CN113151270A

CN113151270A - 一种高效表达碱性蛋白酶的启动子及其应用

Info

Publication number: CN113151270A
Application number: CN202110363144.3A
Authority: CN
Inventors: 毛淑红; 王珊; 路福平; 张会图; 李玉
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2021-04-02
Filing date: 2021-04-02
Publication date: 2021-07-23

Abstract

本发明为提高碱性蛋白酶的活性提供了一种新的启动子P64，该启动子来源于解淀粉芽孢杆菌，通过对基因组转录组数据分析和酶活检测方法获得。在新型启动子P64的调控下，碱性蛋白酶基因在重组工程菌株解淀粉芽孢杆菌P64‑pLF/11018中得到了高效表达，酶活达到12751U/mL，是野生型解淀粉芽孢杆菌(938U/mL)的13.6倍，极具工业应用潜力。本发明除了应用于工业生产外，还为解淀粉芽孢杆菌中外源基因高效表达研究奠定了基础，对促进其基因技术和微生物代谢工程的进一步发展具有重要意义。

Description

一种高效表达碱性蛋白酶的启动子及其应用

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效表达碱性蛋白酶基因的启动子及其应用。

背景技术：

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)是一种与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的细菌,可抑制多种植物病原菌的生长。在其自身的生长过程中可以产生一系列的代谢产物，这些代谢产物使得解淀粉芽孢杆菌能够具有广泛地抑制真菌和细菌的活性。同时具有促进植物生长的功能，还可通过诱导植株增强自身免疫***以提高抗病能力。有研究表明，解淀粉芽孢杆菌具有较强的蛋白分泌能力，在异源基因表达宿主方面有突出表现。

作为工业酶制剂的蛋白酶能催化蛋白质和多肽水解，在干酪生产、肉类嫩化和植物蛋白改性中均具重要的应用价值。微生物来源的蛋白酶，相对于动植物来源蛋白酶，具有下游技术处理相对简单、价格低廉、菌体易于培养、产量高的特性。近年来，国内外研究者对碱性蛋白酶基因工程做了大量的工作，取得了较大进展。Tang等利用芽孢杆菌穿梭表达载体构建了碱性蛋白酶基因重组表达质粒，在枯草芽孢杆菌中进行了高表达研究。何少明等从短小芽孢杆菌中克隆得到蛋白酶基因，分别在大肠杆菌和短小芽孢杆菌中进行表达，酶活提高了两倍。解淀粉芽孢杆菌是一种重要工业微生物，是多种工业酶(蛋白酶、α-淀粉酶、β-葡聚糖酶)的生产宿主，因此对解淀粉芽孢杆菌碱性蛋自酶的研究成为热点。王慧等以解淀粉芽孢杆菌为宿主，通过对表达元件进行优化，使碱性蛋白酶活性提高了25％。

启动子是细菌中基因表达的必需调控元件，决定了基因表达的强度和时机。通过启动子的***或缺失，可以改变基因的表达，实现对菌体生长发育以及代谢调控的研究。启动子也是构建各种表达***、实现异源基因表达的基础。目前对于利用来源于解淀粉芽孢杆菌的启动子实现蛋白酶高效表达的研究并不多，就现有的启动子而言，可以完美用于工业菌株构建的启动子数量极为有限，启动能力和调控方式存在着诸多问题。因此获得更多转录强度高的启动子至关重要，对于研究解淀粉芽孢杆菌基因组的功能意义重大。

发明内容：

基于上述原因，本发明的目的在于提供一种高效表达碱性蛋白酶基因的启动子，以及关于该启动子的应用。

本发明技术方案如下：

一种高效表达碱性蛋白酶基因的启动子P64，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

同时，本发明也提供含有所述启动子P64的重组载体。

相应地，本发明还提供含有上述重组载体的宿主细胞。

此外，本发明还提供所述启动子P64在碱性蛋白酶基因表达中的应用。

另外，本发明提供可扩增所述启动子P64的引物P64-F和P64-R，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。

优选地，所述含有启动子P64的重组载体为P64-pLF-AprE，通过如下方法构建：1)以大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭载体为模板，反向PCR扩增获得线性载体片段；2)将线性载体片段与所述启动子P64连接，连接后的产物转化至宿主细胞中培养并筛选阳性克隆；3)收集筛选出的阳性转化子，提取质粒进行测序，测序正确的即为P64-pLF-AprE。其中，上述步骤1)中用于反向PCR扩增的引物为pLF-F和pLF-R，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。

优选地，本发明提供含有P64-pLF-AprE的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌或解淀粉芽孢杆菌。

本发明由解淀粉芽抱杆菌基因组中筛选获得一种新型强启动子P64，可在解淀粉芽抱杆菌中高效表达碱性蛋白酶基因，其表达后的相应酶活为野生型的13.6倍，在工业酶制剂领域具有良好的应用潜力。此外，本发明还构建了包含启动子P64的重组载体和工程菌株。本发明除了应用于工业生产，还可为解淀粉芽孢杆菌中外源基因的高效表达研究提供有力工具。

附图说明：

图1启动子片段的电泳结果；其中，泳道M为核酸分子量标准，泳道1、2中240bp处的条带为启动子扩增片段。

图2线性载体片段的电泳结果；其中，泳道M为核酸分子量标准，泳道1-4中6.9kb处的条带为线性载体的扩增片段。

图3重组载体的酶切验证结果；其中，泳道M为核酸分子量标准，泳道1-4中1.2kb和5.9kb处的条带为酶切产物条带。

图4重组载体构建的总流程图。

图5解淀粉芽孢杆重组菌阳性转化子的酶切验证结果；其中，泳道M为核酸分子量标准；泳道1、2中1.2kb和5.9kb处的条带为酶切产物条带。

图6野生型解淀粉芽孢杆菌和构建的工程菌P64-pLF/11018、PA-pLF/11018的酶活测定结果。

具体实施方式：

下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。除非特别说明，本发明所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。

所用到的菌株：大肠杆菌JM109、大肠杆菌EC135、解淀粉芽孢杆菌11018(天津科技大学微生物菌种保藏中心)。

所用的酶及试剂：限制性内切酶SacI、KpnI、质粒提取试剂盒及GoldstarDNA聚合酶购自Takara公司，连接酶BiscMIX购自全式金公司。三氯乙酸、福林酚、甘油均购自天津百奥泰公司。

所用的培养基：

LB培养基(g/L)：蛋白胨10，NaCl 10，酵母粉5。

发酵培养基(g/L)：玉米粉64，豆饼粉40，高温淀粉酶0.7，磷酸二氢钾0.4，磷酸氢二钠4。

实施例1、启动子筛选

对解淀粉芽孢杆菌进行转录组测序(测序由苏州金唯智生物科技有限公司完成)，获得转录组测序数据；通过转录组数据中基因表达量的TPM值衡量表达水平，将TPM值进行排序，选出包括P64在内的每个时期基因转录水平较高的启动子序列。

实施例2、解淀粉芽孢杆菌基因组提取

(1)收集过夜培养于培养基中的菌液，4000r/min离心10min，弃上清，加入100μlTEBuffer后振荡重悬；

(2)加15μL(50mg/mL)溶菌酶，37℃水浴10min；

(3)加20μL蛋白酶K和60μL 10％SDS，水浴2-3h至澄清；

(4)加等体积的酚仿，振荡混匀，12000r/min离心5min，取上清；

(5)加入60％-80％的异丙醇，上下颠倒混匀，-70℃放置5min，12000r/min离心5min，弃上清；

(6)加入500μL乙醇洗两次，12000rmp离心5min，弃上清，晾干5-10min；

(7)加50μL无菌水溶解获得的基因组。

实施例3、启动子及载体片段的克隆

根据启动子P64的序列设计并合成其上、下游引物P64-F/P64-R(引物合成由苏州金唯智生物科技有限公司完成)。引物P64-F和P64-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。

以解淀粉芽孢杆菌基因组为模板，以P64-F/P64-R为引物进行PCR扩增反应。PCR反应体系如表1所示，反应程序如表2所示。反应结束后获得长约240bp的片段，产物切胶回收后通过琼脂糖凝胶电泳验证，电泳结果如图1所示。

表1启动子的PCR扩增反应体系

*GoldStar：试剂盒中由DNA聚合酶、PCR Buffer、Mg²⁺、dNTPs等组成的预混体系

表2启动子的PCR扩增反应程序

以大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭载体(PA-pLF-AprE，包含大肠杆菌和芽孢杆菌复制子、氯霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因以及碱性蛋白酶基因AprE)为模板，利用SnapGene软件设计并合成引物pLF-F/pLF-R。pLF-F和pLF-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:5所示。利用引物pLF-F/pLF-R进行反向PCR，反应体系如表3所示，反应程序如表4所示。扩增结束后获得长约6.9kbp的线性载体片段pLF-AprE，产物切胶回收后通过琼脂糖凝胶电泳验证，电泳结果如图2所示。

表3线性载体的PCR扩增反应体系

*PrimerStar：试剂盒中已配制好的预混体系，包括聚合酶、缓冲液、Mg²⁺、dNTPs等组分

表4线性载体的PCR扩增反应程序

实施例4、重组载体的构建

线性载体pLF-AprE的PCR产物经切胶回收后，与纯化回收的启动子P64进行连接，连接产物化转至大肠杆菌JM109中。化转过程如下：(1)将适量连接产物加入上述感受态中，轻轻混匀，冰上放置30min；(2)将其放到42℃水浴90s，冰浴2min后加入复苏液，37℃、220r/min振荡培养40min；(3)4000r/min离心5min，取适量体积的菌液涂布于氯霉素抗性平板上，37℃过夜培养。

挑取阳性转化子转接至液体LB培养基中培养一段时间后，提取质粒进行酶切验证分析。酶切后的琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示：经KpnI/SmaI酶切后，得到5900bp和1200bp左右的片段。酶切验证正确后将启动子序列送测序机构(苏州金唯智生物科技有限公司)进行测序。测序正确的质粒即为构建成功的重组载体P64-pLF-AprE。图4为本发明重组载体构建的总体流程图。

实施例5、工程菌株的构建

1、将构建成功的载体化转至大肠杆菌进行甲基化修饰。具体过程如下：(1)将适量重组载体P64-pLF-AprE加入大肠杆菌EC135感受态中，轻轻混匀，冰上放置30min；42℃水浴90s后再冰浴2min；(2)冰浴后加入复苏液，37℃、220r/min振荡培养一段时间；(3)4000r/min离心5min，取适量体积的菌液涂布于抗性平板上，37℃过夜培养；(4)12h后挑取转化子单菌落于5mL LB试管中培养至菌体OD达到0.2时加入***糖诱导剂；(5)继续培养过夜后提取质粒。

2、将提取的重组质粒电转至解淀粉芽孢杆菌。具体过程如下：(1)取重组质粒5μL加入80μL解淀粉芽孢杆菌11018感受态细胞悬液中，混合后转入电转杯；(2)静置2min后2500V电击，电击后立即加入复苏液，混匀后置于37℃摇床复苏3h；(3)将菌悬液涂布于Kan抗性LB平板上，37℃培养一段时间后筛选阳性转化子；(4)挑取阳性转化子接种于LB液体培养基，37℃，220r/min过夜培养。对转化子进行重组质粒酶切鉴定，酶切后的琼脂糖凝胶电泳结果如图5所示：经KpnI/SmaI酶切后，得到5900bp和1200bp左右的片段，表明解淀粉芽孢杆菌P64-pLF/11018工程菌株构建成功。

采用与上述相同的工程菌株构建方法，构建包含大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭载体(PA-pLF-AprE)的工程菌解淀粉芽孢杆菌PA-pLF/11018。

实施例6、工程菌株的表达及分析

对启动子在解淀粉芽孢杆菌中表达碱性蛋白酶的活性进行评估比较。

选取已构建完成的工程菌P64-pLF/11018和PA-pLF/11018，以及野生型解淀粉芽孢杆菌11018进行发酵培养，具体操作如下：分别将上述3种菌接种于LB液体培养基中，37℃，220r/min，振荡培养12h，之后以2％的接种量分别转接至含100mL发酵培养基的三角瓶中，37℃，220r/min，振荡培养48h；取发酵液，12000r/min离心3min后取上清进行酶活性测定。

酶活测定方法参照GB/T23527-2009附录B福林酚法进行。1个酶活力单位(U/mL)定义为1mL酶液在40℃、pH为10.5条件下反应1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需要的酶量。

三种菌的酶活测定结果如表5及图6所示。从图和表中可以看出，工程菌P64-PLF/11018中启动子P64表达的碱性蛋白酶酶活是野生型的13.6倍，并且也明显高于枯草芽孢杆菌PA启动子表达的蛋白酶酶活。

表5三种菌的碱性蛋白酶酶活测定结果

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种高效表达碱性蛋白酶的启动子及其应用

<130> 20210329

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tttcattctc tatcaatccc ctctcttgag tcatgcggta ttgctgaaca tatcatagtt 60

caaataatct ccattttcaa gataaatagg aaaaaagttt taatttacac cctgacacat 120

tacttttatg gaatttattc caaaaccttt tataatatga attgatagcg ctatctgact 180

atgatgatag gaggagaaat g 201

<210> 2

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgatcatcc gcgggagctc catttctcct cctatcatca tagtc 45

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgttttgcaa acatggtacc tttcattctc tatcaatccc ctctc 45

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cggatgtttg caaaacgatt caaaacctc 29

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gggtgatcac atcaagcagc gcaaat 26

Claims

1.一种碱性蛋白酶基因的启动子P64，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.含有权利要求1所述的启动子P64的重组载体。

3.含有权利要求2所述的重组载体的宿主细胞。

4.如权利要求1所述的启动子P64在碱性蛋白酶基因表达中的应用。

5.扩增权利要求1所述的启动子P64的引物P64-F和P64-R，其特征在于：所述引物P64-F和P64-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。

6.根据权利要求2所述重组载体，其特征在于：所述重组载体为P64-pLF-AprE，通过如下方法构建：1)以大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭载体为模板，反向PCR扩增获得线性载体片段；2)将线性载体片段与所述启动子P64连接，连接后的产物转化至宿主细胞中培养并筛选阳性克隆；3)收集筛选出的阳性转化子，提取质粒进行测序，测序正确的即为P64-pLF-AprE；

其中，所述步骤1)中用于反向PCR扩增的引物为pLF-F和pLF-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。

7.含有权利要求6所述的重组载体的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为大肠杆菌或解淀粉芽孢杆菌。