7、8同样的发酵方法制备野生酶粗酶液。

实施例10：酶学性质测定

以实施例9所采用枯草芽孢杆菌表达***酶活测定样品，及酶活测定方法，测定野生型XYL以及突变体E455G的酶学性质，结果如下，详见附图4-7：

(1)比活：XYL突变体E455G的比活为281.66U/mg。

(2)最适反应温度：30℃。

(3)温度稳定性：在pH 7.0条件下，分别于0、10、20、30和40℃水浴保温2h，之后测定酶活。在0、10和20℃保温2h后，XYL突变体E455G及野生型的残余活力均保持在95％以上；在30℃和40℃保温2h后，XYL突变体E455G的残余活力分别为91.02％和60％，与之对应，野生型的残余活力为90.08％和63.98％。

(4)最适pH：7.0。

(5)pH稳定性：在4℃下，分别于pH 6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的缓冲液中保温7d，之后测定酶活。pH 7.0、8.0和9.0条件下的稳定性较好，突变体E455G的残余酶活分别为79.55％，83.27％和70.19％，野生型的残余酶活分别为83.4％、84.85％和65.92％。与之相比，在pH 6.0和pH 10.0条件下，二者的残余活力分别在3％和19％左右。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津科技大学

<120> 一种新型β-木糖苷酶及其制备

<130> 1

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 534

<212> PRT

<213> 短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus） TCCC 11573

<400> 1

Met Lys Ile Thr Asn Pro Val Leu Lys Gly Phe Asn Pro Asp Pro Ser

1 5 10 15

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Trp Phe Pro Gly Val Gln Ile Tyr His Ser Arg Asp Leu Val His Trp

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Arg Leu Ala Ala Arg Pro Leu Gln Lys Thr Ser Gln Leu Asp Met Lys

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85 90 95

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130 135 140

Trp Asp His Arg Glu Lys His His Ser Phe Ala Gly Ile Ala Leu Gln

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165 170 175

Phe Lys Gly Thr Pro Ile Lys Leu Thr Glu Ala Pro His Leu Tyr His

180 185 190

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210 215 220

Glu Val His Pro Asp Asn Pro Ile Leu Ser Ala Phe His Ala Pro Glu

225 230 235 240

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245 250 255

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275 280 285

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Gly Gly Lys Glu Gly Ala Leu Glu Val Glu Ala Pro Ala Ile Asn Glu

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325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

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Trp Lys Glu Ile Asp Val Ser Phe Glu Ser Ser His Leu Ser Asp Asp

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<210> 2

<211> 1602

<212> DNA

<213> 短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus） TCCC 11573

<400> 2

atgaaaatta ccaatccagt gctcaaaggg tttaacccgg acccaagtat ttgccgtgta 60

ggagaagatt attacatggc ggtctctaca tttgaatggt ttccaggggt gcaaatttat 120

cattcgaggg atttagtcca ttggcggctt gctgcgcgtc ctttgcaaaa aacgtcgcag 180

ctggacatga aggggaatcc tgattctggc ggagtatggg caccgtgcct aagctatgca 240

gatggtcagt tttggctcat ttattcagat atcaaagtag tggatggtcc atttaaagat 300

ggtcataatt atttggtcac ggcaagtgaa gtggatggtg attggagtga gccggtccgt 360

ctcaatagct ctggctttga tccctcttta tttcatgatc aaagcggcaa gaaatacgtc 420

ttaaatatgc tgtgggatca tagggaaaag caccattcat ttgcgggtat tgccctgcag 480

gaatatagcg tgacggaaaa gaaactcatt ggtcagcgga aggtcatttt taaaggcacg 540

ccgataaaat tgacagaagc gccgcatctt tatcacattg gtgattacta ttatttatta 600

acagcagaag gaggtacccg gtacgagcat gcggcaacaa ttgcccgttc ctcgcagatt 660

gaagggcctt atgaggttca tcctgataac cccattttaa gtgcttttca cgcacctgaa 720

catccgcttc aaaaatgcgg gcatgcttcc atcgttcaaa cgcatacaaa tgaatggtat 780

ttggctcatc tcactggccg ccccattcaa tcaagcaagg aatctatttt tcaacagaga 840

gggtggtgtc ctttaggaag agaaacagcg attcaaaagc ttgaatggaa ggatggctgg 900

ccgtatgttg tgggcggaaa agagggggcg ctggaggttg aagcgccagc gataaacgaa 960

aaggtttttg ctcctacaca ccatacagtc gatgaattta aagaatcaac gttaaataga 1020

cacttccaaa cattaagaat cccttttact gatcagatcg gttcattaac ggaaaaacct 1080

cagcatttaa ggttatacgg tcaggaatct ctaacatcta agtttaccca agctttcgtt 1140

gcaaggcgct ggcaaagctt ttattttgaa gcagagacag ctgtttcgtt ctttccagag 1200

aattttcagc aagccgctgg tcttgtgaat tattataata cggaaaattg gacagcgctt 1260

caggtgacat atgacgagga acttggccgc attcttgaac tatctgtctg tcaaaacctt 1320

tccttttctc agccgttgac acaaaaaatc gtcattccag aggaggtcac gtatgtgtat 1380

ttaaaagtga ccgttcagaa agagacatat acctattctt attcttttga tcaaagagaa 1440

tggaaggaaa ttgatgtgtc atttgaatca agccatttat ccgatgactt cattcgagga 1500

gggggatttt ttacaggggc atttgtcggc atgcagtgcc aggatacaag cggcgagcgt 1560

cttcctgctg atttcaacta tttccgttat gaggaaacag aa 1602

<210> 3

<211> 534

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Lys Ile Thr Asn Pro Val Leu Lys Gly Phe Asn Pro Asp Pro Ser

1 5 10 15

Ile Cys Arg Val Gly Glu Asp Tyr Tyr Met Ala Val Ser Thr Phe Glu

20 25 30

Trp Phe Pro Gly Val Gln Ile Tyr His Ser Arg Asp Leu Val His Trp

35 40 45

Arg Leu Ala Ala Arg Pro Leu Gln Lys Thr Ser Gln Leu Asp Met Lys

50 55 60

Gly Asn Pro Asp Ser Gly Gly Val Trp Ala Pro Cys Leu Ser Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Gly Gln Phe Trp Leu Ile Tyr Ser Asp Ile Lys Val Val Asp Gly

85 90 95

Pro Phe Lys Asp Gly His Asn Tyr Leu Val Thr Ala Ser Glu Val Asp

100 105 110

Gly Asp Trp Ser Glu Pro Val Arg Leu Asn Ser Ser Gly Phe Asp Pro

115 120 125

Ser Leu Phe His Asp Gln Ser Gly Lys Lys Tyr Val Leu Asn Met Leu

130 135 140

Trp Asp His Arg Glu Lys His His Ser Phe Ala Gly Ile Ala Leu Gln

145 150 155 160

Glu Tyr Ser Val Thr Glu Lys Lys Leu Ile Gly Gln Arg Lys Val Ile

165 170 175

Phe Lys Gly Thr Pro Ile Lys Leu Thr Glu Ala Pro His Leu Tyr His

180 185 190

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195 200 205

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Trp Thr Ala Leu Gln Val Thr Tyr Asp Glu Glu Leu Gly Arg Ile Leu

420 425 430

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435 440 445

Lys Ile Val Ile Pro Glu Gly Val Thr Tyr Val Tyr Leu Lys Val Thr

450 455 460

Val Gln Lys Glu Thr Tyr Thr Tyr Ser Tyr Ser Phe Asp Gln Arg Glu

465 470 475 480

Trp Lys Glu Ile Asp Val Ser Phe Glu Ser Ser His Leu Ser Asp Asp

485 490 495

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<210> 4

<211> 1602

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

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cattcgaggg atttagtcca ttggcggctt gctgcgcgtc ctttgcaaaa aacgtcgcag 180

ctggacatga aggggaatcc tgattctggc ggagtatggg caccgtgcct aagctatgca 240

gatggtcagt tttggctcat ttattcagat atcaaagtag tggatggtcc atttaaagat 300

ggtcataatt atttggtcac ggcaagtgaa gtggatggtg attggagtga gccggtccgt 360

ctcaatagct ctggctttga tccctcttta tttcatgatc aaagcggcaa gaaatacgtc 420

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gaatatagcg tgacggaaaa gaaactcatt ggtcagcgga aggtcatttt taaaggcacg 540

ccgataaaat tgacagaagc gccgcatctt tatcacattg gtgattacta ttatttatta 600

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catccgcttc aaaaatgcgg gcatgcttcc atcgttcaaa cgcatacaaa tgaatggtat 780

ttggctcatc tcactggccg ccccattcaa tcaagcaagg aatctatttt tcaacagaga 840

gggtggtgtc ctttaggaag agaaacagcg attcaaaagc ttgaatggaa ggatggctgg 900

ccgtatgttg tgggcggaaa agagggggcg ctggaggttg aagcgccagc gataaacgaa 960

aaggtttttg ctcctacaca ccatacagtc gatgaattta aagaatcaac gttaaataga 1020

cacttccaaa cattaagaat cccttttact gatcagatcg gttcattaac ggaaaaacct 1080

cagcatttaa ggttatacgg tcaggaatct ctaacatcta agtttaccca agctttcgtt 1140

gcaaggcgct ggcaaagctt ttattttgaa gcagagacag ctgtttcgtt ctttccagag 1200

aattttcagc aagccgctgg tcttgtgaat tattataata cggaaaattg gacagcgctt 1260

caggtgacat atgacgagga acttggccgc attcttgaac tatctgtctg tcaaaacctt 1320

tccttttctc agccgttgac acaaaaaatc gtcattccag agggggtcac gtatgtgtat 1380

ttaaaagtga ccgttcagaa agagacatat acctattctt attcttttga tcaaagagaa 1440

tggaaggaaa ttgatgtgtc atttgaatca agccatttat ccgatgactt cattcgagga 1500

gggggatttt ttacaggggc atttgtcggc atgcagtgcc aggatacaag cggcgagcgt 1560

cttcctgctg atttcaacta tttccgttat gaggaaacag aa 1602

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

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<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aaggaaaaaa gcggccgctt ctgtttcctc ataacggaaa 40

Claims

1.一种β-木糖苷酶突变体，其特征在于，所述突变体为E455G，氨基酸序列如序列表SEQID No.3所示。

2.权利要求1所述β-木糖苷酶突变体的编码基因。

3.权利要求2所述β-木糖苷酶突变体的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如序列表SEQ ID No.4所示。

4.一种包含权利要求2所述基因的重组载体或重组菌株。

5.如权利要求4所述的重组载体或重组菌株，其特征在于，表达载体为pBSA43，宿主细胞为枯草芽孢杆菌WB600或解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218。

6.权利要求4所述重组载体或重组菌株在生产β-木糖苷酶中的应用。

7.权利要求1所述β-木糖苷酶突变体在水解木聚糖中的应用。