JP2021530213A - 緑藻類ベストロフィン重炭酸塩トランスポーター - Google Patents

緑藻類ベストロフィン重炭酸塩トランスポーター Download PDF

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Abstract

本開示の態様は、重炭酸塩が植物細胞内の膜を通過する能力の増加の結果として、増加した炭素利用効率を有する遺伝子修飾された植物および／または藻類に関する。本開示の他の態様は、このような植物および／または藻類を作製する方法、ならびに炭素利用効率を増加させるためにこれらの遺伝子修飾された植物を栽培する方法、および／または炭素利用効率を増加させるためにこれらの遺伝子修飾された藻類を成長させる方法に関する。

Description

発明の詳細な説明
〔関連出願の相互参照〕
本出願は、２０１８年１１月１９日に出願された米国仮出願第６２／７６９，２１４号、および２０１８年７月１３日に出願された米国仮出願第６２／６９７，８４０号の優先権を主張し、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
〔ＡＳＣＩＩテキストファイルによる配列表の提出〕
ＡＳＣＩＩテキストファイルによる以下の提出物の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ読み取り可能な形式（ＣＲＦ）（ファイル名：794542000140SEQLIST.TXT、記録日：２０１９年６月２８日、サイズ：４６１ＫＢ）。
〔技術分野〕
本開示は、遺伝子修飾された植物に関する。特に、本開示は、好ましくは増加した炭素利用効率を提供する緑藻類ベストロフィン重炭酸塩トランスポーターを含有する遺伝子修飾された植物に関する。
〔背景〕
緑藻類および他の光合成水生生物は、自然環境において低い、そして変動するＣＯ２条件に曝されることが多い。これらの生物のＣＯ２利用能力を低下させる可能性がある様々な要因が存在し、水中での気体のゆっくりとした拡散、２つの無機炭素（Ｃｉ）形態である二酸化炭素（ＣＯ２）および重炭酸塩（ＨＣＯ３ −）のゆっくりとした相互変換、ならびにｐＨ変化を含む。変化しやすい自然環境の結果として、ほとんどの水生光合成生物は、限られたＣＯ２条件下で誘導可能な二酸化炭素濃縮機構（carbon dioxide concentrating mechanism、ＣＣＭ）を進化させてきた。ＣＣＭは、緑藻類などの水生光合成生物がルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）による固定のためにＣｉを効率的に濃縮することを可能にする（Ｇｉｏｒｄａｎｏら、Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏ ５６：９９−１３１，２００５）。緑藻類であるクラミドモナス・ラインハルディ（Chlamydomonas reinhardtii）の現行のＣＣＭモデル（Ｊｕｎｇｎｉｃｋら、Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈ Ｒｅｓ １２１：１５９−１７３，２０１４；ＷａｎｇおよびＳｐａｌｄｉｎｇ、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １６６：２０４０−２０５０，２０１４）は、膜を通したＣｉ、特にＨＣＯ３ −の移動を可能にするＣＣＭの主要な成分として、原形質膜上および葉緑体包膜上の重炭酸塩トランスポーターを含む。ＣＯ２およびＨＣＯ３ −を相互変換する炭酸脱水酵素は、ＣＣＭモデルのさらなる重要な成分である（Ｍｉｔｒａら、Ｃａｎ Ｊ Ｂｏｔ ８３：７８０−７９５、２００５；Ｍｏｒｏｎｅｙら、Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈ Ｒｅｓ １０９：１３３−１４９、２０１１）。
クラミドモナス・ラインハルディにおいて、ピレノイドと呼ばれる区画は、葉緑体の基部に位置している。ピレノイドは、限られたＣＯ２条件下でルビスコが隔離される位置である（Ｋｕｃｈｉｔｓｕら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓ ２９：１２６９−１２７８，１９８８；Ｒａｗａｔら、Ｐｌａｎｔａ １９８：２６３−２７０，１９９６；Ｂｏｒｋｈｓｅｎｉｏｕｓら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １１６：１５８５−１５９１，１９９８）。チラコイド細管およびミニ細管の広範なネットワークは、おそらくＨＣＯ３ −がピレノイドに入るための経路を提供するために、ピレノイドに結合している（Ｅｎｇｅｌら、Ｅｌｉｆｅ １３：０４８８９，２０１５）。チラコイド炭酸脱水酵素ＣＡＨ３はこれらの細管において見られ、ＣＡＨ３はＨＣＯ３ −をＣＯ２に変換しルーメン内に固定する、と仮定される（ＭｏｒｏｎｅｙおよびＹｎａｌｖｅｚ、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｃｅｌｌ ６：１２５１−１２５９，２００７）。
高ＣＯ２条件（５％ ｖ／ｖ）で成長させたクラミドモナス・ラインハルディ細胞は、Ｃｉに対して低い親和性を示す。高ＣＯ２順化細胞がより低いＣＯ２条件（例えば、周囲（０．０４％）〜低（０．０１％ ｖ／ｖ未満））に曝されるとき、高親和性Ｃｉトランスポーターの誘導が報告されている。ＣＯ２は細胞内の膜を横切って容易に拡散する（Ｇｕｔｋｎｅｃｈｔら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ ６９：７７９−７９４、１９７７）が、以来、低ＣＯ２条件下で成長させた細胞においてルビスコによる固定が起こりうる場所へのＣｉ（特にＨＣＯ３ −）の移動を促進する活性な輸送システムの必要性を、多くの研究が確立してきた（Ｍｏｒｏｎｅｙら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ８３：４６０−４６３、１９８７；Ｓｕｌｔｅｍｅｙｅｒら、Ｐｌａｎｔａ １７６：２５６−２６０、１９８８；Ｂａｄｇｅｒら、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ Ｐｌａｎｔ ９０：５２９−５３６、１９９４；Ｏｈｎｉｓｈｉら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２２：３１０５−３１１７、２０１０）。さらに、分子および生理学的研究もまた、細胞の原形質膜上および葉緑体包膜上のＣｉトランスポーターの複数の形態の発生を確認してきた（Ａｍｏｒｏｓｏら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １１６：１９３−２０１，１９９８；Ｄｕａｎｍｕら、ＰＮＡＳ １０６：５９９０−５９９５，２００９；Ａｔｋｉｎｓｏｎら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ ５：１２４９７，２０１５；Ｇａｏら、Ｐｌａｎｔ ８２：１−１１，２０１５；Ｙａｍａｎｏら、ＰＮＡＳ １１２：７３１５−７３２０，２０１５）。
海洋環境に生息するシアノバクテリアにおいて、原形質膜でのＨＣＯ３ −輸送は、塩水の高濃度外部Ｎａ＋イオンに連動することが多い。クラミドモナス・ラインハルディが見られる淡水環境においては、Ｎａ＋濃度が比較的低いので、輸送はＨ＋共役であると考えられる（Ｍｏｒｔｈら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２：６０−７０，２０１１；Ｔａｙｌｏｒら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ １７：６７５−６８４，２０１２）。結果として、クラミドモナス・ラインハルディおよびボルボックス・カルテリ（Volvox carteri）を用いたゲノム研究は、Ｈ＋およびＮａ＋共役な硫酸およびリン酸のトランスポーターの両方の存在を明らかにした（Ｐｏｏｔａｋｈａｍら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １５３：１６５３−１６６８，２０１０）。このタイプのイオンカップリングが重炭酸塩の取り込みにも重要であるかどうかは、まだ明らかではない。
今日まで、クラミドモナス・ラインハルディにおける２つの高親和性重炭酸塩輸送タンパク質および１つの低親和性重炭酸塩輸送タンパク質が特性付けられており、低ＣＯ２条件下で機能することが知られている。第１の高親和性トランスポーターである高光度活性化タンパク質３（High Light Activated protein 3、ＨＬＡ３）は、多剤耐性タンパク質ファミリーのＡＴＰ結合カセット（ATP-binding cassette、ＡＢＣ）型トランスポーターであり、原形質膜に局在する（ＩｍおよびＧｒｏｓｓｍａｎ、２００２）。Ｈｌａ３転写物は、高光度および低ＣＯ２条件の両方によって誘導され、Ｃｉａ５遺伝子によってコードされるＣＣＭ「マスターレギュレーター」によって制御される。Ｄｕａｎｍｕら（２００９）は、ＨＬＡ３ ＲＮＡｉノックダウン変異体におけるＣｉ親和性およびＣｉ取り込みの有意な減少を示し、ＨＣＯ３ −輸送におけるこのタンパク質の役割を支持した。第２の高親和性トランスポーターである低炭素誘導性タンパク質１（Low Carbon Inducible protein 1、ＬＣＩ１）は、比較的小さいタンパク質である。ＬＣＩ１は、低ＣＯ２条件下で成長した細胞において強くアップレギュレートされ、原形質膜に局在している（Ｏｈｎｉｓｈｉら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２２：３１０５−３１１７，２０１０）。さらに、Ｌｃｒ１（ＭＹＢ−転写因子を欠くクラミドモナス株）バックグラウンドにおけるＬＣＩ１タンパク質の過剰発現は、Ｃｉ取り込みの増加をもたらした。したがって、ＨＬＡ３およびＬＣＩ１は両方とも、原形質膜上に位置するＣｉトランスポーターであると考えられる。
第３のトランスポーターであるＮＡＲ１．２（ＬＣＩＡとしても知られる）は、ギ酸／亜硝酸塩トランスポーターファミリーの葉緑体包膜タンパク質である。ＮＡＲ１．２タンパク質は、（ｍＭ領域にあるＫ１／２値で明らかにされるように）重炭酸塩に対してより低い親和性を有するが、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）卵母細胞においてＮＡＲ１．２を発現させると、ＨＣＯ３ −取り込みが増加した（Ｍａｒｉｓｃａｌら、Ｐｒｏｔｉｓｔ １５７：４２１−４３３，２００６；Ａｔｋｉｎｓｏｎら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ ５：１２４９７，２０１５）。ＮＡＲ１．２は、葉緑体包膜に局在することが示されており、Ｃｉ取り込みに関与すると考えられているが、このための分子メカニズムは依然として不明である（Ｙａｍａｎｏら、ＰＮＡＳ １１２： ７３１５−７３２０、２０１５）。実験結果は、ＮＡＲ１．２およびＨＬＡ３タンパク質がＣＣＭ内で協同的役割を有することを示す（Ｙａｍａｎｏら、ＰＮＡＳ １１２： ７３１５−７３２０，２０１５）。極低ＣＯ２条件下では、ＮＡＲ１．２は低ＣＯ２誘導性タンパク質Ｂ（Low-CO2 Inducible protein B、ＬＣＩＢ）と連動することが示されている。これらの結果は、ＬＣＩＢがＣＯ２取り込み、およびピレノイドから流出したＣＯ２の再取り込みに関与する一方、ＮＡＲ１．２はＨＣＯ３ −取り込みおよび輸送経路に関与するモデルを示唆した（ＷａｎｇおよびＳｐａｌｄｉｎｇ、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １６６：２０４０−２０５０、２０１４）。
上記のＣＣＭに関与する可能性が高いタンパク質に加えて、複数の他のタンパク質の役割が示唆されている。例えば、２つの可溶性タンパク質ＬＣＩＢおよびＬＣＩＣは、細胞を極低ＣＯ２に順化した場合に、ピレノイドと密接に会合することが観察されている複合体を形成する（Ｙａｍａｎｏら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ５１：１４５３−１４６８，２０１０）が、この複合体がどのような役割を果たし得るのかは、まだ確かではない（Ｊｉｎら、ＰＮＡＳ １１３：１４７１６−１４７２１，２０１６）。別の例は、ミトコンドリアに局在することが示されている他の推定されるＣｉトランスポーターであるＣＣＰ１およびＣＣＰ２によって提供される（Ａｔｋｉｎｓｏｎら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ ５：１２４９７，２０１５）。この局在は、ミトコンドリアがＣＣＭ機能において重要である可能性を示唆するが、この機構が何であるか、またはミトコンドリアが何の役割を果たし得るかは、まだ明らかではない。
ベストロフィンは、Ｃｌ−チャネル活性を示し電位依存性Ｃａ２＋チャネルのレギュレーターとしても機能する膜タンパク質のファミリーである。ヒトおよびマウスベストロフィンは、ＨＣＯ３ −に対して高透過性および高伝導性を有することが見出されている（ＱｕおよびＨａｒｔｚｅｌｌ、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２９４：Ｃ１３７１−Ｃ１３７７、２００８）。しかし、光合成生物性ベストロフィンタンパク質中のアミノ酸は、哺乳類におけるそれらの対応物と比較して高い多様性を示すことが、タンパク質アラインメントおよび系統樹解析を使用して、示されている。例えば、動物ベストロフィンにおいてＣａ２＋感応機構を形成する残基は、アラビドプシスにおけるベストロフィン様タンパク質（ＡｔＢｅｓｔ１およびＡｔＢｅｓｔ２）においては保存されておらず、このことは、Ｃａ２＋が葉緑体におけるＡｔＢｅｓｔチャネル活性化には必要とされないことを示唆する。したがって、進化の間、光合成生物におけるベストロフィンタンパク質は、哺乳動物におけるものとは異なる電気生理学的特性を獲得したかもしれない（Ｄｕａｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５８：８４８−８５８，２０１６）。クラミドモナス・ラインハルディにおいて、ＬＣＩ１１およびＣｒｅ１６．ｇ６６２６００が推定されるベストロフィンとして示唆されており、Ｃｒｅ１６．ｇ６６３４００がベストロフィン様タンパク質であることが提案されている（Ｍａｃｋｉｎｄｅｒら、Ｃｅｌｌ １７１：１３３−１４７、２０１７）が、これらはさらには特性付けられていない。
現在のデータは、クラミドモナス・ラインハルディにおける無機炭素（Ｃｉ）流入のための５つのタンパク質（ＨＬＡ３、ＬＣＩ１、ＬＣＩＡ、ＣＡＨ３、およびＬＣＩＢを含む）の必要性を明らかに支持するのみである（Ｍａｃｋｉｎｄｅｒ、Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ ２１７：５４−６１、２０１８）。上記のように、これらのタンパク質は、原形質膜および葉緑体包膜に局在する。クラミドモナス・ラインハルディＣＣＭの現行のモデルは、葉緑体チラコイド膜中の少なくとも１つのさらなるトランスポーターまたはチャネルがストロマからルーメン中のＣＡＨ３へのＨＣＯ３ −の流動を維持するために必要であることを示唆する（Ｍａｃｋｉｎｄｅｒ Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ ２１７：５４−６１，２０１８）。さらに、機能的重炭酸塩輸送タンパク質を同定することは、依然として重要な目標である。現在の研究は、多くのありうる重炭酸塩輸送タンパク質を同定したが、これらのうちのわずかなもののみが有望な実験結果を有し、そして利用可能なメカニズムデータはほとんどない。
〔概要〕
これらの需要を満たすために、本開示は、重炭酸塩輸送タンパク質として働く緑藻類ベストロフィンポリペプチドを対象とする。本開示の特定の態様は、遺伝子改変された植物、またはその一部であって、前記植物は、重炭酸塩が前記植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質からストロマへと膜を通過する能力を増加させるか、もしくは提供する１つ以上の遺伝子改変を含む、植物、またはその一部に関する。いくつかの態様において、本開示は、遺伝子改変された植物、またはその一部であって、前記植物は、重炭酸塩が前記植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する能力を増加させるか、もしくは提供する１つ以上の遺伝子改変を含む、植物、またはその一部に関する。いくつかの実施形態において、重炭酸塩が膜を通過する能力の獲得は、少なくとも１つの緑藻類ベストロフィンポリペプチドの発現の結果である。いくつかの実施形態において、前記緑藻類ベストロフィンポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の群から選択される。いくつかの実施形態において、重炭酸塩が膜を通過する能力の増加または提供は：配列番号１に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性を有する第１のポリペプチド；配列番号２に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性を有する第２のポリペプチド；配列番号３に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性を有する第３のポリペプチド、または；それらの任意の組み合わせ；の群から選択されるポリペプチドの発現の結果である。いくつかの実施形態において、重炭酸塩が膜を通過する能力の増加または提供は：配列番号１に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する第１のポリペプチド；配列番号２に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する第２のポリペプチド；配列番号３に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する第３のポリペプチド、または；それらの任意の組み合わせ；の群から選択されるポリペプチドの発現の結果である。いくつかの実施形態において、重炭酸塩が膜を通過する能力の増加または提供は：配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、または配列番号１１１の群から選択され；好ましくは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号４２、配列番号６２、または配列番号６３の群から選択されるポリペプチドの発現の結果である。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドは、植物細胞内の少なくとも１つの葉緑体の葉緑体包膜またはチラコイド膜に局在している。いくつかの実施形態において、前記植物細胞は、葉肉細胞である。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドは、前記植物の葉肉細胞の少なくとも７０％において発現される。
いくつかの態様において、本開示は、増加した炭素利用効率を有する植物、またはその一部であって、前記植物は、前記植物、またはその一部において、緑藻類ベストロフィンポリペプチドの少なくとも１つのコード配列を有する少なくとも１つの修飾された核酸配列を含み、ここで、前記ベストロフィンポリペプチドは、前記植物、またはその一部において、発現され、ここで、前記植物が周囲の二酸化炭素条件下で栽培される場合には、収量、成長速度、もしくはバイオマスは、前記ベストロフィンポリペプチドを過剰発現しない対応する野生型（ＷＴ）植物、もしくはその対応するＷＴ部分からの収量、成長速度、もしくはバイオマスよりも大きいか、または、収量、成長速度、もしくはバイオマスは、周囲の二酸化炭素条件下で栽培された前記ベストロフィンポリペプチドを過剰発現しない対応する野生型（ＷＴ）植物、もしくはその対応するＷＴ部分からの収量、成長速度、もしくはバイオマスと実質的に類似する、植物、またはその一部に関する。いくつかの実施形態において、前記ベストロフィンポリペプチドは、植物細胞の少なくとも１つの葉緑体の葉緑体包膜または葉緑体チラコイド膜に局在している。いくつかの実施形態において、前記植物細胞は、葉肉細胞である。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドは、前記植物の葉肉細胞の少なくとも７０％において発現される。
いくつかの態様において、本開示は、増加した水利用効率を有する植物、またはその一部であって、前記植物は、前記植物、またはその一部において、緑藻類ベストロフィンポリペプチドの少なくとも１つのコード配列を有する少なくとも１つの修飾された核酸配列を含み、ここで、前記ベストロフィンポリペプチドは、前記植物、またはその一部において、発現され、ここで、前記植物が周囲の二酸化炭素条件下で栽培される場合には、収量、成長速度、もしくはバイオマスは、前記ベストロフィンポリペプチドを過剰発現しない対応する野生型（ＷＴ）植物、もしくはその対応するＷＴ部分からの収量、成長速度、もしくはバイオマスよりも大きいか、または、収量、成長速度、もしくはバイオマスは、周囲の二酸化炭素条件下で栽培された前記ベストロフィンポリペプチドを過剰発現しない対応する野生型（ＷＴ）植物、もしくはその対応するＷＴ部分からの収量、成長速度、もしくはバイオマスと実質的に類似する、植物、またはその一部に関する。いくつかの実施形態において、前記ベストロフィンポリペプチドは、植物細胞の少なくとも１つの葉緑体の葉緑体包膜または葉緑体チラコイド膜に局在している。いくつかの実施形態において、前記植物細胞は、葉肉細胞である。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドは、前記植物の葉肉細胞の少なくとも７０％において発現される。
いくつかの態様において、本開示は、増加した窒素利用効率を有する植物、またはその一部であって、前記植物は、前記植物、またはその一部において、緑藻類ベストロフィンポリペプチドの少なくとも１つのコード配列を有する少なくとも１つの修飾された核酸配列を含み、ここで、前記ベストロフィンポリペプチドは、前記植物、またはその一部において、発現され、ここで、前記植物が周囲の二酸化炭素条件下で栽培される場合には、収量、成長速度、もしくはバイオマスは、前記ベストロフィンポリペプチドを過剰発現しない対応する野生型（ＷＴ）植物、もしくはその対応するＷＴ部分からの収量、成長速度、もしくはバイオマスよりも大きいか、または、収量、成長速度、もしくはバイオマスは、周囲の二酸化炭素条件下で栽培された前記ベストロフィンポリペプチドを過剰発現しない対応する野生型（ＷＴ）植物、もしくはその対応するＷＴ部分からの収量、成長速度、もしくはバイオマスと実質的に類似する、植物、またはその一部に関する。いくつかの実施形態において、前記ベストロフィンポリペプチドは、植物細胞の少なくとも１つの葉緑体の葉緑体包膜または葉緑体チラコイド膜に局在している。いくつかの実施形態において、前記植物細胞は、葉肉細胞である。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドは、前記植物の葉肉細胞の少なくとも７０％において発現される。
いくつかの態様において、本開示は、減少した光阻害を有する植物、またはその一部であって、前記植物は、前記植物、またはその一部において、緑藻類ベストロフィンポリペプチドの少なくとも１つのコード配列を有する少なくとも１つの修飾された核酸配列を含み、ここで、前記ベストロフィンポリペプチドは、前記植物、またはその一部において、発現され、ここで、前記植物が周囲の二酸化炭素条件下で栽培される場合には、収量、成長速度、もしくはバイオマスは、前記ベストロフィンポリペプチドを過剰発現しない対応する野生型（ＷＴ）植物、もしくはその対応するＷＴ部分からの収量、成長速度、もしくはバイオマスよりも大きいか、または、収量、成長速度、もしくはバイオマスは、周囲の二酸化炭素条件下で栽培された前記ベストロフィンポリペプチドを過剰発現しない対応する野生型（ＷＴ）植物、もしくはその対応するＷＴ部分からの収量、成長速度、もしくはバイオマスと実質的に類似する、植物、またはその一部に関する。いくつかの実施形態において、前記ベストロフィンポリペプチドは、植物細胞の少なくとも１つの葉緑体の葉緑体包膜または葉緑体チラコイド膜に局在している。いくつかの実施形態において、前記植物細胞は、葉肉細胞である。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドは、前記植物の葉肉細胞の少なくとも７０％において発現される。
上記の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、前記修飾された核酸配列は、前記植物の核ゲノムに安定に組み込まれている。上記の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの修飾された核酸配列は、緑藻類ベストロフィンポリペプチドの前記少なくとも１つのコード配列に作動可能に連結されたシグナルペプチド配列または標的配列をコードする第２の核酸配列をさらに含み、前記シグナルペプチド配列または標的配列の発現は、植物細胞の少なくとも１つの葉緑体の葉緑体包膜または葉緑体チラコイド膜への前記ベストロフィンポリペプチドの局在をもたらす。
上記の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、増加した炭素利用効率、増加した水利用効率、増加した窒素利用効率、または減少した光阻害は：配列番号１に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性を有する第１のポリペプチド；配列番号２に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性を有する第２のポリペプチド；配列番号３に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性を有する第３のポリペプチド、または；それらの任意の組み合わせ；の群から選択されるポリペプチドの発現の結果である。上記の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、増加した炭素利用効率、増加した水利用効率、増加した窒素利用効率、または減少した光阻害は：配列番号１に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する第１のポリペプチド；配列番号２に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する第２のポリペプチド；配列番号３に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する第３のポリペプチド、または；それらの任意の組み合わせ；の群から選択されるポリペプチドの発現の結果である。上記の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、重炭酸塩が膜を通過する能力の増加または提供は：配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、または配列番号１１１の群から選択され；好ましくは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号４２、配列番号６２、または配列番号６３の群から選択されるポリペプチドの発現の結果である。
上記の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、植物は、カウピー（すなわち、ブラックアイエンドウマメ、ササゲ（Vigna unguiculata））、ダイズ豆（すなわち、ダイズ豆、ダイズ（Glycine max））、キャッサバ（すなわち、マニオック、キャッサバ（Manihot esculenta））、イネ（すなわち、イネ（Oryza sativa）、アフリカイネ（Oryza glaberrima）、ジザニア・スプ（Zizania spp））、コムギ（すなわち、一般的なコムギ、スペルト、デュラム、パンコムギ（Triticum aestivum）、スペルトコムギ（Triticum spelta）、デュラムコムギ（Triticum durum）、トリティカム・スプ（Triticum spp））、オオムギ（すなわち、オオムギ（Hordeum vulgare））、ライムギ（すなわち、ライムギ（Secale cereale））、オートムギ（すなわち、エンバク（Avena sativa））、ジャガイモ（すなわち、ジャガイモ（Solanum tuberosum））、トマト（すなわち、トマト（Solanum lycopersicum））、または別のＣ３農作物植物である。いくつかの実施形態において、植物は、タバコ（すなわち、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）、ニコチアナ・エドワードソニー（Nicotiana edwardsonii）、ニコチアナ・プラムバグニフォリア（Nicotiana plumbagnifolia）、ニコチアナ・ロンギフロラ（Nicotiana longiflora））、またはアラビドプシス（すなわち、ロッククレス、サレクレス、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））である。上記の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、植物は、トウモロコシ（すなわちメイズ、トウモロコシ（Zea mays））、サトウモロコシ（すなわち、デュラ、グレートミッレト（great millet）、ミロ、モロコシ（Sorghum bicolor））、サトウキビ（すなわち、サトウキビ、サトウキビ（Saccharum officinarum））、キビ（すなわちフィンガーミッレト、一般的なミッレト、パールミッレト、フォクステイルミッレト、シコウビエ（Eleusine coracana）、キビ（Panicum miliaceum）、トウジンビエ（Pennisetum glaucum）、アワ（Setaria italica））、スイッチグラス（すなわち、背が高いパニックグラス、タッチグラス、スイッチグラス（Panicum virganum））、または別のＣ４農作物植物ではない。
いくつかの実施形態において、上記の実施形態のいずれかの植物部分は、葉、茎、根、花、種子、果実、細胞、またはそれらの一部である。いくつかの実施形態において、植物部分は、果実である。いくつかの実施形態において、植物部分は、穀粒（grain）、穀粒（kernel）、豆、または塊茎である。
いくつかの態様において、本開示は、上記の実施形態のいずれかの花粉粒または胚珠に関する。
いくつかの態様において、本開示は、上記の実施形態のいずれかから産生されるプロトプラストに関する。
いくつかの態様において、本開示は、上記の実施形態のいずれかのプロトプラストまたは細胞から産生される組織培養物に関し、ここで、細胞またはプロトプラストは、葉、葯、雌蕊、茎、葉柄、根、根端、果実、種子、花、子葉、胚軸、胚、または***組織細胞の群における植物部分のうちの１つから産生される。
いくつかの態様において、本開示は、遺伝子改変された種子であって、前記種子は、重炭酸塩が膜を通過する能力を増加させるか、もしくは提供する１つ以上の遺伝子改変を含む、種子に関する。いくつかの実施形態において、種子は、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質からストロマへと膜を通過する能力を有する植物を産生する。いくつかの実施形態において、種子は、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する能力を有する植物を産生する。いくつかの実施形態において、植物は、少なくとも１つの緑藻類ベストロフィンポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態において、緑藻類ベストロフィンポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または、それらの任意の組み合わせ、の群から選択される。いくつかの実施形態において、植物は：配列番号１に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性を有する第１のポリペプチド；配列番号２に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性を有する第２のポリペプチド；配列番号３に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性を有する第３のポリペプチド、または；それらの任意の組み合わせ；の群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態において、植物は、配列番号１に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する第１のポリペプチド；配列番号２に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する第２のポリペプチド；配列番号３に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する第３のポリペプチド、または；それらの任意の組み合わせ；の群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態において、植物は：配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、または配列番号１１１の群から選択され；好ましくは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号４２、配列番号６２、または配列番号６３の群から選択されるポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、植物細胞の少なくとも１つの葉緑体の葉緑体包膜または葉緑体チラコイド膜に局在している。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、植物細胞は、葉肉細胞である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、植物の葉肉細胞の少なくとも７０％において発現される。いくつかの実施形態において、植物は、カウピー、ダイズ豆、キャッサバ、イネ、ダイズ、コムギ、または他のＣ３農作物植物である。いくつかの実施形態において、植物は、トウモロコシ、モロコシ、または他のＣ４農作物植物ではない。
上記の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、内因性炭酸脱水酵素の発現は調節される。いくつかの実施形態において、調節された発現は、増加した発現、減少した発現、異なる位置での発現、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
本開示の特定の態様は、増加した炭素利用効率を有する植物を作製する方法に関し、ここで、当該方法の工程は、ａ）植物に遺伝子改変を導入し、その結果、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質からストロマへと膜を通過する能力を増加させるか、もしくは提供し、または重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する能力を増加させるか、もしくは提供し、それによって、植物の炭素利用効率を増加させること、である。
いくつかの態様において、本開示は、増加した水利用効率を有する植物を作製する方法に関し、ここで、当該方法の工程は、ａ）植物に遺伝子改変を導入し、その結果、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質からストロマへと膜を通過する能力を増加させるか、もしくは提供し、または重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する能力を増加させるか、もしくは提供し、それによって、植物の水利用効率を増加させること、である。
いくつかの態様において、本開示は、増加した窒素利用効率を有する植物を作製する方法に関し、ここで、当該方法の工程は、ａ）植物に遺伝子改変を導入し、その結果、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質からストロマへと膜を通過する能力を増加させるか、もしくは提供し、または重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する能力を増加させるか、もしくは提供し、それによって、植物の窒素利用効率を増加させること、である。
いくつかの態様において、本開示は、減少した光阻害を有する植物を作製する方法に関し、ここで、当該方法の工程は、ａ）植物に遺伝子改変を導入し、その結果、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質からストロマへと膜を通過する能力を増加させるか、もしくは提供し、または重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する能力を増加させるか、もしくは提供し、それによって、植物の光阻害を減少させること、である。
いくつかの態様において、本開示は、増加した成長または生産性を有する植物を作製する方法に関し、ここで、当該方法の工程は、ａ）植物に遺伝子改変を導入し、その結果、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質からストロマへと膜を通過する能力を増加させるか、もしくは提供し、または重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する能力を増加させるか、もしくは提供し、それによって、植物の成長または生産性を増加させること、である。
上記の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、内因性炭酸脱水酵素の発現は調節される。いくつかの実施形態において、調節された発現は、増加した発現、減少した発現、異なる位置での発現、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
いくつかの態様において、本開示は、増加した炭素利用効率を有する植物を栽培する方法に関し、ここで、当該方法の工程は、ａ）重炭酸塩が膜を通過する能力を増加させるか、または提供する１つ以上の遺伝子改変を種子に提供することであって、ここで、当該種子は、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質からストロマへと膜を通過する能力を有する植物を提供するか、または重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する能力を有する植物を提供する、ｂ）同じ条件下で栽培された１つ以上の遺伝子改変を欠く植物と比較して、重炭酸塩が膜を通過する能力が炭素利用効率を増加させる条件下で、植物を栽培すること、である。
いくつかの態様において、本開示は、増加した水利用効率を有する植物を栽培する方法に関し、ここで、当該方法の工程は、ａ）重炭酸塩が膜を通過する能力を増加させるか、または提供する１つ以上の遺伝子改変を種子に提供することであって、ここで、当該種子は、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質からストロマへと膜を通過する能力を有する植物を提供するか、または重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する能力を有する植物を提供する、ｂ）同じ条件下で栽培された１つ以上の遺伝子改変を欠く植物と比較して、重炭酸塩が膜を通過する能力が水利用効率を増加させる条件下で、植物を栽培すること、である。
いくつかの態様において、本開示は、増加した窒素利用効率を有する植物を栽培する方法に関し、ここで、当該方法の工程は、ａ）重炭酸塩が膜を通過する能力を増加させるか、または提供する１つ以上の遺伝子改変を種子に提供することであって、ここで、当該種子は、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質からストロマへと膜を通過する能力を有する植物を提供するか、または重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する能力を有する植物を提供する、ｂ）同じ条件下で栽培された１つ以上の遺伝子改変を欠く植物と比較して、重炭酸塩が膜を通過する能力が窒素利用効率を増加させる条件下で、植物を栽培すること、である。
いくつかの態様において、本開示は、減少した光阻害を有する植物を栽培する方法に関し、ここで、当該方法の工程は、ａ）重炭酸塩が膜を通過する能力を増加させるか、または提供する１つ以上の遺伝子改変を種子に提供することであって、ここで、当該種子は、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質からストロマへと膜を通過する能力を有する植物を提供するか、または重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する能力を有する植物を提供する、ｂ）同じ条件下で栽培された１つ以上の遺伝子改変を欠く植物と比較して、重炭酸塩が膜を通過する能力が光阻害を減少させる条件下で、植物を栽培すること、である。
いくつかの態様において、本開示は、増加した成長または生産性を有する植物を栽培する方法に関し、ここで、当該方法の工程は、ａ）重炭酸塩が膜を通過する能力を増加させるか、または提供する１つ以上の遺伝子改変を種子に提供することであって、ここで、当該種子は、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質からストロマへと膜を通過する能力を有する植物を提供するか、または重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する能力を有する植物を提供する、ｂ）同じ条件下で栽培された１つ以上の遺伝子改変を欠く植物と比較して、重炭酸塩が膜を通過する能力が成長または生産性を増加させる条件下で、植物を栽培すること、である。
いくつかの態様において、本開示は、増加した炭素利用効率を有する植物を栽培する方法に関し、ここで、当該方法の工程は、ａ）重炭酸塩が膜を通過する能力を増加させるか、または提供する１つ以上の遺伝子改変を組織培養物またはプロトプラストに提供すること、ｂ）組織培養物またはプロトプラストを未発達植物体へと再生させること、ｃ）未発達植物体を植物へと成長させることであって、ここで、当該植物は、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質からストロマへと膜を通過する能力を有するか、または重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する能力を有する、ｄ）同じ条件下で成長した１つ以上の遺伝子改変を欠く植物と比較して、重炭酸塩が膜を通過する能力が炭素利用効率を増加させる条件へと、植物を移植すること、である。
いくつかの態様において、本開示は、増加した水利用効率を有する植物を栽培する方法に関し、ここで、当該方法の工程は、ａ）重炭酸塩が膜を通過する能力を増加させるか、または提供する１つ以上の遺伝子改変を組織培養物またはプロトプラストに提供すること、ｂ）組織培養物またはプロトプラストを未発達植物体へと再生させること、ｃ）未発達植物体を植物へと成長させることであって、ここで、当該植物は、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質からストロマへと膜を通過する能力を有するか、または重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する能力を有する、ｄ）同じ条件下で成長した１つ以上の遺伝子改変を欠く植物と比較して、重炭酸塩が膜を通過する能力が水利用効率を増加させる条件へと、植物を移植すること、である。
いくつかの態様において、本開示は、増加した窒素利用効率を有する植物を栽培する方法に関し、ここで、当該方法の工程は、ａ）重炭酸塩が膜を通過する能力を増加させるか、または提供する１つ以上の遺伝子改変を組織培養物またはプロトプラストに提供すること、ｂ）組織培養物またはプロトプラストを未発達植物体へと再生させること、ｃ）未発達植物体を植物へと成長させることであって、ここで、当該植物は、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質からストロマへと膜を通過する能力を有するか、または重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する能力を有する、ｄ）同じ条件下で成長した１つ以上の遺伝子改変を欠く植物と比較して、重炭酸塩が膜を通過する能力が窒素利用効率を増加させる条件へと、植物を移植すること、である。
いくつかの態様において、本開示は、減少した光阻害を有する植物を栽培する方法に関し、ここで、当該方法の工程は、ａ）重炭酸塩が膜を通過する能力を増加させるか、または提供する１つ以上の遺伝子改変を組織培養物またはプロトプラストに提供すること、ｂ）組織培養物またはプロトプラストを未発達植物体へと再生させること、ｃ）未発達植物体を植物へと成長させることであって、ここで、当該植物は、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質からストロマへと膜を通過する能力を有するか、または重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する能力を有する、ｄ）同じ条件下で成長した１つ以上の遺伝子改変を欠く植物と比較して、重炭酸塩が膜を通過する能力が光阻害を減少させる条件へと、植物を移植すること、である。
いくつかの態様において、本開示は、増加した成長または生産性を有する植物を栽培する方法に関し、ここで、当該方法の工程は、ａ）重炭酸塩が膜を通過する能力を増加させるか、または提供する１つ以上の遺伝子改変を組織培養物またはプロトプラストに提供すること、ｂ）組織培養物またはプロトプラストを未発達植物体へと再生させること、ｃ）未発達植物体を植物へと成長させることであって、ここで、当該植物は、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質からストロマへと膜を通過する能力を有するか、または重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する能力を有する、ｄ）同じ条件下で成長した１つ以上の遺伝子改変を欠く植物と比較して、重炭酸塩が膜を通過する能力が成長または生産性を増加させる条件へと、植物を移植すること、である。
上記の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、種子、組織培養物、またはプロトプラストは、内因性炭酸脱水酵素の発現を調節する１つ以上の遺伝子改変を有する。いくつかの実施形態において、調節された発現は、増加した発現、減少した発現、異なる位置での発現、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
上記の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、重炭酸塩が膜を通過する能力の増加または提供は：配列番号１に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する第１のポリペプチド；配列番号２に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する第２のポリペプチド；配列番号３に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する第３のポリペプチド、または；それらの任意の組み合わせ；の群から選択される少なくとも１つポリペプチドの発現の結果である。上記の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、重炭酸塩が膜を通過する能力の増加または提供は：配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、または配列番号１１１の群から選択され；好ましくは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号４２、配列番号６２、または配列番号６３の群から選択される少なくとも１つのポリペプチドの発現の結果である。上記の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、植物は、カウピー、ダイズ豆、キャッサバ、イネ、ダイズ、コムギ、または他のＣ３農作物植物である。上記の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、植物は、トウモロコシ、モロコシ、または他のＣ４農作物植物ではない。
本開示の特定の態様は、藻類の葉緑体のルーメンへと重炭酸塩を輸送する藻類の能力の増加をもたらす１つ以上の遺伝子改変を含む、遺伝子改変された藻類に関する。いくつかの実施形態において、重炭酸塩輸送能力の増加は、以下の群からの少なくとも１つの緑藻類ベストロフィンポリペプチドを過剰発現した結果である：配列番号１に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性を有する第１のポリペプチド；配列番号２に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性を有する第２のポリペプチド；配列番号３に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性を有する第３のポリペプチド、または；それらの任意の組み合わせ。いくつかの実施形態において、重炭酸塩輸送能力の増加は、以下の群からの少なくとも１つの緑藻類ベストロフィンポリペプチドを過剰発現した結果である：配列番号１に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する第１のポリペプチド；配列番号２に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する第２のポリペプチド；配列番号３に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する第３のポリペプチド、または；それらの任意の組み合わせ。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、葉緑体チラコイド膜に局在している。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも藻類が１００ｐｐｍ未満の二酸化炭素（ＣＯ２は０．０１％［ｖ／ｖ］未満、空気中）条件下にある場合には、過剰発現される。
いくつかの態様において、本開示は、少なくとも１つの緑藻類ベストロフィンポリペプチドのコード配列を含む修飾された核酸配列を含む、増加した重炭酸塩輸送を有する緑藻類、またはその一部に関し；ここで、ベストロフィンポリペプチドは過剰発現され；ここで、ベストロフィンポリペプチドは葉緑体チラコイド膜に局在し；ここで、藻類が１００ｐｐｍ未満の二酸化炭素（ＣＯ２は０．０１％［ｖ／ｖ］未満、空気中）条件下で培養される場合には、収量、成長速度、もしくはバイオマスは、少なくとも１つのベストロフィンポリペプチドを過剰発現しない対応する野生型（ＷＴ）藻類もしくはそのＷＴ部分からの収量、成長速度、もしくはバイオマスよりも大きいか、または、収量、成長速度、もしくはバイオマスは、１００ｐｐｍ未満の二酸化炭素（ＣＯ２は０．０１％［ｖ／ｖ］未満、空気中）条件下で培養された、少なくとも１つのベストロフィンポリペプチドを過剰発現しない対応するＷＴ藻類もしくはその対応するＷＴ部分からの収量、成長速度、もしくはバイオマスと実質的に類似する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの緑藻類ベストロフィンポリペプチドは、以下の群から選択される：配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する第１のポリペプチド、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する第２のポリペプチド、配列番号３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する第３のポリペプチド、またはそれらの任意の組み合わせ。
いくつかの態様において、本開示は、少なくとも１つの緑藻類ベストロフィンポリペプチドのコード配列を含む修飾された核酸配列を含む、１００ｐｐｍ未満の二酸化炭素（ＣＯ２は０．０１％［ｖ／ｖ］未満、空気中）条件下で増加した成長を有する緑藻類、またはその一部に関し；ここで、ベストロフィンポリペプチドは過剰発現され；ここで、ベストロフィンポリペプチドは葉緑体チラコイド膜に局在し；ここで、藻類が１００ｐｐｍ未満の二酸化炭素（ＣＯ２は０．０１％［ｖ／ｖ］未満、空気中）条件下で培養される場合には、収量、成長速度、もしくはバイオマスは、少なくとも１つのベストロフィンポリペプチドを過剰発現しない対応する野生型（ＷＴ）藻類もしくはそのＷＴ部分からの収量、成長速度、もしくはバイオマスよりも大きいか、または、収量、成長速度、もしくはバイオマスは、１００ｐｐｍ未満の二酸化炭素（ＣＯ２は０．０１％［ｖ／ｖ］未満、空気中）条件下で培養された、少なくとも１つのベストロフィンポリペプチドを過剰発現しない対応するＷＴ藻類もしくはその対応するＷＴ部分からの収量、成長速度、もしくはバイオマスと実質的に類似する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの緑藻類ベストロフィンポリペプチドは、以下の群から選択される：配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する第１のポリペプチド、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する第２のポリペプチド、配列番号３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する第３のポリペプチド、またはそれらの任意の組み合わせ。
上記の藻類のいずれかのいくつかの実施形態において、緑藻類は、以下の群から選択される：クラミドモナス・ラインハルディ（Chlamydomonas reinhardtii）、クラミドモナス・エウスティグマ（Chlamydomonas eustigma）、ボルボックス・カルテリ・ｆ・ナガリエンシス（Volvox carteri f. nagariensis）、ゴニウム・ペクトラレ（Gonium pectorale）。
いくつかの態様において、本開示は、増加した炭素利用効率を有する藻類を作製する方法に関し、ここで、当該方法の工程は、ａ）藻類の葉緑体のルーメンへと重炭酸塩を輸送する能力の増加を含む、藻類に遺伝子改変を導入し、それによって、藻類の炭素利用効率を増加させること、である。いくつかの実施形態において、輸送能力の獲得は、以下の群から選択される、少なくとも１つの緑藻類ベストロフィンポリペプチドを過剰発現した結果である：配列番号１に対して少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性を有する第１のポリペプチド；配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性を有する第２のポリペプチド；配列番号３に対して少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性を有する第３のポリペプチド；またはそれらの任意の組み合わせ。いくつかの実施形態において、重炭酸塩輸送能力の増加は、以下の群から選択される、少なくとも１つの緑藻類ベストロフィンポリペプチドを過剰発現した結果である：配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する第１のポリペプチド、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する第２のポリペプチド、配列番号３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する第３のポリペプチド、またはそれらの任意の組み合わせ。
〔図面の簡単な説明〕
図１Ａ〜１Ｄは、クラミドモナス・ラインハルディ（C. reinhardtii）遺伝子（ＢＳＴ１、ＢＳＴ２、およびＢＳＴ３）およびタンパク質（ＢＳＴ１、ＢＳＴ２、およびＢＳＴ３）の互いに対する類似性、ならびにＢＳＴ１〜３の他のベストロフィンファミリータンパク質に対する類似性を示す。図１Ａは、ＢＳＴ１、ＢＳＴ２、およびＢＳＴ３遺伝子の模式図を示し、明灰色の四角はエキソンを表し、細い灰色の線はイントロンを表し、太い灰色の線は非翻訳領域（untranslated region、ＵＴＲ）を表し、重ねられた線（エキソンおよびイントロンに重ねられている）は３つの遺伝子によって共有される共通領域を示す。図１Ｂは、クラミドモナス・ラインハルディゲノム上のＢＳＴ１、ＢＳＴ２、およびＢＳＴ３遺伝子の位置および方向を示す。図１Ｃは、ＢＳＴ１（配列番号１）、ＢＳＴ２（配列番号２）、およびＢＳＴ３（配列番号３）タンパク質のアミノ酸アラインメントを示し、下端の行におけるアスタリスクは、３つのタンパク質すべてにおいて同一であるアミノ酸を示す。図１Ｄは、維管束植物（上から２番目の群）、非維管束植物（上から３番目の群）、珪藻類（上から４番目の群）、および緑藻類（下端の群）における、クラミドモナス・ラインハルディＢＳＴ１、ＢＳＴ２およびＢＳＴ３ホモログのタンパク質配列の系統樹を示す。
図２Ａ〜２Ｂは、クラミドモナス・ラインハルディ遺伝子ＢＳＴ１、ＢＳＴ２、およびＢＳＴ３の転写解析を示す。図２Ａは、野生型株Ｄ６６およびｃｉａ５細胞における、低ＣＯ２（ＣＯ２は０．０４％未満、空気中）と高ＣＯ２（ＣＯ２は５％（ｖ／ｖ）、空気中）とでの、ＢＳＴ１〜３蓄積を示す半定量ＲＴ−ＰＣＲを示す。図２Ｂは、高ＣＯ２（ＣＯ２は５％（ｖ／ｖ）、空気中）で成長した細胞から得られたｃＤＮＡにおけるＢＳＴ１〜３の発現、および２時間（２ｈ）、４時間（４ｈ）、６時間（６ｈ）、または１２時間（１２ｈ）の間、低ＣＯ２（ＣＯ２は０．０４％未満、空気中）に切り替えた細胞中で得られたｃＤＮＡにおけるＢＳＴ１〜３の発現を示す半定量ＲＴ−ＰＣＲの時間経過を示す。アクチンは、図２Ａおよび図２Ｂの両方においてローディングコントロールとして使用され、示される結果は、２つの反復のうちの１つからのものである。
図３Ａ〜３Ｂは、クラミドモナス・ラインハルディにおけるＢＳＴ１−Ｖｅｎｕｓ、ＢＳＴ２−Ｖｅｎｕｓ、およびＢＳＴ３−Ｖｅｎｕｓ融合タンパク質の局在を示す共焦点顕微鏡蛍光タンパク質画像を示す。図３Ａは、クラミドモナス・ラインハルディにおけるＢＳＴ１−Ｖｅｎｕｓ、ＢＳＴ２−Ｖｅｎｕｓ、およびＢＳＴ３−Ｖｅｎｕｓ融合タンパク質発現の位置（「Ｖｅｎｕｓ」列）、葉緑体チラコイドの位置（「クロロフィル」列）、ならびに互いに対する両方の位置（「マージ」列）を示す。スケールバーは、５μｍである。図３Ｂは、図３Ａの「ＢＳＴ１」行からのピレノイドの拡大画像を示す。矢印は、ピレノイドを貫通するチラコイド細管中のピレノイド内部にＢＳＴ１−Ｖｅｎｕｓ蛍光を見ることができる場所を強調する。スケールバーは、１μｍである。図３Ａおよび図３Ｂの両方について、画像は複数の反復の代表的な画像である。
図４は、野生型株Ｄ６６と比較した、ＲＮＡｉノックダウン株ｂｓｔｉ−１およびｂｓｔｉ−２におけるＢＳＴ１〜３発現のｑＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す。エラーバーは、３つの生物学的反復についての標準誤差を示す。
図５Ａ〜５Ｃは、様々なｐＨおよびＣＯ２条件下での、野生型株Ｄ６６と比較した、ＲＮＡｉノックダウン株ｂｓｔｉ−１、ならびにｐｍｐ１およびｃｉａ３変異株の成長表現型解析の結果を示す。垂直方向の点は、３つの異なる細胞濃度（１０，０００細胞、５，０００細胞および２，５００細胞）を表す。図５Ａは、極低ＣＯ２（ＣＯ２は０．０１％（ｖ／ｖ）、空気中）条件、およびｐＨ７または８．４下での、株の成長表現型解析の結果を示す。図５Ｂは、低ＣＯ２（ＣＯ２は０．０４％（ｖ／ｖ）、大気中）およびｐＨ７または８．４下での、株の成長表現型解析の結果を示す。図５Ｃは、高ＣＯ２（ＣＯ２は５％（ｖ／ｖ）、大気中）条件、およびｐＨ７または８．４下での、株の成長表現型解析の結果を示す。成長表現型解析実験は３回反復され、示される結果は代表的なものである。
図６Ａ〜６Ｆは、ＢＳＴ−ＲＮＡｉライン（line）１および２、すなわちｂｓｔｉ−１およびｂｓｔｉ−２、ならびにＤ６６の光合成酸素発生活性を示す。図６Ａは、Ｋ０．５（Ｃｉ）値（最大酸素放発生の半値に必要なＣｉ濃度）を示し、これは、ｐＨ８．４で１２時間、低ＣＯ２（ＣＯ２は０．０４％未満）に順化させたｂｓｔｉ−１およびＤ６６について、Ｃｉ曲線に対するＯ２発生から算出された。図６Ｂは、異なるＣｉ量および異なるｐＨ値にて測定された酸素発生活性を示し、ｐＨ８．４で１２時間、低ＣＯ２（ＣＯ２は０．０４％未満）に順化させたｂｓｔｉ−１およびＤ６６についての曲線としてプロットされる。図６Ｃは、Ｋ０．５（Ｃｉ）値（最大酸素発生の半値に必要なＣｉ濃度）を示し、これは、ｐＨ７．８で１２時間、低ＣＯ２（ＣＯ２は０．０４％未満）に順化させたｂｓｔｉ−１、ｂｓｔｉ−２、およびＤ６６について、Ｃｉ曲線に対するＯ２発生から算出された。記号「＊」は、Ｋ０．５（Ｃｉ）の差が有意であった（スチューデントのｔ検定でＰ＜０．０５）ことを示している。図６Ｄは、異なるＣｉ量および異なるｐＨ値にて測定された酸素発生活性を示し、ｐＨ７．８で１２時間、低ＣＯ２（ＣＯ２は０．０４％未満）に順化させたｂｓｔｉ−１、ｂｓｔｉ−２、およびＤ６６についての曲線としてプロットされる。図６Ｅは、Ｋ０．５（Ｃｉ）値（最大酸素発生の半値に必要なＣｉ濃度）を示し、これは、ｐＨ７．８で１２時間、高ＣＯ２（ＣＯ２は５％より高い）に順化させたｂｓｔｉ−１およびＤ６６について、Ｃｉ曲線に対するＯ２発生から算出された。図６Ｆは、異なるＣｉ量および異なるｐＨ値にて測定された酸素発生活性を示し、ｐＨ７．８で１２時間、高ＣＯ２（ＣＯ２は５％より高い）に順化させたｂｓｔｉ−１およびＤ６６についての曲線としてプロットされる。図６Ａ〜６Ｆについて、それぞれのＣｉ濃度で３回の反復試行が行われ、エラーバーは３つの生物学的反復を表し、標準偏差に基づく。すべての株のＶｍａｘを１００％酸素発生活性に設定した。
図７Ａ〜７Ｄは、ｂｓｔｉ−１およびＤ６６の無機炭素取り込みを示す。図７Ａは、ｐＨ７．８での細胞内（内部）Ｃｉ蓄積の経時変化を示す。図７Ｂは、ｐＨ７．８でのＣＯ２（Ｃｉ）固定の経時変化を示す。図７Ｃは、ｐＨ８．４での細胞内Ｃｉ蓄積の経時変化を示す。図７Ｄは、ｐＨ８．４でのＣＯ２固定の経時変化を示す。細胞は、上昇したＣＯ２（ＣＯ２は５％、空気中）で成長させ、その後、解析の前に１２時間、低ＣＯ２（ＣＯ２は０．０４％未満）に順化させた。細胞を採取し、内因性Ｃｉを枯渇させた後、アッセイを実施し、それぞれの時点について３回の反復のサンプルで試行した。図７Ａ〜７Ｄにおけるエラーバーは、３回の生物学的反復を表す。
図８Ａ〜８Ｃは、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＣＬｉＰ）由来の変異体ｂｓｔ３において、ＢＳＴ３がノックアウトされていることを示す。図８Ａは、ＢＳＴ３遺伝子の模式図を示し、エキソンは灰色の四角として描写され、イントロンは黒色の線として描写され、非翻訳領域は暗灰色の四角として描写される。インサートの位置は明灰色の三角として示され、インサートを検出するためのプライマーは小さな黒色の矢印として示される。図８Ｂは、ｂｓｔ３においてインサートの位置を確認するための、図８Ａにおいて示されるプライマーを使用するＰＣＲ反応の結果を示す。レーン１、鋳型としてＷＴ株Ｄ６６ ＤＮＡを使用するＢＳＴ３ＦおよびＢＳＴ３Ｒプライマー；レーン２、鋳型としてｂｓｔ３ ＤＮＡを使用するＣＩＢ１ＦおよびＢＳＴ３Ｆプライマー；レーン３、鋳型としてｂｓｔ３ ＤＮＡを使用するＣＩＢ１ＲおよびＢＳＴ３Ｒプライマー；レーン４、鋳型としてｂｓｔ３ ＤＮＡを使用するＢＳＴ３ＦおよびＢＳＴ３Ｒプライマー。レーン１およびレーン４のサイズ差は、１８００ｂｐのカセットがあることを示す。図８Ｃは、Ｄ６６およびｂｓｔ３細胞における、低ＣＯ２（ＣＯ２は０．０４％未満、空気中）および高ＣＯ２（ＣＯ２は５％（ｖ／ｖ）、空気中）におけるＢＳＴ１〜３蓄積を示す半定量ＲＴ−ＰＣＲを示す。赤色の四角で示されるように、ＢＳＴ３は、ｂｓｔ３細胞においては発現していない。アクチンは、ローディングコントロールとして使用された。
図９Ａ〜９Ｄは、ＷＴ株Ｄ６６と比較した、ノックアウト株ｂｓｔ３の成長および無機炭素親和性の測定を示す。図９Ａは、６日間にわたる低ＣＯ２（ＣＯ２は０．０４％未満）、ｐＨ８．６におけるｂｓｔ３およびＷＴの成長を示し、ＯＤ７３０を使用して測定された。図９Ｂは、６日間にわたる低ＣＯ２（ＣＯ２は０．０４％未満）、ｐＨ８．６、ｐＨ８．６におけるｂｓｔ３およびＷＴの成長を示し、これは、波長６４５および６６３でのクロロフィル推定を使用して測定された。図９Ｃは、ｂｓｔ３およびＤ６６についての曲線としてプロットされた、ｐＨ７．４で測定された酸素発生活性を示す。それぞれのＣｉ濃度で３回の反復を行った。図９Ｄは、ｐＨ７．４でのｂｓｔ３およびＤ６６についてのＣｉ曲線に対するＯ２発生から算出されたＫ０．５（Ｃｉ）値（最大酸素発生の半値に必要なＣｉ濃度）を示す。
図１０Ａ〜１０Ｄは、クラミドモナス・ラインハルディＢＳＴ１、ＢＳＴ２、およびＢＳＴ３についてのタンパク質構造モデルを示す。図１０Ａは、クラミドモナス・ラインハルディＢＳＴ１〜３およびクレブシエラ・ニューモニア（Klebsiella pneumonia）ベストロフィン（Ｋｐｂｅｓｔ）についての構造モデルを、突出形状として示され標識された選択的細孔を並べる保存残基を有するモノマーとして示す。図１０Ｂは、ローカルＱＭＥＡＮスコア（構造品質評価スコアリング関数）を用いて陰影が付けられたＢＳＴ１ホモペンタマーモデルの二次構造を示す。図１０Ｃは、ＢＳＴ１ホモペンタマーモデル上に描写されたチャネル空洞の輪郭を黒色で示す。図１０ＡのＢＳＴ１モデルからの保存残基は、チャネル空洞内に延在する突出形状として描写されている。図１０Ｄは、計算されたＢＳＴ１ホモペンタマーモデル上の静電ポテンシャルを示す。静電ポテンシャルは、−４ｋＴ／ｅ（負）〜＋４ｋＴ／ｅ（正）のポテンシャルスケールで表示される。
図１１は、無機炭素（Ｃｉ）輸送のための現状のクラミドモナス・ラインハルディＣＣＭモデルを示す。ＢＳＴ１、ＢＳＴ２、およびＢＳＴ３は、葉緑体チラコイド膜に局在する重炭酸塩輸送チャネル（明灰色、灰色、および暗灰色の矩形）として示されている。
〔詳細な説明〕
以下の説明は、例示的な方法、パラメータなどを記載する。しかしながら、そのような説明は、本開示の範囲に対する限定としては意図されておらず、代わりに、例示的な実施形態の説明として提供されることが認識されるべきである。
〔遺伝子組み換え植物や種子〕
本開示の特定の態様は、遺伝子改変された植物、またはその一部であって、植物は、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質からストロマへと膜を通過する能力を増加させるか、もしくは提供する１つ以上の遺伝子改変を含む、植物、またはその一部に関する。いくつかの態様において、本開示は、遺伝子改変された植物、またはその一部であって、植物は、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する能力を増加させるか、もしくは提供する１つ以上の遺伝子改変を含む、植物、またはその一部に関する。いくつかの実施形態において、重炭酸塩が膜を通過する能力の獲得は、少なくとも１つの緑藻類ベストロフィンポリペプチドの発現の結果である。いくつかの実施形態において、重炭酸塩が膜を通過する能力の獲得は、２つまたは３つの緑藻類ベストロフィンポリペプチドの発現の結果である。いくつかの実施形態において、重炭酸塩が膜を通過する能力の獲得は、４つ以上（例えば、５、６、７、８、９、１０つ）の緑藻類ベストロフィンポリペプチドの発現の結果である。いくつかの実施形態において、緑藻類ベストロフィンポリペプチドは、配列番号１（すなわち、ＢＥＳＴＲＯＰＨＩＮ１、ＢＳＴ１、Ｃｒｅ１６．ｇ６６２６００．ｔ１．２）、配列番号２（すなわち、ＢＥＳＴＲＯＰＨＩＮ２、ＢＳＴ２、Ｃｒｅ１６．ｇ６６３４００．ｔ２．１）、または配列番号３（すなわち、ＢＥＳＴＲＯＰＨＩＮ３、ＢＳＴ３、Ｃｒｅ１６．ｇ６６３４５０．ｔ１．２）である。いくつかの実施形態において、重炭酸塩が膜を通過する能力の増加または提供は、以下の群から選択される少なくとも１つのポリペプチドの発現の結果である：配列番号１に対して少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する第１のポリペプチド；配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する第２のポリペプチド；配列番号３に対して少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する第３のポリペプチド、または；それらの任意の組み合わせ。いくつかの実施形態において、重炭酸塩が膜を通過する能力の増加または提供は：配列番号１に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する第１のポリペプチド；配列番号２に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する第２のポリペプチド；配列番号３に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する第３のポリペプチド、または；それらの任意の組み合わせ；の群から選択されるポリペプチドの発現の結果である。
本明細書中に記載される場合、用語「ＢＳＴ１」、ならびにその大文字およびイタリック体は、緑藻類遺伝子およびタンパク質に言及する。本明細書中に記載される場合、いくつかの実施形態において、この用語は、クラミドモナス・ラインハルディ遺伝子およびタンパク質に言及し得る。他の実施形態において、この用語は、重炭酸塩も輸送する任意の緑藻類種の遺伝子およびタンパク質の１つ以上のホモログまたはオルソログに言及し得る。いくつかの実施形態において、この用語は、任意の緑藻類種の遺伝子およびタンパク質の１つ以上のパラログに言及し得る。いくつかの実施形態において、緑藻類種は、クラミドモナス・ラインハルディ（C. reinhardtii）、クラミドモナス・エウスティグマ（Chlamydomonas eustigma）、ボルボックス・カルテリ・ｆ・ナガリエンシス（Volvox carteri f. nagariensis）、またはゴニウム・ペクトラレ（Gonium pectorale）である。配列番号１は、クラミドモナス・ラインハルディＢＳＴ１タンパク質を提供する。すべてイタリック体の小文字で示される場合、遺伝子／タンパク質の変異体（例えば、ノックアウト）型が意図される。クラミドモナス・ラインハルディにおいて、変異体型は、単一の遺伝子／タンパク質であり得る。他の緑藻類種において、変異体型は、遺伝子／タンパク質のホモログ、オルソログ、および／またはパラログのうちの１つ、いくつか、またはすべてであり得る。
本明細書中に記載される場合、用語「ＢＳＴ２」、ならびにその大文字およびイタリック体は、緑藻類遺伝子およびタンパク質に言及する。本明細書中に記載される場合、いくつかの実施形態において、この用語は、クラミドモナス・ラインハルディ遺伝子およびタンパク質に言及し得る。他の実施形態において、この用語は、重炭酸塩も輸送する任意の緑藻類種の遺伝子およびタンパク質の１つ以上のホモログまたはオルソログに言及し得る。いくつかの実施形態において、この用語は、任意の緑藻類種の遺伝子およびタンパク質の１つ以上のパラログに言及し得る。いくつかの実施形態において、緑藻類種は、クラミドモナス・ラインハルディ（C. reinhardtii）、クラミドモナス・エウスティグマ（Chlamydomonas eustigma）、ボルボックス・カルテリ・ｆ・ナガリエンシス（Volvox carteri f. nagariensis）、またはゴニウム・ペクトラレ（Gonium pectorale）である。配列番号２は、クラミドモナス・ラインハルディＢＳＴ２タンパク質を提供する。すべてイタリック体の小文字で示される場合、遺伝子／タンパク質の変異体（例えば、ノックアウト）型が意図される。クラミドモナス・ラインハルディにおいて、変異体型は、単一の遺伝子／タンパク質であり得る。他の緑藻類種において、変異体型は、遺伝子／タンパク質のホモログ、オルソログ、および／またはパラログのうちの１つ、いくつか、またはすべてであり得る。
本明細書中に記載される場合、用語「ＢＳＴ３」、ならびにその大文字およびイタリック体は、緑藻類遺伝子およびタンパク質に言及する。本明細書中に記載される場合、いくつかの実施形態において、この用語は、クラミドモナス・ラインハルディ遺伝子およびタンパク質に言及し得る。他の実施形態において、この用語は、重炭酸塩も輸送する任意の緑藻類種の遺伝子およびタンパク質の１つ以上のホモログまたはオルソログに言及し得る。いくつかの実施形態において、この用語は、任意の緑藻類種の遺伝子およびタンパク質の１つ以上のパラログに言及し得る。いくつかの実施形態において、緑藻類種は、クラミドモナス・ラインハルディ（C. reinhardtii）、クラミドモナス・エウスティグマ（Chlamydomonas eustigma）、ボルボックス・カルテリ・ｆ・ナガリエンシス（Volvox carteri f. nagariensis）、またはゴニウム・ペクトラレ（Gonium pectorale）である。配列番号３は、クラミドモナス・ラインハルディＢＳＴ３タンパク質を提供する。すべてイタリック体の小文字で示される場合、遺伝子／タンパク質の変異体（例えば、ノックアウト）型が意図される。クラミドモナス・ラインハルディにおいて、変異体型は、単一の遺伝子／タンパク質であり得る。他の緑藻類種において、変異体型は、遺伝子／タンパク質のホモログ、オルソログ、および／またはパラログのうちの１つ、いくつか、またはすべてであり得る。
いくつかの実施形態において、重炭酸塩が膜を通過する能力の増加または提供は：配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、または配列番号１１１の群からのポリペプチド、または当該群のうちの１つと高い割合の同一性を有するポリペプチド；好ましくは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号４２、配列番号６２、または配列番号６３からなる群から選択されるポリペプチドの発現の結果である。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの文脈において、語句「高い割合で同一」、「高い割合の同一性」、または「高い配列同一性」およびそれらの文法的活用は、配列比較アルゴリズムを使用して、または目視検査により測定して、最大一致するように比較およびアラインされたときに、少なくとも約８０％、同一性、少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のヌクレオチドまたはアミノ酸同一性を有する、２つ以上の配列またはサブ配列に言及する。例示的な実施形態において、高い割合の同一性は、少なくとも約１６ヌクレオチドまたはアミノ酸長である配列の領域にわたって存在する。別の例示的な実施形態において、高い割合の同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチドまたはアミノ酸長である配列の領域にわたって存在する。さらに別の例示的な実施形態において、高い割合の同一性は、少なくとも約１００ヌクレオチドまたはアミノ酸長以上である配列の領域にわたって存在する。１つの例示的な実施形態において、配列は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の全長にわたって高い割合で同一である。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、植物細胞内の少なくとも１つの葉緑体の葉緑体包膜またはチラコイド膜に局在している。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、膜を横切って重炭酸塩（ＨＣＯ３ −）を移動させることができる。いくつかの実施形態において、ポリぺプチドは、膜を横切って塩化物アニオン（Ｃｌ−）を移動させることができる。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、膜を横切ってＨＣＯ３ −およびＣｌ−の両方を移動させることができる。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、膜を横切って負に帯電したイオンを移動させることができる。いくつかの実施形態において、植物細胞は葉肉細胞である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、植物の葉肉細胞の少なくとも７０％において発現される。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、オリゴマー化してペンタマーを形成する。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、オリゴマー化してホモペンタマーを形成する。いくつかの実施形態において、ペンタマーまたはホモペンタマーは、主に負の静水ポテンシャルを有するエントリーポケット、および中性／正の電荷を有する選択的細孔を有する。いくつかの実施形態において、ホモペンタマーは、負に帯電したイオンを輸送する。
いくつかの態様において、本開示は、増加した炭素利用効率を有する植物、またはその一部であって、植物は、植物、またはその一部において、緑藻類ベストロフィンポリペプチドの少なくとも１つのコード配列を有する少なくとも１つの修飾された核酸配列を含み、ここで、ベストロフィンポリペプチドは、植物、またはその一部において、発現され、ここで、植物が周囲の二酸化炭素条件下で栽培される場合には、収量、成長速度、もしくはバイオマスは、ベストロフィンポリペプチドを過剰発現しない対応する野生型（ＷＴ）植物、もしくはその対応するＷＴ部分からの収量、成長速度、もしくはバイオマスよりも大きいか、または、収量、成長速度、もしくはバイオマスは、周囲の二酸化炭素条件下で栽培されたベストロフィンポリペプチドを過剰発現しない対応する野生型（ＷＴ）植物、もしくはその対応するＷＴ部分からの収量、成長速度、もしくはバイオマスと実質的に類似する、植物、またはその一部に関する。本明細書中で使用される場合、用語「周囲の二酸化炭素」は、ＣＯ２を添加または除去されることがない、空気中の二酸化炭素含有量に言及する。いくつかの実施形態において、周囲の二酸化炭素条件は、４００〜５００ｐｐｍ、４００〜５５０ｐｐｍ、４００〜６００ｐｐｍ、４００〜６５０ｐｐｍ、４００〜７００ｐｐｍ、４５０〜５００ｐｐｍ、４５０〜５５０ｐｐｍ、４５０〜６００ｐｐｍ、４５０〜６５０ｐｐｍ、４５０〜７００ｐｐｍ、５００〜５５０ｐｐｍ、５００〜６００ｐｐｍ、５００〜６５０ｐｐｍ、５００〜７００ｐｐｍ、５５０〜６００ｐｐｍ、５５０〜６５０ｐｐｍ、５５０〜７００ｐｐｍ、６００〜６５０ｐｐｍ、６００〜７００ｐｐｍ、または６５０〜７００ｐｐｍの二酸化炭素条件である。本明細書中で使用される場合、用語「炭素利用効率」は、植物のバイオマスに組み込まれる、環境から獲得される炭素の割合に言及し得る。炭素利用効率は、当技術分野で公知の任意の方法（例えば、植物によって取り込まれる炭素の総量から、植物呼吸によって失われる炭素の量を減算し、次いで、この値を植物によって取り込まれる炭素の総量で除算する、など）によって測定され得る。いくつかの実施形態において、ベストロフィンポリペプチドは、植物細胞の少なくとも１つの葉緑体の葉緑体包膜または葉緑体チラコイド膜に局在している。いくつかの実施形態において、植物細胞は、葉肉細胞である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、植物の葉肉細胞の少なくとも７０％において発現される。
いくつかの態様において、本開示は、増加した水利用効率を有する植物、またはその一部であって、植物は、植物、またはその一部において、緑藻類ベストロフィンポリペプチドの少なくとも１つのコード配列を有する少なくとも１つの修飾された核酸配列を含み、ここで、ベストロフィンポリペプチドは、植物、またはその一部において、発現され、ここで、植物が周囲の二酸化炭素条件下で栽培される場合には、収量、成長速度、もしくはバイオマスは、ベストロフィンポリペプチドを過剰発現しない対応する野生型（ＷＴ）植物、もしくはその対応するＷＴ部分からの収量、成長速度、もしくはバイオマスよりも大きいか、または、収量、成長速度、もしくはバイオマスは、周囲の二酸化炭素条件下で栽培されたベストロフィンポリペプチドを過剰発現しない対応する野生型（ＷＴ）植物、もしくはその対応するＷＴ部分からの収量、成長速度、もしくはバイオマスと実質的に類似する、植物、またはその一部に関する。本明細書中で使用される場合、用語「水利用効率」は、植物における水消費に対する炭素同化の比率に言及する。水利用効率の尺度は、固有の水利用効率および瞬間的な水利用効率を含むが、これらに限定されない。瞬間的な水利用効率は、植物炭素同化と植物蒸散との間の比率を決定することによって、計算され得る。固有の水利用効率は、植物炭素同化と植物気孔伝導性との間の比率を決定することによって、計算され得る。炭素同化の尺度は、植物光合成速度、収量、およびバイオマスを含み得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ベストロフィンポリペプチドは、植物細胞の少なくとも１つの葉緑体の葉緑体包膜または葉緑体チラコイド膜に局在している。いくつかの実施形態において、植物細胞は、葉肉細胞である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、植物の葉肉細胞の少なくとも７０％において発現される。
いくつかの態様において、本開示は、増加した窒素利用効率を有する植物、またはその一部であって、植物は、植物、またはその一部において、緑藻類ベストロフィンポリペプチドの少なくとも１つのコード配列を有する少なくとも１つの修飾された核酸配列を含み、ここで、ベストロフィンポリペプチドは、植物、またはその一部において、発現され、ここで、植物が周囲の二酸化炭素条件下で栽培される場合には、収量、成長速度、もしくはバイオマスは、ベストロフィンポリペプチドを過剰発現しない対応する野生型（ＷＴ）植物、もしくはその対応するＷＴ部分からの収量、成長速度、もしくはバイオマスよりも大きいか、または、収量、成長速度、もしくはバイオマスは、周囲の二酸化炭素条件下で栽培されたベストロフィンポリペプチドを過剰発現しない対応する野生型（ＷＴ）植物、もしくはその対応するＷＴ部分からの収量、成長速度、もしくはバイオマスと実質的に類似する、植物、またはその一部に関する。本明細書中で使用される場合、用語「窒素利用効率」は、植物に供給される全窒素に対する、代謝のために植物によって使用される窒素の比率に言及する。窒素利用効率は、当技術分野で公知の任意の方法（例えば、１５Ｎ同位体標識、農業効率、見かけ上の窒素回収）によって、測定され得る。植物に供給される窒素源は、土壌に含まれる窒素、窒素固定細菌によって供給される窒素、および肥料に含まれる窒素を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ベストロフィンポリペプチドは、植物細胞の少なくとも１つの葉緑体の葉緑体包膜または葉緑体チラコイド膜に局在している。いくつかの実施形態において、植物細胞は、葉肉細胞である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、植物の葉肉細胞の少なくとも７０％において発現される。
いくつかの態様において、本開示は、減少した光阻害を有する植物、またはその一部であって、植物は、植物、またはその一部において、緑藻類ベストロフィンポリペプチドの少なくとも１つのコード配列を有する少なくとも１つの修飾された核酸配列を含み、ここで、ベストロフィンポリペプチドは、植物、またはその一部において、発現され、ここで、植物が周囲の二酸化炭素条件下で栽培される場合には、収量、成長速度、もしくはバイオマスは、ベストロフィンポリペプチドを過剰発現しない対応する野生型（ＷＴ）植物、もしくはその対応するＷＴ部分からの収量、成長速度、もしくはバイオマスよりも大きいか、または、収量、成長速度、もしくはバイオマスは、周囲の二酸化炭素条件下で栽培されたベストロフィンポリペプチドを過剰発現しない対応する野生型（ＷＴ）植物、もしくはその対応するＷＴ部分からの収量、成長速度、もしくはバイオマスと実質的に類似する、植物、またはその一部に関する。本明細書中で使用される場合、用語「光阻害」は、植物における光合成的産生の光誘導減少に言及する。光阻害は、当技術分野で公知の任意の方法（例えば、光飽和酸素発生の速度、クロロフィルａ蛍光の可変レベル対最大レベルの比率）によって、測定され得る。いくつかの実施形態において、ベストロフィンポリペプチドは、植物細胞の少なくとも１つの葉緑体の葉緑体包膜または葉緑体チラコイド膜に局在している。いくつかの実施形態において、植物細胞は、葉肉細胞である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、植物の葉肉細胞の少なくとも７０％において発現される。
上記の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、修飾された核酸配列は、植物の核ゲノムに安定に組み込まれている。上記の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾された核酸配列は、緑藻類ベストロフィンポリペプチドの少なくとも１つのコード配列に作動可能に連結されたシグナルペプチド配列または標的配列をコードする第２の核酸配列をさらに含み、シグナルペプチド配列または標的配列の発現は、植物細胞の少なくとも１つの葉緑体の葉緑体包膜または葉緑体チラコイド膜へのベストロフィンポリペプチドの局在をもたらす。いくつかの実施形態において、シグナルペプチド配列または標的配列は、リーダー配列である。いくつかの実施形態において、シグナルペプチド配列または標的配列は、葉緑体包膜または葉緑体チラコイド膜におけるポリペプチド発現をもたらすことが当技術分野で公知の任意の配列である。
上記の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、増加した炭素利用効率、増加した水利用効率、増加した窒素利用効率、または減少した光阻害は：配列番号１に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７１％、少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する第１のポリペプチド；配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する第２のポリペプチド；配列番号３に対して少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する第３のポリペプチド、または；それらの任意の組み合わせ；の発現の結果である。上記の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、増加した炭素利用効率、増加した水利用効率、増加した窒素利用効率、または減少した光阻害は：配列番号１に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する第１のポリペプチド；配列番号２に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する第２のポリペプチド；配列番号３に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する第３のポリペプチド、または；それらの任意の組み合わせ；の発現の結果である。
上記の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、重炭酸塩が膜を通過する能力の増加または提供は：配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、または配列番号１１１の群からのポリペプチド；好ましくは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号４２、配列番号６２、または配列番号６３からなる群から選択されるポリペプチドの発現の結果である。
上記の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、植物は、カウピー（すなわち、ブラックアイエンドウマメ、ササゲ（Vigna unguiculata））、ダイズ豆（すなわち、ダイズ豆、ダイズ（Glycine max））、キャッサバ（すなわち、マニオック、キャッサバ（Manihot esculenta））、イネ（すなわち、イネ（Oryza sativa）、アフリカイネ（Oryza glaberrima）、ジザニア・スプ（Zizania spp））、コムギ（すなわち、一般的なコムギ、スペルト、デュラム、パンコムギ（Triticum aestivum）、スペルトコムギ（Triticum spelta）、デュラムコムギ（Triticum durum）、トリティカム・スプ（Triticum spp））、オオムギ（すなわち、オオムギ（Hordeum vulgare））、ライムギ（すなわち、ライムギ（Secale cereale））、オートムギ（すなわち、エンバク（Avena sativa））、ジャガイモ（すなわち、ジャガイモ（Solanum tuberosum））、トマト（すなわち、トマト（Solanum lycopersicum））、または別のＣ３農作物植物である。いくつかの実施形態において、植物は、タバコ（すなわち、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）、ニコチアナ・エドワードソニー（Nicotiana edwardsonii）、ニコチアナ・プラムバグニフォリア（Nicotiana plumbagnifolia）、ニコチアナ・ロンギフロラ（Nicotiana longiflora））、またはアラビドプシス（すなわち、ロッククレス、サレクレス、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））である。上記の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、植物は、トウモロコシ（すなわちメイズ、トウモロコシ（Zea mays））、サトウモロコシ（すなわち、デュラ、グレートミッレト（great millet）、ミロ、モロコシ（Sorghum bicolor））、サトウキビ（すなわち、サトウキビ、サトウキビ（Saccharum officinarum））、キビ（すなわちフィンガーミッレト、一般的なミッレト、パールミッレト、フォクステイルミッレト、シコウビエ（Eleusine coracana）、キビ（Panicum miliaceum）、トウジンビエ（Pennisetum glaucum）、アワ（Setaria italica））、スイッチグラス（すなわち、背が高いパニックグラス、タッチグラス、スイッチグラス（Panicum virganum））、または別のＣ４農作物植物ではない。
いくつかの実施形態において、上記の実施形態のいずれかの植物部分は、葉、茎、根、花、種子、果実、細胞、またはそれらの一部である。いくつかの実施形態において、植物部分は、果実である。いくつかの実施形態において、植物部分は、穀粒（grain）、穀粒（kernel）、豆、または塊茎である。
いくつかの態様において、本開示は、上記の実施形態のいずれかの花粉粒または胚珠に関する。
いくつかの態様において、本開示は、上記の実施形態のいずれかから産生されるプロトプラストに関する。
いくつかの態様において、本開示は、上記の実施形態のいずれかのプロトプラストまたは細胞から産生される組織培養物に関し、ここで、細胞またはプロトプラストは、葉、葯、雌蕊、茎、葉柄、根、根端、果実、種子、花、子葉、胚軸、胚、または***組織細胞の群における植物部分のうちの１つから産生される。
いくつかの態様において、本開示は、遺伝子改変された種子であって、種子は、重炭酸塩が膜を通過する能力を増加させるか、もしくは提供する１つ以上の遺伝子改変を含む、種子に関する。いくつかの実施形態において、種子は、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質からストロマへと膜を通過する能力を有する植物を産生する。いくつかの実施形態において、種子は、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する能力を有する植物を産生する。いくつかの実施形態において、植物は、少なくとも１つの緑藻類ベストロフィンポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態において、緑藻類ベストロフィンポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または、それらの任意の組み合わせ、である。いくつかの実施形態において、植物は：配列番号１に対して少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する第１のポリペプチド；配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する第２のポリペプチド；配列番号３に対して少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する第３のポリペプチド、または；それらの任意の組み合わせ；を発現する。いくつかの実施形態において、植物は、配列番号１に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する第１のポリペプチド；配列番号２に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する第２のポリペプチド；配列番号３に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する第３のポリペプチド、または；それらの任意の組み合わせ；を発現する。いくつかの実施形態において、植物は：配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、または配列番号１１１の群からのポリペプチド；好ましくは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号４２、配列番号６２、または配列番号６３からなる群から選択されるポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、植物細胞の少なくとも１つの葉緑体の葉緑体包膜または葉緑体チラコイド膜に局在している。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、植物細胞は、葉肉細胞である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、植物の葉肉細胞の少なくとも７０％において発現される。上記の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、植物は、カウピー（すなわち、ブラックアイエンドウマメ、ササゲ（Vigna unguiculata））、ダイズ豆（すなわち、ダイズ豆、ダイズ（Glycine max））、キャッサバ（すなわち、マニオック、キャッサバ（Manihot esculenta））、イネ（すなわち、イネ（Oryza sativa）、アフリカイネ（Oryza glaberrima）、ジザニア・スプ（Zizania spp））、コムギ（すなわち、一般的なコムギ、スペルト、デュラム、パンコムギ（Triticum aestivum）、スペルトコムギ（Triticum spelta）、デュラムコムギ（Triticum durum）、トリティカム・スプ（Triticum spp））、オオムギ（すなわち、オオムギ（Hordeum vulgare））、ライムギ（すなわち、ライムギ（Secale cereale））、オートムギ（すなわち、エンバク（Avena sativa））、ジャガイモ（すなわち、ジャガイモ（Solanum tuberosum））、トマト（すなわち、トマト（Solanum lycopersicum））、または別のＣ３農作物植物である。いくつかの実施形態において、植物は、タバコ（すなわち、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）、ニコチアナ・エドワードソニー（Nicotiana edwardsonii）、ニコチアナ・プラムバグニフォリア（Nicotiana plumbagnifolia）、ニコチアナ・ロンギフロラ（Nicotiana longiflora））、またはアラビドプシス（すなわち、ロッククレス、サレクレス、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））である。上記の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、植物は、トウモロコシ（すなわちメイズ、トウモロコシ（Zea mays））、サトウモロコシ（すなわち、デュラ、グレートミッレト（great millet）、ミロ、モロコシ（Sorghum bicolor））、サトウキビ（すなわち、サトウキビ、サトウキビ（Saccharum officinarum））、キビ（すなわちフィンガーミッレト、一般的なミッレト、パールミッレト、フォクステイルミッレト、シコウビエ（Eleusine coracana）、キビ（Panicum miliaceum）、トウジンビエ（Pennisetum glaucum）、アワ（Setaria italica））、スイッチグラス（すなわち、背が高いパニックグラス、タッチグラス、スイッチグラス（Panicum virganum））、または別のＣ４農作物植物ではない。
上記の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、内因性炭酸脱水酵素の発現は調節される。いくつかの実施形態において、調節された発現は、増加した発現、減少した発現、異なる位置での発現、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
〔遺伝子改変された植物を作製、栽培する方法〕
本開示の特定の態様は、増加した炭素利用効率を有する植物を作製する方法に関し、ここで、当該方法の工程は、ａ）植物に遺伝子改変を導入し、その結果、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質からストロマへと膜を通過する能力を増加させるか、もしくは提供し、または重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する能力を増加させるか、もしくは提供し、それによって、植物の炭素利用効率を増加させること、である。
いくつかの態様において、本開示は、増加した水利用効率を有する植物を作製する方法に関し、ここで、当該方法の工程は、ａ）植物に遺伝子改変を導入し、その結果、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質からストロマへと膜を通過する能力を増加させるか、もしくは提供し、または重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する能力を増加させるか、もしくは提供し、それによって、植物の水利用効率を増加させること、である。
いくつかの態様において、本開示は、増加した窒素利用効率を有する植物を作製する方法に関し、ここで、当該方法の工程は、ａ）植物に遺伝子改変を導入し、その結果、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質からストロマへと膜を通過する能力を増加させるか、もしくは提供し、または重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する能力を増加させるか、もしくは提供し、それによって、植物の窒素利用効率を増加させること、である。
いくつかの態様において、本開示は、減少した光阻害を有する植物を作製する方法に関し、ここで、当該方法の工程は、ａ）植物に遺伝子改変を導入し、その結果、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質からストロマへと膜を通過する能力を増加させるか、もしくは提供し、または重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する能力を増加させるか、もしくは提供し、それによって、植物の光阻害を減少させること、である。
いくつかの態様において、本開示は、増加した成長または生産性を有する植物を作製する方法に関し、ここで、当該方法の工程は、ａ）植物に遺伝子改変を導入し、その結果、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質からストロマへと膜を通過する能力を増加させるか、もしくは提供し、または重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する能力を増加させるか、もしくは提供し、それによって、植物の成長または生産性を増加させること、である。増加した成長の指標は、以下を含み得るがこれに限定されない：より速い成長速度、より大きな植物、増加したバイオマス、増加した乾燥質量、増加したシュート質量、および増加したルート質量。増加した生産性の指標は、以下を含み得るがこれに限定されない：より高い作物収量、より多くの数の葉、およびより少ない作物成熟までの日数。
上記の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、内因性炭酸脱水酵素の発現は、調節される。いくつかの実施形態において、調節された発現は、増加した発現、減少した発現、異なる位置での発現、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
いくつかの態様において、本開示は、増加した炭素利用効率を有する植物を栽培する方法に関し、ここで、当該方法の工程は、ａ）重炭酸塩が膜を通過する能力を増加させるか、または提供する１つ以上の遺伝子改変を種子に提供することであって、ここで、当該種子は、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質からストロマへと膜を通過する能力を有する植物を提供するか、または重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する能力を有する植物を提供する、ｂ）同じ条件下で栽培された１つ以上の遺伝子改変を欠く植物と比較して、重炭酸塩が膜を通過する能力が炭素利用効率を増加させる条件下で、植物を栽培すること、である。
いくつかの態様において、本開示は、増加した水利用効率を有する植物を栽培する方法に関し、ここで、当該方法の工程は、ａ）重炭酸塩が膜を通過する能力を増加させるか、または提供する１つ以上の遺伝子改変を種子に提供することであって、ここで、当該種子は、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質からストロマへと膜を通過する能力を有する植物を提供するか、または重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する能力を有する植物を提供する、ｂ）同じ条件下で栽培された１つ以上の遺伝子改変を欠く植物と比較して、重炭酸塩が膜を通過する能力が水利用効率を増加させる条件下で、植物を栽培すること、である。
いくつかの態様において、本開示は、増加した窒素利用効率を有する植物を栽培する方法に関し、ここで、当該方法の工程は、ａ）重炭酸塩が膜を通過する能力を増加させるか、または提供する１つ以上の遺伝子改変を種子に提供することであって、ここで、当該種子は、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質からストロマへと膜を通過する能力を有する植物を提供するか、または重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する能力を有する植物を提供する、ｂ）同じ条件下で栽培された１つ以上の遺伝子改変を欠く植物と比較して、重炭酸塩が膜を通過する能力が窒素利用効率を増加させる条件下で、植物を栽培すること、である。
いくつかの態様において、本開示は、減少した光阻害を有する植物を栽培する方法に関し、ここで、当該方法の工程は、ａ）重炭酸塩が膜を通過する能力を増加させるか、または提供する１つ以上の遺伝子改変を種子に提供することであって、ここで、当該種子は、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質からストロマへと膜を通過する能力を有する植物を提供するか、または重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する能力を有する植物を提供する、ｂ）同じ条件下で栽培された１つ以上の遺伝子改変を欠く植物と比較して、重炭酸塩が膜を通過する能力が光阻害を減少させる条件下で、植物を栽培すること、である。
いくつかの態様において、本開示は、増加した成長または生産性を有する植物を栽培する方法に関し、ここで、当該方法の工程は、ａ）重炭酸塩が膜を通過する能力を増加させるか、または提供する１つ以上の遺伝子改変を種子に提供することであって、ここで、当該種子は、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質からストロマへと膜を通過する能力を有する植物を提供するか、または重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する能力を有する植物を提供する、ｂ）同じ条件下で栽培された１つ以上の遺伝子改変を欠く植物と比較して、重炭酸塩が膜を通過する能力が成長または生産性を増加させる条件下で、植物を栽培すること、である。
いくつかの態様において、本開示は、増加した炭素利用効率を有する植物を栽培する方法に関し、ここで、当該方法の工程は、ａ）重炭酸塩が膜を通過する能力を増加させるか、または提供する１つ以上の遺伝子改変を組織培養物またはプロトプラストに提供すること、ｂ）組織培養物またはプロトプラストを未発達植物体へと再生させること、ｃ）未発達植物体を植物へと成長させることであって、ここで、当該植物は、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質からストロマへと膜を通過する能力を有するか、または重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する能力を有する、ｄ）同じ条件下で成長した１つ以上の遺伝子改変を欠く植物と比較して、重炭酸塩が膜を通過する能力が炭素利用効率を増加させる条件へと、植物を移植すること、である。
いくつかの態様において、本開示は、増加した水利用効率を有する植物を栽培する方法に関し、ここで、当該方法の工程は、ａ）重炭酸塩が膜を通過する能力を増加させるか、または提供する１つ以上の遺伝子改変を組織培養物またはプロトプラストに提供すること、ｂ）組織培養物またはプロトプラストを未発達植物体へと再生させること、ｃ）未発達植物体を植物へと成長させることであって、ここで、当該植物は、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質からストロマへと膜を通過する能力を有するか、または重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する能力を有する、ｄ）同じ条件下で成長した１つ以上の遺伝子改変を欠く植物と比較して、重炭酸塩が膜を通過する能力が水利用効率を増加させる条件へと、植物を移植すること、である。
いくつかの態様において、本開示は、増加した窒素利用効率を有する植物を栽培する方法に関し、ここで、当該方法の工程は、ａ）重炭酸塩が膜を通過する能力を増加させるか、または提供する１つ以上の遺伝子改変を組織培養物またはプロトプラストに提供すること、ｂ）組織培養物またはプロトプラストを未発達植物体へと再生させること、ｃ）未発達植物体を植物へと成長させることであって、ここで、当該植物は、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質からストロマへと膜を通過する能力を有するか、または重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する能力を有する、ｄ）同じ条件下で成長した１つ以上の遺伝子改変を欠く植物と比較して、重炭酸塩が膜を通過する能力が窒素利用効率を増加させる条件へと、植物を移植すること、である。
いくつかの態様において、本開示は、減少した光阻害を有する植物を栽培する方法に関し、ここで、当該方法の工程は、ａ）重炭酸塩が膜を通過する能力を増加させるか、または提供する１つ以上の遺伝子改変を組織培養物またはプロトプラストに提供すること、ｂ）組織培養物またはプロトプラストを未発達植物体へと再生させること、ｃ）未発達植物体を植物へと成長させることであって、ここで、当該植物は、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質からストロマへと膜を通過する能力を有するか、または重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する能力を有する、ｄ）同じ条件下で成長した１つ以上の遺伝子改変を欠く植物と比較して、重炭酸塩が膜を通過する能力が光阻害を減少させる条件へと、植物を移植すること、である。
いくつかの態様において、本開示は、増加した成長または生産性を有する植物を栽培する方法に関し、ここで、当該方法の工程は、ａ）重炭酸塩が膜を通過する能力を増加させるか、または提供する１つ以上の遺伝子改変を組織培養物またはプロトプラストに提供すること、ｂ）組織培養物またはプロトプラストを未発達植物体へと再生させること、ｃ）未発達植物体を植物へと成長させることであって、ここで、当該植物は、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質からストロマへと膜を通過する能力を有するか、または重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する能力を有する、ｄ）同じ条件下で成長した１つ以上の遺伝子改変を欠く植物と比較して、重炭酸塩が膜を通過する能力が成長または生産性を増加させる条件へと、植物を移植すること、である。
上記の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、種子、組織培養物、またはプロトプラストは、内因性炭酸脱水酵素の発現を調節する１つ以上の遺伝子改変を有する。いくつかの実施形態において、調節された発現は、増加した発現、減少した発現、異なる位置での発現、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
上記の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、重炭酸塩が膜を通過する能力の増加または提供は、配列番号１との少なくとも９５％の配列同一性を有する第１のポリペプチド、配列番号２との少なくとも９５％の配列同一性を有する第２のポリペプチド、配列番号３との少なくとも９５％の配列同一性を有する第３のポリペプチド、またはそれらの任意の組み合わせの群から選択される、少なくとも１つのポリペプチドの発現の結果である。上記の方法のいずれかの、重炭酸塩が膜を通過する能力の増加または提供は、以下の群から選択される少なくとも１つのポリペプチドの発現の結果であり：配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、または配列番号１１１；好ましくは、以下からなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドの発現の結果である：配列番号１０、配列番号１１、配列番号１５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号４２、配列番号６２、または配列番号６３。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、植物細胞の少なくとも１つの葉緑体の葉緑体包膜または葉緑体チラコイド膜に局在している。いくつかの実施形態において、植物細胞は、葉肉細胞である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、植物の葉肉細胞の少なくとも７０％において発現される。上記の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、植物は、カウピー（すなわち、ブラックアイエンドウマメ、ササゲ（Vigna unguiculata））、ダイズ豆（すなわち、ダイズ豆、ダイズ（Glycine max））、キャッサバ（すなわち、マニオック、キャッサバ（Manihot esculenta））、イネ（すなわち、イネ（Oryza sativa）、アフリカイネ（Oryza glaberrima）、ジザニア・スプ（Zizania spp））、コムギ（すなわち、一般的なコムギ、スペルト、デュラム、パンコムギ（Triticum aestivum）、スペルトコムギ（Triticum spelta）、デュラムコムギ（Triticum durum）、トリティカム・スプ（Triticum spp））、オオムギ（すなわち、オオムギ（Hordeum vulgare））、ライムギ（すなわち、ライムギ（Secale cereale））、オートムギ（すなわち、エンバク（Avena sativa））、ジャガイモ（すなわち、ジャガイモ（Solanum tuberosum））、トマト（すなわち、トマト（Solanum lycopersicum））、または別のＣ３農作物植物である。いくつかの実施形態において、植物は、タバコ（すなわち、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）、ニコチアナ・エドワードソニー（Nicotiana edwardsonii）、ニコチアナ・プラムバグニフォリア（Nicotiana plumbagnifolia）、ニコチアナ・ロンギフロラ（Nicotiana longiflora））、またはアラビドプシス（すなわち、ロッククレス、サレクレス、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））である。上記の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、植物は、トウモロコシ（すなわちメイズ、トウモロコシ（Zea mays））、サトウモロコシ（すなわち、デュラ、グレートミッレト（great millet）、ミロ、モロコシ（Sorghum bicolor））、サトウキビ（すなわち、サトウキビ、サトウキビ（Saccharum officinarum））、キビ（すなわちフィンガーミッレト、一般的なミッレト、パールミッレト、フォクステイルミッレト、シコウビエ（Eleusine coracana）、キビ（Panicum miliaceum）、トウジンビエ（Pennisetum glaucum）、アワ（Setaria italica））、スイッチグラス（すなわち、背が高いパニックグラス、タッチグラス、スイッチグラス（Panicum virganum））、または別のＣ４農作物植物ではない。
〔遺伝子改変された藻類〕
本開示の特定の態様は、藻類の葉緑体のルーメンへと重炭酸塩を輸送する藻類の能力の増加をもたらす１つ以上の遺伝子改変を含む、遺伝子改変された藻類に関する。いくつかの実施形態において、重炭酸塩輸送能力の増加は、以下の群から選択される少なくとも１つの緑藻類ベストロフィンポリペプチドを過剰発現した結果である：配列番号１に対して少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する第１のポリペプチド；配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する第２のポリペプチド；配列番号３に対して少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する第３のポリペプチド；またはそれらの任意の組み合わせ。いくつかの実施形態において、重炭酸塩輸送能力の増加は、以下の群から選択される少なくとも１つの緑藻類ベストロフィンポリペプチドを過剰発現した結果である：配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する第１のポリペプチド、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する第２のポリペプチド、配列番号３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する第３のポリペプチド、またはそれらの任意の組み合わせ。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、葉緑体チラコイド膜に局在している。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも藻類が１００ｐｐｍ未満の二酸化炭素（ＣＯ２は０．０１％［ｖ／ｖ］未満、空気中）条件下にある場合には、過剰発現される。
いくつかの態様において、本開示は、少なくとも１つの緑藻類ベストロフィンポリペプチドのコード配列を含む修飾された核酸配列を含む、増加した重炭酸塩輸送を有する緑藻類、またはその一部に関し；ここで、ベストロフィンポリペプチドは過剰発現され；ここで、ベストロフィンポリペプチドは葉緑体チラコイド膜に局在し；ここで、藻類が１００ｐｐｍ未満の二酸化炭素（ＣＯ２は０．０１％［ｖ／ｖ］未満、空気中）条件下で培養される場合には、収量、成長速度、もしくはバイオマスは、少なくとも１つのベストロフィンポリペプチドを過剰発現しない対応する野生型（ＷＴ）藻類もしくはそのＷＴ部分からの収量、成長速度、もしくはバイオマスよりも大きいか、または、収量、成長速度、もしくはバイオマスは、１００ｐｐｍ未満の二酸化炭素（ＣＯ２は０．０１％［ｖ／ｖ］未満、空気中）条件下で培養された、少なくとも１つのベストロフィンポリペプチドを過剰発現しない対応するＷＴ藻類もしくはその対応するＷＴ部分からの収量、成長速度、もしくはバイオマスと実質的に類似する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの緑藻類ベストロフィンポリペプチドは、以下の群から選択される：配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する第１のポリペプチド、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する第２のポリペプチド、配列番号３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する第３のポリペプチド、またはそれらの任意の組み合わせ。
いくつかの態様において、本開示は、少なくとも１つの緑藻類ベストロフィンポリペプチドのコード配列を含む修飾された核酸配列を含む、１００ｐｐｍ未満の二酸化炭素（ＣＯ２は０．０１％［ｖ／ｖ］未満、空気中）条件下で増加した成長を有する緑藻類、またはその一部に関し；ここで、ベストロフィンポリペプチドは過剰発現され；ここで、ベストロフィンポリペプチドは葉緑体チラコイド膜に局在し；ここで、藻類が１００ｐｐｍ未満の二酸化炭素（ＣＯ２は０．０１％［ｖ／ｖ］未満、空気中）条件下で培養される場合には、収量、成長速度、もしくはバイオマスは、少なくとも１つのベストロフィンポリペプチドを過剰発現しない対応する野生型（ＷＴ）藻類もしくはそのＷＴ部分からの収量、成長速度、もしくはバイオマスよりも大きいか、または、収量、成長速度、もしくはバイオマスは、１００ｐｐｍ未満の二酸化炭素（ＣＯ２は０．０１％［ｖ／ｖ］未満、空気中）条件下で培養された、少なくとも１つのベストロフィンポリペプチドを過剰発現しない対応するＷＴ藻類もしくはその対応するＷＴ部分からの収量、成長速度、もしくはバイオマスと実質的に類似する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの緑藻類ベストロフィンポリペプチドは、以下の群から選択される：配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する第１のポリペプチド、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する第２のポリペプチド、配列番号３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する第３のポリペプチド、またはそれらの任意の組み合わせ。
上記の藻類のいずれかのいくつかの実施形態において、緑藻類は、以下の群から選択される：クラミドモナス・ラインハルディ（Chlamydomonas reinhardtii）、クラミドモナス・エウスティグマ（Chlamydomonas eustigma）、ボルボックス・カルテリ・ｆ・ナガリエンシス（Volvox carteri f. nagariensis）、ゴニウム・ペクトラレ（Gonium pectorale）。
〔遺伝子改変された藻類を作製する方法〕
いくつかの態様において、本開示は、増加した炭素利用効率を有する藻類を作製する方法に関し、ここで、当該方法の工程は、ａ）藻類の葉緑体のルーメンへと重炭酸塩を輸送する能力の増加を含む、藻類に遺伝子改変を導入し、それによって、藻類の炭素利用効率を増加させること、である。いくつかの実施形態において、輸送能力の獲得は、以下の群から選択される、少なくとも１つの緑藻類ベストロフィンポリペプチドを過剰発現した結果である：配列番号１に対して少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する第１のポリペプチド；配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する第２のポリペプチド；配列番号３に対して少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する第３のポリペプチド；またはそれらの任意の組み合わせ。いくつかの実施形態において、重炭酸塩輸送能力の増加は、以下の群から選択される、少なくとも１つの緑藻類ベストロフィンポリペプチドを過剰発現した結果である：配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する第１のポリペプチド、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する第２のポリペプチド、配列番号３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する第３のポリペプチド、またはそれらの任意の組み合わせ。
〔トランスジェニック植物および植物細胞を作製する分子生物学的方法〕
本発明の一実施形態は、１つ以上の修飾された植物遺伝子および／または導入された遺伝子を含む植物または植物細胞を提供する。例えば、本開示は、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質から植物細胞質からストロマへと膜を通過する増加した能力または提供された能力を有するトランスジェニック植物を提供する。さらに、本開示は、重炭酸塩が植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する増加した能力または提供された能力を有するトランスジェニック植物を提供する。さらに、本開示は、緑藻類ベストロフィンポリペプチドの少なくとも１つのコード配列を含む少なくとも１つの修飾された核酸配列を有するトランスジェニック植物を提供する。他の遺伝的要素（例えば、内因性炭酸脱水酵素）の調節された発現もまた、本明細書中で検討され、記載される。
遺伝子改変された単子葉植物細胞および双子葉植物細胞の形質転換および生成は、当技術分野で公知である。例えば、Ｗｅｉｓｉｎｇら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１−４７７（１９８８）；米国特許第５，６７９，５５８号；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇａｒｔｌａｎｄ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ（１９９５）；および、Ｗａｎｇら、Ａｃｔａ Ｈｏｒｔ．４６１：４０１−４０８（１９９８）を参照のこと。方法の選択は、形質転換される植物の型、特定の用途および／または所望の結果に伴って、変化する。適切な形質転換技術は、当業者によって容易に選択される。
細胞ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡおよびオルガネラＤＮＡ）を欠失、挿入または他の修飾をするための当技術分野で公知の任意の方法論が、本明細書中に記載される本発明を実施するにあたって、使用され得る。例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）における、標的遺伝子の欠失または挿入のための遺伝子構築物を含む非武装Ｔｉプラスミド（disarmed Ti plasmid）は、植物細胞を形質転換するために使用され得、その後、形質転換された植物は、例えば以下のような、当技術分野において記載される手順を使用して、形質転換された植物細胞から再建され得る：ＥＰ０１１６７１８、ＥＰ０２７０８２２、ＰＣＴ公報ＷＯ８４／０２９１３、および公開された欧州特許出願（「ＥＰ」）０２４２２４６。Ｔｉプラスミドベクターはそれぞれ、ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡの、境界配列（border sequence）の間に位置する遺伝子、または少なくとも右境界配列の左側に位置する遺伝子を含む。もちろん、他の型のベクターが、以下のような手順を使用して、植物細胞を形質転換するために使用され得る：直接遺伝子導入（例えば、ＥＰ０２３３２４７に記載されるようなもの）、花粉媒介形質転換（例えば、ＥＰ０２７０３５６、ＰＣＴ公報ＷＯ８５／０１８５６、および米国特許第４，６８４，６１１号に記載されるようなもの）、植物ＲＮＡウイルス媒介形質転換（例えば、ＥＰ００６７５５３、および米国特許第４，４０７，９５６号に記載されるようなもの）、リポソーム媒介形質転換（例えば、米国特許第４，５３６，４７５号に記載されるようなもの）、ならびに、トウモロコシの特定のラインを形質転換するための方法（例えば、米国特許第６，１４０，５５３号；Ｆｒｏｍｍら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９０）８，８３３ ８３９）； Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ（１９９０）２，６０３ ６１８）、およびイネの特定のラインを形質転換するための方法（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３３８，２７４ ２７６；Ｄａｔｔａら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、（１９９０）８，７３６ ７４０）、および単子葉植物を一般的に形質転換するための方法（ＰＣＴ公報ＷＯ９２／０９６９６）、などの他の方法。綿の形質転換については、ＰＣＴ特許公報ＷＯ００／７１７３３に記載される方法が使用され得る。ダイズ豆の形質転換については、当技術分野で公知の方法（例えば、Ｈｉｎｃｈｅｅら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、（１９８８）６，９１５）およびＣｈｒｉｓｔｏｕら（Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ、（１９９０）８，１４５）またはＷＯ００／４２２０７の方法）が参照される。
本発明のトランスジェニック植物は、同じ特性を有するより多くのトランスジェニック植物を作製するために、または同一もしくは関連する植物種の他の変種において遺伝子改変を導入するために、従来の植物育種スキームにおいて使用され得る。形質転換植物から得られる種子は、好ましくは染色体ＤＮＡまたはオルガネラＤＮＡにおいて安定なインサートのような遺伝子改変を含む。本発明に基づく遺伝子改変を含む植物は、本発明の遺伝子改変を含む植物、例えば果樹または装飾植物、の根茎を含む植物か、またはそれに由来する植物を含む。したがって、形質転換された植物または植物部分に挿入された任意の非トランスジェニック移植植物部分は、本発明に含まれる。
導入された遺伝的要素は、導入された遺伝子の発現をもたらす発現ベクターであっても発現カセットであっても、典型的には植物発現可能なプロモーターを利用するのであろう。本明細書中で使用される場合、「植物発現可能なプロモーター」は、植物細胞における本発明の遺伝子改変の発現を確実にするプロモーターに言及する。植物における構成的発現を導くプロモーターの例は、当技術分野において公知であり、以下を含む：例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の強力な構成的３５Ｓプロモーター（「３５Ｓプロモーター」）（例えば、単離ＣＭ１８４１（Ｇａｒｄｎｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，（１９８１）９，２８７１ ２８８７）、ＣａｂｂＢ Ｓ（Ｆｒａｎｃｋら、Ｃｅｌｌ（１９８０）２１、２８５ ２９４）、およびＣａｂｂＢ ＪＩ（ＨｕｌｌおよびＨｏｗｅｌｌ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、（１９８７）８６、４８２ ４８３））；ユビキチンファミリーからのプロモーター（例えば、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎらのメイズユビキチンプロモーター、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、（１９９２）１８、６７５−６８９）、ｇｏｓ２プロモーター（ｄｅ Ｐａｔｅｒら、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊ（１９９２）２、８３４−８４４）、エミュープロモーター（Ｌａｓｔら、Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ，（１９９０）８１、５８１−５８８）、Ａｎら（Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊ（１９９６）１０、１０７）に記載されるプロモーター、Ｚｈａｎｇら（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、（１９９１）３、１１５５−１１６５）に記載されるイネアクチンプロモーターなどのアクチンプロモーター；キャッサバべインモザイクウイルスのプロモーター（ＷＯ９７／４８８１９、Ｖｅｒｄａｇｕｅｒら（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、（１９９８）３７、１０５５−１０６７）、サブタレニアン・クローバー・スタントウイルスからのプロモーターのｐＰＬＥＸシリーズ（ＷＯ９６／０６９３２、特にＳ４またはＳ７プロモーター）、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、例えば、ｐＡｄｈ１Ｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ０４０４９、Ｘ００５８１）、およびＴ ＤＮＡの、１’および２’遺伝子の発現をそれぞれ駆動するＴＲ１’プロモーターおよびＴＲ２’プロモーター（それぞれ「ＴＲ１’プロモーター」および「ＴＲ２’プロモーター」）（Ｖｅｌｔｅｎら、ＥＭＢＯ Ｊ、（１９８４）３、２７２３ ２７３０）。
あるいは、植物発現可能なプロモーターは、組織特異的プロモーター、すなわち、植物のいくつかの細胞または組織（例えば、緑色組織）において、より高レベルの発現を導くプロモーター（ＰＥＰカルボキシラーゼのプロモーターなど）であり得る。植物ＰＥＰカルボキシラーゼプロモーター（Ｐａｔｈｉｒａｎａら、Ｐｌａｎｔ Ｊ、（１９９７）１２：２９３−３０４）は、導管組織における発現のための強力なプロモーターであると記載されており、本発明の一実施形態において有用である。あるいは、植物発現可能なプロモーターはまた、損傷誘導性プロモーター（例えば、エンドウ細胞壁インベルターゼ遺伝子のプロモーター（Ｚｈａｎｇら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ、（１９９６）１１２：１１１１−１１１７）でもあり得る。本明細書中で使用される場合、「損傷誘導性」プロモーターは、機械的または昆虫の摂食のいずれかによる植物の損傷の際に、プロモーターの制御下でのコード配列の発現が、このような植物において有意に増加することを意味する。これらの植物発現可能なプロモーターは、エンハンサー要素と組み合わされ得、それらは、最小プロモーター要素と組み合わされ得るか、または所望の発現プロファイルを確実にするために反復要素を含み得る。
いくつかの実施形態において、植物細胞における発現を増加させるための遺伝的要素が利用され得る。例えば、導入された遺伝子の５’末端もしくは３’末端のイントロン、または導入された遺伝子のコード配列、例えば、ｈｓｐ７０イントロン。他のこのような遺伝的要素は、以下を含み得るがこれに限定されない：プロモーターエンハンサー要素；二重または三重プロモーター領域；別の導入遺伝子とは異なるか、または内因性（植物宿主）遺伝子リーダー配列とは異なる、５’リーダー配列；同じ植物において使用される別の導入遺伝子とは異なるか、または内因性（植物宿主）トレーラー配列とは異なる、３’トレーラー配列。
本発明の導入された遺伝子は、宿主細胞ＤＮＡへと挿入され得、挿入された遺伝子部分は適切な３’末端転写調節シグナル（すなわち、転写産物形成シグナルおよびポリアデニル化シグナル）の上流（すなわち、５’）にある。これは、好ましくは植物細胞ゲノム（核または葉緑体）に遺伝子を挿入することによって、達成される。好ましいポリアデニル化シグナルおよび転写産物形成シグナルは、形質転換された植物細胞において３’非翻訳ＤＮＡ配列として働く、以下のようなもののポリアデニル化シグナルおよび転写産物形成シグナルを含む：ノパリンシンターゼ遺伝子（Ｄｅｐｉｃｋｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ Ａｐｐｌ Ｇｅｎ、（１９８２）１、５６１−５７３）、オクトピンシンターゼ遺伝子（Ｇｉｅｌｅｎら、ＥＭＢＯ Ｊ、（１９８４）３：８３５ ８４５）、ＳＣＳＶまたはＭａｌｉｃ酵素ターミネーター（Ｓｃｈｕｎｍａｎｎら、Ｐｌａｎｔ Ｆｕｎｃｔ Ｂｉｏｌ、（２００３）３０：４５３−４６０）、およびＴ ＤＮＡ遺伝子７（ＶｅｌｔｅｎおよびＳｃｈｅｌｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、（１９８５）１３、６９８１ ６９９８）。いくつかの実施形態において、１つ以上の導入された遺伝子は、核ゲノムへ安定に組み込まれる。安定な組み込みは、核酸配列が核ゲノムへ組み込まれたままであり、その後の植物世代を通じて発現され続ける（すなわち、検出可能なｍＲＮＡ転写産物またはタンパク質が産生される）場合に、存在する。核ゲノムへの安定な組み込みは、当技術分野で公知の任意の方法（例えば、微粒子衝撃、アグロバクテリウム媒介形質転換、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、プロトプラストのエレクトロポレーション、マイクロインジェクションなど）によって、達成され得る。
組み換え核酸または修飾された核酸という用語は、遺伝子工学技術または化学合成によるポリヌクレオチドの単離セグメントの人工操作によって達成される、他の方法では分離される２つの配列セグメントの組み合わせによって作製されるポリヌクレオチドに言及する。そうすることにおいて、所望の機能のポリヌクレオチドセグメントを一緒に連結して、所望の機能の組み合わせを生成し得る。
本明細書中で使用される場合、用語「過剰発現」および「アップレギュレーション」は、遺伝子修飾の結果として、野生型生物（例えば、植物、藻類）における発現と比較して（例えば、ｍＲＮＡ、ポリペプチドなどの）増加した発現に言及する。いくつかの実施形態において、発現の増加は、野生型における発現よりも約１０％多い、わずかな増加である。いくつかの実施形態において、発現の増加は、野生型における発現と比較して５０％以上（例えば、６０％、７０％、８０％、１００％など）の増加である。いくつかの実施形態において、内因性遺伝子は過剰発現される。いくつかの実施形態において、外因性遺伝子は、発現されることによって、過剰発現される。植物または藻類における遺伝子の過剰発現は、以下の使用を含むがこれに限定されない、当該分野で公知の任意の方法によって達成され得る：構成的プロモーター、誘導性プロモーター、高発現プロモーター（例えば、ＰｓａＤプロモーター）、エンハンサー、転写調節配列および／または翻訳調節配列、コドン最適化、修飾された転写因子、および／または過剰発現される遺伝子の発現を制御する変異遺伝子または修飾された遺伝子。
組み換え核酸が特定の配列の発現、クローニング、または複製を意図される場合、宿主細胞への導入のために調製されるＤＮＡ構築物は、典型的には所望のポリペプチドをコードする意図されるＤＮＡフラグメントを含む、宿主によって認識される複製系（すなわち、ベクター）を含み得、ポリペプチドをコードするセグメントに作動可能に連結される転写調節配列および翻訳開始調節配列も含み得る。さらに、このような構築物は、細胞局在シグナル（例えば、葉緑体局在シグナル）を含み得る。好ましい実施形態において、このようなＤＮＡ構築物は、宿主細胞のゲノムＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡまたはミトコンドリアＤＮＡに導入される。
いくつかの実施形態において、非組み込み発現系を使用して、１つ以上の導入された遺伝子の発現を誘導し得る。発現系（発現ベクター）は例えば、以下を含み得る：複製起点または自己複製配列（autonomously replicating sequence、ＡＲＳ）および発現制御配列、プロモーター、エンハンサーおよび必要なプロセシング情報部位（リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、転写ターミネーター配列、およびｍＲＮＡ安定化配列など）。シグナルペプチドはまた、適切な場合、タンパク質が細胞膜、細胞壁を通過すること、および／もしくは留まること、または細胞から分泌されることを可能にする、同一の種または関連する種の分泌ポリペプチドから適切なものに含まれ得る。
本明細書中に開示される本発明の方法論を実施する際に有用な選択マーカーは、ポジティブ選択マーカーであり得る。典型的には、ポジティブ選択は、目的の組み換えポリヌクレオチドが細胞内に存在するときのみ、遺伝子改変された細胞が毒性物質の存在下で生存し得る場合に言及する。ネガティブ選択マーカーおよびスクリーニングマーカーもまた、当技術分野で公知であり、そして本発明によって検討される。当業者は、利用可能な任意の関連のマーカーが本明細書中に開示される本発明の実施において利用され得ることを認識するであろう。
本発明の組み換え株のスクリーニングおよび分子分析は、核酸ハイブリダイゼーション技術を利用して行われ得る。ハイブリダイゼーション手順は、本明細書中に記載される技術を使用して修飾されたもののように、ポリヌクレオチドを同定するために有用であり、本明細書中に教示されるように有用であるには十分な対象調節配列との相同性を有する。特定のハイブリダイゼーション技術は、本発明に必須ではない。ハイブリダイゼーション技術の改善がなされるにつれて、それらは当業者によって容易に適用され得る。ハイブリダイゼーションプローブは、当業者に公知の任意の適切な標識を用いて標識され得る。ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件（例えば、温度および塩濃度）は、検出閾値の厳しさを変化させるために変更され得る。ハイブリダイゼーション条件に関するさらなる手引きについては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）（以下参照）、またはＡｕｓｕｂｅｌら（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ、ＮＹ、ＮＹ．Ｙ．を参照のこと。
さらに、遺伝子改変株のスクリーニングおよび分子分析、ならびに所望の単離された核酸の作製は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して実施され得る。ＰＣＲは、核酸配列の反復的な、酵素的な、準備された合成である。この手順は公知であり、この当業者によって一般に使用される（Ｍｕｌｌｉｓ、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、４，８００，１５９号；Ｓａｉｋｉら、（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０：１３５０−１３５４を参照のこと）。ＰＣＲは、標的配列の逆鎖にハイブリダイゼーションする２つのオリゴヌクレオチドプライマーが隣接する、目的のＤＮＡフラグメントの酵素的増幅に基づく。プライマーは、３’末端が互いに向くように配向される。鋳型の熱変性、プライマーのそれらの相補配列へのアニーリング、およびＤＮＡポリメラーゼを用いたアニーリングされたプライマーの伸長、の反復サイクルは、ＰＣＲプライマーの５’末端によって定義されるセグメントの増幅を生じる。各プライマーの伸長産物は他のプライマーの鋳型として働き得るので、各サイクルは、前のサイクルで生産されたＤＮＡ鋳型の量を本質的に２倍にする。これは、数時間で数百万倍までの、特定の標的フラグメントの指数関数的な蓄積を生じる。好熱性細菌サームス・アクアティクス（Thermus aquaticus）から単離されるＴａｑポリメラーゼなどの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用することによって、増幅プロセスは完全に自動化され得る。使用することができる他の酵素は、当業者に公知である。
本発明の核酸およびタンパク質はまた、特異的に開示された配列のホモログも包含し得る。相同性（例えば、配列同一性）は、５０％〜１００％であり得る。ある場合には、そのような相同性は、８０％を超え、８５％を超え、９０％を超え、または９５％を超える。配列の任意の意図される使用に必要とされる相同性または同一性の程度は、当業者によって容易に同定される。本明細書中で使用される場合、２つの核酸の配列同一性の割合は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８によって開示されるような、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７．において変更されるような、当技術分野で公知のアルゴリズムを使用して、決定される。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０２−４１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれる。ＮＢＬＡＳＴヌクレオチド探索は、所望の配列同一性の割合を有するヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝１００、文字長＝１２）を用いて、行われる。比較の目的でギャップアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載されるように、ギャップＢＬＡＳＴが使用される。ＢＬＡＳＴおよびギャップＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（ＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターが使用される。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。
好ましい宿主細胞は、植物細胞または藻類細胞である。組み換え宿主細胞は、本文脈において、単離された核酸分子を含有するか、宿主細胞において通常存在し、機能的である１つ以上の欠失または他の非機能的遺伝子を含有するか、または少なくとも１つの組み換えタンパク質を産生するための１つ以上の遺伝子を含有するように、遺伝子修飾されたものである。本発明のタンパク質をコードする核酸は、形質転換、リポフェクション、エレクトロポレーション、または当業者に公知の任意の他の方法論を含むがこれに限定されない、特定の型の細胞について適切である、当技術分野で公知の任意の手段によって、導入され得る。
本発明を一般的に説明したが、本発明をさらに説明するために本明細書に含まれ、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定することを意図しない、特定の具体的な実施例を参照することによって、本発明はより良く理解されるであろう。
〔実施例〕
本開示は、以下の実施例においてさらに詳細に記載されるが、これらは特許請求の範囲のように本開示の範囲を限定することは、決して意図されない。添付の図面は、本開示の明細書および記載の不可欠な部分と見なされることが意図される。以下の実施例は、例示のために提供されるが、特許請求される開示を限定するものではない。
〔実施例１：細胞培養および成長のために使用される一般的な材料および方法〕
以下の実施例は、以下の実施例すべてにおいて使用される細胞培養条件および成長条件を記載する。クラミドモナス・ラインハルディ細胞は、ペトリプレート上のＴｒｉｓ−アセテート−リン酸（ＴＡＰ）培地またはイースト−アセテート（ＹＡ）培地のいずれかで維持された。実験の前に、細胞は、最小（すなわち、炭素源を含まない）培地に接種され、高ＣＯ２（ＣＯ２は５％より高い、空気中）で２〜３×１０６細胞・ｍL−１の濃度まで増殖させた。次いで、これらの細胞は、最小培地に希釈され、示されるｐＨおよびＣＯ２濃度で増殖させた。
クラミドモナス・ラインハルディ培養条件は、Ｍａら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １５６：８８４−８９６、２０１１に記載されているものと同じであった。Ｄ６６株（ｎｉｔ２−、ｃｗ１５、ｍｔ＋）は、Ｄｒ．Ｒｏｇｅｎｅ Ｓｃｈｎｅｌｌ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｒｋａｎｓａｓ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｒｏｃｋ）から入手した。ＣＭＪ０３０（ＣＣ−４５３３；ｃｗ１５、ｍｔ−）およびｂｓｔ３（ＢＳＴ３ノックアウトＬＭＪ．ＲＹ０４０２．０８９３６５）は、クラミドモナス培養収集物（Ｚｈａｎｇら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２６（４）：１３９８−１４０９，２０１４）のＣＬｉＰ収集物から得た。Ｔｒｉｓ−アセテート−リン酸（ＴＡＰ）培地、イースト−アセテート（ＹＡ）培地、および最小（ＭＩＮ；アセテートなし、すなわち炭素源なし）は、Ｓｕｅｏｋａ、ＰＮＡＳ ４６：８３−９１，１９６０に従って、調製された。ＴＡＰおよびＹＡペトリプレートの両方は、１．２％（ｗ／ｖ）アガーを添加することによって調製され、クラミドモナス・ラインハルディ細胞は、いずれかのタイプのペトリプレート上で維持された。細胞培養は、混合栄養性成長のために、ＴＡＰプレートからのコロニーを三角フラスコ中のＴＡＰ液体培地１００ｍＬに接種することによって、開始した。培養物は、継続的な照明（１００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１）および４８時間の振盪下で、早期の対数期まで成長させた。早期の対数期のＴＡＰ成長培養物は、収集され、ＭＩＮ培地を用いて洗浄され、その後、ＭＩＮ培地中に再懸濁され、高ＣＯ２（ＣＯ２は５％［ｖ／ｖ］、空気中）でバブリングされ、０．２〜０．３（〜２〜３×１０６細胞・ｍL−１）のＯＤ７３０に達した。ＣＣＭ誘導のために、細胞は、低ＣＯ２（ＣＯ２は０．０１％［ｖ／ｖ］未満、空気中）バブリングに１２時間、または周囲のＣＯ２（ＣＯ２は０．０４％〜０．０４５％［ｖ／ｖ］、空気中）に移された。
〔実施例２：ベストロフィンファミリー遺伝子の系統樹〕
以下の実施例は、さまざまな光合成生物におけるベストロフィンファミリー遺伝子の進化的関係を描写する系統樹の構築を記載する。哺乳動物において、ベストロフィンタンパク質は、塩化物および重炭酸塩を導くことが知られている。植物において、ほとんどのベストロフィンタンパク質は、まだ特性付けられていない。
〔材料および方法〕
３つのクラミドモナス・ラインハルディ遺伝子ＢＥＳＴＲＯＰＨＩＮ１（ＢＳＴ１）、ＢＥＳＴＲＯＰＨＩＮ２（ＢＳＴ２）、およびＢＥＳＴＲＯＰＨＩＮ３（ＢＳＴ３）は、複数の理由から、この系統樹において使用するために選択された。１つには、ＢＳＴ１、ＢＳＴ２、およびＢＳＴ３遺伝子は、共通領域を共有すること（図１Ａ〜１Ｂを参照のこと）。もう１つには、ＢＳＴ１（配列番号１）、ＢＳＴ２（配列番号２）、およびＢＳＴ３（配列番号３）タンパク質のアミノ酸配列は、互いに８０％を超えて同一であること（図１Ｃを参照のこと）。クラミドモナス・ラインハルディは７つの他の予測されたベストロフィンを含むが、これらの他のベストロフィンはいずれもこれら３つのタンパク質と４５％を超える同一性を有しない。最後に、選択された３つのベストロフィンはすべて、葉緑体に標的とされると予測されたこと。
系統樹構築：ＢＳＴ１（Ｃｒｅ１６．ｇ６６２６００．ｔ１．２）、ＢＳＴ２（Ｃｒｅ１６．ｇ６６３４００．ｔ２．１）、およびＢＳＴ３（Ｃｒｅ１６．ｇ６６３４５０．ｔ１．２）についてのアミノ酸配列は、以下に対してＢＬＡＳＴＥＤされた：ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ（Ｂｅｎｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２１（１３）：２９６３−２９６５，１９９３）、およびＰｈｙｔｏｚｏｍｅ ｖ１２．１（ｈｔｔｐｓ：／／Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ．ｊｇｉ．ｄｏｅ．ｇｏｖ／ｐｚ／ｐｏｒｔａｌ．ｈｔｍｌ；Ｇｏｏｄｓｔｅｉｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４０（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ１１７８−１１８６，２０１２）。これらのデータベースを使用して同定された上位ヒットがダウンロードされた。さらに、ホモサピエンスＢＥＳＴ１（ＳＪＭ３１５３３．１）およびクレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）ベストロフィン（ｐｄｂ＿４ＷＤ８＿Ａ）をコードするアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋからダウンロードされ、系統解析における外群として含まれた。合計６３の初期配列が、アミノ酸置換マトリックスＢＬＯＳＵＭ６２（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、ＰＮＡＳ ８９（２２）：１０９１５−１０９１９、１９９２）を用いたＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２（２２）：４６７３−４６８０、１９９４）アルゴリズムを使用して、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ １１．１．４（Ｋｅａｒｓｅら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２８（１２）：１６４７−１６４９、２０１２）において、アラインされた。２つのデータベース（ＮＣＢＩおよびＰｈｙｔｏｚｏｍｅ）からの複製配列、ならびに７０％未満の対割合ポジティブ同一性（pairwise percentage positive identity）（ＢＬＯＳＵＭ６２）を有する配列は、排除された。最終的なアラインメントは、３０配列を含み、配列から可変長末端を除去するために手動でトリミングされた。系統解析は、ＭＥＧＡ Ｘ（Ｋｕｍａｒら、Ｃｏｍｐｕｔ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｓｃｉ １０（２）：１８９−１９１、１９９４）において完了された。アラインメントの系統解析のための最良の最尤（ＭＬ）モデルは、ＭＥＧＡ Ｘにおけるモデル選択関数を使用して、計算された。ＭＬ樹は、ガンマ分布（５つの別個のカテゴリー）および５００のブートストラップ複製を有するＬＧ置換モデル（ＬｅおよびＧａｓｃｕｅｌ、Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｅｖｏｌ ２５（７）：１３０７−１３２０、２００８）を使用して、構築された（図１Ｄ参照）。Ａｄｏｂｅ Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｏｒ ＣＣを使用して、樹はフォーマットされ、シェーディングされた。クラミドモナス・ラインハルディＢＳＴ１、ＢＳＴ２およびＢＳＴ３ホモログのタンパク質配列の系統樹は、最尤（ＭＬ）を使用して、構築された。
〔結果〕
図１Ａは、ＢＳＴ１、ＢＳＴ２、およびＢＳＴ３遺伝子の模式図を示し、明灰色の四角はエキソンを表し、細い灰色の線はイントロンを表し、太い灰色の線は非翻訳領域（ＵＴＲ）を表し、重ねられた線（エキソンおよびイントロンに重ねられている）は３つの遺伝子によって共有される共通領域を示す。さらに、３つのベストロフィン遺伝子それぞれの長さが示されており、ＢＳＴ１は最も短く３０００ｋｂ未満であり、ＢＳＴ２は最も長く５０００ｋｂを超えた。図１Ｂにおいて、クラミドモナス・ラインハルディゲノム上のＢＳＴ１、ＢＳＴ２、およびＢＳＴ３遺伝子の位置および方向が示される。ＢＳＴ１（Ｃｒｅ１６．ｇ６６２６００）、ＢＳＴ２（Ｃｒｅ１６．ｇ６６３４００）およびＢＳＴ３（Ｃｒｅ１６．ｇ６６３４５０）は、クラミドモナス・ラインハルディの１６番目の染色体上の１３０ｋｂｐ領域内に位置するパラロガス遺伝子である。さらに、この画像は、ＢＳＴ１、ＢＳＴ２、およびＢＳＴ３の互いの相対的な位置を示す。図１Ｃは、ＢＳＴ１、ＢＳＴ２、およびＢＳＴ３タンパク質のアミノ酸アラインメントを示し、ここで、下端の行におけるアスタリスクは、３つのタンパク質すべてにおいて同一であるアミノ酸を示す。ＢＳＴ１、ＢＳＴ２、およびＢＳＴ３タンパク質は、互いに８０％を超えて同一である。
図１Ｄは、種々の光合成生物におけるクラミドモナス・ラインハルディＢＳＴ１、ＢＳＴ２、およびＢＳＴ３ホモログのタンパク質配列間の関係を表す系統樹を示す。これらの生物は、維管束植物（上から２番目の群）、非維管束植物（上から３番目の群）、珪藻類（上から４番目の群）、および緑藻類（下端の群）を含む。クラミドモナス・ラインハルディベストロフィンタンパク質は、緑藻類群内において太字で示される。非光合成生物であるヒト（ホモサピエンス）と細菌（クレブシエラ・ニューモニエ）由来のタンパク質からなる外群もまた示される（上端の群）。クラミドモナス・ラインハルディＢＳＴ１、ＢＳＴ２およびＢＳＴ３のヒトベストロフィン１（ＢＥＳＴ１）との配列アラインメントは、ＢＥＳＴ１およびＢＳＴ１〜３との間で低い配列同一性（２１〜２３％）を示した。クラミドモナス・ラインハルディベストロフィンタンパク質は、互いにかなりの配列類似性を示し、他の緑藻類ベストロフィンタンパク質とかなりの配列類似性を示し、これは、樹内のそれらの近傍位置およびこれらのタンパク質を連結するより浅い分枝パターンによって、示される。特に、ボルボックス・カルテリおよびクラミドモナス・エウスティグマはクラミドモナス・ラインハルディと非常に近縁であるが、デュナリエラ・サリナ（Dunaliella salina）はクラミドモナス・ラインハルディとより遠縁である。珪藻種（青緑色で強調される）は、クラミドモナス・ラインハルディと非常に遠縁であり、実際に異なる内部共生現象から生じた。この遠縁関係は、これらのタンパク質を連結するより深い分枝パターンによって、明確に描写される。図１Ｄに示される維管束植物および非維管束植物タンパク質は、クラミドモナス・ラインハルディベストロフィンタンパク質に対してわずか３０〜３５％の低い配列類似性を有し、これは、それらのより遠い位置およびこれらのタンパク質を連結するより深い分枝パターンによって、描写される。例えば、アラビドプシスのチラコイド局在ＶＣＣＮ１タンパク質は、ＢＳＴ１〜３と約３０％の配列同一性を有する。この系統樹を構築するために使用された他のタンパク質もまたベストロフィンファミリー遺伝子であるが、それらはクラミドモナス・ラインハルディベストロフィンとはわずかに遠縁である。アミノ酸レベルでは、クラミドモナス・ラインハルディベストロフィンは、高等植物または哺乳類において見られるベストロフィンタンパク質との５０％未満の同一性を有する。さらに、ヒトベストロフィンタンパク質は、クラミドモナス・ラインハルディベストロフィンとは十分に異なっており、細菌性クレブシエラ・ニューモニエベストロフィンタンパク質と共に、系統樹を固定するための外群として使用され得る。
〔実施例３：ベストロフィンは低ＣＯ２下でアップレギュレートされ、それらの発現はＣＩＡ５によって制御される〕
ＣＩＡ５は、多くのＣＣＭ遺伝子を制御する転写因子である。特に、ＣＩＡ５は、既知のＣＣＭトランスポーターすべてを制御する。以下の実施例は、高ＣＯ２または低ＣＯ２条件のいずれかで成長させた、野生型（ＷＴ）Ｄ６６クラミドモナス・ラインハルディ株、およびｃｉａ５変異クラミドモナス・ラインハルディ株におけるベストロフィン発現の解析を記載する。
〔材料及び方法〕
クラミドモナス・ラインハルディ細胞のための細胞培養条件および成長条件は、実施例１に記載したとおりであった。実験のために、ＷＴ Ｄ６６クラミドモナス・ラインハルディ株およびｃｉａ５変異体クラミドモナス・ラインハルディ株は、高ＣＯ２（ＣＯ２は５％［ｖ／ｖ］、空気中）または低ＣＯ２状態（ＣＯ２は０．０４％［ｖ／ｖ］未満、空気中、すなわち周囲のＣＯ２条件）のいずれかで培養された。
ＲＮＡサンプルは、クラミドモナス・ラインハルディ株両方の高ＣＯ２および低ＣＯ２順化培養物から、得られた。ＲＮＡ抽出は、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の説明書に従って使用して、行われた。サンプル当たり１ｕｇのＲＮＡが、ｃＤＮＡのための鋳型として使用され、これは、ＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ（登録商標） Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＮＥＢ）を製造業者の説明書に従って使用して、作製された。サンプル当たり１００ｎｇのＲＮＡを使用して、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６を使用して、ＮＥＢからのＬｕｎａ（登録商標） Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ｑＰＣＲ Ｋｉｔを製造業者の説明書に従って使用して、ｑＲＴＰＣＲが行われた。半定量ＲＴ−ＰＣＲは、ＢＳＴ１、ＢＳＴ２、またはＢＳＴ３に対して特異的なプライマーを使用して行われ、アクチンプライマーをコントロールとした（表１に列挙される）。ＰＣＲ産物は、ゲル電気泳動を使用して、分析された。実験は、２回反復された。
Figure 2021530213
ＢＳＴ１、ＢＳＴ２、およびＢＳＴ３発現の経時変化分析もまた行われた。この分析のために、高ＣＯ２下で成長させた細胞は、２〜１２時間、低ＣＯ２に移され、次いでＲＮＡが抽出され、上記のようにｃＤＮＡが作製された。この分析は、２回反復された。
〔結果〕
図２Ａに示すように、Ｄ６６（ＷＴ）において、３つのベストロフィン遺伝子すべての発現レベルは、高ＣＯ２条件と比較して、低ＣＯ２状態下でアップレギュレートされた。特に、ＢＳＴ３発現は、高ＣＯ２条件下で成長させた細胞においては非常に低く、低ＣＯ２条件下で成長させた細胞においてははるかに高かった。高ＣＯ２条件下で成長させたＤ６６細胞と比較して、低ＣＯ２条件下で成長させたＤ６６細胞からのバンドの強度増加は、３つの遺伝子すべてが低ＣＯ２条件下でアップレギュレートされることを明らかに示す。Ｄ６６とは対照的に、低ＣＯ２条件は、ｃｉａ５変異体におけるＢＳＴ１、ＢＳＴ２、またはＢＳＴ３の発現増加を誘導しなかった。さらに、ＢＳＴ１およびＢＳＴ３は、ｃｉａ５変異体においていずれの条件下でも発現されず、これは、ｃｉａ５変異体における他のＣＣＭ遺伝子と同様の転写パターンである（Ｘｉａｎｇら、ＰＮＡＳ ９８（９）：５３４１−５３４６，２００１；Ｆｕｋｕｚａｗａら、ＰＮＡＳ ９８（９）：５３４７−５３５２，２００１；Ｍｏｒｏｎｅｙら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ８９（３）：８９７−９０３，１９８９）。ｃｉａ５細胞におけるＢＳＴ２転写レベルは、高ＣＯ２条件および低ＣＯ２条件の両方で同じであり、低ＣＯ２においては目立った誘導を示さなかった。これは、ＢＳＴ２転写レベルが低ＣＯ２条件において増加するＤ６６細胞とは対照的である。
図２Ｂは、高ＣＯ２条件から低ＣＯ２条件への移した後の異なる時点での、Ｄ６６における３つのＢＳＴ遺伝子の発現を示す。３つの遺伝子はすべて、低ＣＯ２へと切り替えた後の２時間以内に転写レベルが増加し、これらの発現レベルは、誘導後少なくとも１２時間まで維持された。これらの結果は、３つのＢＳＴ遺伝子すべてが、ＣＣＭを誘導することが知られている低ＣＯ２成長条件下でアップレギュレートされたことを実証する。さらに、このアップレギュレーションはｃｉａ５変異体においては見られず、このことは、ベストロフィン遺伝子の発現がＣＩＡ５によって調節されることを示唆する。総合すると、これらの結果は、ベストロフィン遺伝子のＣＣＭにおける役割の可能性を示している。
〔実施例４：葉緑体におけるベストロフィンの局在〕
現行のＣＣＭモデルは、葉緑体チラコイド膜での重炭酸塩トランスポーターが重炭酸塩取り込みに必要であることを示しているが、これらのトランスポーターはまだ同定されていない。以下の実施例は、クラミドモナス・ラインハルディ細胞内でのキメラベストロフィン−Ｖｅｎｕｓタンパク質の局在を記載する。葉緑体内の特定の位置を同定するために、蛍光画像化アプローチが選択されたが、これは、計算的解析が、葉緑体内の特定の位置ではなく、３つのベストロフィンタンパク質のリーダー配列に基づいて葉緑体標的を予測したためである。
〔材料および方法〕
蛍光タンパク質タグ付け：この実験のために、融合タンパク質ＢＳＴ１−Ｖｅｎｕｓ、ＢＳＴ２−Ｖｅｎｕｓ、およびＢＳＴ３−Ｖｅｎｕｓを生成するために、ＢＳＴ１、ＢＳＴ２、またはＢＳＴ３のコード配列がＶｅｎｕｓのコード配列と融合された。ＢＳＴ１〜３遺伝子は、Ｍａｃｋｉｎｄｅｒら、Ｃｅｌｌ １７１（１）：１３３−１４７ ｅ１１４，２０１７のようにして、クローニングされ、クラミドモナス株ＣＣ−４５３３に形質転換された。簡単に述べると、ＢＳＴ１〜３遺伝子のオープンリーディングフレームは、ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅され（プライマーは表２に列挙した）、ギブソンアセンブリを介して、Ｃ末端Ｖｅｎｕｓ−３ｘＦＬＡＧおよびＰＳＡＤプロモーターと共に、ｐＬＭ００５にクローニングされた。ＢＳＴそれぞれについて１つずつ、３つの別々の構築物が生成された。ＰＳＡＤは、クラミドモナス・ラインハルディにおける光化学系Ｉのストロマ側に位置する豊富な葉緑体タンパク質をコードする核遺伝子を駆動する高発現プロモーターである（ＦｉｓｃｈｅｒおよびＲｏｃｈａｉｘ、２００１）。形質転換のために、野生型培養物は、中期の対数期まで成長させ、２×１０８細胞・ｍＬ−１まで濃縮した。懸濁液は、エレクトロポレーションの前に、ＥｃｏＲＶによって線状化された構築プラスミドと混合した。次いで、懸濁液は、選択のためにＴＡＰパラモマイシン（２０μｇ・ｍＬ−１）上にプレーティングされた。ＢＳＴ１−Ｖｅｎｕｓを発現する株、ＢＳＴ２−Ｖｅｎｕｓを発現する株、およびＢＳＴ３−Ｖｅｎｕｓを発現する株、の３つの別々の株が生成された。蛍光コロニーは、Ｔｙｐｈｏｏｎ ８６１０スキャナーを使用して、同定された。Ｖｅｎｕｓについてのレーザー設定は、励起については５３２ｎｍであり、そして発光については５５５／２０であり、そしてクロロフィル自己蛍光は、６３３ｎｍで励起、６７０／３０発光であった、。
Figure 2021530213
共焦点顕微鏡法：次いで、ベストロフィンタンパク質の局在を決定するために、共焦点顕微鏡を使用して、３つの生成された株の蛍光画像が撮影された。同定された蛍光コロニーは、ＴＡＰ培地中で中期の対数期に達するまで従属栄養的に成長させた。次いで、培養物は収集され、そして撮影の前に一晩、Ｔｒｉｓ最小培地中に再懸濁された。画像は、Ａｉｒｙｓｃａｎモジュールを備えたＬａｓｅｒ−ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ＬＳＭ８８０（Ｚｅｉｓｓ）を用いて、１．４ＮＡのｘ６３対物レンズを使用して撮影された。５１４ｎｍおよび５６１ｎｍのアルゴンレーザーが、それぞれ、Ｖｅｎｕｓおよびクロロフィルの励起のために使用された。フィルターは、Ｖｅｎｕｓ発光については５２５〜５５０ｎｍ、クロロフィル発光については６２０〜６７０ｎｍに設定された。クロロフィル蛍光を使用して、これらの株における葉緑体チラコイドスタックを局在させ、そしてＶｅｎｕｓおよびクロロフィル蛍光の重ね合わせを使用して、葉緑体チラコイドスタックに対するベストロフィンタンパク質の位置を同定した。複数の反復が撮影された。
〔結果〕
図３Ａに示されるように、３つのベストロフィン融合タンパク質はすべて、葉緑体内に不均一なシグナルを示し、これは、Ｖｅｎｕｓシグナル（左列に示される）によって示される。Ｖｅｎｕｓシグナルおよびクロロフィルシグナル（中央の列に示される）がマージされた場合、Ｖｅｎｕｓシグナルと葉緑体中のチラコイドスタックとの間にオーバーラップが見られた。３つのＢＳＴ−Ｖｅｎｕｓ融合タンパク質はすべて、葉緑体のチラコイド膜に局在していた。さらに、ピレノイドのチラコイド細管は、Ｖｅｎｕｓシグナルとクロロフィルシグナルとの間で同じオーバーラップを示す。これは、ＢＳＴ１−Ｖｅｎｕｓ株の拡大ピレノイド画像を示す図３Ｂにおいて明確に描写される。矢印は、ピレノイドを貫通するチラコイド細管においてピレノイド内部にＢＳＴ１−Ｖｅｎｕｓ蛍光が見られる場所を示す。これらの結果は両方とも、ベストロフィンが葉緑体に対して標的とされるというコンピュータ予測（ベストロフィンリーダー配列に基づく）を確認し、ベストロフィンタンパク質のチラコイド局在を強く示す。
〔実施例５：低ＣＯ２下でのクラミドモナス・ラインハルディ成長にはベストロフィンが必要である〕
以下の実施例は、クラミドモナス・ラインハルディの成長に対する、３つのベストロフィンＢＳＴ１、ＢＳＴ２、およびＢＳＴ３の発現を減少させる効果を記載する。三重ベストロフィンＲＮＡｉノックダウン株ｂｓｔｉ−１の成長表現型は、種々のＣＯ２濃度およびｐＨの成長条件下で、ＷＴ株Ｄ６６と、ならびに変異株ｃｉａ３およびｐｍｐ１と、比較された。２つの変異株は、既知のＣＣＭ成分において変異を有する；ｃｉａ３株はチラコイド炭酸脱水酵素であるＣＡＨ３において変異を有し、一方ｐｍｐ１株はストロマシータ炭酸脱水酵素であるＬＣＩＢ／ＬＣＩＣに変異を有する。
〔材料および方法〕
ＲＮＡｉを使用したＢＳＴ１、ＢＳＴ２およびＢＳＴ３ノックダウン：３つのベストロフィン遺伝子すべてを同時に標的とするために、ＲＮＡｉノックダウンアプローチが選択された。現在、ｂｓｔ３ノックアウト株のみが、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能である。ｂｓｔ１およびｂｓｔ２ノックアウト株は入手できない。さらに、実施例７において詳細に記載されるように、ｂｓｔ３ノックアウト株は低ＣＯ２条件下で試験され、正常に成長することが見出された。これは、ｂｓｔ３ノックアウト株のみが試験されているということ、および、三重ノックアウト株を生成する材料が現在入手できないということ、の両方を意味する。したがって、ＲＮＡｉノックダウンアプローチが最良の選択肢であると考えられた。
ＢＳＴタンパク質のノックダウンのための人工マイクロＲＮＡ構築物は、Ｍｏｌｎａｒら、Ｐｌａｎｔ Ｊ ５８（１）：１６５−１７４，２００９．のプロトコルを使用して作製された。簡単に述べると、ウェブマイクロＲＮＡデザイナー（ＷＭＤ３）ウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ＷＭＤ３．ｗｅｉｇｅｌｗｏｒｌｄ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｗｅｂａｐｐ．ｃｇｉ）が使用され、３つのＢＳＴコード配列の「共通領域」における種々の位置に相補的な２組のオリゴがデザインされた。２つの独立した構築物がデザインされ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｃｅｎｔｅｒから入手されたｐＣｈｌａｍｙＲＮＡ３ｉｎｔプラスミドにクローニングされた。ＲＮＡｉノックダウンのために使用された３つのベストロフィンを標的とするようにデザインされたオリゴを表３に示す。２つの三重ノックダウンライン（ＢＳＴ−ＲＮＡｉライン１および２またはｂｓｔｉ−１およびｂｓｔｉ−２）は、４００の形質転換体から単離された。オリゴＢ１フォワードおよびリバースを使用してｂｓｔｉ−１が生成され、オリゴＢ２フォワードおよびリバースを使用してｂｓｔｉ−２が生成された。
Figure 2021530213
パロモマイシン耐性（ｐａｒａＲ）を付与するＡｐｈＶＩＩＩ遺伝子を有するｐＣｈｌａｍｙＲＮＡ３ｉｎｔプラスミドは、エレクトロポレーションによって、Ｄ６６に形質転換された（Ｓｈｉｍｏｇａｗａｒａら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４８（４）：１８２１−１８２８、１９９８）。形質転換体は、抗生物質パロモマイシン（４μｇ・ｍＬ−１；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＴＡＰアガー培地上で選択された。次いで、耐性株は、ＭＩＮプレート上にレプリカプレーティングすることによって、「低ＣＯ２で病的（sick on low CO2）」表現型についてスクリーニングされた。次に、これらは、継続的な照明（１００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１）を備えた高ＣＯ２チャンバ（ＣＯ２は５％［ｖ／ｖ］、空気中）および低ＣＯ２チャンバ（ＣＯ２は０．０１％［ｖ／ｖ］、空気中）に７日間置かれた。成長細胞を液体ＭＩＮ培地中に同じ細胞濃度（ＯＤ７３０＝０．１、０．０５および０．０２５）まで懸濁することによってスポット試験が行われ、１５μＬがＭＩＮプレート上にスポットされた。これらのプレートは、高ＣＯ２、周囲のＣＯ２および低ＣＯ２チャンバに７日間置かれた。環境ガスモニター（ＥＧＭ−４、ＰＰシステム、マサチューセッツ州）を使用して、ＣＯ２濃度が測定された。
定量ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ；ｑＰＣＲ）：ＲＮＡ抽出は、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の説明書に従って使用して、行われた。サンプル当たり１ｕｇのＲＮＡが、ｃＤＮＡのための鋳型として使用され、これは、ＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ（登録商標） Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＮＥＢ）を製造業者の説明書に従って使用して、作製された。サンプル当たり１００ｎｇのＲＮＡを使用して、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６を使用して、ＮＥＢからのＬｕｎａ（登録商標） Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ｑＰＣＲ Ｋｉｔを製造業者の説明書に従って使用して、ｑＲＴＰＣＲが行われた。ｑＰＣＲのために使用されたプライマーを表４に列挙する；ＣＢＬＰプライマーがコントロールとして使用された。
Figure 2021530213
種々のｐＨおよびＣＯ２レベル下での成長表現型検査：ＷＴ株Ｄ６６、突然変異株ｃｉａ３（ＣＡＨ３ノックアウト）、変異株ｐｍｐ１（ＬＣＩＢ／ＬＣＩＣノックアウト）、およびｂｓｔｉ−１は、極低ＣＯ２（ＣＯ２は０．０１％（ｖ／ｖ）、空気中）、低（または周囲の）ＣＯ２（ＣＯ２は０．０４％〜０．０４５％（ｖ／ｖ）、空気中）、および高ＣＯ２（ＣＯ２は５％（ｖ／ｖ）、空気中）下で成長させた。これら３つのＣＯ２条件下それぞれにおける成長は、ｐＨ７およびｐＨ８．４の両方で試験された。プレートに接種するために、３つの異なる細胞濃度をが使用された；最高濃度は１０，０００細胞であり、中間濃度は５，０００細胞であり、最低濃度は２，５００細胞であった。３つの異なる濃度の３つのスポットが、４つの株すべてについて試験プレートそれぞれに適用された。成長表現型検査実験は、３回反復された。
〔結果〕
低ＣＯ２条件下でのクナミドモナス・ラインハルディ成長におけるベストロフィンの役割を調べるために、ＲＮＡｉアプローチが採用され、３つのベストロフィン遺伝子すべての発現を一度に減少させた。ＢＳＴ１、ＢＳＴ２、およびＢＳＴ３を標的とするＲＮＡｉを使用して、２つのＲＮＡｉノックダウンライン、ｂｓｔｉ−１およびｂｓｔｉ−２が生成された。ｂｓｔｉ−１、ｂｓｔｉ−２、およびＷＴコントロール株Ｄ６６におけるＢＳＴ１、ＢＳＴ２、およびＢＳＴ３の発現レベルは、定量ＲＴ−ＰＣＲを使用して、測定された。図４に示すように、３つのベストロフィン遺伝子すべての発現レベルは、ＷＴコントロール株Ｄ６６と比較して、ｂｓｔｉ−１およびｂｓｔｉ−２ ＲＮＡｉノックダウンラインにおいて低かった（示されるエラーバーは、３つの生物学的反復についての標準誤差を示す）。特に、ｂｓｔｉ−１およびｂｓｔｉ−２（ＢＳＴ−ＲＮＡｉライン１および２）は、Ｄ６６と比較して、ＢＳＴ１、ＢＳＴ２、およびＢＳＴ３の発現において、ほぼ６０〜９０％のノックダウンを示した。この結果は、ｂｓｔｉ−１およびｂｓｔｉ−２ ＲＮＡｉノックダウンラインにおける３つのベストロフィン遺伝子すべての発現が、ＲＮＡｉアプローチを使用して効果的に減少されたことを示す。
次に、ｂｓｔｉ−１ ＲＮＡｉノックダウンライン、野生型株Ｄ６６、ならびにＣＡＨ３変異株ｃｉａ３、およびＬＣＩＢ／ＬＣＩＣ変異株ｐｍｐ１が、それらの種々のｐＨおよびＣＯ２レベル下で成長する能力について、試験された。培養物は、ｐＨ７または８．４、および極低ＣＯ２、低ＣＯ２、または高ＣＯ２条件下で成長させた。極低ＣＯ２において、ｂｓｔｉ−１は著しく減少した成長を示し、これは高ｐＨでさらに悪化し、ＣＣＭ変異体ｃｉａ３およびｐｍｐ１の成長に似ていた（図５Ａ）。ｐＨ７では、ｂｓｔｉ−１の成長はｐＨ８．４よりもわずかに良好であった。低ＣＯ２において、ｂｓｔｉ−１、ｃｉａ３、およびｐｍｐ１はすべて、野生型Ｄ６６株と比較して減少した成長を示した（図５Ｂ）。また、４つの株はすべて、ｐＨ８．４と比較して、ｐＨ７でわずかに良好な成長を示した。しかしながら、高ＣＯ２では、ｂｓｔｉ−１の成長は、野生型、ｃｉａ３およびｐｍｐ１と同等であった（図５Ｃ）。総合すると、これらの結果は、３つのベストロフィン（ｂｓｔｉ−１）すべてのＲＮＡｉノックダウンが、ＷＴ（Ｄ６６）および低ＣＯ２で病的な表現型であることが公知の他の変異体（ｃｉａ３、ｐｍｐ１）の両方と比較して、低ＣＯ２で病的な表現型を明らかに示すことを示す。さらに、ＣＡＨ３（ｃｉａ３はＣＡＨ３ノックアウトである）は、クナミドモナス・ラインハルディチラコイドルーメン内に見出される炭酸脱水酵素であり、ＣＣＭが機能するために必要である。３つのベストロフィンタンパク質は、チラコイド内のＣＡＨ３に重炭酸塩を送達するタンパク質であり得る。したがって、これらの結果は、３つのＢＳＴすべてが低ＣＯ２条件下でのクナミドモナス・ラインハルディの野生型様成長のために必要であることを示した。
〔実施例６：三重ベストロフィンＲＮＡｉノックダウン株は、無機炭素（Ｃｉ）を蓄積する能力が低下している〕
以下の実施例は、ＷＴ株Ｄ６６と比較した、三重ベストロフィンＲＮＡｉノックダウン株ｂｓｔｉ−１およびｂｓｔｉ−２（実施例５に記載されたもの）の無機炭素親和性試験を記載する。
〔材料および方法〕
無機炭素に対する親和性：この分析では、（Ｏ２発生のような）光合成の速度が、様々な無機炭素レベル（無機炭素＝ＣＯ２およびＨＣＯ３ −）で測定された。外部Ｃｉ（Ｋ１／２［ＤＩＣ］）（溶解無機炭素）に対する親和性は、Ｍａら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １５６：８８４−８９６，２０１１．に従って、推定された。具体的には、１００μｇのクロロフィルと等価な細胞が、不活性窒素ガスでバブリングされた、すなわちＣＯ２フリーなＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ７．４）、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ７．８）、または２５ｍＭ ＥＰＰＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ８．４）中に懸濁された。細胞は、３００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１で照明されたＯ２電極チャンバ（Ｒａｎｋ Ｂｒｏｔｈｅｒｓ、ケンブリッジ イギリス）に移され、バッファーおよび細胞内空間に残るＤＩＣを枯渇させるために静置された。内因性ＣＯ２の枯渇に伴い、正味のＯ２発生は観測されない。既知濃度のＮａＨＣＯ３がチャンバに注入され、Ｏ２発生の速度が測定された。この実験において、無機炭素レベルは２５μＭから２ｍＭまで変化させた。Ｋ１／２［ＤＩＣ］は、酸素発生（すなわち、光合成）の最大速度の半分（５０％）に必要なＤＩＣ濃度として計算された（Ｂａｄｇｅｒ、１９８５）。クロロフィル含量は、クロロフィルａおよびクロロフィルｂを合わせることによって、測定された。クロロフィルは、１００％メタノール中で抽出され、分光光度計を使用して測定された。Ｋ１／２（ＣＯ２）は、Ｏ２発生のＶｍａｘの半値に到達するために必要なＣＯ２濃度とみなされる。
Ｃｉ親和性は、ｐＨ８．４で１２時間、低ＣＯ２（ＣＯ２は０．０４％未満）に順化させたｂｓｔｉ−１およびＤ６６について、推定された（図６Ａ）。図６Ａに示されるＫ０．５（Ｃｉ）値（最大酸素発生の半値に必要なＣｉ濃度）は、図６Ｂに示されるＣｉ曲線に対するＯ２発生から計算された。さらに、Ｃｉ親和性は、ｐＨ７．８で１２時間、低ＣＯ２（ＣＯ２は０．０４％未満）に順化させたｂｓｔｉ−１、ｂｓｔｉ−２、およびＤ６６について、推定された（図６Ｃ）。図６Ｃに示されるＫ０．５（Ｃｉ）値（最大酸素発生の半値に必要なＣｉ濃度）は、図６Ｄに示されるＣｉ曲線に対するＯ２発生から計算された。さらに、Ｃｉ親和性は、ｐ７．８で１２時間、高ＣＯ２（ＣＯ２は５％より高い）に順化させたｂｓｔｉ−１およびＤ６６について、推定された（図６Ｅ）。図６Ｅに示されるＫ０．５（Ｃｉ）値（最大酸素発生の半値に必要なＣｉ濃度）は、図６Ｆに示されるＣｉ曲線に対するＯ２発生から計算された。それぞれのＣｉ濃度で３回の試験が行われた。記号「＊」は、Ｋ０．５（Ｃｉ）の差が有意（スチューデントのｔ検定でＰ＜０．０５）であったことを示す。ｐＨ７．８および低ＣＯ２順化では、Ｄ６６のＶｍａｘは１２１μｍｏｌ Ｏ２ ｍｇ−１ Ｃｈｌ ｈｒ−１であり、ｂｓｔｉ−１のＶｍａｘは１０５μｍｏｌ Ｏ２ ｍｇ−１ Ｃｈｌ ｈｒ−１であり、ｂｓｔｉ−２のＶｍａｘは９５μｍｏｌ Ｏ２ ｍｇ−１ Ｃｈｌ ｈｒ−１であった。ｐＨ７．８および高ＣＯ２順化では、Ｄ６６のＶｍａｘは１２１μｍｏｌ Ｏ２ ｍｇ−１ Ｃｈｌ ｈｒ−１であり、ｂｓｔｉ−１のＶｍａｘは１２０μｍｏｌ Ｏ２ ｍｇ−１ Ｃｈｌ ｈｒ−１である。ｐＨ８．４および低ＣＯ２順化では、Ｄ６６のＶｍａｘは１２４μｍｏｌ Ｏ２ ｍｇ−１ Ｃｈｌ ｈｒ−１であり、ｂｓｔｉ−１のＶｍａｘは８５．５μｍｏｌ Ｏ２ ｍｇ−１ Ｃｈｌ ｈｒ−１である。すべての株のＶｍａｘを１００％酸素発生活性に設定した。
無機炭素の取り込み：シリコーンオイル遠心分離を使用して、モロニーら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ７９（１）：１７７−１８３，１９８５．に従って溶解Ｃｉの細胞内濃度を測定した。簡単に述べると、細胞は遠心分離され、２５μｇのＣｈｌ ｍＬ−１濃度でＣｉが枯渇した２５ｍＭ ＥＰＰＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．８または８．４）中に懸濁され、正味のＯ２発生がゼロになるまで明所でインキュベートされた。細胞は使用されるまで明所で維持された。次いで、Ｃｉが枯渇した細胞３００μＬは、７５μＬのＤｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ ＡＲ ２０シリコーンオイルで覆われた、０．７５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む１Ｍグリシン（ｐＨ１０）２５μＬを含むチューブ中で遠心分離された。アッセイは、Ｂｅｃｋｍａｎ微量遠心分離機Ｂにおいて、２００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１光中で、２５℃で行われた。ｐＨ７．８で２５ｍＭを３μｌ（添加濃度２５μｍ）またはｐＨ８．４で５０ｍＭを３μｌ（添加濃度５０μｍ）のＮａＨ１４ＣＯ３のいずれかを添加し、その後、示される照射時間（２００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１光中で１５〜１２０秒間）置くことにより、Ｃｉ取り込みが開始された。各時点について、３回の反復サンプルが試行された。反応は、微量遠心分離機Ｂ（Ｂｅｃｋｍａｎ）中で１５秒間、遠心分離するによって、停止させた。内部Ｃｉは、ペレット中の全量Ｃ１４と酸安定Ｃ１４との間の差を使用して計算され、Ｍａｃｈｉｎｇｕｒａら、Ｊ Ｅｘｐ Ｂｏｔ ６８（１４）：３８７９−３８９０，２０１７．に記載されているように細胞体積について補正された。
〔結果〕
ＣＣＭを有する藻類細胞の２つの特性は、第１に、それらは無機炭素（Ｃｉ）に対する親和性が非常に高いこと、第２に、それらは拡散によって得られるものよりも高いレベルまでＣｉを蓄積する能力があること、である。したがって、ＲＮＡｉノックダウンラインｂｓｔｉ−１およびｂｓｔｉ−２、ならびにＷＴ株Ｄ６６の光合成酸素発生活性が試験された。低ＣＯ２に順化させたＲＮＡｉノックダウンラインｂｓｔｉ−１およびｂｓｔｉ−２は、測定されたＫ０．５（Ｃｉ）によって判定されるように、それぞれｐＨ７．８でＣｉに対して３〜１０倍低い親和性を示した（図６Ａおよび図６Ｃ）。高ＣＯ２に順化させると、ｂｓｔｉ−１もＤ６６と比較してＣｉ親和性が減少した（図６Ｅ）。これは、３つのＢＳＴ遺伝子すべての発現が減少することで、Ｃｉに対する細胞の親和性の減少が引き起こされたことを示す。ｐＨ８．４では、ｂｓｔｉ−１に対するＫ０．５（Ｃｉ）は９５μＭである一方で、対照的に、Ｄ６６に対するＫ０．５（Ｃｉ）は３５μＭと低い。８．４というより高いｐＨでは、培地における支配的なＣｉ種は重炭酸塩であり、したがって、Ｃｉに対するＤ６６（ＷＴ）細胞のより高い親和性は、それらの重炭酸塩を積極的に取り込み利用する能力を反映する。これらの結果は、ｂｓｔｉ−１およびｂｓｔｉ−２が光合成Ｏ２発生のための無機炭素に対してより高い要件を有することを示し、ＣＣＭにおけるベストロフィンの役割の強力な証拠である。
Ｃｉの蓄積と固定におけるＢＳＴ１〜３の重要性を評価するために、Ｄ６６およびｂｓｔｉ−１において、Ｃｉ取り込み活性も測定された。低ＣＯ２に順化させたｂｓｔｉ−１は、ｐＨ７．８およびｐＨ８．４の両方でＤ６６と比較して、１４Ｃｉの蓄積および固定が有意に低かった（図７Ａ〜７Ｄ）。ｐＨ７．８および８．４の両方で、ｂｓｔｉ−１は、Ｄ６６細胞において見られたレベルのわずか２０〜２５％までしか１４Ｃｉを蓄積しなかった。この差は、最も早い時点（１５秒）と、Ｄ６６細胞が添加された１４Ｃｉの大部分を使い果たした最も遅い時点（明所では最長２分）と、の両方で見られた。これらの結果は、ＢＳＴ１〜３がクラミドモナス・ラインハルディの低ＣＯ２条件におけるＣｉ取り込みに重要な役割を果たすことを示し、また、ＣＣＭにおけるベストロフィンの役割の強力な証拠を提供する。
〔実施例７：ｂｓｔ３ノックアウト株は低ＣＯ２条件下で正常な成長を有し、ＷＴと比較した場合、同様の無機炭素親和性を有する〕
以下の実施例は、ＷＴ株Ｄ６６と比較した、クラミドモナス・ラインハルディｂｓｔ３ノックアウト株の低ＣＯ２条件下での成長およびＣｉ親和性試験を記載する。
〔材料および方法〕
クラミドモナス・ラインハルディノックアウト株：ノックアウト株は、ランダム挿入変異誘導を使用して作製され、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＣＬｉＰ）の一部である。株は、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｈｌａｍｙｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ．ｏｒｇ／）から注文することができる。現在、ｂｓｔ３ノックアウト株のみが入手可能である。ｂｓｔ１およびｂｓｔ２ノックアウト株は入手できない。ｂｓｔ３ノックアウト株における挿入位置を確認するため、ＢＳＴ３遺伝子およびにインサートに特異的なプライマーを使用して、ＰＣＲが行われた（表５を参照のこと）。インサート特異的プライマー（ＣＩＢ１ＦおよびＣＩＢ１Ｒ）、および隣接領域についての情報は、ＣＬｉＰウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｈｌａｍｙｌｉｂｒａｒｙ．ｏｒｇ／ａｌｌＭｕｔａｎｔｓ）から入手した。
Figure 2021530213
半定量ＲＴ−ＰＣＲ分析は実施例３と同様に行われた。
成長測定：ＷＴ株Ｄ６６およびノックアウト株ｂｓｔ３は、上記の実施例に記載の方法を使用して、ｐＨ８．６で成長させた。成長はＯＤ７３０を使用して測定され、クロロフィル推定は波長６４５および６６３で行われた。測定は、６日間、低ＣＯ２（ＣＯ２は０．０４％未満）で行われた。細胞は、４８時間ＴＡＰにおいて成長させた後、０．０１のＯＤ７３０でＭＩＮに移された。
無機炭素に対する親和性：これは、実施例６に記載の方法を使用して行われた。酸素発生活性はｐＨ７．４で測定され、Ｋ０．５（Ｃｉ）値（最大酸素発生の半値に必要なＣｉ濃度）はＣｉ曲線に対するＯ２発生から計算された。それぞれのＣｉ濃度で３回の反復試行が行われた。
〔結果〕
ＢＳＴ３ノックアウト（ｂｓｔ３）は、ｂｓｔ３遺伝子の第１エキソンにパロモマイシンインサートを有するＣＬｉＰ変異体コレクションから入手した（図８Ａ）。インサートの位置は、ＰＣＲを使用して確認された（図８Ｂ）。さらに、ＢＳＴ１〜３発現は、高ＣＯ２条件および低ＣＯ２条件下でｂｓｔ３ノックアウト株において分析され、ＷＴ株Ｄ６６と比較された。ＢＳＴ３発現は、両方の条件下でｂｓｔ３において検出されなかった一方、ＢＳＴ１およびＢＳＴ２発現は、両方の条件下でｂｓｔ３ノックアウト株とＷＴ株Ｄ６６との間で同等であった（図８Ｃ）。
低ＣＯ２（ＣＯ２は０．０４％未満）（図９Ａ〜９Ｂ）、極低（ＣＯ２は０．０２％）または高ＣＯ２（ＣＯ２は５％（ｖ／ｖ）、空気中）（データは示さず）下の野生型細胞と比較して、ｂｓｔ３株の大きな成長差異は見られなかった。ＷＴとｂｓｔ３との間のＣｉ親和性にも顕著な差異はなかった（図９Ｃ）。ＲＮＡｉノックダウンラインｂｓｔｉ−１において、３つのＢＳＴ遺伝子すべての発現が減少し、ｐＨ７．８およびｐＨ８．４の両方でＣｉ親和性が減少する。これは、Ｃｉ親和性にＷＴとの差異を有さない、ＢＳＴ３発現を欠失するのみのノックアウト株であるｂｓｔ３とは全く対照的である（図９Ｃ〜９Ｄ）。これらの結果は、３つのＢＳＴの機能は重複しており、生理学的効果を観察するためには３つの遺伝子すべての発現を減少させなければならない、という仮説を支持する。
〔実施例８：ＢＳＴ１、ＢＳＴ２、およびＢＳＴ３の構造的特性付け、ならびに現行のクラミドモナス・ラインハルディＣＣＭモデル〕
以下の実施例は、クラミドモナス・ラインハルディＢＳＴ１、ＢＳＴ２、およびＢＳＴ３タンパク質の構造的特性付けを記載する。当該実施例は、原稿のクラミドモナス・ラインハルディＣＣＭモデルも記載する。
〔材料および方法〕
ＢＳＴ１、ＢＳＴ２、およびＢＳＴ３のペプチド配列は、Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ ｖ１２．１から入手した。相同性モデリングは、テンプレートとしてクレブシエラ・ニューモニア（Klebsiella pneumonia）ベストロフィン（Ｋｐｂｅｓｔ；ＰＤＢ：４ＤＷ８）を使用して行われ、Ｓｗｉｓｓ−Ｍｏｄｅｌウェブサーバー（Ｙａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４６（６２１６）：１４９８−１５０１，２０１４）を用いて生成された。Ｋｐｂｅｓｔが選択されたのは、それは、Ｓｗｉｓｓ−ＭｏｄｅｌによってＢＳＴ１〜３についての最上位テンプレートとして同定されたためである。得られた構造およびＫｐｂｅｓｔの構造は、図１０Ａに突出形状として示され標識された選択的細孔を並べる保存残基選択的細孔を並べる保存残基を有するモノマーとして示される。得られたＢＳＴ１ホモペンタマーモデルはｇｒｏｍｏｓ ４３Ｂ１力場でエネルギー最小化に供され、静電ポテンシャルはＳｗｉｓｓ−ＰＤＢｖｉｅｗｅｒ（Ｖ４．０１）を使用して原子部分電荷を使用して計算された。次いで、ＢＳＴ１ホモペンタマーモデル上に電場を表示して、図１０Ｄが生成された。静電ポテンシャルは、−４ｋＴ／ｅ（負）〜＋４ｋＴ／ｅ（正）のポテンシャルスケールで表示され、空洞が強調された。ＢＳＴ１ホモペンタマー構造の質（図１０Ｂ）は、ＱＭＥＡＮスコア（Ｂｅｎｋｅｒｔら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ７１（１）：２６１−２７７、２００８）を使用して、得られた。
〔結果〕
ＢＳＴ１〜３が陰イオンとしてベストロフィンを輸送する機能するか否かを予測するために、クレブシエラ・ニューモニアベストロフィンを使用したＢＳＴ１〜３の相同性モデリングが行われた。ＢＳＴ１〜３は、ベストロフィンファミリーのタンパク質において保存されているそれらの選択的細孔に沿って非極性残基を含有する（図１０Ａ；Ｑｕら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２６（２０）：５４１１−５４１９，２００６）。構造研究は、ヒトおよびクレブシエラ・ニューモニアベストロフィンがペンタマーであることを示し、ペンタマーアセンブリにおけるＢＳＴ１のモデリングは、高い信頼性である（図１０Ｂ）。エントリーポケットは、支配的には負の静電ポテンシャルを有し、選択的細孔は中性／正に帯電しており、ＢＳＴ１〜３が負に帯電したイオンを輸送する、という仮説を支持する（図１０Ｃ〜１０Ｄ；Ｙａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４６（６２１６）：１４９８−１５０１，２０１４；Ｋａｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ５１６（７５３０）：２１３−２１８，２０１４）。これらの結果は、クラミドモナス・ラインハルディベストロフィンがアニオントランスポーターである可能性を示唆する。
実施例２〜８に記載の結果は、クラミドモナス・ラインハルディＣＣＭの文脈における３つのベストロフィンタンパク質の重要な役割を実証する。総合すると、これらの結果は、３つのベストロフィンタンパク質がチラコイド局在重炭酸塩輸送チャネルであることを示す。図１１は、ＢＳＴ１、ＢＳＴ２、およびＢＳＴ３の、Ｃｉ輸送のための現行のクラミドモナス・ラインハルディＣＣＭモデルへの統合を示す。
図１Ａ〜１Ｄは、クラミドモナス・ラインハルディ（C. reinhardtii）遺伝子（ＢＳＴ１、ＢＳＴ２、およびＢＳＴ３）およびタンパク質（ＢＳＴ１、ＢＳＴ２、およびＢＳＴ３）の互いに対する類似性、ならびにＢＳＴ１〜３の他のベストロフィンファミリータンパク質に対する類似性を示す。図１Ａは、ＢＳＴ１、ＢＳＴ２、およびＢＳＴ３遺伝子の模式図を示し、明灰色の四角はエキソンを表し、細い灰色の線はイントロンを表し、太い灰色の線は非翻訳領域（untranslated region、ＵＴＲ）を表し、重ねられた線（エキソンおよびイントロンに重ねられている）は３つの遺伝子によって共有される共通領域を示す。 図１Ａ〜１Ｄは、クラミドモナス・ラインハルディ（C. reinhardtii）遺伝子（ＢＳＴ１、ＢＳＴ２、およびＢＳＴ３）およびタンパク質（ＢＳＴ１、ＢＳＴ２、およびＢＳＴ３）の互いに対する類似性、ならびにＢＳＴ１〜３の他のベストロフィンファミリータンパク質に対する類似性を示す。図１Ｂは、クラミドモナス・ラインハルディゲノム上のＢＳＴ１、ＢＳＴ２、およびＢＳＴ３遺伝子の位置および方向を示す。 図１Ａ〜１Ｄは、クラミドモナス・ラインハルディ（C. reinhardtii）遺伝子（ＢＳＴ１、ＢＳＴ２、およびＢＳＴ３）およびタンパク質（ＢＳＴ１、ＢＳＴ２、およびＢＳＴ３）の互いに対する類似性、ならびにＢＳＴ１〜３の他のベストロフィンファミリータンパク質に対する類似性を示す。図１Ｃは、ＢＳＴ１（配列番号１）、ＢＳＴ２（配列番号２）、およびＢＳＴ３（配列番号３）タンパク質のアミノ酸アラインメントを示し、下端の行におけるアスタリスクは、３つのタンパク質すべてにおいて同一であるアミノ酸を示す。 図１Ａ〜１Ｄは、クラミドモナス・ラインハルディ（C. reinhardtii）遺伝子（ＢＳＴ１、ＢＳＴ２、およびＢＳＴ３）およびタンパク質（ＢＳＴ１、ＢＳＴ２、およびＢＳＴ３）の互いに対する類似性、ならびにＢＳＴ１〜３の他のベストロフィンファミリータンパク質に対する類似性を示す。図１Ｄは、維管束植物（上から２番目の群）、非維管束植物（上から３番目の群）、珪藻類（上から４番目の群）、および緑藻類（下端の群）における、クラミドモナス・ラインハルディＢＳＴ１、ＢＳＴ２およびＢＳＴ３ホモログのタンパク質配列の系統樹を示す。 図２Ａ〜２Ｂは、クラミドモナス・ラインハルディ遺伝子ＢＳＴ１、ＢＳＴ２、およびＢＳＴ３の転写解析を示す。図２Ａは、野生型株Ｄ６６およびｃｉａ５細胞における、低ＣＯ２（ＣＯ２は０．０４％未満、空気中）と高ＣＯ２（ＣＯ２は５％（ｖ／ｖ）、空気中）とでの、ＢＳＴ１〜３蓄積を示す半定量ＲＴ−ＰＣＲを示す。アクチンは、図２Ａおよび図２Ｂの両方においてローディングコントロールとして使用され、示される結果は、２つの反復のうちの１つからのものである。 図２Ａ〜２Ｂは、クラミドモナス・ラインハルディ遺伝子ＢＳＴ１、ＢＳＴ２、およびＢＳＴ３の転写解析を示す。図２Ｂは、高ＣＯ２（ＣＯ２は５％（ｖ／ｖ）、空気中）で成長した細胞から得られたｃＤＮＡにおけるＢＳＴ１〜３の発現、および２時間（２ｈ）、４時間（４ｈ）、６時間（６ｈ）、または１２時間（１２ｈ）の間、低ＣＯ２（ＣＯ２は０．０４％未満、空気中）に切り替えた細胞中で得られたｃＤＮＡにおけるＢＳＴ１〜３の発現を示す半定量ＲＴ−ＰＣＲの時間経過を示す。アクチンは、図２Ａおよび図２Ｂの両方においてローディングコントロールとして使用され、示される結果は、２つの反復のうちの１つからのものである。 図３Ａ〜３Ｂは、クラミドモナス・ラインハルディにおけるＢＳＴ１−Ｖｅｎｕｓ、ＢＳＴ２−Ｖｅｎｕｓ、およびＢＳＴ３−Ｖｅｎｕｓ融合タンパク質の局在を示す共焦点顕微鏡蛍光タンパク質画像を示す。図３Ａは、クラミドモナス・ラインハルディにおけるＢＳＴ１−Ｖｅｎｕｓ、ＢＳＴ２−Ｖｅｎｕｓ、およびＢＳＴ３−Ｖｅｎｕｓ融合タンパク質発現の位置（「Ｖｅｎｕｓ」列）、葉緑体チラコイドの位置（「クロロフィル」列）、ならびに互いに対する両方の位置（「マージ」列）を示す。スケールバーは、５μｍである。図３Ｂは、図３Ａの「ＢＳＴ１」行からのピレノイドの拡大画像を示す。矢印は、ピレノイドを貫通するチラコイド細管中のピレノイド内部にＢＳＴ１−Ｖｅｎｕｓ蛍光を見ることができる場所を強調する。スケールバーは、１μｍである。図３Ａおよび図３Ｂの両方について、画像は複数の反復の代表的な画像である。 図４は、野生型株Ｄ６６と比較した、ＲＮＡｉノックダウン株ｂｓｔｉ−１およびｂｓｔｉ−２におけるＢＳＴ１〜３発現のｑＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す。 図５Ａ〜５Ｃは、様々なｐＨおよびＣＯ２条件下での、野生型株Ｄ６６と比較した、ＲＮＡｉノックダウン株ｂｓｔｉ−１、ならびにｐｍｐ１およびｃｉａ３変異株の成長表現型解析の結果を示す。垂直方向の点は、３つの異なる細胞濃度（１０，０００細胞、５，０００細胞および２，５００細胞）を表す。図５Ａは、極低ＣＯ２（ＣＯ２は０．０１％（ｖ／ｖ）、空気中）条件、およびｐＨ７または８．４下での、株の成長表現型解析の結果を示す。図５Ｂは、低ＣＯ２（ＣＯ２は０．０４％（ｖ／ｖ）、大気中）およびｐＨ７または８．４下での、株の成長表現型解析の結果を示す。図５Ｃは、高ＣＯ２（ＣＯ２は５％（ｖ／ｖ）、大気中）条件、およびｐＨ７または８．４下での、株の成長表現型解析の結果を示す。成長表現型解析実験は３回反復され、示される結果は代表的なものである。 図６Ａ〜６Ｆは、ＢＳＴ−ＲＮＡｉライン（line）１および２、すなわちｂｓｔｉ−１およびｂｓｔｉ−２、ならびにＤ６６の光合成酸素発生活性を示す。図６Ａは、Ｋ０．５（Ｃｉ）値（最大酸素放発生の半値に必要なＣｉ濃度）を示し、これは、ｐＨ８．４で１２時間、低ＣＯ２（ＣＯ２は０．０４％未満）に順化させたｂｓｔｉ−１およびＤ６６について、Ｃｉ曲線に対するＯ２発生から算出された。図６Ａ〜６Ｆについて、それぞれのＣｉ濃度で３回の反復試行が行われ、エラーバーは３つの生物学的反復を表し、標準偏差に基づく。すべての株のＶｍａｘを１００％酸素発生活性に設定した。 図６Ａ〜６Ｆは、ＢＳＴ−ＲＮＡｉライン（line）１および２、すなわちｂｓｔｉ−１およびｂｓｔｉ−２、ならびにＤ６６の光合成酸素発生活性を示す。図６Ｂは、異なるＣｉ量および異なるｐＨ値にて測定された酸素発生活性を示し、ｐＨ８．４で１２時間、低ＣＯ２（ＣＯ２は０．０４％未満）に順化させたｂｓｔｉ−１およびＤ６６についての曲線としてプロットされる。図６Ａ〜６Ｆについて、それぞれのＣｉ濃度で３回の反復試行が行われ、エラーバーは３つの生物学的反復を表し、標準偏差に基づく。すべての株のＶｍａｘを１００％酸素発生活性に設定した。 図６Ａ〜６Ｆは、ＢＳＴ−ＲＮＡｉライン（line）１および２、すなわちｂｓｔｉ−１およびｂｓｔｉ−２、ならびにＤ６６の光合成酸素発生活性を示す。図６Ｃは、Ｋ０．５（Ｃｉ）値（最大酸素発生の半値に必要なＣｉ濃度）を示し、これは、ｐＨ７．８で１２時間、低ＣＯ２（ＣＯ２は０．０４％未満）に順化させたｂｓｔｉ−１、ｂｓｔｉ−２、およびＤ６６について、Ｃｉ曲線に対するＯ２発生から算出された。記号「＊」は、Ｋ０．５（Ｃｉ）の差が有意であった（スチューデントのｔ検定でＰ＜０．０５）ことを示している。図６Ａ〜６Ｆについて、それぞれのＣｉ濃度で３回の反復試行が行われ、エラーバーは３つの生物学的反復を表し、標準偏差に基づく。すべての株のＶｍａｘを１００％酸素発生活性に設定した。 図６Ａ〜６Ｆは、ＢＳＴ−ＲＮＡｉライン（line）１および２、すなわちｂｓｔｉ−１およびｂｓｔｉ−２、ならびにＤ６６の光合成酸素発生活性を示す。図６Ｄは、異なるＣｉ量および異なるｐＨ値にて測定された酸素発生活性を示し、ｐＨ７．８で１２時間、低ＣＯ２（ＣＯ２は０．０４％未満）に順化させたｂｓｔｉ−１、ｂｓｔｉ−２、およびＤ６６についての曲線としてプロットされる。図６Ａ〜６Ｆについて、それぞれのＣｉ濃度で３回の反復試行が行われ、エラーバーは３つの生物学的反復を表し、標準偏差に基づく。すべての株のＶｍａｘを１００％酸素発生活性に設定した。 図６Ａ〜６Ｆは、ＢＳＴ−ＲＮＡｉライン（line）１および２、すなわちｂｓｔｉ−１およびｂｓｔｉ−２、ならびにＤ６６の光合成酸素発生活性を示す。図６Ｅは、Ｋ０．５（Ｃｉ）値（最大酸素発生の半値に必要なＣｉ濃度）を示し、これは、ｐＨ７．８で１２時間、高ＣＯ２（ＣＯ２は５％より高い）に順化させたｂｓｔｉ−１およびＤ６６について、Ｃｉ曲線に対するＯ２発生から算出された。図６Ａ〜６Ｆについて、それぞれのＣｉ濃度で３回の反復試行が行われ、エラーバーは３つの生物学的反復を表し、標準偏差に基づく。すべての株のＶｍａｘを１００％酸素発生活性に設定した。 図６Ａ〜６Ｆは、ＢＳＴ−ＲＮＡｉライン（line）１および２、すなわちｂｓｔｉ−１およびｂｓｔｉ−２、ならびにＤ６６の光合成酸素発生活性を示す。図６Ｆは、異なるＣｉ量および異なるｐＨ値にて測定された酸素発生活性を示し、ｐＨ７．８で１２時間、高ＣＯ２（ＣＯ２は５％より高い）に順化させたｂｓｔｉ−１およびＤ６６についての曲線としてプロットされる。図６Ａ〜６Ｆについて、それぞれのＣｉ濃度で３回の反復試行が行われ、エラーバーは３つの生物学的反復を表し、標準偏差に基づく。すべての株のＶｍａｘを１００％酸素発生活性に設定した。 図７Ａ〜７Ｄは、ｂｓｔｉ−１およびＤ６６の無機炭素取り込みを示す。図７Ａは、ｐＨ７．８での細胞内（内部）Ｃｉ蓄積の経時変化を示す。細胞を採取し、内因性Ｃｉを枯渇させた後、アッセイを実施し、それぞれの時点について３回の反復のサンプルで試行した。図７Ａ〜７Ｄにおけるエラーバーは、３回の生物学的反復を表す。 図７Ａ〜７Ｄは、ｂｓｔｉ−１およびＤ６６の無機炭素取り込みを示す。図７Ｂは、ｐＨ７．８でのＣＯ２（Ｃｉ）固定の経時変化を示す。細胞を採取し、内因性Ｃｉを枯渇させた後、アッセイを実施し、それぞれの時点について３回の反復のサンプルで試行した。図７Ａ〜７Ｄにおけるエラーバーは、３回の生物学的反復を表す。 図７Ａ〜７Ｄは、ｂｓｔｉ−１およびＤ６６の無機炭素取り込みを示す。図７Ｃは、ｐＨ８．４での細胞内Ｃｉ蓄積の経時変化を示す。細胞を採取し、内因性Ｃｉを枯渇させた後、アッセイを実施し、それぞれの時点について３回の反復のサンプルで試行した。図７Ａ〜７Ｄにおけるエラーバーは、３回の生物学的反復を表す。 図７Ａ〜７Ｄは、ｂｓｔｉ−１およびＤ６６の無機炭素取り込みを示す。図７Ｄは、ｐＨ８．４でのＣＯ２固定の経時変化を示す。細胞は、上昇したＣＯ２（ＣＯ２は５％、空気中）で成長させ、その後、解析の前に１２時間、低ＣＯ２（ＣＯ２は０．０４％未満）に順化させた。細胞を採取し、内因性Ｃｉを枯渇させた後、アッセイを実施し、それぞれの時点について３回の反復のサンプルで試行した。 図８Ａ〜８Ｃは、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＣＬｉＰ）由来の変異体ｂｓｔ３において、ＢＳＴ３がノックアウトされていることを示す。図８Ａは、ＢＳＴ３遺伝子の模式図を示し、エキソンは灰色の四角として描写され、イントロンは黒色の線として描写され、非翻訳領域は暗灰色の四角として描写される。インサートの位置は明灰色の三角として示され、インサートを検出するためのプライマーは小さな黒色の矢印として示される。 図８Ａ〜８Ｃは、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＣＬｉＰ）由来の変異体ｂｓｔ３において、ＢＳＴ３がノックアウトされていることを示す。図８Ｂは、ｂｓｔ３においてインサートの位置を確認するための、図８Ａにおいて示されるプライマーを使用するＰＣＲ反応の結果を示す。レーン１、鋳型としてＷＴ株Ｄ６６ ＤＮＡを使用するＢＳＴ３ＦおよびＢＳＴ３Ｒプライマー；レーン２、鋳型としてｂｓｔ３ ＤＮＡを使用するＣＩＢ１ＦおよびＢＳＴ３Ｆプライマー；レーン３、鋳型としてｂｓｔ３ ＤＮＡを使用するＣＩＢ１ＲおよびＢＳＴ３Ｒプライマー；レーン４、鋳型としてｂｓｔ３ ＤＮＡを使用するＢＳＴ３ＦおよびＢＳＴ３Ｒプライマー。レーン１およびレーン４のサイズ差は、１８００ｂｐのカセットがあることを示す。 図８Ａ〜８Ｃは、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＣＬｉＰ）由来の変異体ｂｓｔ３において、ＢＳＴ３がノックアウトされていることを示す。図８Ｃは、Ｄ６６およびｂｓｔ３細胞における、低ＣＯ２（ＣＯ２は０．０４％未満、空気中）および高ＣＯ２（ＣＯ２は５％（ｖ／ｖ）、空気中）におけるＢＳＴ１〜３蓄積を示す半定量ＲＴ−ＰＣＲを示す。赤色の四角で示されるように、ＢＳＴ３は、ｂｓｔ３細胞においては発現していない。アクチンは、ローディングコントロールとして使用された。 図９Ａ〜９Ｄは、ＷＴ株Ｄ６６と比較した、ノックアウト株ｂｓｔ３の成長および無機炭素親和性の測定を示す。図９Ａは、６日間にわたる低ＣＯ２（ＣＯ２は０．０４％未満）、ｐＨ８．６におけるｂｓｔ３およびＷＴの成長を示し、ＯＤ７３０を使用して測定された。 図９Ａ〜９Ｄは、ＷＴ株Ｄ６６と比較した、ノックアウト株ｂｓｔ３の成長および無機炭素親和性の測定を示す。図９Ｂは、６日間にわたる低ＣＯ２（ＣＯ２は０．０４％未満）、ｐＨ８．６、ｐＨ８．６におけるｂｓｔ３およびＷＴの成長を示し、これは、波長６４５および６６３でのクロロフィル推定を使用して測定された。 図９Ａ〜９Ｄは、ＷＴ株Ｄ６６と比較した、ノックアウト株ｂｓｔ３の成長および無機炭素親和性の測定を示す。図９Ｃは、ｂｓｔ３およびＤ６６についての曲線としてプロットされた、ｐＨ７．４で測定された酸素発生活性を示す。それぞれのＣｉ濃度で３回の反復を行った。 図９Ａ〜９Ｄは、ＷＴ株Ｄ６６と比較した、ノックアウト株ｂｓｔ３の成長および無機炭素親和性の測定を示す。図９Ｄは、ｐＨ７．４でのｂｓｔ３およびＤ６６についてのＣｉ曲線に対するＯ２発生から算出されたＫ０．５（Ｃｉ）値（最大酸素発生の半値に必要なＣｉ濃度）を示す。 図１０Ａ〜１０Ｄは、クラミドモナス・ラインハルディＢＳＴ１、ＢＳＴ２、およびＢＳＴ３についてのタンパク質構造モデルを示す。図１０Ａは、クラミドモナス・ラインハルディＢＳＴ１〜３およびクレブシエラ・ニューモニア（Klebsiella pneumonia）ベストロフィン（Ｋｐｂｅｓｔ）についての構造モデルを、突出形状として示され標識された選択的細孔を並べる保存残基を有するモノマーとして示す。 図１０Ａ〜１０Ｄは、クラミドモナス・ラインハルディＢＳＴ１、ＢＳＴ２、およびＢＳＴ３についてのタンパク質構造モデルを示す。図１０Ｂは、ローカルＱＭＥＡＮスコア（構造品質評価スコアリング関数）を用いて陰影が付けられたＢＳＴ１ホモペンタマーモデルの二次構造を示す。 図１０Ａ〜１０Ｄは、クラミドモナス・ラインハルディＢＳＴ１、ＢＳＴ２、およびＢＳＴ３についてのタンパク質構造モデルを示す。図１０Ｃは、ＢＳＴ１ホモペンタマーモデル上に描写されたチャネル空洞の輪郭を黒色で示す。図１０ＡのＢＳＴ１モデルからの保存残基は、チャネル空洞内に延在する突出形状として描写されている。 図１０Ａ〜１０Ｄは、クラミドモナス・ラインハルディＢＳＴ１、ＢＳＴ２、およびＢＳＴ３についてのタンパク質構造モデルを示す。図１０Ｄは、計算されたＢＳＴ１ホモペンタマーモデル上の静電ポテンシャルを示す。静電ポテンシャルは、−４ｋＴ／ｅ（負）〜＋４ｋＴ／ｅ（正）のポテンシャルスケールで表示される。 図１１は、無機炭素（Ｃｉ）輸送のための現状のクラミドモナス・ラインハルディＣＣＭモデルを示す。ＢＳＴ１、ＢＳＴ２、およびＢＳＴ３は、葉緑体チラコイド膜に局在する重炭酸塩輸送チャネル（明灰色、灰色、および暗灰色の矩形）として示されている。

Claims (20)

  1. 遺伝子改変された植物、またはその一部であって、
    前記植物は、
    重炭酸塩が前記植物の葉緑体の少なくとも一部の植物細胞質からストロマへと膜を通過する能力を増加させるか、もしくは提供する１つ以上の遺伝子改変を含むか、または、
    重炭酸塩が前記植物の葉緑体の少なくとも一部のストロマからルーメンへと膜を通過する能力を増加させるか、もしくは提供する１つ以上の遺伝子改変を含む、
    植物、またはその一部。
  2. 重炭酸塩が膜を通過する能力の獲得は、少なくとも１つの緑藻類ベストロフィンポリペプチドの発現を含む、請求項１に記載の植物、またはその一部。
  3. 前記緑藻類ベストロフィンポリペプチドは、
    配列番号１に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性を有する第１のポリペプチド、
    配列番号２に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性を有する第２のポリペプチド、
    配列番号３に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性を有する第３のポリペプチド、および、
    それらの任意の組み合わせ、
    からなる群から選択される、請求項２に記載の植物、またはその一部。
  4. 前記緑藻類ベストロフィンポリペプチドは、
    配列番号１に対して、少なくとも９５％の同一性を有する第１のポリペプチド、
    配列番号２に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する第２のポリペプチド、
    配列番号３に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する第３のポリペプチド、および、
    それらの任意の組み合わせ、
    からなる群から選択される、請求項３に記載の植物、またはその一部。
  5. 前記緑藻類ベストロフィンポリペプチドは、
    配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、および配列番号１１１からなる群から選択され、
    好ましくは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号４２、配列番号６２、および配列番号６３からなる群から選択される、請求項２に記載の植物、またはその一部。
  6. 前記緑藻類ベストロフィンポリペプチドは、植物細胞内の少なくとも１つの葉緑体の葉緑体包膜またはチラコイド膜に局在している、請求項２に記載の植物、またはその一部。
  7. 前記植物細胞は、葉肉細胞である、請求項６に記載の植物、またはその一部。
  8. 前記緑藻類ベストロフィンポリペプチドは、前記植物の葉肉細胞の少なくとも７０％において発現される、請求項７に記載の植物、またはその一部。
  9. 内因性炭酸脱水酵素の調節された発現をさらに含む、請求項２に記載の植物、またはその一部。
  10. 前記調節された発現は、増加した発現、減少した発現、異なる位置での発現、およびそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択される、請求項９に記載の植物、またはその一部。
  11. 前記植物は、カウピー、ダイズ豆、キャッサバ、イネ、ダイズ、コムギ、および他のＣ３農作物植物からなる群から選択され、
    前記植物は、トウモロコシ、モロコシ、および他のＣ４農作物植物からなる群からは選択されない、請求項１に記載の植物、またはその一部。
  12. 増加した炭素利用効率を有する植物、またはその一部であって、
    前記植物は、前記植物、またはその一部において、緑藻類ベストロフィンポリペプチドの少なくとも１つのコード配列を含む少なくとも１つの修飾された核酸配列を含み、
    ここで、前記ベストロフィンポリペプチドは、前記植物、またはその一部において、発現され、
    ここで、前記植物が周囲の二酸化炭素条件下で栽培される場合には、
    収量、成長速度、もしくはバイオマスは、前記ベストロフィンポリペプチドを過剰発現しない対応する野生型（ＷＴ）植物、もしくはその対応するＷＴ部分からの収量、成長速度、もしくはバイオマスよりも大きいか、または、
    収量、成長速度、もしくはバイオマスは、周囲の二酸化炭素条件下で栽培された前記ベストロフィンポリペプチドを過剰発現しない対応するＷＴ植物、もしくはその対応するＷＴ部分からの収量、成長速度、もしくはバイオマスと実質的に類似する、
    植物、またはその一部。
  13. 前記ベストロフィンポリペプチドは、植物細胞の少なくとも１つの葉緑体の葉緑体包膜または葉緑体チラコイド膜に局在しており、
    前記植物細胞は、葉肉細胞であり、
    前記ポリペプチドは、前記植物の葉肉細胞の少なくとも７０％において発現される、請求項１２に記載の植物、またはその一部。
  14. 前記修飾された核酸配列は、前記植物の核ゲノムに安定に組み込まれている、請求項１２に記載の植物、またはその一部。
  15. 前記少なくとも１つの修飾された核酸配列は、緑藻類ベストロフィンポリペプチドの前記少なくとも１つのコード配列に作動可能に連結されたシグナルペプチド配列または標的配列をコードする第２の核酸配列をさらに含み、
    前記シグナルペプチド配列または標的配列の発現は、植物細胞の少なくとも１つの葉緑体の葉緑体包膜または葉緑体チラコイド膜への前記ベストロフィンポリペプチドの局在をもたらす、
    請求項１４に記載の植物、またはその一部。
  16. 前記緑藻類ベストロフィンポリペプチドは、
    配列番号１に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性を有する第１のポリペプチド、
    配列番号２に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性を有する第２のポリペプチド、
    配列番号３に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性を有する第３のポリペプチド、および、
    それらの任意の組み合わせ、
    からなる群から選択される、請求項１２に記載の植物、またはその一部。
  17. 前記緑藻類ベストロフィンポリペプチドは、
    配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、または配列番号１１１からなる群から選択され、
    好ましくは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号４２、配列番号６２、および配列番号６３からなる群から選択される、請求項１２に記載の植物、またはその一部。
  18. 内因性炭酸脱水酵素の調節された発現をさらに含む、請求項１２に記載の植物、またはその一部。
  19. 前記調節された発現は、増加した発現、減少した発現、異なる位置での発現、およびそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択される、請求項１８に記載の植物、またはその一部。
  20. 前記植物は、カウピー、ダイズ豆、キャッサバ、イネ、ダイズ、コムギ、および他のＣ３農作物植物からなる群から選択され、
    前記植物は、トウモロコシ、モロコシ、および他のＣ４農作物植物からなる群からは選択されない、請求項１２に記載の植物、またはその一部。

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