CN104611361B - OsPSE1基因在调节植物衰老中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域,具体公开了OsPSE1基因在调节植物衰老中的应用。本发明利用一个水稻早衰植株,通过图位克隆法克隆出OsPSE1基因并进行了功能分析,发现OsPSE1基因在早衰水稻中表达,可以使早衰水稻恢复正常,而在正常水稻中过表达,则可以进一步延迟植物衰老,增加水稻生物量的积累,暗示了OsPSE1基因在提高作物产量上具有较好的应用潜力;本发明利用基因工程手段调控OsPSE1基因的表达水平进行分子育种,在提高作物产量上具有潜在的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,具体涉及OsPSE1基因在调节植物衰老中的应用。
背景技术
植物衰老是由植物生育时期决定的一个从细胞水平到组织、器官乃至植物整体水平的逐渐老化死亡的过程,是植物发育的最终阶段。植物衰老死亡首先表现在叶片上,因为叶片是植物利用光能、合成有机化合物的重要场所,叶片的衰老会直接降低作物的光合作用、生物量的积累。因而叶片是研究植物衰老的重要表型。
植物衰老不仅受到内部基因的表达调控,同时受到植物生长外部环境的影响。近年来采用多种分子克隆方法,研究衰老相关的突变体,分离了若干衰老相关的基因,使人们对植物衰老的分子机理认识有了很大进展。目前,已知的衰老相关基因大致可分为四类:第一类是激素类相关基因,激素信号途径在叶片衰老的过程中发挥着极其重要的作用,包括细胞***素、赤霉素、乙烯、脱落酸、生长素等的相关基因;第二类是编码转录调控因子的基因,试验证明在叶片衰老发生时,大量转录因子基因的表达发生上调。已知转录因子家族包括NAC家族,WRKY家族,C2H2-type锌指蛋白家族,AP2/EREBP家族,和MYB 蛋白家族;第三类是编码与能量合成与转运相关蛋白的基因,包括与光合作用有关的基因,与蔗糖运输有关的基因等;第四类是参与生物大分子降解的相关基因,如蛋白质降解、氨基酸代谢和脂类降解相关基因等。
迄今为止,水稻中已经定位了近200个控制持绿性和叶绿素降解相关的QTLs。另外通过抑制差减杂交法和图位克隆法已经克隆到超过20个衰老相关基因,这些基因分布于除了3号和6号染色体外的其他10条染色体上。其中sgr(t)、SGR和sgr分别为同一个基因的等位突变体,均编码叶绿体转运肽,包含三个跨膜结构域,作用是延迟叶绿素的降解;OsDOS编码 CCCH-型锌指蛋白,在叶片衰老和幼穗分化时期表达,调节自然衰老和参与茉莉酸介导的叶片衰老途径和花粉发育的调控途径;Ygl1基因的突变使得叶绿体合成的最后一步脂化反应受损,幼苗期叶片黄化;nyc1编码叶绿素 b 氧化还原酶,能有效抑制捕光***复合体2和类囊体膜的降解;NOL基因所编码的蛋白与NYC1有很高的同源性,但是没有跨膜结构域,该基因突变后的表型与nyc1极为相似,免疫共沉淀实验证明NOL能与NYC1相互作用,推测NOL与NYC1形成复合体并定位于类囊体膜上,组成叶绿素b还原酶复合体;NOE1 编码一个水稻过氧化氢酶OsCATC,突变导致叶片中过氧化氢含量增高,激活了硝酸还原酶并促发 NO的产生,从而诱导水稻叶片早衰;Osl2和Osh69分别编码 GABA(γ-氨基丁酸)转氨酶和编码碱性牛乳糖,二者特异在衰老时期的叶片中表达,在茎秆和根里几乎不表达;Osh36编码氨基转移酶;Osl20可能编码支链 α-酮酸脱氢酶;Osl55可能编码丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶;Osl30可能编码 4-羟基苯双加氧酶;Osl57可能编码三酰辅酶 A 硫解酶;Osl85可能编码异柠檬酸裂解酶;Osl295可能编码天冬氨酸蛋白酶;Osl381可能编码 dTDP-葡萄糖 4, 6 脱水酶;Osl139可能编码种子蛋白; Osl43可能编码盐诱导蛋白;Osh70可能编码聚糖醛酸酶同功酶1的 β亚基;Osh67功能未知。
水稻(Oryza sativa L.)是世界最重要的粮食作物之一,也是我国的第一大农作物,在全球粮食生产和消费中占有极其重要的地位。水稻在抽穗到结实期间,叶片提前衰老会缩短叶片功能期和籽粒灌浆时间,影响籽粒发育,导致干物质积累减少并最终限制作物产量和品质的提高。防止水稻早衰是水稻栽培研究领域的重大课题,研究水稻衰老特别是生育后期的功能性衰老过程的分子控制机理,不仅能够加深我们对这一基础生物学过程的理解,并且能够为延缓植物衰老,改善作物农艺性状提供有效的方法策略。
发明内容
本发明的首要目的是填补水稻防衰老研究分子机理的不足,提供OsPSE1基因在调节植物衰老中的应用。
本发明的第二个目的是提供一种抗衰老转基因植物的培育方法。
本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的:
OsPSE1基因在调节植物衰老中的应用,所述OsPSE1基因的序列如SEQ ID NO:1所示。
进一步地,所述植物为水稻,现有技术已经对水稻的全基因组进行了测序,发明人首先是发现了一个表现为早衰的水稻植株,在该早衰植株的基础上通过图位克隆法克隆获得了OsPSE1基因。
同样地,SEQ ID NO:2所述氨基酸序列的蛋白质可用于调节植物衰老;OsPSE1编码的蛋白包含果胶裂解酶家族的保守结构域Pec_lyase_C。
优选地,上述调节植物衰老为使早衰植物恢复正常或延缓正常植物衰老。
一种转基因植物的培育方法,有方法A和方法B:
所述方法A包括以下步骤:
S1. 在正常目的植物中,将SEQ ID NO:1所述基因进行过表达,得到转基因植物;
S2. 从S1所得到的转基因植物中筛选获得与正常目的植物相比,衰老延迟的转基因植物;
所述方法B包括以下步骤:
S1. 向早衰目的植物中导入SEQ ID NO:1所述基因,得到所述转基因植物;
S2. 从S1所得到的转基因植物中筛选获得与早衰目的植物相比,恢复正常的转基因植物。
本发明所述的OsPSE1基因序列可以连接到任何一种植物转化载体,用任何一种转化方法将OsPSE1基因导入目的植物,从而获得表达所述基因的转基因品种。
本发明所述的基因构建到植物转化载体中,可以对所述基因或其调控序列作适当的修饰,也可以在其转录起始密码子前用其它启动子取代所述基因原有的启动子,从而拓宽对研究植物衰老及其如何影响植物生长发育的认识和应用。
优选地,上述转基因植物的培育方法中,SEQ ID NO:1所述基因是通过含有所述基因的重组表达载体导入目的植物的。
更优选地,所述重组表达载体中启动SEQ ID NO:1所述基因转录的启动子为组成型启动子或自身启动子;具体地,所述组成型启动子为Ubi或35S;含有自身启动子的自身启动子的OsPSE1的核苷酸序列如SEQ ID NO:5。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明利用一个水稻早衰植株,通过图位克隆法克隆出OsPSE1基因并进行了功能分析,OsPSE1基因在早衰植物中表达,可以使早衰植物恢复正常,而在正常植株中过表达,则可以进一步延迟植物衰老,增加水稻生物量的积累,暗示了OsPSE1基因在提高水稻产量上具有较好的应用潜力;本发明利用基因工程手段调控OsPSE1基因的表达水平,在提高作物产量的分子育种上具有潜在的应用价值。
附图说明
图1为水稻衰老相关基因OsPSE1/Ospse1区域的电子物理图谱;其中重组个体数指特定分子标记与OsPSE1/Ospse1座位之间的区域发生染色体交换的个体数,ORF为开放阅读框,OsPSE1/Ospse1位于BAC克隆OSJNBa0026J14上。
图2为水稻衰老相关基因OsPSE1遗传互补和过量表达T1代植株的鉴定实物图;图2a中,Ospse1为早衰的水稻植株,CW312为野生型植株,OsPSE1-CT为野生型基因与自身启动子构建的遗传互补载体转化早衰植株Ospse1后的T1代转基因植株;OsPSE1-OE为野生型基因接组成型启动子(Ubi)过量表达载体转化Ospse1植株的T1代转基因植株;图2b为OsPSE1在相应植株绿色叶片的qRT-PCR表达模式分析;OsUBQ作为内参基因。
图3为水稻衰老相关基因OsPSE1/Ospse1基因结构及序列图;图3a为OsPSE1和Ospse1的核苷酸序列比对图;图3b图为OsPSE1和Ospse1的氨基酸序列比对图,黑色下划线为果胶裂解酶家族的Pec_lyase_C结构域。
图4为水稻衰老相关基因OsPSE1/Ospse1表达特性的半定量RT-PCR检测图;OsActin1基因为内参基因,WT为野生型,Ospse1为早衰的水稻植株。
具体实施方式
下面将结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤、条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。若无特别说明,实施例中所用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法和技术,所使用的试剂或材料均为通过商业途径得到。
实施例1水稻衰老相关基因OsPSE1/Ospse1的电子物理图谱的构建及候选基因筛选
本发明利用图位克隆法克隆OsPSE1/Ospse1基因(图1)。
发明人在组织培养过程中获得了早衰的水稻植株Ospse1,发明人将该植株与野生型材料CW312杂交,获得的杂交F1代植株表形正常,表明早衰基因相对正常基因表现为隐性。F1代通过自交得到F2代群体,在抽穗期至结实期统计F2群体野生型和早衰个体的数目,早衰的水稻植株Ospse1与野生型材料CW312的分离比为1:3,说明该早衰表型是由一对隐性基因控制。
将早衰的水稻植株Ospse1与粳稻品种日本晴杂交,建立的F2分离群体用于Ospse1基因的遗传定位。利用水稻InDel标记 (表1)对Ospse1进行初步定位,发现标记C123-3、C094-148与Ospse1基因连锁,位于一号染色体长臂端3832 kb的范围内。将该区域内的水稻日本晴序列和93-11序列比对,设计***/缺失In/Del标记对135株早衰隐性纯合植株进行分析,将Ospse1定位于标记H17-1和P21-4区域290 kb范围内。利用侧翼标记分析法筛选了超过2976株F2个体获得了28株重组个体,在290 kb区域内进一步开发的分子标记对28株重组体的下一代进行精细定位,将该区域进一步缩小到位于标记M20290和J14-3之间的38 kb范围内,位于BAC克隆OSJNBa0026J14上。
为确定OsPSE1的候选基因,申请人以日本晴的参考序列,通过基因预测软件RiceGAAS (http://ricegaas.dna.affrc.go.jp)对目的区域进行基因预测及注释分析,在该区域内预测有10个基因,其中有5个基因为假基因或者基因很小,因此初步确定了OsPSE1的5个候选基因,分别为ORF1、ORF4、ORF5、ORF8、ORF10。
通过对5个候选基因设计扩增全长基因的PCR引物,分别扩增野生型CW312和早衰植株Ospse1的基因组DNA并进行测序,结果发现ORF5在早衰植株Ospse1相比于野生型在第947位有一个碱基的缺失。因此,将ORF5作为OsPSE1的候选基因,并进一步通过功能互补实验确认其功能。
实施例2OsPSE1的遗传互补载体和过量表达载体转化水稻早衰植株Ospse1
根据日本晴参考序列设计包括编码区约1 kb及其上下游调控区各延伸约2.3 kb和1.1 kb的特异性PCR引物OsPSE1-CT-F和OsPSE1-CT-R(表2),利用高保真酶KOD-Plus结合长片段PCR(long-range PCR,LR-PCR)技术,以野生型CW312的gDNA为模板,扩增约4.3 kb目的片段,用限制性内切酶Hind III和BamH I切割后克隆到植物双元载体pCAMBIA1300(CAMBIA公司,Canberra,Australia)上,获得遗传互补载体。
另外设计包含候选基因OsPSE1整个ORF的基因特异性引物OsPSE1-OE-F和OsPSE1-OE-R(表2),PCR扩增CW312基因组DNA得到约1.1 kb的片段,用BamH I/HindIII进行双酶切后克隆到pOX载体上,利用组成型表达的玉米泛素基因Ubi启动子驱动OsPSE1的表达,即过表达载体。
然后,通过农杆菌EHA105介导的遗传转化将上述遗传互补载体和过表达载体导入早衰的水稻植株Ospse1中,通过潮霉素筛选转基因植株并对OsPSE1进行qRT-PCR表达分析(表2)。结果表明,将OsPSE1遗传互补载体导入受体早衰的水稻植株Ospse1中,转化体中OsPSE1的表达水平与野生型个体相似,植株早衰的表型恢复为正常,证明了该基因的生物学功能与水稻衰老相关;另外,在早衰的水稻植株Ospse1中过量表达OsPSE1,转基因植株的OsPSE1基因表达量超过野生型个体水平,使早衰植株不仅恢复正常生长,而且其衰老进程比野生型还缓慢,表明过表达OsPSE1能够延缓正常植物的衰老(图2)。
实施例3水稻衰老相关基因OsPSE1/Ospse1的核苷酸序列及蛋白结构
通过PCR扩增OsPSE1和Ospse1的基因组序列并进行测序,发现水稻早衰植株Ospse1是在野生型OsPSE1编码区第947 bp处发生了一个C碱基的缺失(图3a),导致了其编码区从1095 bp延长至1191 bp,而其编码的蛋白质从突变点起发生了移码突变,OsPSE1和Ospse1的核苷酸序列分别如SEQ ID No:1和SEQ ID No:3所示。
OsPSE1和早衰植株Ospse1的蛋白序列分别如SEQ ID No:2和SEQ ID No:4所示。OsPSE1编码由364个氨基酸残基组成的蛋白多肽,分子量约39.5 kDa,等电点为7.432;而Ospse1则编码由396个氨基酸残基组成的蛋白多肽,分子量约43.6 kDa,等电点为9.68;两个蛋白均具有果胶酶C家族的保守功能域Pec_lyase_C结构域,位于第114~278个氨基酸之间。而OsPSE1和Ospse1的氨基酸序列差异部分在C端的第316位氨基酸后(图3b)。
实施例4水稻衰老相关基因OsPSE1/Ospse1的表达特性分析
利用半定量RT-PCR技术对OsPSE1/Ospse1基因的表达模式进行了分析(图4)。分别采集水稻野生型CW312和早衰植株Ospse1的根、茎、叶、穗和叶片并提取总RNA,用反转录试剂盒SuperScriptTM Reverse Transcriptase II进行反转录合成cDNA第一条链。利用OsPSE1和Ospse1基因的特异引物进行RT-PCR扩增。结果表明,OsPSE1/Ospse1在水稻的根、茎、叶和幼穗等各种组织中均有表达,但是表达量偏低。另外,在水稻整个衰老进程中,该基因在野生型和早衰植株中的表达水平没有明显的差别,说明Ospse1在OsPSE1编码区内的碱基缺失不影响该基因转录本的水平,并且Ospse1的早衰与Ospse1的表达量关系不大。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> OsPSE1基因在调节植物衰老中的应用
<130>
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
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<211> 1095
<212> DNA
<213> 水稻衰老相关基因OsPSE1序列
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20 25 30
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35 40 45
Thr Leu Arg Ala Leu Ala Gly Ala Ala Glu Gly Phe Gly Arg Arg Ala
50 55 60
Ile Gly Gly Leu His Gly Pro Leu Tyr Arg Val Thr Ser Leu Asp Asp
65 70 75 80
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85 90 95
Trp Ile Val Phe Asp Val Ser Gly Asp Ile His Leu Arg Thr Tyr Leu
100 105 110
Arg Val Thr Ser His Lys Thr Ile Asp Gly Arg Gly Gln Arg Val Arg
115 120 125
Leu Leu Gly Lys Gly Leu Gln Leu Lys Glu Cys Arg His Val Ile Val
130 135 140
Cys Asn Leu Gln Ile Glu Gly Gly Arg Gly His Asp Val Asp Ala Ile
145 150 155 160
Gln Ile Lys Pro Ser Ser Ala Asp Ile Trp Ile Asp Arg Cys Ser Leu
165 170 175
Ala Asp Cys Asp Asp Gly Leu Val Asp Ile Thr Arg Gly Ser Thr Asp
180 185 190
Val Thr Val Ser Arg Cys Arg Phe Ser Arg His Asp Lys Thr Met Leu
195 200 205
Val Gly Ala Asp Pro Ser His Thr Gly Asp Arg Gly Ile Arg Val Thr
210 215 220
Val His His Cys Phe Phe Asp Gly Thr Arg Gln Arg His Pro Arg Val
225 230 235 240
Arg Phe Gly Arg Ala His Leu Tyr Asn Asn Tyr Thr Arg Gly Trp Gly
245 250 255
Ile Tyr Ala Val Ala Ala Gly Val Glu Ala Gln Val Ala Ser Gln Cys
260 265 270
Asn Val Tyr Glu Ala Gly Ala Glu Arg Lys Ala Val Phe Arg Tyr Val
275 280 285
Pro Glu Arg Ala Ala Asp Arg Glu Glu Ala Glu Ala Gly Trp Val Arg
290 295 300
Ser Glu Gly Asp Ala Phe Leu Asn Gly Ala Arg Pro Cys Leu Val Asp
305 310 315 320
Gly Gly Asp Ala Ala Val Phe Arg Pro Glu Glu Tyr Tyr Glu Arg Trp
325 330 335
Thr Met Glu Ala Ala Ser Pro Ala Leu Lys Glu Val Val Gln Leu Cys
340 345 350
Ala Gly Trp Gln Pro Val Pro Arg Pro Pro Gly Glu
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<212> DNA
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gtcagcaggt gtaacccaca tatgagcaac ttcctcctca tctcatcctc ttcgtcctaa 720
ctaggcctag tcagcatttc tctggatctg gcattgtgct atggtgtcat caacatctct 780
ccctctctta ctggtggtgg aggttatgga tgtggctgtc taaggcgtct agggtagggg 840
tgaaggagga tggtagagga cgttcaccac gcggtggatg cggacgcgaa gccatcggcg 900
tttgtagccc atgcgcactg gtacgacagc ggtgacaatg gtgtcggggg tggaggagga 960
gagtggtgcg agggcggccc gctgatccac acctacttgg tctccttcca tggcttctcc 1020
atgcggatgt tgccgttgtt gtgggtgctt ccgctatcgt agttctcctc ctcttctagg 1080
gctgccgctg cagcaacgac gataggggtg gacaactcaa cgacacggga gctccgctcg 1140
gtcgcgctca tgtgaggaag aagaggagcg aagaagagaa gaggagagaa gaatttcttc 1200
catcgatccc tgacaagtgg aaccccacct actgactcag caagtctacc atggttaact 1260
tgccatgcta gaaaaaccac ttcctaaact accgaagaag tcacactggt ttgtgaaaga 1320
cggggaagac gttatacctg gttttatggt tgagagagtt gatttaggtt gtgatctttt 1380
ggaggagttg ggaacccctc ccctccgcac gcaaaacaga gctatagatt aacgcataat 1440
taataaagta ttagctatat aaaacttaaa aatggattaa tacgattttt aaagcaactt 1500
tcatatataa actttttaca aaacacgcac catttatcag tttaaaaagt gtgcacgcgg 1560
aaaacgagta agatgagttg ggaactcaag ggaaagaaca cagccttaat cagtagcaaa 1620
agatcaggca cacaaaatag acttattcct ttaatttcct cgagcaacct aacatataaa 1680
aagtagcaaa agatcacaca aaatagactt atttctttat tttcctcgag caacctaaca 1740
tataaaatgg actaaggctc tattgttttc cacgcgcaaa ctttcgaaaa tgctaaacga 1800
tacgttttta taaaaaagtt gctgtaaaat attatatcaa tccagctaat acttgattaa 1860
ccatacgttt aactcgtcgt ttccttttgc gtgccaagag gaggcaaccc ctcaaaagaa 1920
cacagccgct attgcaaatc atcttcagac actattgcaa ttcagacaac atcacgaata 1980
tagacggcga ccgatcggtg accaaccgag acagaccacg ccggcggatt ggccactcca 2040
taatgcagtg tacctaattt tggtaacgct ttaccacagc cgcgtcgtca acgccgacgc 2100
cgaggtcatc ttctactacc agagtgcctc ttctcccgta ctccgccacg ccgcacgtct 2160
tcccttcgac tccgcttctc caccgacgcc accactgtcc ttctcgcttg ccgtgcctca 2220
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taacattttt gtgtcgcgtt ggtttagttt taatccgatc cgatccgcac cgcacggcac 2340
ggcggcgcgg ccatctagcg ccgccatggg cgcctcctgc tcctccccct tcccccctcc 2400
tccttcacct gccgaatcca acgccccctc cgcctccgcg atgcaccacc cgcctcaccc 2460
cgcggccgga ggaggaggac ccgtcatgcc gtacgccgac gccgaccgca ccctccgcgc 2520
gctggccggc gcggcggagg gcttcggccg ccgcgccatc ggcgggctcc acggcccgct 2580
ctaccgcgtc acctccctcg acgacgacgg ccacggcacc ctccgccagg cgtgccgcgc 2640
ccacggcccg ctctggatcg tcttcgacgt ctccggcgac atccacctcc gcacctacct 2700
ccgcgtcacc tcccacaaga ccatcgacgg gcgcggccag cgcgtgcgcc tcctgggcaa 2760
ggggctccag ctcaaggagt gccgccacgt gatcgtctgc aacctccaga tcgagggcgg 2820
gcgcggccac gacgtggacg ccatccagat caagccctcc tccgccgaca tctggatcga 2880
ccgctgcagc ctcgccgact gcgacgacgg cctcgtggac atcacccgcg ggagcaccga 2940
cgtcaccgtc tcccggtgcc gcttctcccg ccacgacaag accatgctgg tgggcgccga 3000
cccgtcccac accggcgacc gcggcatccg cgtcaccgtc caccactgct tcttcgacgg 3060
cacgcggcag cgccacccgc gggtgcggtt cgggagggcg cacctgtaca acaactacac 3120
gagggggtgg ggcatctacg cggtggccgc cggggtggag gcgcaggtgg cgtcgcagtg 3180
caacgtgtac gaggccgggg cggagaggaa ggcggtgttc aggtacgtgc cggagagggc 3240
ggcggaccgg gaggaggcgg aggccgggtg ggtgaggtcg gagggggacg ccttcctcaa 3300
cggggcgcgg ccgtgcctgg tggacggcgg cgacgcggcg gtgttcaggc cggaggagta 3360
ctacgagagg tggaccatgg aggcggcgtc gccggcgctc aaggaggtgg tgcagctgtg 3420
cgccgggtgg cagcccgtgc cgaggccacc gggcgagtga tccatccatc catgttacta 3480
gtgtatatca aaaagaaata ttcatgtatt atccatttag tgtgtcagta catcattacc 3540
aagtaataat cgtgtaataa tcatgcacgt gtgtaatcct cataaaataa gtttaagcaa 3600
tgaatttaac ccacaatc 3618
Claims (3)
1.SEQ ID NO:1所述的OsPSE1基因在延缓正常植物衰老中的应用,具体为:S1.在正常目的植物中,将SEQ ID NO:1所述基因进行过表达,得到转基因植物;S2.从S1所得到的转基因植物中筛选得到与正常目的植物相比,衰老延迟的转基因植物;
所述目的植物为水稻。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,SEQ ID NO:1所述基因是通过含有所述基因的重组表达载体导入所述目的植物中的。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述重组表达载体中启动SEQ ID NO:1所述基因转录的启动子为植物通用组成型启动子。
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Title |
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Characterization and fine mapping of the rice premature senescence mutant ospse1;Hai-Bin Wu et al;《Theor Appl Genet》;20130427;第1898页右栏最后段,第1902段左栏第2段、右栏第2段,图6,第1905页右栏最后1段 * |
Large-scale development of EST-SSR markers in sponge gourd via transcriptome sequencing;Hai-Bin Wu et al.;《Mol Breeding》;20141231;全文 * |
水稻叶片衰老分子机制研究进展;赵春德 等;《分子植物育种》;20141028;第13卷(第3期);全文 * |
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