CN107746836A - 一种以活性形式表达的谷氨酰胺转氨酶突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种以活性形式表达的谷氨酰胺转氨酶突变体，属于酶工程和发酵工程领域。本发明通过对谷氨酰胺转氨酶成熟区进行定点突变，改变谷氨酰胺转氨酶活性位点附近的氨基酸残基，提高谷氨酰胺转氨酶的催化效率，得到了谷氨酰胺转氨酶酶活的进一步提高的重组菌hpro‑E300W。重组菌hpro‑E300W发酵罐发酵酶活可达59.85U/mL，是目前报道的发酵水平的最高值。此外，本发明通过在谷氨酰胺转氨酶中***解脂耶氏酵母内源性蛋白酶Kex2识别位点现了谷氨酰胺转氨酶在解脂耶氏酵母中的活性表达。发酵生产杂蛋白少，纯化简单，可降低工业化生产谷氨酰胺转氨酶的成本。

Description

一种以活性形式表达的谷氨酰胺转氨酶突变体
技术领域
本发明涉及一种以活性形式表达的谷氨酰胺转氨酶突变体，属于酶工程领域。
背景技术
谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase,EC 2.3.2.13,TGase)，可以催化肽链中的谷氨酰胺残基中的γ-羧酰胺基与酰基受体发生转酰基反应，从而使蛋白质或多肽之间发生共价交联。TGase在食品加工领域的应用广泛，比如，TGase可使蛋白质与必须氨基酸(如赖氨酸)交联，提升一些食品的营养价值。TGase可以将碎肉粘结成块，提高肉制品的利用率，改善肉制品的弹性。此外，TGase在医药，化妆品，生物技术研究，纺织业及皮革加工等领域均有巨大的市场需求。
微生物具有生产成本低、易于培养和改造等优点，所以生产上主要依赖微生物来生产TGase。微生物来源的谷氨酰胺转氨酶通常以无活性酶原(pro-MTG)的形式分泌，需经蛋白酶dispase等切除N-端酶原区(pro)才能转化成活性MTG。酶原区(pro)位于信号肽与成熟酶之间，属于前导肽，对谷氨酰胺转氨酶的折叠和分泌具有重要的影响。有些链霉菌如Streptomyces lividans 3113、Streptomyces ladakanum等，其自身可以表达活化MTG的蛋白酶，因而可以表达活性MTG，但是MTG酶活相对较低，普遍在1.0-6.0U/mL。
近年来利用基因工程技术将谷氨酰胺转氨酶基因克隆至大肠杆菌等异源宿主中表达MTG成为了一种新的趋势，然而，一方面，大肠杆菌等异源宿主是非食品级表达体系，另一方面，在异源宿主中，谷氨酰胺转氨酶通常以无活性酶原的形式分泌，需在体外经蛋白酶TAMEP，SAM-P45，dispase等切除N-端酶原区(pro)才能转化成活性谷氨酰胺转氨酶。且重组菌生产谷氨酰胺转氨酶的产量普遍在2.0-8.0U/mL，还不能满足需求。因此，如何在食品级表达体系中稳定、高效的直接表达活性谷氨酰胺转氨酶，是目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明第一个目的是提供一种酶以活性形式表达的谷氨酰胺转氨酶突变体，所述突变体如(a)、(b)和表达活性谷氨酰胺转氨酶的突变体，所述突变体如(c)、(d)所示：
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的突变体；
(b)将(a)的成熟区第300位的谷氨酸突变成色氨酸，得到氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示的突变体；
(c)在(a)或(b)的第57位和第58位之间***Kex2蛋白酶识别位点，得到氨基酸序列如如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示，所述Kex2蛋白酶识别位点的氨基酸序列为Lys-Arg。
(d)在(a)、(b)或(c)氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有谷氨酰胺转氨酶活性的由(a)、(b)或(c)衍生的突变体。
在本发明的一种实施例中，编码上述突变体的核苷酸序列。
本发明的第二个目的是提供一种表达所述突变体的基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是以解脂耶氏酵母po1h为宿主。
本发明的第三个目的是提供一种表达所述突变体的基因工程菌的构建方法。
在本发明的一种实施例中，所述基因工程菌为表达突变体(a)的基因工程菌，其构建方法如下：
(1)将茂源链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶基因和吸水链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶酶原区hpro基因融合后与载体连接，得到重组质粒pINA1297/hpro-mTG，所述茂源链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5，所述吸水链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶酶原区hpro的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
(2)重组质粒pINA1297/hpro-mTG线性化后，转化到解脂耶氏酵母po1h，经营养缺陷型培养基YNB筛选后，获得基因工程菌po1h/hpro-mTG。
在本发明的一种实施例中，所述基因工程菌为表达突变体(b)的基因工程菌，其构建方法如下：
(1)用编码氨基酸序列为SEQ ID NO.1的谷氨酰胺转氨酶的基因作为大引物，以质粒这pINA1297/hpro-mTG为模板，扩增全质粒，得到表达载体pINA1297/hpro-E300W。
(2)重组质粒pINA1297/hpro-E300W线性化后，转化到解脂耶氏酵母po1h，经营养缺陷型培养基YNB筛选后，获得基因工程菌po1h/hpro-E300W。
在本发明的一种实施例中，提供一种表达活性谷氨酰胺转氨酶的基因工程菌的构建方法，所述基因工程菌为表达突变体(c)的基因工程菌，其构建方法如下：
以质粒pINA297/hpro-mTG或pINA1297/hpro-E300W为模板，扩增在突变体(a)或(b)的第57位和第58为之间***Kex2蛋白酶识别位点的基因序列，构建质粒pINA1297/hpro-KR-mTG或pINA1297/hpro-KR-E300W，质粒线性化后转化到解脂耶氏酵母po1h，得到高效表达活性谷氨酰胺转氨酶的基因工程菌po1h/hpro-KR-mTG或po1h/hpro-KR-E300W。
本发明第四个目的是提供一种所述基因工程菌发酵生产谷氨酰胺转氨酶的方法，所述方法的步骤如下：
(1)摇瓶发酵：将基因工程菌接种于YPD液体培养基中，25-30℃，180-230rpm培养20-27h后，按8-12％的接种量转接于解脂耶氏酵母发酵培养基中，25℃-30℃，180-230rpm摇瓶培养4-6d。
(2)发酵罐发酵：发酵罐发酵：将基因工程菌接种于YPD液体培养基中，28℃，200rpm培养24h后，种子液以10％的接种量接种至发酵罐中，控制温度28℃，搅拌转速为600rpm，通气量为2vvm，当溶氧开始反弹且>60％时，开始流加50％(W/V)甘油120mL，调节转速使溶氧<30％，发酵120h。
本发明的有益效果：
1.本发明得到了一种谷氨酰胺转氨酶酶活提高的突变体po1h/hpro-mTG和po1h/hpro-E300W，摇瓶发酵酶活分别可达11.7U/mL和16.995U/mL，发酵罐发酵酶活分别可达43.7U/mL和59.85U/mL，是目前报道的发酵水平的最高值。
2、本发明还得到一种表达活性谷氨酰胺转氨酶的突变体po1h/hpro-KR-mTG和po1h/hpro-KR-E300W，实现了谷氨酰胺转氨酶的活性表达，摇瓶发酵酶活分别可达5.265U/mL和7.107U/mL，发酵罐发酵酶活分别达到17.1/mL和22.9U/mL。
3.解脂耶氏酵母为食品级表达体系(已被FDA认定是安全的)，发酵中不需诱导或添加抗生素，能用于食品和药品的生产。易于培养，发酵方法简单，周期短。高密度发酵，分泌能力强，利于大量表达谷氨酰胺转氨酶。本发明采用的po1h系的解脂耶氏酵母已敲除胞外蛋白酶基因，所以胞外几乎无杂蛋白，易于谷氨酰胺转氨酶的分离纯化。
4.本发明使用的谷氨酰胺转氨酶基因来源于茂源链霉菌，pH适应范围广，稳定性高(pH适应范围为5-9，最适反应pH范围为6-7，最适反应温度为55℃)。
附图说明
图1：重组菌株发酵mTG酶活
图2：重组菌株发酵上清SDS-PAGE图
图3：活性表达mTG重组菌hpro-KR-mTG产mTG酶活
图4：活性表达重组菌hpro-KR-E300W产mTG酶活
图5：活性表达mTG重组菌hpro-KR-mTG发酵上清SDS-PAGE图
图6：活性表达mTG重组菌hpro-KR-E300W发酵上清SDS-PAGE图
具体实施方式
培养基：
LB培养基：Yeast Extract 5g/L，Tryptone 10g/L，NaCl 10g/L。
YPD培养基：Yeast Extract 10g/L，Tryptone 20g/L，葡萄糖20g/L。
YNB培养基：YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L。
固体培养基则是在液体培养基中加2％的琼脂。
发酵培养基：甘油15g/L，酵母粉20g/L，氯化铵2.64g/L，磷酸二氢钾0.32g/L，无水硫酸镁0.25g/L，维生素B13.34×10-4g/L，调节pH至8.0。
pro-MTG的体外活化：
取40μL发酵上清，加入2μL中性蛋白酶dispase(0.1mg/mL)，用旋涡振荡仪混匀，37℃保温20min。
谷氨酰胺转氨酶酶活力的测定：
采用比色法测定谷氨酰胺转氨酶酶活。1个单位的酶活定义为：在37℃的条件下,每分钟催化α-N-CBZ-GLN-GLY合成1μmol的L-谷氨酸-γ-单轻胺酸所用的酶量(U/mL)。酶活测定条件：在37℃条件下，40μL发酵上清液，100μL 30mMα-N-CBZ-GLN-GLY反应10min，加入40μL终止剂(3M HCl，12％三氯乙酸，5％FeCl3)终止反应。在525nm处测定吸光值，通过L-谷氨酸-γ-单轻胺酸绘制标准曲线，根据标准曲线计算酶活。
酶纯化方法：
发酵液于5000rpm，4℃条件下离心20min，收集上清液。上清液转移至透析袋中，于pH5.0的0.05mol/L醋酸盐缓冲液中低温(4℃)透析12h，然后过0.22μm滤膜，并将样品收集至洁净的试管中。pH5.0的0.05mol/L醋酸盐缓冲液平衡强阳离子交换柱Fractogel EMDSO3 -，进样，之后继续用pH5.0的0.05mol/L醋酸盐缓冲液洗下与柱子结合不牢的杂蛋白，然后用含有0-1.0mol/L NaCl的醋酸盐缓冲液(pH5.0，0.05mol/L)洗脱，在出峰处收集目的蛋白mTG。
实施例1基因工程菌po1h/hpro-mTG的构建
以实验室保留的质粒pINA1297/N355Q为模板，P1和P2为引物进行PCR，通过PCR扩增含有hpro酶原区的1297表达载体。PCR扩增体系为：模板1μL，上下游引物各1μL，primeSTAR 25μL，双蒸水22μL。PCR条件为：98℃ 3min，98℃ 10s，60℃ 5s，72℃ 5min30s，72℃ 20min，30个循环。以实验室保留的质粒pET 20b/mpro-mTG为模板，P3和P4为引物进行PCR，通过PCR扩增含有mTG的基因片段。PCR扩增体系同上，PCR条件为：98℃ 3min，98℃10s，60℃ 5s，72℃ 1min 20s，72℃ 10min，30个循环。两种PCR产物经Dpn I消化后进行胶回收，回收产物以摩尔比为1:2进行混合，使用One Step Cloning Kit进行连接后，转化E.coli JM109，菌落PCR筛选阳性转化子。挑出2个阳性转化子接种到LB液体培养基中，37℃，培养12h,交由上海生工进行测序，测序正确即说明基因工程菌pINA1297/hpro-mTG构建成功。将重组质粒pINA1297/hpro-mTG经快切酶Not I线性化，胶回收后转化解脂耶氏酵母po1h，经营养缺陷型培养基YNB筛选后，获得基因工程菌po1h/hpro-mTG。
表1引物
实施例2突变位点的确定
运用Discovery Studio2017软件进行虚拟氨基酸突变，确定活性位点中的关键氨基酸，并根据预测结果对影响酶与底物亲和力的位点进行针对性突变，即Y24W、R89W、E300W、Y302R。
实施例3定点突变表达菌株的构建
(1)将茂源链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶基因和吸水链霉菌来源的酶原区hpro基因融使用One Step Cloning Kit进行连接后，构建质粒pINA1297/hpro-mTG。
(2)以实验室保留的质粒pET 20b/mpro-mTG为模板，P5和P4，P6和P4，P3和P7，P3和P8为引物进行PCR，通过PCR扩增得到含有Y24W、R89W、E300W、Y302R的突变基因片段。PCR扩增体系为：模板1μL，上下游引物各1μL，primeSTAR 25μL，双蒸水22μL。PCR条件为：98℃3min，98℃ 10s，60℃ 5s，72℃ 1min，72℃ 10min，30个循环。两种PCR产物经Dpn I消化后，分别进行胶回收。以质粒pINA297/hpro-MTG为模板，以回收产物为大引物，分别进行大引物PCR获得定点突变的表达载体片段。PCR体系为同上，PCR条件为：98℃ 3min，98℃ 10s，55℃15s，72℃ 6min 20s，72℃ 20min，30个循环。PCR产物经Dpn I消化后进行胶回收，转化E.coli JM109，菌落PCR筛选阳性转化子。分别挑出2个阳性转化子接种到LB液体培养基中，37℃，培养12h，交由上海生工进行测序，测序正确即说明基因工程菌pINA1297/Y24W、pINA1297/hpro-R89W，pINA1297/hpro-E300W、pINA1297/Y302R构建成功。将重组质粒pINA1297/Y24W、pINA1297/hpro-R89W，pINA1297/hpro-E300W、pINA1297/Y302R分别经快切酶Not I线性化，胶回收后转化解脂耶氏酵母po1h，经营养缺陷型培养基YNB筛选后，获得基因工程菌po1h/hpro-Y24W、po1h/hpro-R89W，po1h/hpro-E300W、po1h/hpro-Y302R。
实施例4基因工程菌hpro-mTG，hpro-Y24W，hpro-R89W，hpro-E300W，hpro-Y302R摇瓶发酵
将实施例3中中构建的基因工程菌hpro-mTG，hpro-Y24W，hpro-R89W，hpro-E300W，hpro-Y302R与实施例1构建的出发菌株hpro-mTG分别接种于YPD液体培养基中，28℃，200rpm培养24h，次日按10％的接种量转接于解脂耶氏酵母发酵培养基中，28℃，200rpm摇瓶(规格：250mL)培养120h。发酵液于4℃，4000rpm离心10min，上清液即为胞外粗酶液，经dispase活化后，测酶活。经检测酶活分别为0.916U/mL，9.87U/mL，16.995U/mL和0.635U/mL，hpro-mTG酶活为11.7U/mL(图1)。SDS-PAGE图可以看出各转化子表达量有着明显的差别(图2)。
实施例5***Kex2蛋白酶识别位点的表达载体的构建
以构建的pINA297/hpro-mTG和pINA297/hpro-E300W为模板，P9和P4为引物进行PCR，分别通过PCR扩增含有已加入Kex2蛋白酶识别位点的mTG或E300W的基因片段。PCR扩增体系同实施例1，PCR条件为：98℃ 3min，98℃ 10s，60℃ 5s，72℃ 1min 20s，72℃ 10min，30个循环。PCR产物经Dpn I消化后进行胶回收，以回收产物作为大引物，以质粒pINA297/hpro-mTG或pINA297/hpro-E300W为模板进行大引物PCR，获得突变基因片段。PCR条件为：98℃ 3min，98℃ 10s，55℃ 15s，72℃ 6min 20s，72℃ 20min，30个循环。PCR产物经Dpn I消化后进行胶回收，转化E.coli JM109，菌落PCR筛选阳性转化子。分别挑出2个阳性转化子接种到LB液体培养基中，37℃，培养12h，交由上海生工进行测序，测序正确即说明基因工程菌pINA1297/hpro-KR-mTG、pINA1297/hpro-KR-E300W构建成功。将构建成功的重组质粒经快切酶Not I线性化，胶回收后转化解脂耶氏酵母po1h，经营养缺陷型培养基YNB筛选后，获得基因工程菌polh/hpro-KR-mTG和po1h/H-KR-E300W。
实施例6基因工程菌polh/hpro-KR-mTG和po1h/hpro-KR-E300W摇瓶发酵
将实施例1和2中构建的基因工程菌polh/hpro-KR-mTG，po1h/hpro-KR-E300W接种于YPD液体培养基中，28℃，200rpm培养24h，次日按10％的接种量转接于解脂耶氏酵母发酵培养基中，28℃，200rpm摇瓶(规格：250mL)培养120h。发酵液于4℃，4000rpm离心10min，上清液即为胞外粗酶液，检测发现胞外酶活最高分别达到了5.265U/mL，7.107U/mL(图3，图4)。SDS-PAGE的结果进一步论证了共表达TAMEP与hpro-mTG，以及在酶原和成熟酶之间***Kex2识别位点均能实现谷氨酰胺转氨酶在解脂耶氏酵母中的高效活性表达(图5，图6)。
实施例7基因工程菌polh/hpro-KR-mTG和po1h/hpro-KR-E300W发酵罐发酵
重组菌polh/hpro-KR-mTG和po1h/hpro-KR-E300W分别接种于YPD液体培养基中，28℃，200rpm培养24h，种子液以10％的接种量接种至发酵罐中，控制温度28℃，搅拌转速为600rpm，通气量为2vvm。当溶氧开始反弹且>60％时，开始流加50％(W/V)甘油120mL，调节转速使溶氧<30％，发酵120h。发酵液于4℃，4000rpm离心10min，上清液即为胞外粗酶液，经dispase活化后，测酶活。经检测酶活最高分别可达17.1/mL和22.9U/mL。
实施例8酶学性质
对纯化谷氨酰胺转氨酶进行酶学性质方面的研究，具体见表2。可以看出，hpro-E300W和hpro-R89W的比酶活较出发菌株分别提高了1.31倍和1.17倍，hpro-Y24W和hpro-Y302R的比酶活较出发菌株有所下降。所有突变体的Km值均具有不同程度的上升，说明突变会不同程度的影响酶与底物的亲和力。hpro-E300W的Kcat/Km值有较大的提高，说明该突变基因工程菌使得酶的催化效率提高，hpro-R89W，hpro-Y24W和hpro-Y302R的Kcat/Km值变小，酶的催化效率降低。活性表达重组菌hpro-KR-mTG，hpro-KR-E300W的Km值、Kcat/Km与对应的出发菌株hpro-mTG，hpro-E300W相比变化不大。
表2酶学性质
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种以活性形式表达的谷氨酰胺转氨酶突变体
<160> 15
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 388
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Ala Ser Gly Asp Asp Glu Glu Arg Glu Gly Ser Tyr Ala Glu Thr His
1 5 10 15
Gly Leu Thr Ala Glu Asp Val Lys Asn Ile Asn Ala Leu Asn Lys Arg
20 25 30
Ala Leu Thr Ala Gly Gln Pro Gly Asn Ser Leu Thr Glu Leu Pro Pro
35 40 45
Ser Val Ser Ala Leu Phe Arg Ala Pro Asp Ser Asp Asp Arg Val Thr
50 55 60
Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser
65 70 75 80
Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln
85 90 95
Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu
100 105 110
Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys Val Gly Val Thr Trp Val Asn
115 120 125
Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu
130 135 140
Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu
145 150 155 160
Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu
165 170 175
Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu Val Ala Ser Val Met Asn Arg
180 185 190
Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys
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Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu
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<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<400> 15
cgccgagcgt cagtgcgctc ttccgggccc ccaagcgaga ctccgacgac agggtcacc 59

Claims (10)

1.一种酶活提高的谷氨酰胺转氨酶突变体，所述突变体如(a)、(b)、(c)或(d)所示：
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的突变体；
(b)将(a)第300位的谷氨酸突变成色氨酸，得到氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的突变体；
(c)在(a)或(b)的第57位和第58之间***Kex2蛋白酶识别位点，得到氨基酸序列如SEQID NO.3或SEQ ID NO.4所示，所述Kex2蛋白酶识别位点的氨基酸序列为Lys-Arg；
(d)在(a)、(b)或(c)氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有谷氨酰胺转氨酶活性的由(a)、(b)或(c)衍生的突变体。
2.编码权利要求1所述突变体的核苷酸序列。
3.表达权利要求1所述突变体的基因工程菌。
4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以解脂耶氏酵母po1h为宿主。
5.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为表达突变体(a)的基因工程菌，其构建方法如下：
(1)将茂源链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶基因和吸水链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶酶原区hpro基因融合后与载体连接，构建质粒pINA1297/hpro-mTG，所述茂源链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5，所述吸水链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶酶原区hpro的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
(2)重组质粒pINA1297/hpro-mTG线性化后，转化到解脂耶氏酵母po1h，经营养缺陷型培养基YNB筛选后，获得基因工程菌po1h/hpro-mTG。
6.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为表达突变体(b)的基因工程菌，其构建方法如下：
(1)用编码突变体(a)的基因作为大引物，以质粒pINA1297/hpro-mTG为模板，扩增全质粒，构建质粒pINA1297/hpro-E300W。
(2)重组质粒pINA1297/hpro-E300W线性化后，转化到解脂耶氏酵母po1h，经营养缺陷型培养基YNB筛选后，获得基因工程菌po1h/hpro-E300W。
7.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为表达突变体(c)的基因工程菌，其构建方法如下：
(1)将编码突变体(a)或(b)的基因连接到表达载体pINA1297构建质粒pINA1297/hpro-mTG或INA1297/hpro-E300W；
(2)以质粒pINA297/hpro-mTG或pINA1297/hpro-E300W为模板，扩增在突变体(a)或(b)的第57位和第58为之间***Kex2蛋白酶识别位点的基因序列，构建质粒pINA1297/hpro-KR-mTG或pINA1297/hpro-KR-E300W，质粒线性化后分别转化到解脂耶氏酵母po1h，得到高效表达活性谷氨酰胺转氨酶的基因工程菌po1h/hpro-KR-mTG或po1h/hpro-KR-E300W。
8.应用权利要求3-7任一所述基因工程菌发酵生产谷氨酰胺转氨酶突变体的方法，其特征在于，所述方法为：
摇瓶发酵：将基因工程菌接种于YPD液体培养基中，25-30℃，180-230rpm培养20-27h后，按8-12％的接种量转接于解脂耶氏酵母发酵培养基中，25-30℃，180-230rpm摇瓶培养4-6d。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法具体步骤为：
发酵罐发酵：将基因工程菌接种于YPD液体培养基中，28℃，200rpm培养24h后，种子液以10％的接种量接种至发酵罐中，控制温度28℃，搅拌转速为600rpm，通气量为2vvm，当溶氧开始反弹且>60％时，开始流加50％(W/V)甘油120mL，调节转速使溶氧<30％，发酵120h。
10.根据权利要求8或9所述方法得到的谷氨酰胺转氨酶。
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