JP2021530213A - 緑藻類ベストロフィン重炭酸塩トランスポーター - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2018年11月19日に出願された米国仮出願第62/769,214号、および2018年7月13日に出願された米国仮出願第62/697,840号の優先権を主張し、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ASCIIテキストファイルによる以下の提出物の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる:配列表のコンピュータ読み取り可能な形式(CRF)(ファイル名:794542000140SEQLIST.TXT、記録日:2019年6月28日、サイズ:461KB)。
本開示は、遺伝子修飾された植物に関する。特に、本開示は、好ましくは増加した炭素利用効率を提供する緑藻類ベストロフィン重炭酸塩トランスポーターを含有する遺伝子修飾された植物に関する。
緑藻類および他の光合成水生生物は、自然環境において低い、そして変動するCO2条件に曝されることが多い。これらの生物のCO2利用能力を低下させる可能性がある様々な要因が存在し、水中での気体のゆっくりとした拡散、2つの無機炭素(Ci)形態である二酸化炭素(CO2)および重炭酸塩(HCO3 −)のゆっくりとした相互変換、ならびにpH変化を含む。変化しやすい自然環境の結果として、ほとんどの水生光合成生物は、限られたCO2条件下で誘導可能な二酸化炭素濃縮機構(carbon dioxide concentrating mechanism、CCM)を進化させてきた。CCMは、緑藻類などの水生光合成生物がルビスコ(Rubisco)による固定のためにCiを効率的に濃縮することを可能にする(Giordanoら、Ann Rev Plant Bio 56:99−131,2005)。緑藻類であるクラミドモナス・ラインハルディ(Chlamydomonas reinhardtii)の現行のCCMモデル(Jungnickら、Photosynth Res 121:159−173,2014;WangおよびSpalding、Plant Physiol 166:2040−2050,2014)は、膜を通したCi、特にHCO3 −の移動を可能にするCCMの主要な成分として、原形質膜上および葉緑体包膜上の重炭酸塩トランスポーターを含む。CO2およびHCO3 −を相互変換する炭酸脱水酵素は、CCMモデルのさらなる重要な成分である(Mitraら、Can J Bot 83:780−795、2005;Moroneyら、Photosynth Res 109:133−149、2011)。
これらの需要を満たすために、本開示は、重炭酸塩輸送タンパク質として働く緑藻類ベストロフィンポリペプチドを対象とする。本開示の特定の態様は、遺伝子改変された植物、またはその一部であって、前記植物は、重炭酸塩が前記植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質からストロマへと膜を通過する能力を増加させるか、もしくは提供する1つ以上の遺伝子改変を含む、植物、またはその一部に関する。いくつかの態様において、本開示は、遺伝子改変された植物、またはその一部であって、前記植物は、重炭酸塩が前記植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する能力を増加させるか、もしくは提供する1つ以上の遺伝子改変を含む、植物、またはその一部に関する。いくつかの実施形態において、重炭酸塩が膜を通過する能力の獲得は、少なくとも1つの緑藻類ベストロフィンポリペプチドの発現の結果である。いくつかの実施形態において、前記緑藻類ベストロフィンポリペプチドは、配列番号1、配列番号2、または配列番号3の群から選択される。いくつかの実施形態において、重炭酸塩が膜を通過する能力の増加または提供は:配列番号1に対して、少なくとも70%の配列同一性、少なくとも75%の配列同一性、少なくとも80%の配列同一性、少なくとも85%の配列同一性、少なくとも90%の配列同一性、または少なくとも95%の配列同一性を有する第1のポリペプチド;配列番号2に対して、少なくとも70%の配列同一性、少なくとも75%の配列同一性、少なくとも80%の配列同一性、少なくとも85%の配列同一性、少なくとも90%の配列同一性、または少なくとも95%の配列同一性を有する第2のポリペプチド;配列番号3に対して、少なくとも70%の配列同一性、少なくとも75%の配列同一性、少なくとも80%の配列同一性、少なくとも85%の配列同一性、少なくとも90%の配列同一性、または少なくとも95%の配列同一性を有する第3のポリペプチド、または;それらの任意の組み合わせ;の群から選択されるポリペプチドの発現の結果である。いくつかの実施形態において、重炭酸塩が膜を通過する能力の増加または提供は:配列番号1に対して、少なくとも95%の配列同一性を有する第1のポリペプチド;配列番号2に対して、少なくとも95%の配列同一性を有する第2のポリペプチド;配列番号3に対して、少なくとも95%の配列同一性を有する第3のポリペプチド、または;それらの任意の組み合わせ;の群から選択されるポリペプチドの発現の結果である。いくつかの実施形態において、重炭酸塩が膜を通過する能力の増加または提供は:配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、または配列番号111の群から選択され;好ましくは、配列番号10、配列番号11、配列番号15、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号42、配列番号62、または配列番号63の群から選択されるポリペプチドの発現の結果である。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドは、植物細胞内の少なくとも1つの葉緑体の葉緑体包膜またはチラコイド膜に局在している。いくつかの実施形態において、前記植物細胞は、葉肉細胞である。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドは、前記植物の葉肉細胞の少なくとも70%において発現される。
図1A〜1Dは、クラミドモナス・ラインハルディ(C. reinhardtii)遺伝子(BST1、BST2、およびBST3)およびタンパク質(BST1、BST2、およびBST3)の互いに対する類似性、ならびにBST1〜3の他のベストロフィンファミリータンパク質に対する類似性を示す。図1Aは、BST1、BST2、およびBST3遺伝子の模式図を示し、明灰色の四角はエキソンを表し、細い灰色の線はイントロンを表し、太い灰色の線は非翻訳領域(untranslated region、UTR)を表し、重ねられた線(エキソンおよびイントロンに重ねられている)は3つの遺伝子によって共有される共通領域を示す。図1Bは、クラミドモナス・ラインハルディゲノム上のBST1、BST2、およびBST3遺伝子の位置および方向を示す。図1Cは、BST1(配列番号1)、BST2(配列番号2)、およびBST3(配列番号3)タンパク質のアミノ酸アラインメントを示し、下端の行におけるアスタリスクは、3つのタンパク質すべてにおいて同一であるアミノ酸を示す。図1Dは、維管束植物(上から2番目の群)、非維管束植物(上から3番目の群)、珪藻類(上から4番目の群)、および緑藻類(下端の群)における、クラミドモナス・ラインハルディBST1、BST2およびBST3ホモログのタンパク質配列の系統樹を示す。
以下の説明は、例示的な方法、パラメータなどを記載する。しかしながら、そのような説明は、本開示の範囲に対する限定としては意図されておらず、代わりに、例示的な実施形態の説明として提供されることが認識されるべきである。
本開示の特定の態様は、遺伝子改変された植物、またはその一部であって、植物は、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質からストロマへと膜を通過する能力を増加させるか、もしくは提供する1つ以上の遺伝子改変を含む、植物、またはその一部に関する。いくつかの態様において、本開示は、遺伝子改変された植物、またはその一部であって、植物は、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する能力を増加させるか、もしくは提供する1つ以上の遺伝子改変を含む、植物、またはその一部に関する。いくつかの実施形態において、重炭酸塩が膜を通過する能力の獲得は、少なくとも1つの緑藻類ベストロフィンポリペプチドの発現の結果である。いくつかの実施形態において、重炭酸塩が膜を通過する能力の獲得は、2つまたは3つの緑藻類ベストロフィンポリペプチドの発現の結果である。いくつかの実施形態において、重炭酸塩が膜を通過する能力の獲得は、4つ以上(例えば、5、6、7、8、9、10つ)の緑藻類ベストロフィンポリペプチドの発現の結果である。いくつかの実施形態において、緑藻類ベストロフィンポリペプチドは、配列番号1(すなわち、BESTROPHIN1、BST1、Cre16.g662600.t1.2)、配列番号2(すなわち、BESTROPHIN2、BST2、Cre16.g663400.t2.1)、または配列番号3(すなわち、BESTROPHIN3、BST3、Cre16.g663450.t1.2)である。いくつかの実施形態において、重炭酸塩が膜を通過する能力の増加または提供は、以下の群から選択される少なくとも1つのポリペプチドの発現の結果である:配列番号1に対して少なくとも70%の配列同一性、少なくとも71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、または少なくとも95%の配列同一性を有する第1のポリペプチド;配列番号2に対して少なくとも70%の配列同一性、少なくとも71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、または少なくとも95%の配列同一性を有する第2のポリペプチド;配列番号3に対して少なくとも70%の配列同一性、少なくとも71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、または少なくとも95%の配列同一性を有する第3のポリペプチド、または;それらの任意の組み合わせ。いくつかの実施形態において、重炭酸塩が膜を通過する能力の増加または提供は:配列番号1に対して、少なくとも95%の配列同一性を有する第1のポリペプチド;配列番号2に対して、少なくとも95%の配列同一性を有する第2のポリペプチド;配列番号3に対して、少なくとも95%の配列同一性を有する第3のポリペプチド、または;それらの任意の組み合わせ;の群から選択されるポリペプチドの発現の結果である。
本開示の特定の態様は、増加した炭素利用効率を有する植物を作製する方法に関し、ここで、当該方法の工程は、a)植物に遺伝子改変を導入し、その結果、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質からストロマへと膜を通過する能力を増加させるか、もしくは提供し、または重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する能力を増加させるか、もしくは提供し、それによって、植物の炭素利用効率を増加させること、である。
本開示の特定の態様は、藻類の葉緑体のルーメンへと重炭酸塩を輸送する藻類の能力の増加をもたらす1つ以上の遺伝子改変を含む、遺伝子改変された藻類に関する。いくつかの実施形態において、重炭酸塩輸送能力の増加は、以下の群から選択される少なくとも1つの緑藻類ベストロフィンポリペプチドを過剰発現した結果である:配列番号1に対して少なくとも70%の配列同一性、少なくとも71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、または少なくとも95%の配列同一性を有する第1のポリペプチド;配列番号2に対して少なくとも70%の配列同一性、少なくとも71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、または少なくとも95%の配列同一性を有する第2のポリペプチド;配列番号3に対して少なくとも70%の配列同一性、少なくとも71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、または少なくとも95%の配列同一性を有する第3のポリペプチド;またはそれらの任意の組み合わせ。いくつかの実施形態において、重炭酸塩輸送能力の増加は、以下の群から選択される少なくとも1つの緑藻類ベストロフィンポリペプチドを過剰発現した結果である:配列番号1に対して少なくとも95%の配列同一性を有する第1のポリペプチド、配列番号2に対して少なくとも95%の配列同一性を有する第2のポリペプチド、配列番号3に対して少なくとも95%の配列同一性を有する第3のポリペプチド、またはそれらの任意の組み合わせ。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、葉緑体チラコイド膜に局在している。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも藻類が100ppm未満の二酸化炭素(CO2は0.01%[v/v]未満、空気中)条件下にある場合には、過剰発現される。
いくつかの態様において、本開示は、増加した炭素利用効率を有する藻類を作製する方法に関し、ここで、当該方法の工程は、a)藻類の葉緑体のルーメンへと重炭酸塩を輸送する能力の増加を含む、藻類に遺伝子改変を導入し、それによって、藻類の炭素利用効率を増加させること、である。いくつかの実施形態において、輸送能力の獲得は、以下の群から選択される、少なくとも1つの緑藻類ベストロフィンポリペプチドを過剰発現した結果である:配列番号1に対して少なくとも70%の配列同一性、少なくとも71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、または少なくとも95%の配列同一性を有する第1のポリペプチド;配列番号2に対して少なくとも70%の配列同一性、少なくとも71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、または少なくとも95%の配列同一性を有する第2のポリペプチド;配列番号3に対して少なくとも70%の配列同一性、少なくとも71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、または少なくとも95%の配列同一性を有する第3のポリペプチド;またはそれらの任意の組み合わせ。いくつかの実施形態において、重炭酸塩輸送能力の増加は、以下の群から選択される、少なくとも1つの緑藻類ベストロフィンポリペプチドを過剰発現した結果である:配列番号1に対して少なくとも95%の配列同一性を有する第1のポリペプチド、配列番号2に対して少なくとも95%の配列同一性を有する第2のポリペプチド、配列番号3に対して少なくとも95%の配列同一性を有する第3のポリペプチド、またはそれらの任意の組み合わせ。
本発明の一実施形態は、1つ以上の修飾された植物遺伝子および/または導入された遺伝子を含む植物または植物細胞を提供する。例えば、本開示は、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質から植物細胞質からストロマへと膜を通過する増加した能力または提供された能力を有するトランスジェニック植物を提供する。さらに、本開示は、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する増加した能力または提供された能力を有するトランスジェニック植物を提供する。さらに、本開示は、緑藻類ベストロフィンポリペプチドの少なくとも1つのコード配列を含む少なくとも1つの修飾された核酸配列を有するトランスジェニック植物を提供する。他の遺伝的要素(例えば、内因性炭酸脱水酵素)の調節された発現もまた、本明細書中で検討され、記載される。
本開示は、以下の実施例においてさらに詳細に記載されるが、これらは特許請求の範囲のように本開示の範囲を限定することは、決して意図されない。添付の図面は、本開示の明細書および記載の不可欠な部分と見なされることが意図される。以下の実施例は、例示のために提供されるが、特許請求される開示を限定するものではない。
以下の実施例は、以下の実施例すべてにおいて使用される細胞培養条件および成長条件を記載する。クラミドモナス・ラインハルディ細胞は、ペトリプレート上のTris−アセテート−リン酸(TAP)培地またはイースト−アセテート(YA)培地のいずれかで維持された。実験の前に、細胞は、最小(すなわち、炭素源を含まない)培地に接種され、高CO2(CO2は5%より高い、空気中)で2〜3×106細胞・mL−1の濃度まで増殖させた。次いで、これらの細胞は、最小培地に希釈され、示されるpHおよびCO2濃度で増殖させた。
以下の実施例は、さまざまな光合成生物におけるベストロフィンファミリー遺伝子の進化的関係を描写する系統樹の構築を記載する。哺乳動物において、ベストロフィンタンパク質は、塩化物および重炭酸塩を導くことが知られている。植物において、ほとんどのベストロフィンタンパク質は、まだ特性付けられていない。
3つのクラミドモナス・ラインハルディ遺伝子BESTROPHIN1(BST1)、BESTROPHIN2(BST2)、およびBESTROPHIN3(BST3)は、複数の理由から、この系統樹において使用するために選択された。1つには、BST1、BST2、およびBST3遺伝子は、共通領域を共有すること(図1A〜1Bを参照のこと)。もう1つには、BST1(配列番号1)、BST2(配列番号2)、およびBST3(配列番号3)タンパク質のアミノ酸配列は、互いに80%を超えて同一であること(図1Cを参照のこと)。クラミドモナス・ラインハルディは7つの他の予測されたベストロフィンを含むが、これらの他のベストロフィンはいずれもこれら3つのタンパク質と45%を超える同一性を有しない。最後に、選択された3つのベストロフィンはすべて、葉緑体に標的とされると予測されたこと。
図1Aは、BST1、BST2、およびBST3遺伝子の模式図を示し、明灰色の四角はエキソンを表し、細い灰色の線はイントロンを表し、太い灰色の線は非翻訳領域(UTR)を表し、重ねられた線(エキソンおよびイントロンに重ねられている)は3つの遺伝子によって共有される共通領域を示す。さらに、3つのベストロフィン遺伝子それぞれの長さが示されており、BST1は最も短く3000kb未満であり、BST2は最も長く5000kbを超えた。図1Bにおいて、クラミドモナス・ラインハルディゲノム上のBST1、BST2、およびBST3遺伝子の位置および方向が示される。BST1(Cre16.g662600)、BST2(Cre16.g663400)およびBST3(Cre16.g663450)は、クラミドモナス・ラインハルディの16番目の染色体上の130kbp領域内に位置するパラロガス遺伝子である。さらに、この画像は、BST1、BST2、およびBST3の互いの相対的な位置を示す。図1Cは、BST1、BST2、およびBST3タンパク質のアミノ酸アラインメントを示し、ここで、下端の行におけるアスタリスクは、3つのタンパク質すべてにおいて同一であるアミノ酸を示す。BST1、BST2、およびBST3タンパク質は、互いに80%を超えて同一である。
CIA5は、多くのCCM遺伝子を制御する転写因子である。特に、CIA5は、既知のCCMトランスポーターすべてを制御する。以下の実施例は、高CO2または低CO2条件のいずれかで成長させた、野生型(WT)D66クラミドモナス・ラインハルディ株、およびcia5変異クラミドモナス・ラインハルディ株におけるベストロフィン発現の解析を記載する。
クラミドモナス・ラインハルディ細胞のための細胞培養条件および成長条件は、実施例1に記載したとおりであった。実験のために、WT D66クラミドモナス・ラインハルディ株およびcia5変異体クラミドモナス・ラインハルディ株は、高CO2(CO2は5%[v/v]、空気中)または低CO2状態(CO2は0.04%[v/v]未満、空気中、すなわち周囲のCO2条件)のいずれかで培養された。
図2Aに示すように、D66(WT)において、3つのベストロフィン遺伝子すべての発現レベルは、高CO2条件と比較して、低CO2状態下でアップレギュレートされた。特に、BST3発現は、高CO2条件下で成長させた細胞においては非常に低く、低CO2条件下で成長させた細胞においてははるかに高かった。高CO2条件下で成長させたD66細胞と比較して、低CO2条件下で成長させたD66細胞からのバンドの強度増加は、3つの遺伝子すべてが低CO2条件下でアップレギュレートされることを明らかに示す。D66とは対照的に、低CO2条件は、cia5変異体におけるBST1、BST2、またはBST3の発現増加を誘導しなかった。さらに、BST1およびBST3は、cia5変異体においていずれの条件下でも発現されず、これは、cia5変異体における他のCCM遺伝子と同様の転写パターンである(Xiangら、PNAS 98(9):5341−5346,2001;Fukuzawaら、PNAS 98(9):5347−5352,2001;Moroneyら、Plant Physiol 89(3):897−903,1989)。cia5細胞におけるBST2転写レベルは、高CO2条件および低CO2条件の両方で同じであり、低CO2においては目立った誘導を示さなかった。これは、BST2転写レベルが低CO2条件において増加するD66細胞とは対照的である。
現行のCCMモデルは、葉緑体チラコイド膜での重炭酸塩トランスポーターが重炭酸塩取り込みに必要であることを示しているが、これらのトランスポーターはまだ同定されていない。以下の実施例は、クラミドモナス・ラインハルディ細胞内でのキメラベストロフィン−Venusタンパク質の局在を記載する。葉緑体内の特定の位置を同定するために、蛍光画像化アプローチが選択されたが、これは、計算的解析が、葉緑体内の特定の位置ではなく、3つのベストロフィンタンパク質のリーダー配列に基づいて葉緑体標的を予測したためである。
蛍光タンパク質タグ付け:この実験のために、融合タンパク質BST1−Venus、BST2−Venus、およびBST3−Venusを生成するために、BST1、BST2、またはBST3のコード配列がVenusのコード配列と融合された。BST1〜3遺伝子は、Mackinderら、Cell 171(1):133−147 e114,2017のようにして、クローニングされ、クラミドモナス株CC−4533に形質転換された。簡単に述べると、BST1〜3遺伝子のオープンリーディングフレームは、ゲノムDNAからPCR増幅され(プライマーは表2に列挙した)、ギブソンアセンブリを介して、C末端Venus−3xFLAGおよびPSADプロモーターと共に、pLM005にクローニングされた。BSTそれぞれについて1つずつ、3つの別々の構築物が生成された。PSADは、クラミドモナス・ラインハルディにおける光化学系Iのストロマ側に位置する豊富な葉緑体タンパク質をコードする核遺伝子を駆動する高発現プロモーターである(FischerおよびRochaix、2001)。形質転換のために、野生型培養物は、中期の対数期まで成長させ、2×108細胞・mL−1まで濃縮した。懸濁液は、エレクトロポレーションの前に、EcoRVによって線状化された構築プラスミドと混合した。次いで、懸濁液は、選択のためにTAPパラモマイシン(20μg・mL−1)上にプレーティングされた。BST1−Venusを発現する株、BST2−Venusを発現する株、およびBST3−Venusを発現する株、の3つの別々の株が生成された。蛍光コロニーは、Typhoon 8610スキャナーを使用して、同定された。Venusについてのレーザー設定は、励起については532nmであり、そして発光については555/20であり、そしてクロロフィル自己蛍光は、633nmで励起、670/30発光であった、。
図3Aに示されるように、3つのベストロフィン融合タンパク質はすべて、葉緑体内に不均一なシグナルを示し、これは、Venusシグナル(左列に示される)によって示される。Venusシグナルおよびクロロフィルシグナル(中央の列に示される)がマージされた場合、Venusシグナルと葉緑体中のチラコイドスタックとの間にオーバーラップが見られた。3つのBST−Venus融合タンパク質はすべて、葉緑体のチラコイド膜に局在していた。さらに、ピレノイドのチラコイド細管は、Venusシグナルとクロロフィルシグナルとの間で同じオーバーラップを示す。これは、BST1−Venus株の拡大ピレノイド画像を示す図3Bにおいて明確に描写される。矢印は、ピレノイドを貫通するチラコイド細管においてピレノイド内部にBST1−Venus蛍光が見られる場所を示す。これらの結果は両方とも、ベストロフィンが葉緑体に対して標的とされるというコンピュータ予測(ベストロフィンリーダー配列に基づく)を確認し、ベストロフィンタンパク質のチラコイド局在を強く示す。
以下の実施例は、クラミドモナス・ラインハルディの成長に対する、3つのベストロフィンBST1、BST2、およびBST3の発現を減少させる効果を記載する。三重ベストロフィンRNAiノックダウン株bsti−1の成長表現型は、種々のCO2濃度およびpHの成長条件下で、WT株D66と、ならびに変異株cia3およびpmp1と、比較された。2つの変異株は、既知のCCM成分において変異を有する;cia3株はチラコイド炭酸脱水酵素であるCAH3において変異を有し、一方pmp1株はストロマシータ炭酸脱水酵素であるLCIB/LCICに変異を有する。
RNAiを使用したBST1、BST2およびBST3ノックダウン:3つのベストロフィン遺伝子すべてを同時に標的とするために、RNAiノックダウンアプローチが選択された。現在、bst3ノックアウト株のみが、Chlamydomonas Culture Collectionから入手可能である。bst1およびbst2ノックアウト株は入手できない。さらに、実施例7において詳細に記載されるように、bst3ノックアウト株は低CO2条件下で試験され、正常に成長することが見出された。これは、bst3ノックアウト株のみが試験されているということ、および、三重ノックアウト株を生成する材料が現在入手できないということ、の両方を意味する。したがって、RNAiノックダウンアプローチが最良の選択肢であると考えられた。
低CO2条件下でのクナミドモナス・ラインハルディ成長におけるベストロフィンの役割を調べるために、RNAiアプローチが採用され、3つのベストロフィン遺伝子すべての発現を一度に減少させた。BST1、BST2、およびBST3を標的とするRNAiを使用して、2つのRNAiノックダウンライン、bsti−1およびbsti−2が生成された。bsti−1、bsti−2、およびWTコントロール株D66におけるBST1、BST2、およびBST3の発現レベルは、定量RT−PCRを使用して、測定された。図4に示すように、3つのベストロフィン遺伝子すべての発現レベルは、WTコントロール株D66と比較して、bsti−1およびbsti−2 RNAiノックダウンラインにおいて低かった(示されるエラーバーは、3つの生物学的反復についての標準誤差を示す)。特に、bsti−1およびbsti−2(BST−RNAiライン1および2)は、D66と比較して、BST1、BST2、およびBST3の発現において、ほぼ60〜90%のノックダウンを示した。この結果は、bsti−1およびbsti−2 RNAiノックダウンラインにおける3つのベストロフィン遺伝子すべての発現が、RNAiアプローチを使用して効果的に減少されたことを示す。
以下の実施例は、WT株D66と比較した、三重ベストロフィンRNAiノックダウン株bsti−1およびbsti−2(実施例5に記載されたもの)の無機炭素親和性試験を記載する。
無機炭素に対する親和性:この分析では、(O2発生のような)光合成の速度が、様々な無機炭素レベル(無機炭素=CO2およびHCO3 −)で測定された。外部Ci(K1/2[DIC])(溶解無機炭素)に対する親和性は、Maら、Plant Physiol 156:884−896,2011.に従って、推定された。具体的には、100μgのクロロフィルと等価な細胞が、不活性窒素ガスでバブリングされた、すなわちCO2フリーなHEPES−NaOHバッファー(pH7.4)、HEPES−NaOHバッファー(pH7.8)、または25mM EPPS−NaOHバッファー(pH8.4)中に懸濁された。細胞は、300μmol・m−2・s−1で照明されたO2電極チャンバ(Rank Brothers、ケンブリッジ イギリス)に移され、バッファーおよび細胞内空間に残るDICを枯渇させるために静置された。内因性CO2の枯渇に伴い、正味のO2発生は観測されない。既知濃度のNaHCO3がチャンバに注入され、O2発生の速度が測定された。この実験において、無機炭素レベルは25μMから2mMまで変化させた。K1/2[DIC]は、酸素発生(すなわち、光合成)の最大速度の半分(50%)に必要なDIC濃度として計算された(Badger、1985)。クロロフィル含量は、クロロフィルaおよびクロロフィルbを合わせることによって、測定された。クロロフィルは、100%メタノール中で抽出され、分光光度計を使用して測定された。K1/2(CO2)は、O2発生のVmaxの半値に到達するために必要なCO2濃度とみなされる。
CCMを有する藻類細胞の2つの特性は、第1に、それらは無機炭素(Ci)に対する親和性が非常に高いこと、第2に、それらは拡散によって得られるものよりも高いレベルまでCiを蓄積する能力があること、である。したがって、RNAiノックダウンラインbsti−1およびbsti−2、ならびにWT株D66の光合成酸素発生活性が試験された。低CO2に順化させたRNAiノックダウンラインbsti−1およびbsti−2は、測定されたK0.5(Ci)によって判定されるように、それぞれpH7.8でCiに対して3〜10倍低い親和性を示した(図6Aおよび図6C)。高CO2に順化させると、bsti−1もD66と比較してCi親和性が減少した(図6E)。これは、3つのBST遺伝子すべての発現が減少することで、Ciに対する細胞の親和性の減少が引き起こされたことを示す。pH8.4では、bsti−1に対するK0.5(Ci)は95μMである一方で、対照的に、D66に対するK0.5(Ci)は35μMと低い。8.4というより高いpHでは、培地における支配的なCi種は重炭酸塩であり、したがって、Ciに対するD66(WT)細胞のより高い親和性は、それらの重炭酸塩を積極的に取り込み利用する能力を反映する。これらの結果は、bsti−1およびbsti−2が光合成O2発生のための無機炭素に対してより高い要件を有することを示し、CCMにおけるベストロフィンの役割の強力な証拠である。
以下の実施例は、WT株D66と比較した、クラミドモナス・ラインハルディbst3ノックアウト株の低CO2条件下での成長およびCi親和性試験を記載する。
クラミドモナス・ラインハルディノックアウト株:ノックアウト株は、ランダム挿入変異誘導を使用して作製され、Chlamydomonas Library Project(CLiP)の一部である。株は、Chlamydomonas Resource Center(https://www.chlamycollection.org/)から注文することができる。現在、bst3ノックアウト株のみが入手可能である。bst1およびbst2ノックアウト株は入手できない。bst3ノックアウト株における挿入位置を確認するため、BST3遺伝子およびにインサートに特異的なプライマーを使用して、PCRが行われた(表5を参照のこと)。インサート特異的プライマー(CIB1FおよびCIB1R)、および隣接領域についての情報は、CLiPウェブサイト(https://www.chlamylibrary.org/allMutants)から入手した。
BST3ノックアウト(bst3)は、bst3遺伝子の第1エキソンにパロモマイシンインサートを有するCLiP変異体コレクションから入手した(図8A)。インサートの位置は、PCRを使用して確認された(図8B)。さらに、BST1〜3発現は、高CO2条件および低CO2条件下でbst3ノックアウト株において分析され、WT株D66と比較された。BST3発現は、両方の条件下でbst3において検出されなかった一方、BST1およびBST2発現は、両方の条件下でbst3ノックアウト株とWT株D66との間で同等であった(図8C)。
以下の実施例は、クラミドモナス・ラインハルディBST1、BST2、およびBST3タンパク質の構造的特性付けを記載する。当該実施例は、原稿のクラミドモナス・ラインハルディCCMモデルも記載する。
BST1、BST2、およびBST3のペプチド配列は、Phytozome v12.1から入手した。相同性モデリングは、テンプレートとしてクレブシエラ・ニューモニア(Klebsiella pneumonia)ベストロフィン(Kpbest;PDB:4DW8)を使用して行われ、Swiss−Modelウェブサーバー(Yangら、Science 346(6216):1498−1501,2014)を用いて生成された。Kpbestが選択されたのは、それは、Swiss−ModelによってBST1〜3についての最上位テンプレートとして同定されたためである。得られた構造およびKpbestの構造は、図10Aに突出形状として示され標識された選択的細孔を並べる保存残基選択的細孔を並べる保存残基を有するモノマーとして示される。得られたBST1ホモペンタマーモデルはgromos 43B1力場でエネルギー最小化に供され、静電ポテンシャルはSwiss−PDBviewer(V4.01)を使用して原子部分電荷を使用して計算された。次いで、BST1ホモペンタマーモデル上に電場を表示して、図10Dが生成された。静電ポテンシャルは、−4kT/e(負)〜+4kT/e(正)のポテンシャルスケールで表示され、空洞が強調された。BST1ホモペンタマー構造の質(図10B)は、QMEANスコア(Benkertら、Proteins 71(1):261−277、2008)を使用して、得られた。
BST1〜3が陰イオンとしてベストロフィンを輸送する機能するか否かを予測するために、クレブシエラ・ニューモニアベストロフィンを使用したBST1〜3の相同性モデリングが行われた。BST1〜3は、ベストロフィンファミリーのタンパク質において保存されているそれらの選択的細孔に沿って非極性残基を含有する(図10A;Quら、J Neurosci 26(20):5411−5419,2006)。構造研究は、ヒトおよびクレブシエラ・ニューモニアベストロフィンがペンタマーであることを示し、ペンタマーアセンブリにおけるBST1のモデリングは、高い信頼性である(図10B)。エントリーポケットは、支配的には負の静電ポテンシャルを有し、選択的細孔は中性/正に帯電しており、BST1〜3が負に帯電したイオンを輸送する、という仮説を支持する(図10C〜10D;Yangら、Science 346(6216):1498−1501,2014;Kaneら、Nature 516(7530):213−218,2014)。これらの結果は、クラミドモナス・ラインハルディベストロフィンがアニオントランスポーターである可能性を示唆する。
Claims (20)
- 遺伝子改変された植物、またはその一部であって、
前記植物は、
重炭酸塩が前記植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質からストロマへと膜を通過する能力を増加させるか、もしくは提供する1つ以上の遺伝子改変を含むか、または、
重炭酸塩が前記植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する能力を増加させるか、もしくは提供する1つ以上の遺伝子改変を含む、
植物、またはその一部。 - 重炭酸塩が膜を通過する能力の獲得は、少なくとも1つの緑藻類ベストロフィンポリペプチドの発現を含む、請求項1に記載の植物、またはその一部。
- 前記緑藻類ベストロフィンポリペプチドは、
配列番号1に対して、少なくとも70%の配列同一性、少なくとも75%の配列同一性、少なくとも80%の配列同一性、少なくとも85%の配列同一性、少なくとも90%の配列同一性、または少なくとも95%の配列同一性を有する第1のポリペプチド、
配列番号2に対して、少なくとも70%の配列同一性、少なくとも75%の配列同一性、少なくとも80%の配列同一性、少なくとも85%の配列同一性、少なくとも90%の配列同一性、または少なくとも95%の配列同一性を有する第2のポリペプチド、
配列番号3に対して、少なくとも70%の配列同一性、少なくとも75%の配列同一性、少なくとも80%の配列同一性、少なくとも85%の配列同一性、少なくとも90%の配列同一性、または少なくとも95%の配列同一性を有する第3のポリペプチド、および、
それらの任意の組み合わせ、
からなる群から選択される、請求項2に記載の植物、またはその一部。 - 前記緑藻類ベストロフィンポリペプチドは、
配列番号1に対して、少なくとも95%の同一性を有する第1のポリペプチド、
配列番号2に対して、少なくとも95%の配列同一性を有する第2のポリペプチド、
配列番号3に対して、少なくとも95%の配列同一性を有する第3のポリペプチド、および、
それらの任意の組み合わせ、
からなる群から選択される、請求項3に記載の植物、またはその一部。 - 前記緑藻類ベストロフィンポリペプチドは、
配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、および配列番号111からなる群から選択され、
好ましくは、配列番号10、配列番号11、配列番号15、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号42、配列番号62、および配列番号63からなる群から選択される、請求項2に記載の植物、またはその一部。 - 前記緑藻類ベストロフィンポリペプチドは、植物細胞内の少なくとも1つの葉緑体の葉緑体包膜またはチラコイド膜に局在している、請求項2に記載の植物、またはその一部。
- 前記植物細胞は、葉肉細胞である、請求項6に記載の植物、またはその一部。
- 前記緑藻類ベストロフィンポリペプチドは、前記植物の葉肉細胞の少なくとも70%において発現される、請求項7に記載の植物、またはその一部。
- 内因性炭酸脱水酵素の調節された発現をさらに含む、請求項2に記載の植物、またはその一部。
- 前記調節された発現は、増加した発現、減少した発現、異なる位置での発現、およびそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択される、請求項9に記載の植物、またはその一部。
- 前記植物は、カウピー、ダイズ豆、キャッサバ、イネ、ダイズ、コムギ、および他のC3農作物植物からなる群から選択され、
前記植物は、トウモロコシ、モロコシ、および他のC4農作物植物からなる群からは選択されない、請求項1に記載の植物、またはその一部。 - 増加した炭素利用効率を有する植物、またはその一部であって、
前記植物は、前記植物、またはその一部において、緑藻類ベストロフィンポリペプチドの少なくとも1つのコード配列を含む少なくとも1つの修飾された核酸配列を含み、
ここで、前記ベストロフィンポリペプチドは、前記植物、またはその一部において、発現され、
ここで、前記植物が周囲の二酸化炭素条件下で栽培される場合には、
収量、成長速度、もしくはバイオマスは、前記ベストロフィンポリペプチドを過剰発現しない対応する野生型(WT)植物、もしくはその対応するWT部分からの収量、成長速度、もしくはバイオマスよりも大きいか、または、
収量、成長速度、もしくはバイオマスは、周囲の二酸化炭素条件下で栽培された前記ベストロフィンポリペプチドを過剰発現しない対応するWT植物、もしくはその対応するWT部分からの収量、成長速度、もしくはバイオマスと実質的に類似する、
植物、またはその一部。 - 前記ベストロフィンポリペプチドは、植物細胞の少なくとも1つの葉緑体の葉緑体包膜または葉緑体チラコイド膜に局在しており、
前記植物細胞は、葉肉細胞であり、
前記ポリペプチドは、前記植物の葉肉細胞の少なくとも70%において発現される、請求項12に記載の植物、またはその一部。 - 前記修飾された核酸配列は、前記植物の核ゲノムに安定に組み込まれている、請求項12に記載の植物、またはその一部。
- 前記少なくとも1つの修飾された核酸配列は、緑藻類ベストロフィンポリペプチドの前記少なくとも1つのコード配列に作動可能に連結されたシグナルペプチド配列または標的配列をコードする第2の核酸配列をさらに含み、
前記シグナルペプチド配列または標的配列の発現は、植物細胞の少なくとも1つの葉緑体の葉緑体包膜または葉緑体チラコイド膜への前記ベストロフィンポリペプチドの局在をもたらす、
請求項14に記載の植物、またはその一部。 - 前記緑藻類ベストロフィンポリペプチドは、
配列番号1に対して、少なくとも70%の配列同一性、少なくとも75%の配列同一性、少なくとも80%の配列同一性、少なくとも85%の配列同一性、少なくとも90%の配列同一性、または少なくとも95%の配列同一性を有する第1のポリペプチド、
配列番号2に対して、少なくとも70%の配列同一性、少なくとも75%の配列同一性、少なくとも80%の配列同一性、少なくとも85%の配列同一性、少なくとも90%の配列同一性、または少なくとも95%の配列同一性を有する第2のポリペプチド、
配列番号3に対して、少なくとも70%の配列同一性、少なくとも75%の配列同一性、少なくとも80%の配列同一性、少なくとも85%の配列同一性、少なくとも90%の配列同一性、または少なくとも95%の配列同一性を有する第3のポリペプチド、および、
それらの任意の組み合わせ、
からなる群から選択される、請求項12に記載の植物、またはその一部。 - 前記緑藻類ベストロフィンポリペプチドは、
配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、または配列番号111からなる群から選択され、
好ましくは、配列番号10、配列番号11、配列番号15、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号42、配列番号62、および配列番号63からなる群から選択される、請求項12に記載の植物、またはその一部。 - 内因性炭酸脱水酵素の調節された発現をさらに含む、請求項12に記載の植物、またはその一部。
- 前記調節された発現は、増加した発現、減少した発現、異なる位置での発現、およびそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択される、請求項18に記載の植物、またはその一部。
- 前記植物は、カウピー、ダイズ豆、キャッサバ、イネ、ダイズ、コムギ、および他のC3農作物植物からなる群から選択され、
前記植物は、トウモロコシ、モロコシ、および他のC4農作物植物からなる群からは選択されない、請求項12に記載の植物、またはその一部。
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