CN109641942A

CN109641942A - 绿藻碳酸氢盐转运蛋白及其用途

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Publication number: CN109641942A
Application number: CN201780051141.8A
Authority: CN
Inventors: 詹姆斯·V·莫罗尼; 玛丽露·C·梅钦古拉; 乔安娜·N·巴萨-希舍尔
Original assignee: Luis Anna State University Monitoring Committee College Of Agriculture And Mechanical Engineering
Current assignee: Luis Anna State University Monitoring Committee College Of Agriculture And Mechanical Engineering
Priority date: 2016-06-20
Filing date: 2017-06-20
Publication date: 2019-04-16
Also published as: JP2019518461A; US11667681B2; WO2017223055A1; JP7075900B2; KR20190026763A; BR112018076649A2; ZA201900118B; DK3472187T3; EP3472187B1; AU2017281605B2; KR102567405B1; EP3472187A1; AU2017281605A1; US20190177741A1; EP3472187A4; US10982226B2; US20210189415A1

Abstract

本文提供了绿藻Cia8多肽和编码它们的多核苷酸。本文还提供了包含一个或更多个本文提供的多核苷酸和/或多肽的转化的细胞和转基因植物。

Description

绿藻碳酸氢盐转运蛋白及其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求于2016年6月20日提交的标题为“A GREEN ALGA BICARBONATETRANSPORTER AND USES THEREOF”的共同待决的美国临时专利申请第62/352,278号的权益和优先权，其内容通过引用以其整体并入本文。

序列表

本申请包含以电子形式提交的序列表，该序列表作为名为222220-2080_ST25.txt的ASCⅡ.txt文件，于2016年6月16日创建。序列表的内容以其整体并入本文。

背景

绿藻类及其他光合水生生物体在自然环境中通常暴露于低的和波动的CO₂条件。除其他因素外，这些生物体的CO₂可用性可以受以下限制：气体在水中的缓慢扩散、两种无机碳形式(CO₂和HCO₃ ^-)的缓慢相互转化以及pH改变。因此，几乎所有水生光合生物体都进化出在限制CO₂条件下可诱导的二氧化碳浓缩机制(CCM)，以有效地浓缩无机碳(Ci)，用于通过核酮糖二磷酸羧化酶(Rubisco)固定(Giordano等,2005)。在当前用于绿藻，莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的CCM模型中(Jungnick等,2014；Wang和Spalding,2014)，认为质膜和叶绿体被膜上的碳酸氢盐转运蛋白是CCM的关键组分，允许Ci，特别是HCO₃ ^-通过膜的运动。其他CCM组分包括碳酸酐酶，所述碳酸酐酶使CO₂和HCO₃ ^-相互转化(Mitra等,2005；Moroney等,2011)。在莱茵衣藻(C.reinhardtii)中，称为淀粉核的区室位于叶绿体的底部。淀粉核是核酮糖二磷酸羧化酶在限制CO₂条件下被隔离的地方(Kuchitsu等,1988；Rawat等,1996；Borkhsenious等,1998)。类囊体管和小管(mini-tubule)的广泛网络与淀粉核缔合(Engel等,2015)，推测是提供HCO₃ ^-进入淀粉核的途径。在这些管中发现碳酸酐酶CAH3，并且假设CAH3将腔内的HCO₃ ^-转化为CO₂以用于固定(Moroney和Ynalvez,2007)。

在高CO₂条件(5％v/v)下生长的莱茵衣藻细胞表现出对Ci的低亲和力。已经报道了当适应高CO₂的细胞被暴露于低CO₂条件(0.03％v/v)时，诱导高亲和力转运蛋白。虽然CO₂将容易地在细胞中跨越膜扩散(Gutknecht等,1977)，但许多研究已经自此确定需要一种主动运输***来促进Ci(特别是HCO₃ ^-)向低CO₂细胞中核酮糖二磷酸羧化酶的固定点的运动。(Moroney等,1987；Sültemeyer等,1988；Badger等,1994；Ohnishi等,2010)。另外，分子和生理学研究也确认了细胞的质膜和叶绿体被膜上多种形式的Ci转运蛋白的存在(Amoroso等,1998；Duanmu等,2009；Atkinson等,2015；Gao等,2015；Yamano等,2015)。在海洋蓝藻(cyanobacteria)中，质膜处的HCO₃ ^-转运通常与外部的高Na⁺离子浓度偶联。在发现衣藻属(Chlamydomonas)的淡水环境中，转运被认为是H⁺偶联的，因为Na⁺相对较低((Morth等,2011；Taylor等,2012)。因此，用莱茵衣藻和团藻(Volvox carteri)进行的基因组研究显示，存在至少用于硫酸盐和磷酸盐的H⁺-偶联的和Na⁺-偶联的转运蛋白两者(Pootakham等,2010)。目前尚不清楚这些分子组分是否也出现于碳酸氢盐摄取中。

迄今为止，莱茵衣藻中的两种高亲和力及一种低亲和力碳酸氢盐转运蛋白被表征并且已知在低CO₂条件下具有功能。第一种，高光活化蛋白(high light activatedprotein)(HLA3)是定位于质膜的多药耐受性蛋白家族的ATP结合盒(ABC)型转运蛋白(Im和Grossman,2002)。Hla3转录物由高光和低CO₂条件两者诱导，并且被由Cia5基因编码的CCM1'主调节物(regulator)'控制。Duanmu等(2009)表明，在HLA3RNAi敲低突变体中Ci亲和力和Ci摄取显著降低，这支持蛋白在HCO₃ ^-转运中的作用。第二种，转运蛋白LCI1，是一种相对较小的蛋白，与数据库中的其他跨膜蛋白几乎没有同源性。LCI1在低CO₂条件下被强烈上调，并且已被定位于质膜(Ohnishi等,2010)。在使用LCI1的研究中，作者还确认了在Lcr1(缺乏MYB转录因子的衣藻属菌株)背景中通过过表达LCI1蛋白的Ci摄取增加。因此，HLA3和LCI1被认为是位于质膜上的Ci转运蛋白。

第三种转运蛋白，NAR1.2(也称为LCIA)，是甲酸盐/亚硝酸盐转运蛋白家族的叶绿体被膜蛋白。尽管NAR1.2蛋白对碳酸氢盐具有较低的亲和力(如以落在mM范围内的K_(0.5)值所示)，但在非洲爪蟾(Xenopus laevis)***中观察到当NAR1.2在那些细胞中表达时，HCO₃ ^-摄取增加((Mariscal等,2006；Atkinson等,2015)。到目前为止，NAR1.2已归因于叶绿体被膜上的Ci摄取，尽管尚不存在直接证据支持这一点。虽然NAR1.2蛋白在Ci摄取中起重要作用，但它可能也具有调节功能。这是由最近的一项研究得出的，在该研究中Hla3转录物在NAR1.2蛋白不存在下不积累，因此作者认为这些蛋白在碳酸氢盐积累中协作(Yamano等,2015)。在另一种提出的进入叶绿体的碳酸氢盐途径中，NAR1.2似乎也与可溶性蛋白LCIB缔合(Wang和Spalding,2014)。

两种可溶性蛋白(LCIB/LCIC)形成复合物，并且在观察到当细胞适应低CO₂时该两种可溶性蛋白将与淀粉核紧密缔合之后，认为该两种可溶性蛋白参与从淀粉核中泄漏的CO₂的重新捕获(Yamano等,2010；Wang等,2011)。其他推定的现在被确认为是线粒体的(Atkinson等,2015)转运蛋白CCP1和CCP2，尚未得到解析(resolved)。鉴于这一切，明显的是，衣藻属中的Ci转运***仍有待阐明，以便更好地了解CCM。

附图简述

在结合附图阅读下文描述的本公开内容的多种实施方案的详细描述时，将容易地理解本公开内容的另外的方面。

图.1A-1C示出了显示来自莱茵衣藻菌株在pH 7.3的高CO₂(空气中5％CO₂)(图1A)和低CO₂中(空气中0.01％CO₂)(图1B)中生长的斑点试验(spottest)的结果的图像。菌株包括野生型D66、Cia8突变体和用作对照的三种已知的CCM突变体Cia6、Cia5和Cia3。左侧的数字代表初始OD₇₃₀为0.15(～1.5×10⁶个细胞)和两个连续稀释。图1C示出了显示野生型菌株D66和cia8突变体在液体培养物(MIN)中生长的图。培养物在吹入低CO₂(0.01％-0.025％)的锥形瓶(Erlenmeyer flasks)中生长。值表示为平均值±SE(n＝4)。

图.2A-2B示出了Cia8基因的基因座(ID：Cre09.g395700)的基因组结构，显示了AphVIII***的位置(图2A)。绿色条、空格(spaces)和橙色条分别代表外显子、内含子和非翻译区。图2B示出了代表性凝胶的图像，显示了cia8基因的外显子10中AphVIII***的确认。第一泳道D66是不具有盒的对照基因组DNA，并且另外3个是cia8基因组DNA。泳道2代表***物的3'末端，并且泳道3代表***物的5'末端。泳道4跨越整个***区域(包括位于盒侧翼的基因组区域)，使用基因中引物对。

图3示出了D66和Cia8突变体菌株的RT-PCR分析，使用来自高和低CO₂生长的细胞的多聚(A)RNA作为模板用于逆转录酶PCR。对于Cia8，表2中所示的引物从cDNA扩增1500bp的产物。β-肌动蛋白被用作上样对照。

图4示出了基于与弗氏耶尔森菌(Yersinia frederiksenii)SLC4比对的CIA8的拓扑模型预测。灰色框是推定的通过可变长度的环连接的跨膜螺旋。以>90％的置信水平对62％的残基建模。预测由PHYRE2产生(Kelley等，2015)。

图5A-5C示出了莱茵衣藻野生型和Cia8突变体中Ci-依赖性光合放氧(photosynthetic oxygen evolution)。A，高CO₂-生长的细胞和B，低CO₂-生长的细胞在pH7.3测定；C，低CO₂-生长的细胞在pH 9.0测定。使细胞在高CO₂生长并转移至低CO₂持续4小时。图5A和5B中的***物代表低于用于确定K_(0.5)的500μM的较低的浓度。图5C示出了显示来自在pH 9.0测定的低CO₂-生长的细胞的结果的图。使细胞在高CO₂生长并转移至低CO₂持续约4小时。每个点代表三次单独实验的平均值和标准误差。

图6A-6G示出了CIA8-GFP转化体细胞的活体成像，显示了嵌合蛋白的定位(图6A-6F)。上图是wt D66菌株，且下图是用CIA8:CrGFP转化的D66菌株。使细胞在MIN板上生长，并使用以下波长的光用共聚焦显微镜观察：微分干涉相差(Differential InterferenceContrast)-GFP：在410-470nm处发荧光；在600-700nm处的叶绿素自发荧光。条对应于4.69μm；图6G示出了用融合的CIA8:CrGFP蛋白转化的Cia8突变体菌株的RT-PCR分析的结果。使用来自低CO₂生长的细胞的多聚(A)RNA作为模板用于逆转录酶PCR来完成分析。表2中所示的引物从cDNA扩增GFP转录物(710bp)。

图7A-7C示出了显示在野生型(图7A)和cia8突变体(图7B)菌株中在高和低CO₂条件下Ci转运蛋白基因的定量RT-PCR结果的图。使野生型D66细胞在高CO₂生长48小时，然后经历低CO₂适应4小时。缺乏Cia8基因导致SBF家族中其他CCM转运蛋白和其他两个基因的下调(图7C)。cblp基因被用作为内部对照。相对表达水平表示为1000/2^ΔCt，其中ΔCt＝Ct_基因-Ct_cblp。

图8A-8D示出了一组图像，显示Cia8补充菌株com1和com2的生长表型(图8A)。如本文描述的，这些菌株具有重新引入Cia8突变体的野生型Cia8基因。图8B示出了显示RT-PCR分析的结果的图，显示了补充菌株中Cia8转录物的恢复。GAPDH用作上样对照。图8C示出了显示在pH 9.0野生型D66和一个补充系(complemented line)com1的氧气释放的图(图8C)。每个点代表三次单独实验的平均值和标准误差。图8D示出了图8C中所呈现的数据的碳酸氢盐浓度下端(0至500μM)的放大视图。

图9示出了CIA8初级蛋白序列与来自高等植物和其他绿藻纲植物(chlorophytes)的其他SBF转运蛋白的Clustal Omega比对。NCBI或Phytozome中的物种及其登录号码的列表：Monoraphidium neglectumXP_013904301.1；Monoraphidium neglectumXP_ 013896513.1；胶球藻(Coccomyxa subellipsoidea)C-169]XP_005649764.1；北美云杉(Picea sitchensis)ABR16540.1；Musa acuminata subsp.MalaccensisXP_009404829.1；莲(Nelumbo nucifera)XP_010271688.1；葡萄(Vitis vinifera)XP_002266805.1；橙子(Citrus sinensis)XP_006485208.1；高粱(Sorghum bicolor)XP_002440278.1；胡杨(Populus euphratica)XP_011032852.1；Volvox carteri f.nagariensis XP_ 002955170.1；团藻(Volvox carteri)，基因座名称Vocar.0008s0179；绿色鞭毛藻(Ostreococcus lucimarinus)，基因座名称gwEuk.2.273.1；

图10示出了具有和不具有100mM NaCl的MIN板上的衣藻属的野生型D66和CIA8突变体细胞的生长。在每个斑点接种15μL活跃生长的细胞培养物并使其生长7天。(OD₇₃₀＝0.15～1.5×10⁶个细胞)。当添加Na⁺时，在任一菌株中均未观察到生长的差异。

图11A-11B示出了显示在野生型(WT)D66、cia8突变体以及在补充细胞系com1中¹⁴C14C的积累的图。使细胞在提高的CO₂(3％v/v CO₂)下生长并适应低CO₂。在pH 9.0完成分析。被固定的CO₂(图11B)和池中剩余的CO₂(图11A)。通过Tukey’s HSD检验完成统计分析。不同的字母表示在P＝0.01时平均值有显著差异。

详细描述

在更详细地描述本公开内容之前，应当理解，本公开内容不局限于描述的特定实施方案，并且因此当然本身可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅为了描述特定实施方案的目的，并且不被意图是限制性的。

在提供值的范围的情况下，应当理解，除非上下文另外清楚地规定，该范围的上限和下限之间的每个中间值，至下限的单位的十分之一，和在该陈述的范围中的任何其他陈述的或中间的值被包括在本公开内容内。这些较小的范围的上限和下限可以独立地被包括于所述较小的范围，并且还被包括于本公开内容内，隶属于陈述的范围的任何特定的排除性限制。在陈述的范围包括上限和下限之一或两者的情况下，排除这些包括的限值中的任一个或两者的范围也被包括在本公开内容中。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。虽然在本公开内容的实践或测试中还可以使用与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。

在本说明书中引用的所有出版物及专利均通过引用并入本文，其程度如同每一单独出版物或专利被具体地和单独地指明通过引用并入本文，并且在本说明书中引用的所有出版物及专利均通过引用并入本文以公开和描述与被引用的出版物有关的方法和/或材料。对任何出版物的引用是为了其在提交日之前的公开内容，并且不应被理解为承认本公开内容由于之前的公开内容而无权先于此类出版物。此外，提供的出版物的日期可能不同于实际出版日期，实际出版日期可能需要独立地确认。

如本领域技术人员阅读本公开内容后将清楚的，本文描述并例证的单独实施方案中的每一个具有离散的组成部分和特征，其可以容易地与其他若干实施方案中的任一个的特征分开或组合而不偏离本公开内容的范围或精神。任何所提及的方法可以以事件提及的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序来进行。

除非另外指示，本公开内容的实施方案将采用分子生物学、微生物学、纳米技术、有机化学、生物化学、植物学等的技术，其在本领域的技术内。此类技术在文献中被充分地解释。

定义

在描述所公开的主题时，以下术语将根据下文陈述的定义被使用。

如本文使用的，当与数值变量结合使用时，“约(about)”、“大约(approximately)”等通常指变量的值以及变量的在实验误差内(例如，在平均值的95％置信区间内)或在指示值的+-10％内的所有值，以较大者为准。

如本文使用的，“核酸”和“多核苷酸”通常指至少两个碱基-糖-磷酸组合的串，并且除其他以外指单链DNA和双链DNA、为单链和双链区域的混合的DNA、单链RNA和双链RNA、以及为单链和双链区域的混合的RNA，包含可以是单链或更通常地是双链或单链和双链区域的混合的DNA和RNA的杂合分子。另外，如本文使用的多核苷酸指包含RNA或DNA或者RNA和DNA两者的三链区域。此类区域中的链可以来自相同的分子或来自不同的分子。该区域可以包括一个或更多个分子的所有，但更通常地仅涉及一些分子的一个区域。三螺旋区域的分子中的一个通常是寡核苷酸。“多核苷酸”和“核酸”还包括多核苷酸的此类化学、酶促或代谢修饰形式，以及病毒和细胞(除其他以外，包括简单细胞和复杂细胞)的特征性DNA和RNA的化学形式。例如，术语多核苷酸包括如以上描述的包含一个或更多个修饰的碱基的DNA或RNA。因此，包含不常见的碱基(诸如肌苷)或修饰的碱基(诸如三苯甲基化(tritylated)的碱基)(仅举两个实例)的DNA或RNA为如本文使用术语的多核苷酸。“多核苷酸”和“核酸”还包括PNA(肽核酸)、硫代磷酸酯和天然核酸的磷酸骨架的其他变体。天然核酸具有磷酸骨架，人工核酸可以包含其他类型的骨架，但包含相同的碱基。因此，具有为了稳定性或出于其他原因而修饰的骨架的DNA或RNA为如本文所期望术语的“核酸”或“多核苷酸”。

如本文使用的，“核糖核酸(RNA)”和“脱氧核糖核酸(DNA)”通常指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。RNA可以呈以下的形式：tRNA(转移RNA)、snRNA(核小RNA)、rRNA(核糖体RNA)、mRNA(信使RNA)、反义RNA、RNAi(RNA干扰构建体)、siRNA(短干扰RNA)、或核酶。

如本文使用的，“核酸序列”和“寡核苷酸”也包括以上定义的核酸和多核苷酸。

如本文使用的，“基因”指对应于在染色体上占据特定位置并且包含生物体中的特征或性状的遗传指令的DNA序列的遗传单位。。

如本文使用的，“基因座”指给定基因或其部分在给定物种的染色体上占据的位置。

如本文使用的，“等位基因”表示基因的一种或更多种可选形式中的任一种，其中等位基因涉及至少一种性状或特征。在二倍体细胞或生物体中，给定基因的两个等位基因占据一对同源染色体上对应的基因座。术语“杂合的(heterozygous)”指生物体或细胞在同源染色体上对应的基因座处具有不同的等位基因的遗传条件。

如本文使用的，“纯合的”指生物体或细胞在同源染色体上对应的基因座上具有相同的等位基因的遗传条件。

如本文使用的，术语“外源DNA”或“外源核酸序列”或“外源多核苷酸”指通过转染引入细胞、生物体、或细胞器的核酸序列。外源核酸源自外部来源，例如外源核酸可以来自于另一种细胞或生物体和/或它可以是合成的和/或重组的。虽然外源核酸有时源自不同的生物体或物种，它也可以源自相同物种(例如，除了天然存在的核酸或作为天然存在的核酸替代物的被引入细胞或生物体的核酸的额外拷贝或重组形式)。通常，引入的外源序列是重组序列。

如本文使用的，术语“重组体(recombinant)”通常指非天然存在的核酸、核酸构建体或多肽。此类非天然存在的核酸可以包括已经被修饰的天然核酸，例如具有缺失，取代、倒位、***等的天然核酸，和/或使用分子生物学技术连接的不同来源的核酸序列的组合(例如，编码“融合蛋白”(例如，由两种不同蛋白或蛋白片段的组合形成的蛋白或多肽)的核酸序列)，编码多肽的核酸与启动子序列的组合，其中编码序列和启动子序列来自不同来源或通常原本不天然地一起存在(例如，核酸和组成型启动子)等)。重组体还指由重组核酸编码的多肽。非天然存在的核酸或多肽包括由人修饰的核酸和多肽。

如本文使用的，术语“转染”指将外源和/或重组核酸序列引入活细胞的膜的膜封闭空间的内部，包括将核酸序列引入细胞的胞质溶胶，以及线粒体、细胞核或叶绿体的内部空间中。核酸可以呈裸DNA或裸RNA的形式；它可以与多种蛋白或调节元件(例如，启动子和/或信号元件)缔合；或者核酸可以被掺入到载体或染色体中。

如本文使用的，“转化(transformation)”或“转化的(transformed)”指以允许表达被引入的核酸的编码部分的方式将核酸(例如DNA或RNA)引入细胞中。

如本文使用的，“转化细胞”是用核酸序列转染的细胞。

如本文使用的，“转基因”指用于转化生物体诸如细菌或植物的细胞的人工基因。

如本文使用的，“转基因的”指包含转基因的细胞、组织或生物体。

如本文使用的，“多肽”或“蛋白”是作为氨基酸残基序列。这些序列从左至右以从氨基末端至羧基末端方向书写。根据标准命名法，氨基酸残基序列通过如下指示的三字母或单字母代码命名：丙氨酸(Ala，A)、精氨酸(Arg，R)、天冬酰胺(Asn，N)、天冬氨酸(Asp，D)、半胱氨酸(Cys，C)、谷氨酰胺(Gln，Q)、谷氨酸(Glu，E)、甘氨酸(Gly，G)、组氨酸(His，H)、异亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)、赖氨酸(Lys，K)、甲硫氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)、脯氨酸(Pro，P)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)、和缬氨酸(Val，V)。

如本文使用的，“肽”指相对于蛋白或多肽为短的至少2个氨基酸的链。

如本文使用的，“变体”指与参考多肽不同但保留基本特性的多肽。多肽的典型变体的氨基酸序列与另一参考多肽不同。通常，差异是有限的，使得参考多肽和变体的序列总体上非常相似，并且在许多区域中是相同的。变体和参考多肽的氨基酸序列可以相差一个或更多个修饰(例如，取代、添加和/或缺失)。取代或***的氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码编码的氨基酸残基。多肽的变体可以是天然存在的，诸如等位基因变体，或者它可以是未知的天然存在的变体。

如本文使用的，“功能变体”指蛋白或多肽的变体(例如，Cia8蛋白的变体)，其可以执行与原始蛋白或多肽相同的功能或活性，但不一定在相同水平(例如，变体可以具有增强的、减少的或改变的功能，只要它保留基本功能即可)。

如本文使用的，“同一性”可以指如通过比较序列所确定的，两个或更多个多肽序列或核苷酸之间的关系。在本领域中，“同一性”还指多肽之间的序列相关性程度，如通过此类序列的字符串之间的匹配来确定的。“同一性”可以通过已知的方法容易地计算，所述已知的方法包括但不限于以下中描述的那些：(Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,编著,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics andGenome Projects,Smith,D.W.,编著,Academic Press,New York,1993；ComputerAnalysis of Sequence Data,I部分,Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.,编著,HumanaPress,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；以及Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.,编著,M Stockton Press,New York,1991；以及Carillo,H.,和Lipman,D.,SIAM J.AppliedMath.1988,48:1073。确定同一性的优选的方法被设计为提供测试的序列之间的最大匹配。确定同一性的方法被编成公开可得的计算机程序。两个序列之间的同一性百分比可以通过使用分析软件(例如，the Genetics Computer Group,Madison Wis.的序列分析软件包)来确定，所述分析软件掺入Needelman和Wunsch，(J.Mol.Biol.,1970,48:443-453,)算法(例如NBLAST,和XBLAST)。缺省参数用于确定本公开内容的多肽的同一性。

如本文使用的，“耐受的”或“耐受性”指植物完全或在某种程度上克服环境胁迫或其他限制因子的有害影响的能力。

如本文使用的，如本文使用的“表达”描述了结构基因经历的产生多肽的过程。它是转录和翻译的组合。表达指核酸产生RNA分子的“表达”，但它指多肽的“表达”，表明多肽是通过对应核酸的表达产生的。

如本文使用的，“过表达”和“上调”指编码多肽的核酸(例如，基因)在转化的植物细胞中以比在基本相似的条件下的“野生型”植物细胞(例如，未用基因转染的基本上等同细胞)高的水平的表达(因此产生增加量的由基因编码的多肽)。

如本文使用的，“低表达(under-expression)”和“下调”指多核苷酸(例如，基因)以比野生型植物细胞中低的水平的表达(产生减少量的由多核苷酸编码的多肽)。

如本文使用的，“抑制(inhibit)”或“抑制(inhibiting)”基因的表达表明某些物质(例如，反义核苷酸、阻抑基因、拮抗剂等)在基因的表达中起作用以减少或防止(完全或部分)转录、翻译和/或其他加工步骤，从而下调基因表达，使得产生与野生型相比减少量的由基因编码的活性蛋白。

如本文使用的，如本文使用的“质粒”可以指包含完整“复制子”使得质粒在宿主细胞中被复制的非染色体双链DNA序列。

如本文使用的，术语“载体”可以用于指用于将外源核酸序列引入细胞的媒介物。载体可以包括线性的或环状的DNA分子(例如质粒)，其包含与另外的区段可操作地连接的编码感兴趣的多肽的区段，另外的区段在引入宿主细胞或宿主细胞的细胞器后提供编码感兴趣的多肽的区段的转录和翻译。此类另外的区段可以包括启动子和终止子序列，并且还可以包括一个或更多个复制起点、一个或更多个可选择标志物、增强子、多腺苷酸化信号等。表达载体通常衍生自酵母或细菌基因组或质粒DNA、或病毒DNA，或者可能包含两者的元件。

如本文使用的，“启动子”包括能够驱动编码序列转录的所有序列。特别地，本文使用的术语“启动子”指通常被描述为基因的5'调节区(5'regulator region)的、位于起始密码子的近端的DNA序列。相邻编码序列的转录在启动子区域被启动。术语“启动子”还包括在启动基因转录中起作用的启动子片段。

如本文使用的，“可操作地连接”可以将可用于表达核酸编码序列的调节序列置于核酸分子中相对于编码序列的适当位置，以便实现编码序列的表达。该同一定义有时适用于编码序列和转录控制元件(例如启动子、增强子和终止元件)，和/或可选择标志物，和/或表达载体、多核苷酸或多肽的中的其他功能序列的布置。

如本文使用的，“可选择标志物”指其的表达允许人们鉴定已用包含该标志物基因的载体转化或转染的细胞的基因。例如，重组核酸可以包含与感兴趣基因和启动子可操作地连接的可选择标志物，使得可选择标志物的表达指示用感兴趣基因成功转化的细胞。

如本文使用的，“组成型启动子”是允许其缔合的基因或多核苷酸连续或普遍转录的启动子。组成型启动子通常不受细胞或组织类型、时间或环境的调节。

如本文使用的，“诱导型启动子”是允许其缔合的基因或多核苷酸响应于物质或化合物(例如抗生素或金属)、环境条件(例如温度)、发育阶段或组织类型而转录的启动子。

如本文使用的，“野生型”可以指生物体、品种、菌株、基因、蛋白或特征存在于自然界或被定义的群体中时的典型或平均形式，区分于可能由天然或选择育种或用转基因转化产生的突变体形式时。

如本文使用的，“电穿孔”是藉以将高浓度的质粒DNA(包含外源DNA)添加至宿主细胞原生质体的悬浮液中，并且该混合物用约200V/cm至600V/cm的电场冲击的转化方法。

如本文使用的，“分离的”意指与多核苷酸、肽、多肽、蛋白、抗体或其片段通常在自然界中所缔合的细胞和其他成分分开。在本公开内容的一个方面，分离的多核苷酸是将其与在其天然(native)或天然(natural)环境中例如在染色体上通常与之缔合的3'和5'相邻核苷酸分开。对于本领域技术人员明显的是，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白、抗体或其片段不需要“分离”以区分其与其天然存在的对应物。另外，“浓缩的”、“分开的”或“稀释的”多核苷酸、肽、多肽、蛋白、抗体或其片段与其天然存在的对应物的区分在于每体积的分子浓度或分子数目大于(“浓缩的”)，或小于(“分开的”)其天然存在的对应物的分子浓度或分子数目。在其一级序列或例如通过其糖基化模式不同于其天然存在的对应物的多核苷酸、肽、多肽、蛋白、抗体或其片段不需要以其分离的形式存在，因为其通过其一级序列或可选地通过另一种特征诸如糖基化模式可区分于其天然存在的对应物。尽管未针对本文公开的每个实施方案明确陈述，但应当理解，本公开内容提供了以下和在适当条件下公开的每种组合物的所有以上实施方案。因此，非天然存在的多核苷酸以独立于分离的天然存在的多核苷酸的实施方案提供。在细菌细胞中产生的蛋白以与从在自然界中产生其的真核细胞分离的天然存在的蛋白的单独实施方案提供。

如本文使用的，“cDNA”指与细胞中的RNA转录物互补的DNA序列。它是一种人造分子。通常，cDNA使用RNA转录物作为模板通过称为逆转录酶的酶在体外制备。

如本文使用的，“纯化的”用于指核酸序列、肽或多肽具有相对于天然环境增加的纯度。

如本文使用的，“对照”是用于比较目的的实验中使用的可选受试者或样品，并且被包括以最小化或区分除了独立变量以外的变量的影响。“对照”可以是阳性的或阴性的。

如本文使用的，“浓缩”用于指分子、化合物或组合物(包括但不限于化学化合物、多核苷酸、肽、多肽、蛋白、抗体或其片段)的量，该量指示样品与其天然存在的对应物在以下方面可区分：与其在其天然状态的天然存在的对应物相比，每体积的分子浓度或分子数目大于其天然存在的对应物的浓度或数目和/或其每剂量的效力和/或功能。

如本文使用的，“稀释的”用于指分子、化合物或组合物(包括但不限于化学化合物、多核苷酸、肽、多肽、蛋白、抗体或其片段)的量，该量指示样品与其天然存在的对应物在以下方面可区分：每体积的分子浓度或分子数目小于其天然存在的对应物的浓度或数目。

如本文使用的，“分开的(separated)”指与原始来源或群体物理分开使得分开的化合物、剂、颗粒、化学化合物或分子可以不再被认为是原始来源或群体的一部分的状态。

如本文使用的，“合成的”指化合物通过化学或生物合成方法制备，该化学或生物合成方法在该化合物可以被从其发现的天然生物体之外并且独立于该天然生物体发生。

讨论

绿藻类及其他光和水生生物体在自然环境中通常暴露于低的和波动的CO₂条件。除其他因素外，这些生物体的CO₂可用性可以受以下限制：气体在水中的缓慢扩散，两种无机碳形式(CO₂和HCO₃ ^-)的缓慢相互转化和pH改变。因此，几乎所有水生光合生物体都进化出在限制CO₂条件下可诱导的二氧化碳浓缩机制(CCM)，以有效地浓缩无机碳(Ci)，用于由核酮糖二磷酸羧化酶固定(Giordano等，2005)。迄今为止，莱茵衣藻中的两种高亲和力和一种低亲和力碳酸氢盐转运蛋白被表征并且已知在低CO₂条件下具有功能。HLA3和LCI1被认为是位于质膜上的Ci转运蛋白。第三种转运蛋白NAR1.2(也称为LCIA)是甲酸盐/亚硝酸盐转运蛋白家族的叶绿体被膜蛋白。到目前为止，NAR1.2已归因于叶绿体被膜上的Ci摄取，尽管尚不存在直接证据支持这一点。

此外，两种可溶性蛋白(LCIB/LCIC)形成复合物，并且在观察到当细胞适应低CO₂时该两种可溶性蛋白将与淀粉核紧密缔合之后，该两种可溶性蛋白被认为参与从淀粉核中泄漏的CO₂的重新捕获(Yamano等,2010；Wang等,2011)。其他推定的现在被确认为线粒体的(Atkinson等,2015)转运蛋白CCP1和CCP2尚待得到解析。鉴于这一切，明显的是，衣藻属中的Ci运输***仍有待阐明，以便更好地了解CCM。

如上所述(With that said)，本文描述了来自绿藻的可以参与碳酸氢盐转运的溶质运载体(carrier)蛋白(本文称为Cia8)、其多肽以及编码它们的核酸。本文还提供了可以包含和/或表达Cia8多肽和/或编码Cia8多肽的核酸的修饰的细胞和转基因植物。本公开内容的其他组合物、化合物、方法、特征和优势对于本领域普通技术人员在检查以下附图、详细描述和实施例后将会清楚或变得清楚。意图所有此类另外的组合物、化合物、方法、特征和优势被包括于本说明书中，并且在本公开内容的范围内。

核酸序列

分离的核苷酸和cDNA序列

本公开内容描述了分离的核酸和cDNA序列，其全部或部分可以编码绿藻Cia8多肽。在一些实施方案中，由本文提供的分离的或合成的核苷酸或cDNA序列编码的绿藻Cia8多肽可以结合和/或转运碳酸氢盐。

在一些实施方案中，编码绿藻Cia8多肽的核苷酸可以具有与SEQ ID NO:1-3的任一个约100％相同的分离的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码绿藻Cia8的cDNA可以具有与SEQ ID NO:3约100％相同的序列。cDNA可以具有与SEQ ID NO:3的任一个具有至少99％同一性的序列。在一些实施方案中，cDNA可以是与SEQ ID NO:3的任一个具有至少98％同一性的序列。在其他实施方案中，cDNA可以具有与SEQ ID NO:3的任一个具有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少70％或至少50％的序列同一性的序列。在另外的实施方案中，cDNA序列具有与SEQ ID NO:3的任一个约70％和约80％之间、或约80％和90％之间、或约90％和约100％之间的序列同一性。

在一些实施方案中，绿藻Cia8 cDNA编码具有与SEQ ID NO:4的任一个至少90％同一性的序列的多肽。在另外的实施方案中，绿藻Cia8 cDNA编码具有与SEQ ID NO:4的任一个约90％和约100％之间的序列同一性的序列的多肽。在其他实施方案中，绿藻Cia8 cDNA编码具有与SEQ ID NO:4的任一个约50％和约100％之间的序列同一性的序列的多肽。

本公开内容还提供了分离的核苷酸片段，包括合成的核苷酸片段和cDNA片段，其至少6个核苷酸序列与SEQ ID NO:1-3的任一个内的任何序列具有约90％和100％之间、约95％和约100％之间、或约99％和100％之间的序列同一性。在一些实施方案中，分离的核苷酸或合成的核苷酸片段与SEQ ID NO:1-3的任一个具有约50％至约100％的序列同一性。

在一些实施方案中，分离的或合成的核苷酸片段可以编码能够结合碳酸氢盐和/或跨越膜转运碳酸氢盐的肽或多肽。

重组多核苷酸序列

还提供了具有先前描述的分离的核苷酸或cDNA序列或其片段的任一个、以及与分离的核苷酸或cDNA序列或其片段可操作地连接的另外的多核苷酸序列的重组多核苷酸序列。在一些实施方案中，非编码核苷酸可以被置于编码绿藻Cia8多肽的多核苷酸的5'末端和/或3'末端处，而不影响分子的功能特性。可以在多核苷酸编码区的3'末端处包含多腺苷酸化区域。多腺苷酸化区域可以衍生自内源基因、来自多种其他植物基因、来自T-DNA、或通过化学合成。在另外的实施方案中，编码绿藻Cia8多肽的核苷酸可以与编码绿藻Cia8多肽的N-末端处的(例如)信号或转运(或前导)序列(其共翻译或翻译后指导绿藻Cia8多肽的转移)的核酸缀合。多核苷酸序列还可以被改变，使得所编码的绿藻Cia8多肽与接头、可选择标志物或其他序列缀合，以便于蛋白的合成、纯化和/或鉴定。在一个实施方案中，重组多核苷酸序列包含与分离的核苷酸或cDNA或其片段可操作地连接的至少一个调节序列。

为了在细胞中表达外源绿藻Cia8基因、其片段或反义核苷酸，外源核苷酸可以与细胞中指导基因的转录和/或编码蛋白的翻译的转录和/或翻译起始调节序列(即启动子)组合(例如，在载体中)。在一些实施方案中，可以使用组成型启动子。用于植物细胞的合适的组成型启动子包括但不限于花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录起始区、衍生自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的T-DNA的1'-或2'-启动子、来自拟南芥(Arabidopsis)的ACT11和Cat3启动子(Huang等Plant Mol.Biol.1996,33:125-139和Zhong等Mol.Gen.Genet.1996,251:196-203)、来自甘蓝型油菜(Brassica napus)的硬脂酰-酰基运载体蛋白去饱和酶基因启动子(Solocombe等Plant Physiol.1994,104:1167-1176)以及来自玉米的GPc 1和Gpc2启动子(Martinez等J.Mol.Biol.1989,208:551-565和Manjunath等Plant Mol.Biol.1997,33:97-112)。用于细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞的合适的组成型启动子通常是本领域已知的，诸如用于细菌表达的T-7启动子和用于在酵母中表达的乙醇脱氢酶启动子。

在其他实施方案中，组织特异性启动子或诱导型启动子可以用于在某些环境条件下指导外源核酸在特定细胞类型中和/或在特定发育状态期间的表达。可以通过诱导型启动子影响转录的环境条件的实例包括厌氧条件、升高的温度、光的存在、与化学物质或激素的接触、或病原体的感染。合适的植物诱导型启动子包括根特异性ANRI启动子(Zhang和Forde.Science.1998,279:407)、光合器官特异性RBCS启动子(Khoudi等Gene.1997,197:343)和番茄果实成熟-特异性E8启动子(Deikman,J.,等Plant Physiol.1992,100:2013-2017)。

可选择标志物也可以被包括于重组核酸中，以赋予植物细胞可选择表型。例如，可选择标志物可以编码赋予杀生物剂耐受性、抗生素耐受性(例如，对卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素的耐受性)或除草剂耐受性(例如对氯磺隆或Basta的耐受性)的蛋白。因此，可选择表型的存在指示宿主细胞的成功转化。示例性可选择标志物包括β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)报告物基因。

合适的重组多核苷酸可以通过使用本领域技术人员已知的标准方法获得，所述标准方法包括但不限于限制性酶消化、PCR、连接和克隆技术。在一些实施方案中，重组多核苷酸编码能够结合碳酸氢盐和/或跨越膜转运碳酸氢盐的肽或多肽。

分离的蛋白(多肽)和肽序列

本公开内容还描述了分离的或合成的蛋白(多肽)，其对应于来自绿藻的溶质运载体，诸如Cia8。在一些实施方案中，分离的多肽可以具有对应于SEQ ID NO:4的氨基酸序列。分离的或合成的多肽可以具有与SEQ ID NO:4具有至少约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的或合成的多肽可以具有与SEQ ID NO:4具有至少约98％同一性的氨基酸序列。在其他实施方案中，分离的多肽可以具有与SEQ ID NO:4具有至少约95％、至少约90％、至少约85％、至少约80％、至少约70％、或至少约50％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的或合成的多肽与SEQ ID NO:4具有大于约70％、或约70％和约90％之间、或约90％和100％之间的序列同一性。

在一些实施方案中，分离的或合成的多肽可以能够结合碳酸氢盐和/或跨越膜转运碳酸氢盐。在一些实施方案中，分离的或合成的肽可以能够在低CO₂条件中改善生长。在一些实施方案中，低CO₂条件可以是大气水平的CO₂。在一些实施方案中，低CO₂条件可以是小于约3％的CO₂。

可以在本公开内容的多肽的结构中进行导致分子具有与未修饰的多肽相似特征的修饰和改变(例如，保守氨基酸取代)。修饰技术通常是本领域已知的。例如，某些氨基酸可以取代序列中的其他氨基酸而没有明显的活性损失。因为是多肽的相互作用能力和性质确定多肽的生物功能活性，所以可以在多肽序列中进行某些氨基酸序列取代，并且仍然获得功能变体。具有氨基酸序列替代物的多肽仍然保留与对应于绿藻Cia8的多肽基本上相似的性质，这些多肽在本公开内容的范围内。

本公开内容还包括分离的和合成的肽，其对应于与绿藻Cia8对应的多肽片段。在一些实施方案中，肽对应于SEQ ID NO:4的一部分。分离的或合成的肽可以与SEQ ID NO:4的任何一部分具有至少约90％、或至少约95％、或至少约99％的序列同一性。在一些实施方案中，分离的或合成的肽可以与SEQ ID：4中的序列具有约90％和约95％之间、或约95％和约99％之间、或约99％和约100％之间的序列同一性。

在一些实施方案中，分离的或合成的肽可以能够结合碳酸氢盐和/或跨越膜转运碳酸氢盐。在一些实施方案中，分离的或合成的肽可以能够在低CO₂条件中改善生长。在一些实施方案中，低CO₂条件可以是大气水平的CO₂。在一些实施方案中，低CO₂条件可以是小于约3％的CO₂。

在其他实施方案中，如本文所描述的分离的或合成的肽或其片段适用于在产生针对绿藻Cia8的抗体中使用。换言之，如本文描述的分离的或合成的肽充当针对其产生抗体的抗原。在一些实施方案中，分离的或合成的肽序列或其片段也是抗体的表位。针对绿藻Cia8产生的抗体适用于在用于至少检测、定量和纯化绿藻Cia8的方法中使用。用于绿藻Cia8抗体的其他用途通常是本领域已知的。

载体

具有本文描述的多核苷酸或反义多核苷酸中的一种或更多种的载体可以用于产生表达不同水平的绿藻Cia8的转基因的细菌、真菌、酵母、植物细胞和转基因植物。包含本文描述的一种或更多种多核苷酸序列的载体在本公开内容的范围内。

在一个实施方案中，载体可以包含编码绿藻Cia8的多核苷酸，其中DNA分子与SEQID NO:1-3的任一个具有至少约90％、或约90％和约95％之间、或约95％和约100％之间的序列同一性。在一些实施方案中，载体可以包含编码绿藻Cia8的DNA分子，其中DNA分子与SEQ ID NO:1-3的任一个具有至少约90％、或约90％和约95％之间、或约95％和约100％之间的序列同一性。并且其中绿藻Cia8可以结合和/或转运碳酸氢盐和/或在低CO₂条件中改善藻类的生长。在一些实施方案中，载体具有编码具有与SEQ ID NO:3具有至少约90％、或约90％和约95％之间、或95％和约100％之间的序列同一性的序列的多肽的cDNA分子。

在一个实施方案中，载体可以具有与编码绿藻Cia8的DNA分子可操作地连接的至少一个调节序列，使得绿藻Cia8在其被转化到其中的细菌、真菌、酵母、植物或其他细胞中表达。在其他实施方案中，载体包含用于启动绿藻Cia8表达使得绿藻Cia8在其被转化到其中的植物细胞中相对于野生型细菌、真菌、酵母或植物细胞中被过表达的启动子。在一些实施方案中，载体可以具有与编码绿藻Cia8的DNA分子和可选择标志物可操作地连接的至少一个调节序列。

转基因植物

以上描述的多核苷酸序列和载体可以用于产生转基因植物。本公开内容包括具有一种或更多种细胞的转基因植物，其中一种或更多种细胞包含先前描述的具有编码绿藻Cia8的DNA序列的重组多核苷酸或载体的任一个。在一个实施方案中，重组多核苷酸包含与绿藻Cia8DNA序列可操作地连接的至少一个调节元件，所述绿藻Cia8DNA序列与SEQ ID NO:1-3的任一个具有至少约90％、或约90％和约95％之间、或约95％和约100％之间的序列同一性。

本文还描述了具有用包含以下的载体转化的一种或更多种细胞的转基因植物：以上描述的任何一种或更多种核苷酸序列，和/或编码本公开内容的绿藻Cia8蛋白的核酸片段。在一些实施方案中，载体包含与SEQ ID NO:1-3的任一个具有至少约90％、或约90％和约95％之间、或约95％和约100％之间的序列同一性的绿藻Cia8DNA序列。转基因植物可以由任何合适的植物物种或品种制成，所述植物物种或品种包括但不限于拟南芥、水稻、小麦、谷物(corn)、玉米、烟草、大豆、芸苔、番茄、马铃薯、苜蓿、甘蔗和高粱。

在一些实施方案中，具有编码绿藻Cia8的核苷酸序列的转基因植物相对于野生型植物可以具有增加的绿藻Cia8的基因和/或蛋白表达。在其他实施方案中，转基因植物具有编码绿藻Cia8的核苷酸序列，相对于野生型植物具有增加的绿藻Cia8的表达并产生绿藻Cia8多肽。绿藻Cia8多肽可以能够结合碳酸氢盐和/或跨越膜转运碳酸氢盐。

在一些实施方案中，转基因植物产生可以结合和/或转运碳酸氢盐的绿藻Cia8。在一些实施方案中，转基因植物可以产生绿藻Cia8蛋白并且在低CO₂条件中具有改善的生长。在一些实施方案中，低CO₂条件可以是大气水平的CO₂。在一些实施方案中，低CO₂条件可以是小于约3％的CO₂。

本公开内容的转化的植物细胞可以通过将如先前描述的一种或更多种载体引入植物细胞中来产生。在一个实施方案中，本公开内容的转基因植物可以从用先前描述的一种或更多种载体转化的转基因植物细胞生长。在一个实施方案中，细胞可以用载体转化，所述载体包含编码绿藻Cia8的与SEQ ID NO:1-3的任一个具有至少约90％、或约90％和约95％之间、或约95％和约100％之间的序列同一性的重组多核苷酸。在一些实施方案中，至少一种调节序列可以与DNA分子可操作地连接。

用于用载体或裸核酸转化多种植物细胞的技术是本领域熟知的，并且被描述于技术和科学文献中。参见，例如，Weising等Ann.Rev.Genet.1988,22:421-477。例如，载体或裸核酸可以使用诸如但不限于植物细胞原生质体的电穿孔和显微注射的技术被直接引入植物细胞的基因组DNA中，或者重组核酸可以使用诸如DNA微粒轰击的弹道方法(ballisticmethods)被直接引入植物组织中。

显微注射技术是本领域已知的并且被充分描述于科学和专利文献中。使用聚乙二醇沉淀引入重组核酸被描述于Paszkowski等EMBO J.1984,3:2717-2722中。电穿孔技术被描述于Fromm等Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1985,82:5824中。弹道转化技术被描述于Klein等Nature.1987,327:70-73。重组核酸也可以与合适的T-DNA侧翼区组合，并且被引入常规的根癌农杆菌宿主载体或其他合适的载体中。当植物细胞被细菌感染时，根癌农杆菌宿主的毒性作用将指导包含外源核酸和邻近标志物的重组核酸***植物细胞DNA中。根癌农杆菌介导的转化技术，包括二元载体的解除(disarming)和使用，是本领域技术人员已知的并且被充分描述于科学文献中。参见，例如，Horsch等Science.1984,233:496-498；Fraley等Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1983,80:4803；和Gene Transfer to Plants,Potrykus,编著,Springer-Verlag,Berlin,1995。

用于将载体或重组核酸引入植物细胞的另外的方法是通过转化植物细胞原生质体(稳定或瞬时)。植物原生质体仅被质膜包围，并且因此将更容易摄取大分子如外源DNA。这些工程化原生质体可以能够再生完整植株。用于将外源DNA引入植物细胞原生质体的合适方法包括电穿孔和聚乙二醇(PEG)转化。电穿孔后，转化的细胞通过在包含选择剂的适当培养基上生长来鉴定。

转基因植物中外源核酸的存在和拷贝数可以使用本领域熟知的方法，例如DNA印迹分析、PCR和测序来确定。转基因植物中外源绿藻Cia8核酸的表达可以通过检测转基因植物中绿藻Cia8 mRNA和/或绿藻Cia8多肽的增加来确认。用于检测和定量mRNA或蛋白的方法是本领域熟知的。

可以培养通过任何以上转化技术或现在已知或以后开发的其他技术衍生的转化的植物细胞以再生整个植株。在实施方案中，此类再生技术可以依赖于在组织培养生长培养基中操作某些植物激素，通常依赖于与外源核酸一起引入的杀生物剂或除草剂可选择标志物。来自培养的原生质体的植物再生被描述于以下中：Evans等,Protoplasts Isolation和Culture,Handbook of Plant Cell Culture,第124-176页,MacMillilan PublishingCompany,New York,1983；和Binding,Regeneration of Plants,Plant Protoplasts,第21-73页,CRC Press,Boca Raton,1985。再生也可以从植物愈伤组织、外植体、器官或其部分获得。此类再生技术通常被描述于Klee等Ann.Rev.Plant Phys.1987,38:467-486中。

在确认外源绿藻Cia8被稳定地掺入转基因植物的基因组中后，可以通过有性杂交将其引入其他植物中。可以使用许多标准育种技术中的任一种，这取决于待杂交的物种。

转化的细胞

本公开内容还包括用如先前描述的一种或更多种分离的核苷酸或cDNA序列和/或载体转化的一种或更多种细胞。在一些实施方案中，转化的细胞是植物、细菌、真菌或酵母细胞。在一个实施方案中，植物、细菌、真菌或酵母细胞包含如先前描述的一种或更多种载体。此外，细胞的群体在本公开内容的范围内，其中群体内约1％至约100％、或约50％和约75％之间、或约75％和约100％之间的细胞包含如先前描述的载体。

在一些实施方案中，群体内的一个或更多个细胞包含多于一种类型的载体。在一些实施方案中，所有(约100％)包含载体的细胞具有相同类型的载体。在其他实施方案中，并非所有包含载体的细胞都具有相同类型的一种或多于一种(plurality of)载体。在一些实施方案中，群体中约1％至约100％、或约50％和约75％之间、或约75％和约100％之间的细胞包含相同的一种或多于一种载体。在一些细胞群体中，所有细胞来自同一物种。其他细胞群体包含来自不同物种的细胞。用于建立转化(转基因)细胞的转染方法是本领域熟知的。

在一个实施方案中，转化的细胞产生和/或表达能够结合碳酸氢盐和/或跨越膜转运碳酸氢盐的肽或多肽。

实施例

现在已大体上描述了本公开内容的实施方案，以下实施例描述本公开内容的一些另外的实施方案。尽管本公开内容的实施方案结合以下实施例以及对应的文字和附图进行描述，但不意图限制本公开内容的实施方案至本说明书。相反，意图覆盖在本公开内容的实施方案的精神和范围内包括的所有的替换、修改、以及等同物。

实施例1

引言

该实施例可以证明在诱变筛选中鉴定的基因，本文称为Cia8(Phytozome ID：Cre09.g395700)(编码溶质运载体蛋白)，的鉴定和表征。Cia8基因编码属于Na⁺/胆汁酸同向转运蛋白(symporter)家族(SBF)的跨膜蛋白，该跨膜蛋白是一组属于溶质运载体蛋白(SLC)超家族的保守的跨膜蛋白(Pushkin和Kurtz，2006)。结果可以证明Cia8基因产物可以参与莱茵衣藻中的碳酸氢盐摄取和/或在低CO₂条件中改善生长。

结果

Cia8突变体需要高CO₂条件以良好生长

在***诱变筛选后使用包含来自龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)的赋予巴龙霉素耐受性的氨基糖苷类-3’-磷酸转移酶VIII型编码基因(AphVIII)的1.8-kb AphVIIIpara^R盒(Sizova等,2001)鉴定Cia8突变体。通过在MIN板上在高CO₂(约5％)和低CO₂(约0.01％)下培养突变体来筛选突变体，其中潜在的CCM突变体在低CO₂下生长时将显示缓慢生长(Jungnick等，2014)。虽然Cia8突变体在高CO₂条件下生长良好(图1A)，但它在低CO₂下显示出较弱的生长(图1B)，并且因此被用于进一步研究。当细胞在0.01％CO₂的液体(MIN)培养物中生长时，缓慢生长的表型也是明显的，其中与D66的20h相比，cia8突变体的倍增时间约为30h(图1C)。

***的确认

AphVIII***物在Cia8基因中的位置使用Pollock等(2016)描述的衔接子PCR确定。***物位于Cia8基因的第10个外显子中，如图2A中的基因模型显示的。使用扩增***物的5'UTR和3'UTR的2对引物进行PCR扩增以确认***物的存在(图2B)。表2示出了该研究中使用的引物列表。将该突变体中***位点侧翼的基因组DNA分离并测序。对测序的基因组DNA的分析显示了在盒的5'UTR处(***末端处)基因序列的16个碱基缺失，并且19个碱基的新区域被***。***的3'UTR是完整的，不具有缺失或***。分析确认，靶基因序列在第10个外显子中被破坏，并且未发生其他大的DNA缺失或***。

基因表达

通过使用跨越***位点的基因特异性引物对的逆转录PCR(RT-PCR)也确认了基因中转录的破坏。RT-PCR结果显示在Cia8突变体中不存在可检测的完整Cia8转录物的表达(图3)，确认转录物已被破坏并且突变体中的基因产物低于可检测水平。在野生型高CO₂细胞中检测到Lici8mRNA。观察到低CO₂细胞中转录物的显著上调(图3)，表明Cia8基因在低CO₂条件下是可诱导的。来自该RT-PCR的结果还表明，编码CIA8的基因似乎不受大多数CCM基因的主要调节物Cia5基因的调节，因为转录物在Cia5突变体中与在野生型中同样表达。

Cia8突变体与野生型菌株的遗传杂交证明了巴龙霉素耐受性的后代对巴龙霉素敏感的后代的1:1分离比(数据未显示)，说明突变体携带单个***物。通过PCR进一步研究证明巴龙霉素耐受性菌株携带盒。表型分析表明，在低CO₂条件下，对巴龙霉素具有耐受性的四分体一直患病(sick)。综合考虑结果，得出的结论是，Cia8基因的基因座是分离的，并且因此导致在低CO₂条件下观察到的缓慢生长表型的原因。

Cia8基因的结构和跨膜结构域的预测

cDNA和基因组序列的比较显示位于基因组9号染色体上的Cia8具有12个外显子。在核苷酸序列的基础上，Cia8编码529个氨基酸的多肽，并与钠/胆汁酸(SBF样)溶质运载体蛋白组最佳比对。使用PHYRE2软件(Kelley等,2015)预测蛋白的结构。使用蛋白的包含370个氨基酸(氨基酸160-529)的核心跨膜部分给出最高的同源性评分。预测结果显示了具有15-24个氨基酸的10个推定的跨膜结构域和8-30个氨基酸的在跨膜螺旋之间的细胞外环，如图4中显示的。TM 5和6之间的第三个环比其余环长，并且这是SLC4蛋白的特征。该蛋白最接近于(threaded best to)细菌(弗氏耶尔森菌)Na⁺/代谢物同向转运蛋白的晶体结构(82％)，但它也很好地接近于来自几种细菌的HapA蛋白(Na⁺/H⁺逆向转运蛋白)(56％-98％)。

CIA8与其他阴离子转运蛋白的相似性

在PFAM数据库中的搜索显示了八种与CIA8相似的其他预测蛋白：Cre02.g147450；Cre06.g250450；Cre09.g393250；Cre12.g521950；Cre10.g448350；Cre12.g532500；Cre02.g095085和Cre02.g095086，均注释为Na⁺/胆汁酸转运蛋白。这些蛋白与CIA8的序列同一性在19％和31％之间变化。莱茵衣藻中Na/胆汁酸转运蛋白基因的数目与其他物种非常相当，其中在拟南芥中已经报道了6种(Sawada等,2009)，在人类中已经报道了7种(He等,2009)并且在海洋硅藻三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)中报道了5种(Ashworth等,2016)。考虑到由这些类型的蛋白转运的离子数目，这些数字并不令人惊讶。CIA8蛋白还显示出与来自高等植物物种的几个SBF克隆相当的序列相似性，这些SBF克隆中的许多尚未被表征(图9)。在团藻中以76％的同一性发现了最接近的藻类同源物。与CIA8显示出相似性的另一种蛋白是酵母蛋白YNL275w，具有23％的同一性。该酵母蛋白属于HCO₃ ^-转运蛋白超家族，并且已经被证明接受几种阴离子，包括HCO₃ ^-作为潜在的底物((Zhao和Reithmeier,2001)。该分析表明Cia8基因产物属于以保守结构域为特征的保守膜转运蛋白家族，并且它可能参与Ci转运。

CIA8具有针对Ci的降低的亲和力

由于CIA8的表达强烈响应于CO₂限制，其在CCM中的可能功能使用生理学测定评价。缺失CIA8的菌株表现出更高的K_(0.5)(Ci)，表明它们具有比野生型细胞低的对无机碳的亲和力(图5A-5B)。在pH(7.3)，野生型细胞的K_(0.5)(Ci)为25μM。相比之下，Cia8突变细胞具有显著更高的K_(0.5)(Ci)，为90μM(表1)，表明突变体中Ci的亲和力降低。还在pH9.0测量氧气释放，假设培养基中的主要Ci种类是碳酸氢盐，因此，氧气释放更依赖于活性碳酸氢盐摄取。K_(0.5)的变化(shift)在较高pH也是显著的，其中Cia8突变体细胞表现出与野生型细胞中的100μM相比更大的K_(0.5)(Ci)，为350μM(图5C、表1)。该结果确认了突变体中碳酸氢盐的亲和力降低，并因此确认了Cia8基因产物在Ci摄取中的作用。

CIA8定位于莱茵衣藻中的叶绿体

使用TargetP/ChloroP(http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)的分析表明CIA8肽是叶绿体膜蛋白(评分81％)。使用SCLpred-Bologna Biocomputing Group(schloro.biocomp.unibo.it)进行该蛋白的N-末端序列的另一个比对。该软件预测CIA8具有叶绿体转运肽(cTP；评分0.79)和类囊体(0.81)。该软件还预测了作为类囊体膜的位置(0.6)。作为对照，使用拟南芥类囊体逆向转运蛋白Kea3.3，并且该软件预测了cTP(评分(0.77)和作为类囊体膜的分配(0.51)。这些预测给出强烈的指示表明CIA8是叶绿体蛋白。

为了证实这种亚细胞定位，产生在PsaD启动子控制下表达与GFP(-CIA8:CrGFP)融合的Cia8编码序列的莱茵衣藻系。PsaD启动子是高表达启动子，其驱动编码位于莱茵衣藻光***I的基质侧的丰富叶绿体蛋白的核基因(Fischer和Rochaix,2001)。RT-PCR分析显示在该菌株中可检测到GFP转录物(图6G)。

通过共聚焦显微镜上的活体成像在叶绿体中检测到融合蛋白CIA8:CrGFP的绿色荧光。该结果表明CIA8蛋白主要在莱茵衣藻细胞的叶绿体中积累(图6A-6F)。然而，信号似乎并不局限于叶绿体被膜，而是在整个细胞器中扩散，表明类囊体定位。

CIA8运输不依赖于Na⁺

已知几种溶质转运蛋白是Na⁺依赖性的，包括BicA，BicA是蓝细菌中的低亲和力碳酸氢盐转运蛋白((Price等,2004；Price和Howitt,2011)。为了确定Cia8基因功能是否可以依赖于Na⁺离子，使野生型和突变体细胞在不同浓度的Na⁺(<10μM-200mM)上生长。两种培养物在pH6.8的板上在低Na⁺浓度(<10μM)直至100mM下均生长良好(图10)。然而，在200mM Na⁺，细胞的生长受到抑制。野生型和Cia8细胞在低Na⁺浓度生长良好的观察可以表明在莱茵衣藻中HCO₃ ^-的获得不需要Na⁺离子，并且可以反映淡水中的外部Na⁺浓度通常是低的，<1mM(Pootakham等,2010)。然而，由于一些转运蛋白(包括CIA8)是内部的，因此不清楚改变外部Na⁺浓度是否会改变内部浓度。

在低CO₂条件下，Cia8的表达被上调

为了定量和比较Cia8突变体和野生型中其他已知衣藻属转运蛋白的表达，通过定量RT-PCR分析研究了Hla3、Nar1.2、Lci1和Cia8以及其他两个SLC基因(基因ID：Cre02.g147450和Cre09.g393250)的表达。RNA样品获自高CO₂和低CO₂适应的培养物。结果显示这些转运蛋白基因在野生型(图7A)和Cia8突变体(图7B)中的表达水平。结果确认了Cia8基因和其他转运蛋白在适应低CO₂条件下上调，除了Hla3，其通常在大于4小时时表达增加(Duanmu等,2009)。在野生型中，在适应低CO₂条件下，存在Cia8基因的4倍上调。在野生型细胞中也存在两种SBF基因的上调。与野生型相比，这两种SBF基因的相对表达水平在cia8突变体细胞中也是略低的(图7C)。虽然数据确认了Cia8基因产物参与CCM，但它们也表明CIA8的损失可能影响通常在低CO₂条件下被上调的其他基因的转录控制。

与野生型相比，Cia8突变体细胞中碳酸氢盐转运蛋白的相对表达水平较低。这种下调可能表明该Cia8基因对其他转运蛋白的调节作用。在野生型细胞中还存在两个其他SLC基因的显著上调。该数据似乎与我们的前提一致，即Cia8基因产物参与CCM并且其表达受转录水平控制。

Cia8基因可以被补充

通过将Cia8 cDNA(1,869bp)(包括整个5'UTR和3'UTR)在其自身启动子和终止子控制下的pSP124载体中在Cia8突变体中表达来实现CIA8的补充。在博来霉素上选择转化的细胞。选择10个转化体并进行进一步的生长测试和光合作用测定。生长结果显示在低CO₂条件下野生型表型在补充系(称为com1和com2)中被恢复(图8A)。从这两种补充菌株中提取RNA并合成cDNA。得到的RT-PCR分析显示Cia8转录物已经被恢复(图8B)。另外，在pH 9.0的com1的Ci依赖性氧气释放测定显示补充菌株中的K_(0.5)(Ci)与野生型相同。此外，最大氧气释放(V_max)与野生型也没有显著差异(图8C-8D)。这些结果共同确认了该Cre09.g395700编码序列补充Cia8突变体的生长，恢复了Ci摄取中转录物的表达和功能。

Ci摄取测定

为了评价CIA8对Ci摄取活性的贡献，使用硅油层离心方法测量同位素辨别，例如，在D66和CIA8中以及在补充细胞系com1中¹⁴C的积累(图11A-11B)。使用在升高的CO₂(空气中约3％v/v CO₂)或空气(低CO₂)中生长的细胞，在pH 9.0进行分析以确保主要的Ci种类是碳酸氢盐。在所有情况下，适应低CO₂的细胞在细胞中比在升高的CO₂下生长的细胞中具有更大量的累积的Ci(图11A)。当比较Ci摄取和光合速率时，野生型细胞具有比Cia8细胞更大的Ci积累和更大的Ci固定(图11B)。另外，尽管Ci积累未被完全恢复，但com1细胞系中的光合作用几乎被恢复至野生型水平。这些数据支持这样的假设：Ci摄取(最可能以碳酸氢盐形式)在Cia8细胞中被降低。

讨论

碳酸氢盐转运蛋白和其摄取和积累的需要是莱茵衣藻CCM的重要特征。莱茵衣藻中推定的碳酸氢盐转运蛋白通常通过限制CO₂条件来诱导。转运蛋白似乎也具有重叠的功能。如果仅一种转运蛋白的表达被降低，通常不存在强生长表型，并且观察到对Ci摄取的较小的影响。然而，如果两种或更多种转运蛋白被降低，Ci摄取受到影响，并且在低CO₂下的生长被降低。在该工作中，我们通过***诱变产生了新的突变体，并且鉴定了在基因(Phytozome ID：Cre09.g395700)中具有***物的突变体，该基因被命名为Cia8(用于低CO₂诱导)或Cia8(用于Ci积累)并且在本文中被可互换地使用。该实施例的主要目的是确定CIA8蛋白是否参与莱茵衣藻的CCM。对其进行了表征并且证明，该基因的***导致在低CO₂下的较差生长，并且当细胞在限制CO₂条件下生长时，导致Ci亲和力的显着减少。在补充实验中，来自野生型基因的Cia8编码区的表达能够在光合作用测定中恢复正常的生长表型和功能(图8A-8D)。

CIA8蛋白属于SLC超家族，其编码属于～55亚家族的膜结合转运蛋白。这些SLC蛋白转运不同数目的底物。研究表明，一些SLC阴离子转运蛋白参与碳酸氢盐摄取。到目前为止，两个亚家族，即Na⁺依赖性Cl^-/HCO₃ ^-交换蛋白(SLC4)和硫酸盐转运蛋白(SLC26)涉及海洋硅藻、蓝细菌和哺乳动物中的碳酸氢盐转运，其中BAND3是人类中的原型(Price等,2004；Romero,2005；Price和Howitt,2011；Nakajima等,2013；Romero等,2013)。尽管在其他真核生物物种中是重要的碳酸氢盐转运蛋白，但该SLC基因亚家族在莱茵衣藻中仍然具有未知的功能。

CIA8蛋白属于SBF/BASS亚家族，其包括被称为胆汁酸转运蛋白的膜结合转运蛋白。这些蛋白转运不同数目的底物。在拟南芥中，已经对这些基因中的两个进行了表征，并且BASS2参与了甲基赤藓糖醇4-磷酸(MEP)途径中跨越叶绿体被膜的丙酮酸盐转运，而BASS4在芥子油苷代谢期间转运2-酮酸(Gigolashvili等,2009；Furumoto等,2011)。PFAM数据库中的生物信息学搜索显示，一些SBF和SBF样阴离子转运蛋白可能参与碳酸氢盐摄取。尽管在其他真核生物物种中是重要的转运蛋白，但该SBF/BASS基因产物亚家族在莱茵衣藻中仍然具有未知的功能。

该研究中CIA8的生理学表征支持其在限制CO₂条件下参与CCM功能和Ci摄取的观点。CIA8转运蛋白似乎对CCM功能作出显著贡献，因为它是目前为止唯一在单基因敲除突变体中显示出不同表型的转运蛋白(图1)。其他已知的转运蛋白HLA3和NAR1.2未显示出作为单敲除突变体的确定生长表型(Yamano等,2015)，并且也未报道LCI1转化体的生长差异(Ohnishi等,2010)。在pH 7.3和9.0，Cia8突变体中Ci依赖性光合作用的减少的速率和对Ci降低的亲和力(图5A-5C)提供了CIA8可能参与Ci摄取的证据。

虽然如一些动物蛋白中显示的，SBF转运蛋白通常与Na⁺离子的共转运有关(Romero等,2013)，但该实施例中的结果表明Na⁺离子可能不一定是CIA8蛋白功能所必需的(图9)。低Na⁺离子浓度(例如<10μM至100mM)不影响突变体和野生型细胞的生长。这可能是由于细胞培养物生长的TAP和MIN培养基不含添加的钠。因此，莱茵衣藻细胞在极低浓度的钠下生长良好。虽然海洋藻类中Na⁺偶联转运得到了充分的支持，但H⁺偶联转运被认为在淡水藻类中发挥作用。然而，诸如Na⁺或K⁺的其他离子可能与碳酸氢盐运动偶联。另一种可能性可能涉及碳酸氢盐与阴离子诸如氯离子的交换(反向转运)。

突变体中基因转录物的分析显示CIA8突变体是敲除型的。在野生型中，当高CO₂细胞被适应低CO₂时，Cia8转录物被上调(4倍)，并且该诱导与其他转运蛋白一致(图3和11A-11B)，尽管诱导水平并没有一些CCM蛋白那么高。在莱茵衣藻中通过转录物丰度对转运蛋白的调节已被充分记载(Ohnishi等,2010；Gao等,2015；Yamano等,2015)。该类型的调节可能(arguably)防止HCO₃ ^-转运蛋白在高CO₂条件下表达，那时因为CCM不起作用所以HCO₃ ^-转运蛋白不被需要。有趣的是，与野生型相比，这些其他转运蛋白在Cia8突变体中的相对表达被下调。这可以通过负反馈机制来解释，其中CIA8蛋白的损失导致胞质溶胶中HCO₃ ^-的积累，这负负向影响两种质膜转运蛋白(HLA3和LCI1)，以及后来的NAR1.2。可选地，这可能是因为Cia8基因可能对这些其他基因具有某种形式的调节控制，就像Nar1.2基因转录物最近已被证明调节Hla3的表达一样(Yamano等,2015)。

过去的一些研究已经假设在藻类CCM的类囊体膜上存在推定的HCO₃ ^-通道或转运蛋白(Raven,1997；Wang等,2011；Jungnick等,2014)。在该研究中，与CIA8融合的绿色荧光蛋白的信号在整个叶绿体中均匀地分布(图7)。整个细胞器的这种定位表明蛋白可能位于类囊体膜上，类囊体膜是将HCO₃ ^-直接泵入类囊体腔的战略位置。目前尚不清楚CIA8是同向转运蛋白还是反向转运蛋白。然而，如果它位于类囊体膜上，它可能使用在光中建立的跨膜H⁺梯度转运离子。如果CIA8位于类囊体膜上，位于叶绿体被膜上的NAR1.2蛋白将不能补偿CIA8的损失，并且这与我们在本研究中的结果一致。也是因为该定位结果，Cia8基因产物将对CCM功能作出显著贡献，并且可能对Ci摄取作出显著贡献。

植物、真菌和动物中的几乎所有SLC4样蛋白都具有这种硼酸盐转运能力作为原始功能(Parker和Boron,2013)。具有硼酸盐转运功能的SLC4样蛋白的普遍存在表明硼酸盐转运是这些蛋白的原始功能，因此碳酸氢盐和其他离子将是最近的获得物(Parker和Boron,2013)。基于蛋白的***发育和结合机制，硼酸盐和HCO₃ ^-转运***存在有趣的相似性。Characarolina细胞的生物物理研究表明，硼酸盐抑制碳酸氢盐流入细胞，即它们竞争相同的结合位点(Lucas，1975)。Frommer和von Wiren(2002)提供了肾脏中HCO₃ ^-转运与木质部中硼酸盐转运的比较，以支持这种相似性。另外，一项研究表明，BOR1(高等植物中唯一被表征的SLC蛋白)在拟南芥中转运硼(Takano等,2002)。根据该研究，BOR1与酵母膜蛋白YNL275w共有27％的同一性。尽管YNL275w蛋白主要是硼酸盐转运蛋白，但研究证明其在结合测定中摄取多种阴离子作为底物(包括HCO₃ ^-)的能力(Zhao和Reithmeier,2001)。因此有趣的是，CIA8蛋白与酵母YNL275w蛋白共有同一性，表明了共同的起源，并且生理功能的相似性。对这些功能关系的分析可以提供对SLC蛋白在莱茵衣藻中的碳酸氢盐转运中的作用的更好地理解。

总之，CIA8蛋白是在莱茵衣藻CCM中起作用的转运蛋白。当该基因被敲除时，当在限制CO₂条件下生长时，突变体显示出受损的Ci摄取和生长抑制。观察到Cia8基因编码推定的碳酸氢盐转运蛋白，其参与HCO₃ ^-的直接摄取到类囊体腔中，以用于CO₂固定。CIA8蛋白是疏水性的并且根据预测程序，具有与SBF/BASS亚家族中的其他已知转运蛋白相当的拓扑结构。

材料和方法

细胞培养和生长

莱茵衣藻培养条件与Ma等(2011)中描述的相同。D66菌株(nit2^-、cw15、mt⁺)从Dr.Rogene Schnell(University of Arkansas,Little Rock)获得，并且cc124菌株(nit1^-、nit2^-、mt^-)从杜克大学中心(http://www.chlamy.org/)的莱茵衣藻中获得。根据Sueoka(1960)制备Tris-乙酸盐-磷酸盐(Tris-Acetate-Phosphate)(TAP)和最小(Minimal)(MIN)培养基(不具有乙酸盐)。通过添加约1.2％(w/v)的琼脂制备生长培养基的TAP和MIN板。通过将来自TAP板的菌落接种到锥形瓶中的约100mL TAP液体培养基中来启动细胞培养。在连续照射(约100μmol m^-2s^-1)和摇动下使培养物生长至对数早期阶段，持续约48小时。收获生长于TAP的培养物并且用MIN培养基洗涤，并且重悬于MIN培养基中，该MIN培养基与高CO₂(空气中约5％[v/v]CO₂)相连，鼓泡约48小时，达到细胞密度OD₇₃₀在0.2和0.3之间(约2-3×10⁶个细胞mL^-1)。对于CCM诱导，将细胞转移至低CO₂(空气中约0.01％[v/v]CO₂)鼓泡4小时。

对低CO₂患病的突变体的诱变、分离、表型筛选

根据Jungnick等，(2014)，在诱变筛选中产生突变体。通过电穿孔将携带赋予巴龙霉素耐受性的AphVIII基因(para^R)的线性质粒(pSL18)转化到莱茵衣藻的D66菌株中(Shimogawara等,1998)。在包含抗生素巴龙霉素(约7.5μg mL^-1；Invitrogen)的TAP板上选择转化的细胞。在高CO₂室(空气中约5％[v/v]CO₂)和低CO₂室(空气中约0.01％[v/v]CO₂)中生长的菌株中筛选抗生素耐受性菌株，其中光照条件如以上提及的。将细胞在MIN板上划线并置于生长室中。通过将活跃生长的细胞悬浮于液体MIN培养基中至相同的细胞密度(OD₇₃₀＝0.15、0.07和0.03)并且将约15μl的每种悬浮液点样到MIN板上进行斑点试验。将它们置于高的、环境的和低的CO₂室中7天。使用环境气体监测仪(EGM-4,PP systems,Massachusetts)测量生长室中的CO₂浓度。

侧翼区的鉴定

使用衔接子介导的PCR方法鉴定AphVIII***侧翼的DNA区域(Pollock等，2016)。使用在Phytozome数据库10.3版本中的联合基因组研究所的莱茵衣藻((Merchant等,2007；Blaby等,2014)进行同源性搜索。

连锁分析

如先前描述(Moroney等,1986；Harris,2009)进行遗传杂交和四分体分析。简言之，将对数期的Cia8(mt⁺)和cc124(mt^-)细胞培养物在光照下转移至氮缺乏的TAP培养基中过夜以诱导配子发生。第二天早上，将约3mL的每种培养物混合，允许它们在光照下交配约3小时。将等分试样(约0.5mL)涂布在包含约4％琼脂的无氮的TAP培养基(TAP minus-Nitrogen medium)上。将板在黑暗中储存两周以允许接合子成熟。约14天之后，将接合子转移至约1.2％琼脂TAP培养基板用于使减数***发生。进行四分体解剖(Tetraddissections)，并通过巴龙霉素耐受性基因与在低CO₂下生长不良的后代的关联来确定连锁。

光合作用测定

将莱茵衣藻培养物在约100mL TAP培养基中异养地开始，持续48小时以达到对数期。将细胞离心并转移至250mL锥形瓶中并重悬于MIN培养基中，用约5％CO₂鼓泡直至它们达到细胞密度OD₇₃₀＝0.2-0.3(约3×10⁶个细胞mL^-1)。然后将培养物转移至低CO₂(约0.01％)持续约4小时以允许CCM诱导。根据Ma等(2011)估计外部Ci的亲和力(K_0.5[DIC])(溶解的无机碳)。在该方法中，将具有相当于约100μg叶绿素的细胞悬浮于约25mM HEPES-KOH缓冲液(pH约7.3)或约25mM CHES-KOH缓冲液(pH约9.0)中，用惰性氮气鼓泡，即不含CO₂。将细胞转移至以约300μmol m^-2s^-1照射的O₂电极室(Rank Brothers，Cambridge UK)中，并放置以耗尽缓冲液和细胞内空间中的任何剩余DIC。在内源CO₂耗尽时，未观察到净O₂释放。将已知浓度的NaHCO₃注射到室中并且测量O₂释放速率。K_0.5[DIC]被计算为半最大氧气释放速率所需的DIC浓度(Badger，1985)。通过组合叶绿素a和b来测量叶绿素含量。在100％甲醇中提取叶绿素，并使用分光光度计测量。将K_0.5(CO₂)作为达到半V_max O₂释放所需的CO₂浓度。

细胞内定位

使用EcoR1和NdeI限制性位点扩增整个Cre09.395700基因(4,846bp)并将其引入修饰的pSL18CrGFP载体中。***Cre09.395700基因，使得其与已经在载体中的衣藻属密码子优化的GFP基因(Fuhrmann等,1999)符合读框(in-frame)。用KpnI消化使载体线性化。用线性化载体通过电穿孔实现用Cia8基因片段转化野生型菌株D66，并使用PCR分析巴龙霉素耐受菌落。为了对GFP加标签的蛋白成像，将约5μL细胞固定在具有约1.5％低熔点琼脂糖的载玻片上。使用Leica Sp2共聚焦显微镜对细胞成像。将Kr/Ar激光器设定在约488nm的波长以激发eGFP和叶绿素两者，其中光电倍增管设定为约500-520nm以检测eGFP荧光，以及约660-700nm以检测叶绿素自发荧光。使用20×透镜对细胞成像。

基因表达分析

按照提供的指南(Invitrogen)，使用Triazol试剂进行RNA提取。使用约1μg总RNA作为cDNA合成的模板。根据制造商的说明，使用具有高GC含量的转录物的Superscript第一链合成***(Invitrogen，Carlsbad，CA)合成cDNA。将约100ng cDNA的等分试样用作模板与SYBR Select(Applied Biosystems，Foster City，CA)一起，按照制造商的说明(AppliedBiosystems，Foster City，CA)在ABI Prism 7000序列检测***中进行定量PCR。对于RT-PCR，将针对GAPDH基因特异性的引物归一化。对于q-RTPCR，使用CBLP基因作为这些实验中的对照(Mus等,2007)。用于各cDNA的引物列于表2中。

CIA8的补充

通过用包含野生型拷贝的Cia8基因的构建体转化Cia8细胞来实现Cia8突变体的补充。该构建体由包括5'UTR和3'UTR区的Cia8CDS片段(2,949bp)和1,080bp的启动子区片段组成。使用Not1限制性位点连接这些片段，然后将其连接到pGEM-T中。使用BamHI和SacI限制性位点将测序的片段克隆到穿梭载体pSP124s中。序列获自Phytozome Version 10.2(phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal/html)。用于扩增Cia8基因组片段的引物示于表2中。电穿孔方法用于细胞转化，并且选择博来霉素耐受性菌株(Shimogawara等,1998)。通过使用PCR确认选择的衣藻属菌株中补充的DNA的存在。

Ci摄取测定

在pH约9.0(约25℃)进行H¹⁴CO₃的活性物质摄取，其中通过硅油离心-过滤终止约15秒的摄取时间((Price等,2004)。从约25mM储备液(pH约9.5)添加KHCO₃等分试样。通过应用实验确定的速率常数计算在约9.0的pH值来自HCO₃ ^-的CO₂供应速率。表1显示了野生型D66和Cia8突变体细胞的最大氧气释放活性(V_max)和Ci亲和力，K_(0.5)值。使细胞在高CO₂下生长48小时并适应低CO₂ 4小时。括号内：±SE；n＝3。

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序列表

<110>路易斯安娜州立大学监测委员会，农业和机械学院

<120> 绿藻碳酸氢盐转运蛋白及其用途

<130> 222220-2080

<150> US 62/352,278

<151> 2016-06-20

<160> 39

<170> PatentIn 3.5 版本

<210> 1

<211> 4846

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Cia8基因组DNA序列，基因座名称：Cre09.g395700

<400> 1

gtatacatga tagcacgcct tgatatagcc caagaattgt gaaacgaaat tcggctttct 60

tgggcgcgta gggctacatt ggcaggcctt accttaaaaa aagatatatc actttcaccc 120

aacgatgtgc gccggcattc ggtcagcatc aacggcgggc ctgtcgacga cggcaatgca 180

gccgactcga gcgctcattc tatactcgca cctaaggacg gcgcctcgtt tcaatgtgct 240

tcaagagcct tgcttgcgga gttttgggtc ggtgtcggcg ttttggtcgc gccctagtca 300

tagtcggctc gtgggttgca acgccgcagc gggcgacgcc gcagcagcag gcgggcccgt 360

gcctctgccg ggcccgccac aggggccggc gccctccagc cctgcagcat ccacatcaga 420

ttctcaaaat cttaagcaca gtcatccgac gccagcagca cctgcaccag cagcctcatt 480

ggaacctgcc tccgcggcta gcggcgccgg cgtcagcacc agcaccagcg ccagcaccag 540

cgccgccagt accaacagca gcatagacag cagcgccacc acgaacggca gcagtggcgg 600

tggcgccgcg ccatcagctg tgtccacggt ggtgggctgg ctgcgcaagc tggtgacgga 660

gcagtacctg ccgctcatgc tgctggccgc gctggtggcg gcggcgctgc aggtaggtgg 720

ggacgcgcgg tcgctcggtg cgtgcgaggg aggggcaccg cgccacagcg ccccgccggc 780

gagagaaggg catgatactg cgtctggcgc gcgtgtacat cttcaatgcg aagggaaatg 840

ctaggtgatg ttagtttctc gatccgcccg cgttatcaca cggtactaac gtgtctgcgt 900

gtgttggctc cctcctccat tccgcagccg tcctggggtc tggcggcctc taagacgcag 960

ctgcagacgg cggtcacctt caccatcttc gtgctgcagg tgtgattgtc atggtgtggc 1020

tggtgagaag gttgtggacg tggtagtggt tggggcgatg atggtggtca tggtggtatt 1080

ggtggtgtga cgccgcggtc cttgtgtgcg tccggccctg aaccctggct ctagctctag 1140

tgcacctatg cacttccctg gcggaagctt tgtgttcatg tcggcacttg gtggtaagcg 1200

acccgaccac cgaaccgccg cacctgatgc cgccacctca aaacacacac acagggagtc 1260

atgctgcggc agggcgaggc gaagaaggcg cttggggcgg ccggtaagtg gccggcgggt 1320

gcgggcaggc gggggctgcc tactgctctt tgcaggtcct ggacagctgc aggccctgcc 1380

ggccatgtta ccctcgttac gcacgtgaca gcatcgcctc gctagttgca tggtcgtcaa 1440

gtttttttgc atcaccagta cacacacaca cacacacaca cacgtaccca acggcatgcc 1500

aacaccctgc accggctgtg tgtgtgtgtg ccgcgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 1560

gtgtgtgtgt gtgtgcggcg tgcaggcgcc atcgcctggg gcatggcctc catcctcctc 1620

atcacgccac tgctggcgcc actggcgggg gcgctgccgc tgcagccgcc tggactggcg 1680

ctgggtgggt ggcggaggcg gtgcggtgcg ggcaggcgcg agctgcgtcg gggcgcctac 1740

atgcaagggc cgtggttgga aacggcacca tagaaccaat gccagcatat gcatgcgcgc 1800

acattccatg ccgccgagtg tacttgatga cgcgttgcgc ggctccggac atttaagcac 1860

tggcatgcgg gcatcaaccc ccgcgcggcc cgccgtttgg cgccgccgct gttgcgaccc 1920

ctgccgccct tgcccctgcc gctcctgctg caggcctgct tgtgttcgga tgcatgccta 1980

ccaccctgtc cagcggcgtg gcgcttacac aggcgcgtga cacgtgtgtg tgtgtgtgtg 2040

tgactgtgtg tgtgtgcgct tacaacgcgt ctgcacagag tgccagtcac cagcgtgata 2100

ctgctgtgca cccaacgtcg ttgatgcgcg gggtccgcgt gtggggtgtg gccatacggt 2160

atggctgcgc agccatgccc ctcgtgccca cacgctgctg tgacaccaca gaacgcgcac 2220

accgacatac ccaacacacc ccacacacct tccccttgtg ctttcctcac tcacacacac 2280

gtacacacaa acgcacacac atttctgtcc tcccaggttc tgggcggcaa cacggccctg 2340

gcgctgctgc tgaccatcgc caccaacctg gcctccgtgt tcacactgcc cttcctgctg 2400

ccctgggcgc tcaaggtggg tgtagcgcgt ggggcatgag gcgctttgac tttggcaact 2460

ttgtgtgcgc ctcacgtggg ctgcacccgt gggggcagca cccccgctag ctaggtactg 2520

tagtaggggc gcggtaatgc ggcaggggtc ggcaccgtgc cttcacactc cggggaggag 2580

ggagagaatg gattgggtgg agtgcatggc tggatggcag cgacatatgc tcaggtgcgt 2640

ggcgggtatt gctcgccatc accgccatca aagccgattg cacctccttc ccttgcttgc 2700

ttgcgccccc gcgggactgc acccaaaact gtaatgcaga cgaccgcgtc gatcggaggc 2760

tttggcgccg ccgccgcggt cgcgggcggc tccgccgctg ctgctgtgcg gctggacccc 2820

gtgccgctgc tggtgcagct ggtgcagtgc atcctgctgc ccacactgct gggcgccggc 2880

gtgcggggcg ccagcgaggg tgcgtgcggt gtggtgtggt ggggtggggt ggggatggag 2940

ggatggaggg cggcgtgttg ctttgtgtgc gcacacatgc gcgtatggtg gttttctccc 3000

agacggtgcc cgaggtgtac tgccggcgcg tgtgcacatg tacccacacg cgcgccacag 3060

tgccacacgc gcgctgaccc cgcccaccgg ccttgctccc tgctgtttgt cacctgtcgc 3120

ctacgcctgt cgcctcacat gtcgtctcac ctggcgcctc acctccacac atgacaggcc 3180

tgcgcagctg ggtggatgcc aaccggcgca cactgagtgt catcagcggc ggcctgttgt 3240

cactggtgcc ctggatgcag gcgcgtgcgt ggagggcggg cgggcgcgag cgcggtgccg 3300

ggttgccttg gttgctggca gttctggtat tggattgccg tgctgttgcc aacttggggc 3360

agacgacgtg gttccacacc gcaagtccca ccgcgcatgc acgtctccac cgtcatcctc 3420

actaaccacc accaaccgct ttgtacgtca ccgtacggta tgcatgtgtg tgtgtacgaa 3480

ccgccgccgc cgccgcaggt cagcaaggcc ctggctcagg gcgtgacggt ggcgccggcg 3540

gcgctggcgg cggctgtggc ctggtcgctg gccttccatg tcgtgtacct ggggctcaac 3600

tgcggagccg ccacggtggg gcgcctgcct gtgtgcctgt gtgcctgagt gacggcgcgg 3660

gcaggagtgg cacgcagctg gagtcacgcc gccaacattc gtgcacacac acattgcgca 3720

tgcacacaat gcacatacta ttgaggtgcc ggcggttgcc atgagccggc aatgcggcca 3780

aacccacaca acggccctgg cacgctcgca tcacacacga cacatgtcac atgcaacacc 3840

ctcaacacgc actcacgccg tccctccaca cgcacccacc gtatgtgcac acgtctgaat 3900

gacgcagctg ttgaggttgg gcggttctga cccggtggcg gcggcggcca cgcggcgggc 3960

gctgatcatt gtggcctcac agaagactct gcctgtggcc atggcggtgc gtggtggtgg 4020

ggtgggggtg tcgtggaggt gtgatgggaa gttttgtgtg ctacagtgta cgtggtgggg 4080

aggcggtccg gcataggcgg gtgtaccctt taggatgcgc atattgtagt gccagcgtgt 4140

agagatagtg ccgcctttac accaggttgc ttggtgatcg tgctgctgcg ctcgtttgtg 4200

ctcactcacc cactcccaca cacgcgcgca cgcacactcc cgggacaggt gctgggccgg 4260

ctggcgcctg cggtgggcgc cgaggcggcg ggctgcgcgg cggtgacggc tgtgttcagt 4320

cacctggcgc agacgtgtgt ggacttcgca ctggtgtcca ggtgggaggg aggagggggt 4380

agggtagttt catgtgatcc caagcaaccc aagtcccaga accagcccac agttcttgtc 4440

gtcgttggcc gttcatgggg gggcgagcat ggtggcagtc gtaagggacg atgggtgtgt 4500

gctttggtga gaggcttgca tcttttcggc gatcgcatgc tacttgatca ctgagcaggt 4560

tgagcgcttg atacgagccg tgtgtcggac ctgaccatgg gacctggcca ctactggctg 4620

gatgctgtga tgtgtgcagg tggctggagc acattcagcg gcgagacatc aaagccaaca 4680

aggcggccta gctggagcga gggggcattt gctgcaccta gctggagtga gggggcatat 4740

gctgcaccta gctggagcga ggcggcatat gctgcagcag caggaggcgc tcgcatagct 4800

ggaggagggc ctgtgcgtgg gctcgggagg cacgaaccta tgaaag 4846

<210> 2

<211> 1869

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Cia8转录物序列；Genbank登录号：

Cre09.g395700.t1.1

<400> 2

gtatacatga tagcacgcct tgatatagcc caagaattgt gaaacgaaat tcggctttct 60

tgggcgcgta gggctacatt ggcaggcctt accttaaaaa aagatatatc actttcaccc 120

aacgatgtgc gccggcattc ggtcagcatc aacggcgggc ctgtcgacga cggcaatgca 180

gccgactcga gcgctcattc tatactcgca cctaaggacg gcgcctcgtt tcaatgtgct 240

tcaagagcct tgcttgcgga gttttgggtc ggtgtcggcg ttttggtcgc gccctagtca 300

tagtcggctc gtgggttgca acgccgcagc gggcgacgcc gcagcagcag gcgggcccgt 360

gcctctgccg ggcccgccac aggggccggc gccctccagc cctgcagcat ccacatcaga 420

ttctcaaaat cttaagcaca gtcatccgac gccagcagca cctgcaccag cagcctcatt 480

ggaacctgcc tccgcggcta gcggcgccgg cgtcagcacc agcaccagcg ccagcaccag 540

cgccgccagt accaacagca gcatagacag cagcgccacc acgaacggca gcagtggcgg 600

tggcgccgcg ccatcagctg tgtccacggt ggtgggctgg ctgcgcaagc tggtgacgga 660

gcagtacctg ccgctcatgc tgctggccgc gctggtggcg gcggcgctgc agccgtcctg 720

gggtctggcg gcctctaaga cgcagctgca gacggcggtc accttcacca tcttcgtgct 780

gcagggagtc atgctgcggc agggcgaggc gaagaaggcg cttggggcgg ccggcgccat 840

cgcctggggc atggcctcca tcctcctcat cacgccactg ctggcgccac tggcgggggc 900

gctgccgctg cagccgcctg gactggcgct gggcctgctt gtgttcggat gcatgcctac 960

caccctgtcc agcggcgtgg cgcttacaca ggttctgggc ggcaacacgg ccctggcgct 1020

gctgctgacc atcgccacca acctggcctc cgtgttcaca ctgcccttcc tgctgccctg 1080

ggcgctcaag acgaccgcgt cgatcggagg ctttggcgcc gccgccgcgg tcgcgggcgg 1140

ctccgccgct gctgctgtgc ggctggaccc cgtgccgctg ctggtgcagc tggtgcagtg 1200

catcctgctg cccacactgc tgggcgccgg cgtgcggggc gccagcgagg gcctgcgcag 1260

ctgggtggat gccaaccggc gcacactgag tgtcatcagc ggcggcctgt tgtcactggt 1320

gccctggatg caggtcagca aggccctggc tcagggcgtg acggtggcgc cggcggcgct 1380

ggcggcggct gtggcctggt cgctggcctt ccatgtcgtg tacctggggc tcaactgcgg 1440

agccgccacg ctgttgaggt tgggcggttc tgacccggtg gcggcggcgg ccacgcggcg 1500

ggcgctgatc attgtggcct cacagaagac tctgcctgtg gccatggcgg tgctgggccg 1560

gctggcgcct gcggtgggcg ccgaggcggc gggctgcgcg gcggtgacgg ctgtgttcag 1620

tcacctggcg cagacgtgtg tggacttcgc actggtgtcc aggtggctgg agcacattca 1680

gcggcgagac atcaaagcca acaaggcggc ctagctggag cgagggggca tttgctgcac 1740

ctagctggag tgagggggca tatgctgcac ctagctggag cgaggcggca tatgctgcag 1800

cagcaggagg cgctcgcata gctggaggag ggcctgtgcg tgggctcggg aggcacgaac 1860

ctatgaaag 1869

<210> 3

<211> 1590

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Cia8 cDNA序列；GenBank登录号： Cre09.g395700.t1.1

CDS

<400> 3

atgtgcgccg gcattcggtc agcatcaacg gcgggcctgt cgacgacggc aatgcagccg 60

actcgagcgc tcattctata ctcgcaccta aggacggcgc ctcgtttcaa tgtgcttcaa 120

gagccttgct tgcggagttt tgggtcggtg tcggcgtttt ggtcgcgccc tagtcatagt 180

cggctcgtgg gttgcaacgc cgcagcgggc gacgccgcag cagcaggcgg gcccgtgcct 240

ctgccgggcc cgccacaggg gccggcgccc tccagccctg cagcatccac atcagattct 300

caaaatctta agcacagtca tccgacgcca gcagcacctg caccagcagc ctcattggaa 360

cctgcctccg cggctagcgg cgccggcgtc agcaccagca ccagcgccag caccagcgcc 420

gccagtacca acagcagcat agacagcagc gccaccacga acggcagcag tggcggtggc 480

gccgcgccat cagctgtgtc cacggtggtg ggctggctgc gcaagctggt gacggagcag 540

tacctgccgc tcatgctgct ggccgcgctg gtggcggcgg cgctgcagcc gtcctggggt 600

ctggcggcct ctaagacgca gctgcagacg gcggtcacct tcaccatctt cgtgctgcag 660

ggagtcatgc tgcggcaggg cgaggcgaag aaggcgcttg gggcggccgg cgccatcgcc 720

tggggcatgg cctccatcct cctcatcacg ccactgctgg cgccactggc gggggcgctg 780

ccgctgcagc cgcctggact ggcgctgggc ctgcttgtgt tcggatgcat gcctaccacc 840

ctgtccagcg gcgtggcgct tacacaggtt ctgggcggca acacggccct ggcgctgctg 900

ctgaccatcg ccaccaacct ggcctccgtg ttcacactgc ccttcctgct gccctgggcg 960

ctcaagacga ccgcgtcgat cggaggcttt ggcgccgccg ccgcggtcgc gggcggctcc 1020

gccgctgctg ctgtgcggct ggaccccgtg ccgctgctgg tgcagctggt gcagtgcatc 1080

ctgctgccca cactgctggg cgccggcgtg cggggcgcca gcgagggcct gcgcagctgg 1140

gtggatgcca accggcgcac actgagtgtc atcagcggcg gcctgttgtc actggtgccc 1200

tggatgcagg tcagcaaggc cctggctcag ggcgtgacgg tggcgccggc ggcgctggcg 1260

gcggctgtgg cctggtcgct ggccttccat gtcgtgtacc tggggctcaa ctgcggagcc 1320

gccacgctgt tgaggttggg cggttctgac ccggtggcgg cggcggccac gcggcgggcg 1380

ctgatcattg tggcctcaca gaagactctg cctgtggcca tggcggtgct gggccggctg 1440

gcgcctgcgg tgggcgccga ggcggcgggc tgcgcggcgg tgacggctgt gttcagtcac 1500

ctggcgcaga cgtgtgtgga cttcgcactg gtgtccaggt ggctggagca cattcagcgg 1560

cgagacatca aagccaacaa ggcggcctag 1590

<210> 4

<211> 529

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Cia8多肽序列

<400> 4

Met Cys Ala Gly Ile Arg Ser Ala Ser Thr Ala Gly Leu Ser Thr Thr

1 5 10 15

Ala Met Gln Pro Thr Arg Ala Leu Ile Leu Tyr Ser His Leu Arg Thr

20 25 30

Ala Pro Arg Phe Asn Val Leu Gln Glu Pro Cys Leu Arg Ser Phe Gly

35 40 45

Ser Val Ser Ala Phe Trp Ser Arg Pro Ser His Ser Arg Leu Val Gly

50 55 60

Cys Asn Ala Ala Ala Gly Asp Ala Ala Ala Ala Gly Gly Pro Val Pro

65 70 75 80

Leu Pro Gly Pro Pro Gln Gly Pro Ala Pro Ser Ser Pro Ala Ala Ser

85 90 95

Thr Ser Asp Ser Gln Asn Leu Lys His Ser His Pro Thr Pro Ala Ala

100 105 110

Pro Ala Pro Ala Ala Ser Leu Glu Pro Ala Ser Ala Ala Ser Gly Ala

115 120 125

Gly Val Ser Thr Ser Thr Ser Ala Ser Thr Ser Ala Ala Ser Thr Asn

130 135 140

Ser Ser Ile Asp Ser Ser Ala Thr Thr Asn Gly Ser Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Ala Ala Pro Ser Ala Val Ser Thr Val Val Gly Trp Leu Arg Lys Leu

165 170 175

Val Thr Glu Gln Tyr Leu Pro Leu Met Leu Leu Ala Ala Leu Val Ala

180 185 190

Ala Ala Leu Gln Pro Ser Trp Gly Leu Ala Ala Ser Lys Thr Gln Leu

195 200 205

Gln Thr Ala Val Thr Phe Thr Ile Phe Val Leu Gln Gly Val Met Leu

210 215 220

Arg Gln Gly Glu Ala Lys Lys Ala Leu Gly Ala Ala Gly Ala Ile Ala

225 230 235 240

Trp Gly Met Ala Ser Ile Leu Leu Ile Thr Pro Leu Leu Ala Pro Leu

245 250 255

Ala Gly Ala Leu Pro Leu Gln Pro Pro Gly Leu Ala Leu Gly Leu Leu

260 265 270

Val Phe Gly Cys Met Pro Thr Thr Leu Ser Ser Gly Val Ala Leu Thr

275 280 285

Gln Val Leu Gly Gly Asn Thr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Thr Ile Ala

290 295 300

Thr Asn Leu Ala Ser Val Phe Thr Leu Pro Phe Leu Leu Pro Trp Ala

305 310 315 320

Leu Lys Thr Thr Ala Ser Ile Gly Gly Phe Gly Ala Ala Ala Ala Val

325 330 335

Ala Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Val Arg Leu Asp Pro Val Pro Leu

340 345 350

Leu Val Gln Leu Val Gln Cys Ile Leu Leu Pro Thr Leu Leu Gly Ala

355 360 365

Gly Val Arg Gly Ala Ser Glu Gly Leu Arg Ser Trp Val Asp Ala Asn

370 375 380

Arg Arg Thr Leu Ser Val Ile Ser Gly Gly Leu Leu Ser Leu Val Pro

385 390 395 400

Trp Met Gln Val Ser Lys Ala Leu Ala Gln Gly Val Thr Val Ala Pro

405 410 415

Ala Ala Leu Ala Ala Ala Val Ala Trp Ser Leu Ala Phe His Val Val

420 425 430

Tyr Leu Gly Leu Asn Cys Gly Ala Ala Thr Leu Leu Arg Leu Gly Gly

435 440 445

Ser Asp Pro Val Ala Ala Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Ile Ile Val

450 455 460

Ala Ser Gln Lys Thr Leu Pro Val Ala Met Ala Val Leu Gly Arg Leu

465 470 475 480

Ala Pro Ala Val Gly Ala Glu Ala Ala Gly Cys Ala Ala Val Thr Ala

485 490 495

Val Phe Ser His Leu Ala Gln Thr Cys Val Asp Phe Ala Leu Val Ser

500 505 510

Arg Trp Leu Glu His Ile Gln Arg Arg Asp Ile Lys Ala Asn Lys Ala

515 520 525

Ala

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物CIA8-F (正向引物)

<400> 5

gcacatacta ttgaggtgcc g 21

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CIA8-R (反向引物)

<400> 6

cggctgtgtt cagtcacct 19

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物 RIM3-1

<400> 7

cggtatcgga ggaaaagctg 20

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> RIM3-2

<400> 8

taccggctgt tggacgagtt cttctg 26

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> RX1

<400> 9

gccctcatag cccgccaaat cag 23

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> RX2

<400> 10

aagccgataa acaccagccc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物CIA8CDSF2

<400> 11

cagtaccaac agcagcatag 20

<210> 12

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物Cre09.g395700_CIA8-F2

<400> 12

atgtgcgccg gcattcg 17

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物Cre09.g395700_CIA8-R2

<400> 13

ctaggccgcc ttgttggc 18

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物ACTIN F

<400> 14

gccagaagga ctcgtacgtt 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物ACTIN R

<400> 15

cgccagagtc cagcacgata 20

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物GAPDH F

<400> 16

atggcgccaa agaaggttct tc 22

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物GAPDH R

<400> 17

ctacatcttg gccgccacga tc 22

<210> 18

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物CIA8CDSEcoRIRnostop

<400> 18

gatcgaattc acggccgcct tgttggcttt g 31

<210> 19

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物CIA8CDSNdeIF

<400> 19

catgaccata tgatgtgcgc cggcattcgg tc 32

<210> 20

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物ShortGFP-F

<400> 20

ccaagggcga ggagct 16

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物 CrGFP-R

<400> 21

cttgtacagc tcgtccatg 19

<210> 22

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物CIA8transcr_R_BamHI

<400> 22

taggatccct ttcataggtt cgtgcctcc 29

<210> 23

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物 CIA8prom_F_SacI

<400> 23

cagagctcct caggcaaggt gatcaagtg 29

<210> 24

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物CIA8prom_R_NotI

<400> 24

actagcggcc gcgtccgcat gttgcttatt tc 32

<210> 25

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物CIA8transcr_F_NotI

<400> 25

actagcggcc gcgtatacat gatagcacgc cttg 34

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物HLA3_4,765F

<400> 26

gagcgttgtg tgcactgttc 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物HLA3_4,884R

<400> 27

tctctctgcg gctacatcct 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Nar1.2_1,736F

<400> 28

agttgaggca ggttgagagc 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物Nar1.2_1,855R

<400> 29

ccctgaccag ttgttgccat 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物LCI1_1,125F

<400> 30

tggtttactg gccgcttctg 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物LCI1_1,244R

<400> 31

tcacacagcc aatcgaggtt 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物CIA8_1,745F

<400> 32

ctggagtgag ggggcatatg 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CIA8_1,867R

<400> 33

ttcataggtt cgtgcctccc 20

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物SLC_cre09.g393250_1,874F

<400> 34

cgttactccc gtactcgtac c 21

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物SLC_cre09.g393250_1,993R

<400> 35

gcccaccgaa ctacagagag 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物SLC_cre02.g147450_2,777F

<400> 36

ataggcggca gggaaaactc 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物SLC_cre02.g147450_2,896R

<400> 37

tttgtggaat ccgcgtgaca 20

<210> 38

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物CBLPF

<400> 38

cttctcgccc atgaccac 18

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物CBLPR

<400> 39

cccaccaggt tgttcttcag 20

Claims

1.一种cDNA分子，所述cDNA分子编码绿藻Cia8蛋白。

2.如权利要求1所述的cDNA分子，其中所述cDNA分子与SEQ ID NO:3具有100％的序列同一性。

3.如权利要求1所述的cDNA分子，其中所述cDNA分子与SEQ ID NO:3的任一个具有大于或等于约90％的序列同一性。

4.如权利要求1-3中任一项所述的cDNA分子，其中所述绿藻Cia8蛋白结合和/或转运碳酸氢盐。

5.如权利要求1-3中任一项所述的cDNA分子，其中所述cDNA分子编码与SEQ ID NO:4的任一个具有大于或等于约90％的序列同一性的多肽。

6.一种重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含如权利要求1-5中任一项所述的cDNA分子，其中所述cDNA分子与调节序列被可操作地连接。

7.一种分离的多肽分子，所述分离的多肽分子对应于来自绿藻的Cia8多肽。

8.如权利要求7所述的分离的多肽分子，其中所述多肽分子与SEQ ID NO:4的任一个具有100％的序列同一性。

9.如权利要求7所述的分离的多肽，其中所述多肽分子与SEQ ID NO:4的任一个具有约90％或更高的序列同一性。

10.如权利要求7所述分离的多肽，其中所述多肽分子与SEQ ID NO:4的任一个具有约70％或更高的序列同一性。

11.如权利要求7-10所述的分离的多肽，其中所述多肽结合和/或转运碳酸氢盐。

12.一种载体，所述载体包含如权利要求1-5中任一项所述的cDNA分子。

13.一种载体，所述载体包含权利要求6所述的重组多核苷酸。

14.一种载体，所述载体包含cDNA分子，其中所述cDNA分子编码与SEQ ID NO4:4的任一个具有约90％或更高的序列同一性的多肽。

15.如权利要求12-14中任一项所述的载体，所述载体还包含至少一种可选择标志物序列。

16.一种细胞，所述细胞包含如权利要求12-15中任一项所述的载体。

17.如权利要求16所述的细胞，其中所述细胞是植物、细菌、酵母或真菌细胞。

18.一种细胞的群体，其中至少一种细胞包含至少一个如权利要求12-15中任一项所述的载体。

19.如权利要求18所述的细胞的群体，所述细胞的群体还包含至少一个优化蛋白产量、蛋白回收或蛋白翻译后修饰的载体。

20.如权利要求18所述的细胞的群体，其中所有细胞来自同一物种。

21.如权利要求18所述的细胞的群体，其中一个或更多个细胞来自不同物种。

22.如权利要求18-21所述的细胞的群体，其中所述群体内约1％至约100％的细胞包含相同类型的载体。

23.一种转基因植物，所述转基因植物包含：包含重组多核苷酸的多于一个细胞，所述重组多核苷酸包含：编码绿藻Cia8多肽的DNA分子，其中所述DNA分子与SEQ ID NO:1-3的任一个具有至少约90％的序列同一性；和至少一个调节序列，所述至少一个调节序列与所述DNA分子可操作地连接使得所述绿藻Cia8多肽在所述植物细胞中被表达。

24.如权利要求23所述的转基因植物，其中所述绿藻Cia8多肽能够结合和/或转运碳酸氢盐。

25.如权利要求23-24中任一项所述的转基因植物，其中所述DNA分子与SEQ ID NO:1-3的任一个相同。

26.如权利要求23-24中任一项所述的转基因植物，其中所述DNA分子与SEQ ID NO:1-3的任一个具有约90％或更高的序列同一性。

27.如权利要求23-24中任一项所述的转基因植物，其中所述DNA分子编码具有与SEQID NO:4相同的序列的多肽。

28.如权利要求26-28中任一项所述的转基因植物，其中所述DNA分子编码与SEQ IDNO:4具有约90％或更高序列同一性的多肽。

29.一种用于相对于野生型植物增加植物中的绿藻Cia8多肽的表达的方法，所述方法包括：

将编码绿藻Cia8多肽的DNA分子和与所述DNA分子可操作地连接的至少一种调节序列整合到所述植物的至少一个细胞的基因组中，使得所述绿藻Cia8多肽在植物细胞中表达，其中所述DNA分子与SEQ ID NO:1-3的任一个具有至少约90％的序列同一性；以及使所述植物生长，其中绿藻Cia8多肽相对于野生型植物细胞被过表达。