CN114230649A

CN114230649A - 水稻分蘖力相关的Tn1蛋白及其相关生物材料与应用

Info

Publication number: CN114230649A
Application number: CN202111515783.3A
Authority: CN
Inventors: 张洪亮; 张全; 张战营; 李自超; 李金杰
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2021-12-13
Filing date: 2021-12-13
Publication date: 2022-03-25
Anticipated expiration: 2041-12-13
Also published as: CN114230649B

Abstract

本发明公开了一种与水稻分蘖力相关的Tn1蛋白质及其相关生物材料与应用。所述Tn1蛋白质具体可为如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：A1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.1的蛋白质；A2)将A1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且具有调控植物分蘖力活性的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。Tn1蛋白质及其相关生物材料可用于调控植物的分蘖力。

Description

水稻分蘖力相关的Tn1蛋白及其相关生物材料与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中水稻分蘖力相关的Tn1蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

水稻(Oryza Sativa L.)是世界主要粮食作物之一，全球一半以上的人口以稻米为主食。在可利用耕地面积无法增加甚至逐年减少的严峻形势下，推动品种改良，探索水稻高产潜力是仍是今后一段时期水稻育种的重要任务。穗数作为水稻产量三要素之一，在品种改良中具有重要的研究意义。穗数的多少往往建立在分蘖数多少的基础上。因此，持续发掘调控水稻分蘖的新基因，明确其调控机制，将有助于为水稻理想株型育种提供丰富的基因源和理论指导。

水稻分蘖本质上属于侧生分生组织形成的茎部分枝，每个分蘖起始于侧生分生组织在叶腋形成的分蘖芽，最初处于休眠状态的分蘖芽在适当条件下被激活后伸出并生长成为分蘖，在适当条件下分蘖会进入生殖生长阶段最终转换为有效穗。提高水稻分蘖数，促进分蘖早发生，对后期穗数的建成具有重要的意义。同时，发掘新的水稻分蘖基因，对进一步完善水稻分蘖形态建成的分子机制和遗传调控网络具有重要的应用价值和理论意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控植物的分蘖力。

本发明提供了一种蛋白质，名称为Tn1，是如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：

A1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.1的蛋白质；

A2)将A1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且具有调控植物分蘖力活性的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。

其中，SEQ ID No.1由501个氨基酸残基组成。

上述蛋白质可来源于水稻。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述蛋白质中，所述蛋白质标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白质一起融合表达的一种多肽或者蛋白质，以便于目的蛋白质的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白质标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

与蛋白质Tn1相关的生物材料也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的与蛋白质Tn1相关的生物材料，为下述B1)至B7)中的任一种：

为下述B1)至B7)中的任一种：

B1)编码所述蛋白质的DNA分子；

B2)含有B1)所述DNA分子的表达盒；

B3)含有B1)所述DNA分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述DNA分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述DNA分子的转基因植物细胞系、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官；

B6)降低B1)所述DNA分子表达的核酸分子；

B7)含有B6)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

上述生物材料中，B1)所述DNA分子为如下b1)或b2)所示的基因：

b1)编码链的编码序列是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子；

b2)编码链的核苷酸是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子。

其中，序列表中的序列2由1503个核苷酸组成，编码序列表中的SEQ ID No.1所示的蛋白质。

上述生物材料中，B2)所述的含有所述DNA分子的表达盒(Tn1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达Tn1的DNA分子，该DNA分子不但可包括启动Tn1基因转录的启动子，还可包括终止Tn1转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiology 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白质酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5,187,267)；四环素诱导型启动子(美国专利5,057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白质、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(1985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人GenesDev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

可用现有的植物表达载体构建含有所述蛋白质Tn1编码基因或所述蛋白质Tn1编码基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体可为Gateway***载体或双元农杆菌载体等，如ProSuper1300、pGWB411、pGWB412、pGWB405、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pGWB18、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb。使用Tn1基因构建重组载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiqutin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。

上述生物材料中，所述重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌；如所述细菌可以为农杆菌EHA105菌株。

上述的蛋白质、或上述生物材料的下述C1-C2中的任一种中的应用也属于本发明的保护范围：

C1)调控分蘖力；

C2)制备调控分蘖力的产品。

上述调控分蘖力，为提升分蘖力或降低分蘖力。所述提升分蘖力为增加分蘖数和/或促进分蘖芽伸出，所述降低分蘖力为减少分蘖数和/或抑制分蘖芽伸出。所述提升分蘖力可通过抑制或降低所述蛋白质Tn1的编码基因的表达实现；所述降低分蘖力可通过促进或提高所述蛋白质Tn1的编码基因的表达实现。

本发明还提供一种提高水稻分蘖力的方法，包括如下步骤：抑制或降低受体水稻中Tn1基因的表达，得到分蘖力高于所述受体水稻的目的水稻；所述Tn1基因为编码上述Tn1蛋白的基因。

上述方法中，所述抑制或降低受体水稻中Tn1基因的表达是通过对水稻中Tn1基因进行基因编辑实现的。所述基因编辑是借助CRISPR/Cas9***实现的。

上述方法中，所述CRISPR/Cas9***包括表达含有Cas9和gRNA的质粒，所述gRNA的靶序列为SEQ ID No.2所示DNA片段中符合5’-N_X-NGG-3’或5’-CCN-N_X-3’序列排列规则的片段，其中N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数，N_X表示X个连续的脱氧核糖核苷酸。所述gRNA的靶序列具体可为SEQ ID No.2的第148-167位。

上述方法中，所述抑制或降低受体水稻中基因的表达为在水稻的基因组中，缺失序列表中序列3的第2075位至2080位的6个核苷酸。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了植物试剂，其作用为调控植物分蘖力。

本发明所提供的植物试剂含有所述的蛋白质或/和所述的蛋白质相关的生物材料。

上述植物试剂的活性成分可为所述的蛋白质或/和所述的蛋白质相关的生物材料，上述植物试剂的活性成分还可含有其他生物成分或/和非生物成分，上述植物试剂的其他活性成分本领域技术人员可根据植物分蘖效果确定。

所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为禾本科植物，具体可为水稻。

敲除水稻中Tn1基因的实验证明敲除Tn1基因的转基因水稻分蘖数增多，分蘖芽的伸出受到了促进。将Tn1基因编码序列导入水稻的过表达实验证明，过表达Tn1蛋白的转基因水稻与受体水稻相比，分蘖数减少，分蘖芽的伸出受到了抑制。敲除实验和过表达实验均说明Tn1蛋白是与植物分蘖力相关的基因，抑制Tn1蛋白提升植物的分蘖力。本发明的方法操作简单，成本低，大大加快了育种进程，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1中295份水稻种质材料关于有效穗数的全基因组关联分析曼哈顿图。

图2为本发明实施例2中Tn1基因敲除试验中Tn1基因的靶序列位置示意图。

图3为本发明实施例2中Tn1基因过表达材料的DNA水平鉴定图。

图4为本发明实施例2中Tn1基因敲除材料T0代测序峰图。

图5为本发明实施例2中Tn1基因敲除材料tn1-1与野生型日本晴(NIP)的分蘖表型以及统计图。图中所示数据为平均值±标准差，重复数为15，**代表显著性分析结果为P<0.01，Tiller number为分蘖数，单位是个/株。

图6为本发明实施例2中Tn1基因过表达材料(Tn1-OE1和Tn1-OE2)与野生型的分蘖表型以及统计图。图中所示数据为平均值±标准差，重复数为15，*代表显著性分析结果为P<0.05，**代表显著性分析结果为P<0.01，Tiller number为分蘖数，单位是个/株。左图中，从左至右的三盆植株分别是日本晴(NIP)、过表达材料Tn1-OE1和Tn1-OE2。

图7为本发明实施例2中Tn1基因敲除材料，过表达材料与野生型发苗三周后分蘖芽表型照片。

图8为本发明实施例3中Tn1基因在各个时期分蘖芽基部的表达情况。内参为LOC_Os03g13170(Ubiquitin1)基因。Root，sheath，leaf分别代表营养生长期根部，叶鞘，叶片，DT30_Ab，DT45_Ab，DT60_Ab分别代表插秧后30天，45天，60天的分蘖芽基部，ST_1，ST_2，ST_3分别代表插秧后75天的倒一，倒二，倒三节间基部。图中所示数据为平均值±标准差，重复数为3，**代表显著性分析结果为P<0.01，ns代表无差异。

图9为本发明实施例3中Tn1的亚细胞定位图。35S::GFP(ProSuper1300空载)作为对照。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的载体SK-gRNA和载体pC1300-Cas9均记载于非专利文献“Wang,Chun et al.,A simple CRISPR/Cas9 system for multiplex genome editing inrice.Journal of Genetics and Genomics”，公众可以从中国农业大学(即申请人处)获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的载体ProSuper1300记载于非专利文献“Li,Gangling et al.,RGN1 controls grain number and shapes panicle architecture in rice.Plantbiotechnology journal”，公众可以从中国农业大学(即申请人处)获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

实施例1、Tn1基因的获得

本发明利用295份水稻种质材料，在北京种植并调查其有效穗数，利用MLM模型进行全基因组关联分析，结合RiceXPro网站基因表达情况，筛选获得Tn1基因。

利用295份水稻种质材料进行有效穗数关联分析，以P＝10^-4为阈值，将至少连续三个显著SNP位点，且两两间相距不超过170kb的区间定义为一个QTL，共划定13个QTL(qTn1-qTn13)(如图1所示)。根据qTn2内显著SNP位点共注释到12个候选基因，其中5个基因在水稻生长发育各个时期都不表达，剩余的7个基因中，仅有Tn1基因在营养生长期根部高表达，并且存在显著非同义突变SNP位点，符合分蘖基因的表达模式。

以水稻品种日本晴的cDNA为模板，经PCR扩增得到Tn1基因，所用引物如下：

Tn1-F：5’-ATGGATGGTAGTAATGAGAATATC-3’；

Tn1-R：5’-TTACTTTCCCATCTTACTCGCAAAG-3’。

经测序，Tn1基因的编码序列核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，编码蛋白Tn1，该蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.1。

实施例2、Tn1蛋白的功能验证

一、敲除载体的构建

(1)Tn1的基因组基因的核苷酸序列是SEQ ID No.3，共10个外显子，10个内含子(其中，SEQ ID No.3第1-139位为5’UTR，第140-1872位为第一内含子，第1873-1916位为5’UTR，第1917-2249位为第一外显子，第2250-3035位为第二内含子，第3036-3204位为第二外显子，第3205-3317位为第三内含子，第3318-3763位为第三外显子，第3764-4558位为第四内含子，第4559-4582位为第四外显子，第4583-4754位为第五内含子，第4755-4847位为第五外显子，第4848-5824位为第六内含子，第5825-5903位为第六外显子，第5904-5997位为第七内含子，第5998-6082位为第七外显子，第6083-6497位为第八内含子，第6498-6609位为第八外显子，第6610-6690位为第九内含子，第6691-6807位为第九外显子，第6808-6901位为第十内含子，第6902-6949位为第十外显子，第6950-7468位为3’UTR)。登录到网站http://www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html，筛选靶位点。然后到http://www.rgenome.net/cas-offinder/网站评估脱靶情况。挑选脱靶率低的序列作为本研究的靶序列，具体如下：

靶序列：5’-GGTGAGTCTGAACCTTACAT-3’(同SEQ ID No.2的第148-167位，SEQ IDNo.3的第2064-2083位)。

Tn1基因敲除靶序列在其基因组上的位置如图2所示，位于第一个外显子。

(2)设计两个互补DNA序列，在正向靶序列前加GGCA，在反向互补靶序列前加AAAC，具体如下：

F：5’-GGCAGGTGAGTCTGAACCTTACAT-3’；

R：5’-AAACATGTAAGGTTCAGACTCACC-3’(下划线指示的序列与F中下划线指示的序列反向互补)。

(3)中间载体的构建：

a.载体SK-gRNA经过AarI酶切(Ferment公司)，形成带有粘性末端的线性载体；

b.F链与R链混合后变性退火，形成带有粘性末端的片段；

c.将步骤a得到的线性载体和步骤b得到的片段进行连接(摩尔浓度1:3-10)，转化DH5α，得到重组质粒；可用引物T3与R链搭配进行菌落PCR阳性检测，引物序列如下：

T3：5’-ATTAACCCTCACTAAAGGGA-3’；

R：5’-AAACATGTAAGGTTCAGACTCACC-3’。

d.利用公共引物T7(5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’)或T3(5’-ATTAACCCTCACTAAAGGGA-3’)进行测序检测，验证是否正确，正确载体命名为SK-gRNA-Tn1。

(4)构建至最终载体：

载体pC1300-Cas9用KpnI和BamHI进行酶切，得到线性化的pC1300-Cas9载体。将步骤(3)中构建的SK-gRNA-Tn1经KpnI和BglII酶切后，回收目的片段。将前述目的片段连接到线性化的pC1300-Cas9载体上得到敲除载体，具体结构为：以SK-gRNA-Tn1酶切后的目的片段替换载体pC1300-Cas9的限制性核酸内切酶KpnI和BamHI识别位点间的片段(包括KpnI的识别位点和BamHI识别位点在内的小片段)，保持pC1300-Cas9载体的其它序列不变得到的重组载体。测序正确后，所得敲除载体命名为Tn1-CR。

敲除载体Tn1-CR表达gRNA，gRNA的靶序列位于水稻Tn1基因的第一外显子上，具体标靶序列如SEQ ID No.2的第148-167位所示。

二、过表达载体的构建

本实验所用的过表达载体命名为Tn1-OE，是将日本晴中Tn1去除终止密码子的CDS(SEQ ID No.2中第1-1503个核苷酸)通过无缝连接的方法将之连接至带有35S强启动子的植物表达载体ProSuper1300上。酶切位点为HindⅢ与KpnI，所用引物如下所示：

Tn1-OE-F：AATCTCGATACACCAAATCGACTCTAGAAAGCTTATGGATGGTTAATGAGAATATC

Tn1-OE-R：

CGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATGGTACCCTTTCCCATCTTACTCGCAAAGGTC

上述引物均为5’到3’方向书写。

Tn1-OE载体的结构描述为：将ProSuper1300载体的酶切位点HindⅢ与KpnI之间的小片段替换为Tn1编码区序列保持ProSuper1300载体的其它序列不变得到的阳性质粒，即为Tn1蛋白的重组表达载体。Tn1编码序列如SEQ ID No.2第1-1503个核苷酸所示。

三、转基因水稻的获得

(1)重组菌

将上述步骤一制备的敲除载体Tn1-CR用冻融法转化根癌农杆菌EHA105，得到重组菌EHA105-Tn1-CR。

将上述步骤二制备的过表达载体Tn1-OE用冻融法转化根癌农杆菌EHA105，得到重组菌EHA105-Tn1-OE。

(2)转水稻

将上述两种重组菌均采取经典的农杆菌介导的愈伤侵染方法，分别用于侵染受体品种的愈伤受体品种均为日本晴。具体步骤如下：

a、胚性愈伤的获得：将成熟的种子去壳后用75％酒精消毒，再用20％次氯酸钠溶液消毒，无菌水漂洗一次，风干6h。接种于NB培养基，28℃暗培养2周，将胚性愈伤剥下，继代至新的NB培养基，继代培养2周。

b、制备侵染液：吸取保存的农杆菌液，涂布到含利福平和卡那霉素固体培养基上，28℃倒置暗培养2天，刮取少量农杆菌至AAM液体培养基中，吹打混匀，测定菌液浓度OD600约为0.3。

c、共培养：挑选自然分散、颜色鲜黄、直径约为3～5mm的颗粒状愈伤组织至三角瓶中，加入制备好的侵染液，侵染15min，用无菌滤纸吸取多余的侵染液，置于铺有一层滤纸的共培养培养基上，20℃共培养2～3d。

d、抗性愈伤组织的筛选：将共培养后的愈伤组织取出，用无菌水快速摇动清洗5～6次，再用含头孢霉素和羧苄青霉素的无菌水清洗20min，最后置于无菌滤纸上沥干3h。然后移到延迟筛选培养基上。一周后移至到第一轮筛选培养基上，两周后再移至到第二轮筛选培养基上，继续培养两周。

e、分化培养：将筛选获得的抗性愈伤组织接入预分化培养基中，28℃暗培养2周，然后转移至分化培养基上，光照培养2～3周，得到再生转基因幼苗植株。

f、将幼苗移至壮苗培养基上，待幼苗生根长成后，移出培养瓶，洗净根上的培养基，炼苗1～2周，移至大田栽种，直至成熟。

上述转基因过程中所用培养基配方如表1所示。

表1转基因过程中所用各培养基配方

注：NB培养基基本成分包括N6大量元素，B5微量元素，B5有机成分，150mg/L肌醇，300mg/L水解酪蛋白，500mg/L谷氨酰胺，600mg/L脯氨酸，30g/L蔗糖，3g/L植物凝胶。

(3)PCR鉴定获得阳性转基因材料

对步骤(2)获得的T0代Tn1-OE转基因材料和T0代Tn1-CR转基因材料的水稻植株分别进行DNA水平的PCR鉴定和测序鉴定。

Tn1-OE转基因材料鉴定引物为Tn1-OE-check-F和Tn1-OE-check-R：

Tn1-OE-check-F：5’-GACGCCATTTCGCCTTTTCAG-3’；

Tn1-OE-check-R：5’-CTTTCCAATGTAAGGTTCAG-3’。

目的片段的大小为310bp，扩增产物中含有目的片段的植株为阳性，不含有目的片段的植株为阴性，部分阳性样本的鉴定结果如图3所示，阳性植株为T0代Tn1-OE转基因材料(即Tn1基因过表达材料)。

Tn1-CR转基因材料鉴定测序引物为Tn1-CR-check-F和Tn1-CR-check-R：

Tn1-CR-check-F：5’-GGTTTGTATGTTTGTTGACCACC-3’；

Tn1-CR-check-R：5’-TCTAGCTACCGATATGGCTTCTC-3’。

Tn1-CR转基因材料(即Tn1敲除材料)T0代的测序峰图如图4所示，并将纯合材料命名为tn1-1。

四、转基因材料分蘖数相关性状鉴定

Tn1-CR的纯合阳性株系为步骤三中tn1-1的T0代株系收种后得到的T1代，测序得到Tn1-CR的纯合阳性株系(tn1-1)，以下又称Tn1基因敲除材料tn1-1。

Tn1-CR的纯合阳性株系(tn1-1)与野生型水稻日本晴相比，水稻基因组中Tn1的基因发生了突变：两条同源染色体中，核苷酸序列是序列表中序列3的Tn1的基因组基因均发生了如下变化：缺失了序列表中序列3的第2075位至2080位的6个核苷酸，即缺失了序列表中序列2的第148位至167位的6个核苷酸，导致序列1的第53位谷氨酸(Glu)，第54位脯氨酸(Pro)，第55位酪氨酸(Tyr)共三个氨基酸突变为一个天冬氨酸(Asp)，从而将Tn1基因敲除。

将Tn1-CR的纯合阳性株系(tn1-1)与日本晴(NIP)播种于北京中国农业大学上庄实验站。浸种催芽后在苗床生长30天，然后将幼苗移栽大田，每行栽种7株，株距为20cm，行距为25cm，各栽种10行。统计调查移栽后50天时的分蘖表型，tn1-1和NIP各调查15株(边行单株不做统计)，结果见图5，表明移栽后第50天敲除材料tn1-1的分蘖数显著多于野生型日本晴的分蘖数。

将Tn1-OE的T0代阳性株系收种后，在T1代播种前用20mg/L的潮霉素溶液浸种发芽，挑选可正常生根的种子移栽至大田，取叶片提取DNA后，用上述Tn1-OE-check-F和Tn1-OE-check-R进行DNA水平鉴定获得阳性单株。在T2代播种前对T1代所有阳性单株种子进行20mg/L的潮霉素溶液处理，所有浸种种子均可正常生根的T1单株则为纯合株系，记为Tn1-OE1和Tn1-OE2，将其移栽至大田，统计移栽后50天时的分蘖表型。并通过实时定量分析Tn1-OE1和Tn1-OE2中Tn1的表达量。结果见图6：移栽后第50天，过表达材料Tn1-OE1和Tn1-OE2相较于野生型日本晴，表现出分蘖数降低的表型。

为调查Tn1对水稻分蘖芽伸出的影响，将野生型日本晴(NIP)，Tn1敲除材料tn1-1，Tn1过表达材料Tn1-OE1和Tn1-OE2的种子用无菌水消毒处理后。种植于1/2MS培养基，光照培养箱内培养3周，调查茎基部分蘖芽的表型，每个株系种植10株。图7为日本晴(NIP)、敲除材料(tn1-1)、过表达材料(Tn1-OE1和Tn1-OE2)三周幼苗分蘖芽对比图，NIP的分蘖芽长度要短于tn1-1，但长于Tn1-OE1和Tn1-OE2。表明相比于野生型日本晴植株，Tn1敲除材料tn1-1分蘖芽伸出受到了促进，Tn1过表达材料Tn1-OE1和Tn1-OE2分蘖芽伸出受到了抑制。

实施例3、Tn1在水稻各个组织中的表达情况以及亚细胞定位分析

一、实时荧光定量PCR

取水稻品种日本晴各个时期的分蘖芽基部组织，提取总RNA后，利用反转录酶M-MLV反转录合成cDNA第一链，以该cDNA第一链为模板，采用引物Tn1-RT-F和引物Tn1-RT-R扩增Tn1基因的特异片段，采用引物Ubiquitin-F和引物Ubiquitin-R扩增出水稻Ubiquitin基因的特异片段以作为内参进行实时定量分析。所用引物的序列具体如下：

Tn1-RT-F：5’-GGCGTTGGCCTTGCTGAT-3’；

Tn1-RT-R：5’-GTTGACGATTCCTCTCATCCTTTG-3’。

Ubiquitin-F：5’-ACCAGCTGAGGCCCAAGA-3’；

Ubiquitin-R：5’-ACGATTGATTTAACCAGTCCATGA-3’。

实时荧光定量PCR在实时荧光定量PCR仪Applied Biosystems 7500Real TimePCR system(ABI,USA)上进行，一次试验设3个生物学重复，每个生物学重复进行3次机械重复。利用Livak KJ和Schmittgen TD(2001)报道的方法，即2^-ΔΔCT计算相对表达量。

ΔΔCT＝(CT.Target－CT.Ubiquitin)Time x－(CT.Target－CT.Ubiquitin)Time 0

Time x表示任意时间点，Time 0表示经Ubiquitin校正后1倍量的目标基因表达。

结果如图8所示，Tn1基因能在日本晴各个时期的分蘖芽基部组织中检测到。

二、Tn1在水稻原生质体中的亚细胞定位

为研究Tn1的亚细胞定位，本研究利用实施例2步骤二中构建的Tn1-OE载体(所用出发载体为ProSuper1300)，将其转化水稻原生质体观察定位结果。

(1)将脱壳后的水稻品种日本晴种子用75％酒精消毒处理3-5min，然后灭菌水清洗两遍。再用20％次氯酸钠溶液消毒处理(28度摇床160转)，20min换一次次氯酸钠溶液，共两次。最后使用灭菌水漂洗5-8次，置于超净台风干4-5小时

(2)将消毒处理后的种子接种于1/2MS培养基，避光生长12天。

(3)用刀片将(2)中水稻幼苗切碎，放入缓冲液Enzyme solutionⅠ，轻轻摇晃混匀。用400目尼龙膜过滤后，将切碎组织加入Enzyme solutionⅡ。

(4)将包含切碎组织的Enzyme solutionⅡ置于真空泵中，50kpa抽真空0.5h，然后室温条件下，40转摇床处理3-4小时，促进原生质体解离释放。

(5)用400目尼龙膜过滤含有原生质体的Enzyme solutionⅡ，去除水稻切碎组织，收集原生质体于50ml离心管中。用100ml W5溶液清洗原生质体，150g，5min(3acel 9brake)离心收集原生质体。

(6)用MMG溶液重悬(5)中收集的原生质体。

(7)将提取好的Tn1-OE质粒加入2ml小管，加入(6)中得到的原生质体与MMG混合溶液，用手轻轻弹匀。

(8)加入110μl 40％PEG，上下颠倒轻柔混匀，避光28度竖放15分钟。

(9)加满W5，轻柔混匀，150g离心5min去上清。

(10)加800μl W5横放，28度培养箱过夜培养16小时。

(11)激光共聚焦观察。

上述原生质体提取过程所用试剂配方如表2所示。

表2原生质体提取所用试剂

结果如图9所示，表明Tn1是一个定位在细胞核上的蛋白。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 水稻分蘖力相关的Tn1蛋白及其相关生物材料与应用

<130> GNCSY213250

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 501

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Asp Gly Ser Asn Glu Asn Ile Gln Phe Ser Trp Gly Lys Lys Arg

1 5 10 15

Ala Lys Gly Gly Ile Lys Met Asp Thr Gln Phe Tyr Asp Ser Phe Thr

20 25 30

Phe Asp Asn Val Lys Tyr Ser Leu Tyr Asp Asn Val Tyr Leu Phe Lys

35 40 45

Ser Gly Glu Ser Glu Pro Tyr Ile Gly Lys Ile Ile Lys Ile Trp Gln

50 55 60

Gln Asn Gln Ala Lys Lys Val Lys Ile Leu Trp Phe Phe Leu Pro Asp

65 70 75 80

Glu Ile Arg Lys His Leu Ser Gly Pro Val Met Glu Lys Glu Ile Phe

85 90 95

Leu Ala Cys Gly Glu Gly Val Gly Leu Ala Asp Ile Asn Pro Leu Glu

100 105 110

Ala Ile Gly Gly Lys Cys Thr Val Leu Cys Ile Ser Lys Asp Glu Arg

115 120 125

Asn Arg Gln Pro Ser Pro Arg Glu Leu Ala Met Ala Asp Tyr Ile Phe

130 135 140

Tyr Arg Phe Phe Asp Val Asn Ser Cys Thr Leu Ser Glu Gln Leu Pro

145 150 155 160

Glu Lys Ile Ala Gly Val Glu Gly Asn Leu Leu Leu Asn Ser Lys Val

165 170 175

Glu Gln Val Thr Ser Cys Ser Asp Gln Glu Val His Gly Val Asp Gln

180 185 190

Lys Met Leu Asn Val Pro Val Pro Leu Pro Gln Ser Thr Val Met Glu

195 200 205

Asp Glu Ser Pro Val Ala Ala Val Ser Leu Pro Pro Ser Val Phe Lys

210 215 220

Glu Glu Asn Val Ala Ser Ala Ile Pro Phe Pro Gln Pro Val Val Lys

225 230 235 240

Glu Glu Ser Ala Ala Ala Ala Ile Pro Pro Pro His Val Ala Leu Lys

245 250 255

Glu Glu Ser Val Ser Lys Ser Thr Glu Asn Ile Thr Lys Pro Ala Gln

260 265 270

Lys Val Leu Pro Gly Glu Arg Pro Pro Lys Arg Val Lys Phe Ser Glu

275 280 285

Asn Val Thr Val Gln Asn Val Pro Leu Asp Val Pro Glu Arg Pro Ser

290 295 300

Arg Thr Gly Pro Leu Glu Leu Ala Gly Arg Gln Ala Asp Arg Ser Lys

305 310 315 320

Trp Phe Lys Ile Pro Trp Asp Thr Arg Leu Arg Asn Ala Asp Glu Gln

325 330 335

Gly Thr Leu Val Tyr Ile Gln Asn Leu Asp Ile Gln Phe Ala Ala Ala

340 345 350

Asp Ile Glu Glu Leu Ile Arg Asp Ala Leu Gln Leu Asn Cys Ile Ala

355 360 365

Lys Pro Ile Asn His Pro Thr Tyr Asp Asp Pro Asn Asn Gly Lys Ala

370 375 380

Tyr Ala Ile Phe Lys Thr Lys Ser Ala Ala Asp Ser Ala Ile Ser Lys

385 390 395 400

Ile Asn Ser Gly Leu Val Val Gly Gly Arg Pro Leu Tyr Cys Ser Lys

405 410 415

Gly Leu Leu Lys Val Pro Lys Pro Ser Glu Thr Leu Leu Gly His Leu

420 425 430

Thr Ile Asn Asn Ile Arg Met Gly Ile Arg Gln Arg Glu Glu Gln Lys

435 440 445

Lys Ala Val Ser Thr Ser His Cys Ser Gln Pro Asn Thr Met Glu Tyr

450 455 460

Asp Leu Ala Leu Asp Trp Met Leu Val Arg Ala Lys Gln Glu Thr Lys

465 470 475 480

Phe Arg Thr Leu His Lys Lys His Lys Asp Glu Arg Lys Thr Phe Ala

485 490 495

Ser Lys Met Gly Lys

500

<210> 2

<211> 1506

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggatggta gtaatgagaa tatccaattc tcatggggga agaagagagc aaaaggtggt 60

attaagatgg atacacagtt ttatgactcc ttcacatttg acaatgtgaa gtactcactg 120

tatgacaatg tatatctttt taagagtggt gagtctgaac cttacattgg aaagataata 180

aagatatggc agcaaaatca ggctaagaaa gtaaagattc tttggttttt tctcccggat 240

gagattcgaa aacatttaag tggccctgta atggaaaagg agatatttct tgcttgtggt 300

gaaggcgttg gccttgctga tatcaaccca ctggaagcta ttggtgggaa atgcactgtg 360

ctttgcattt caaaggatga gaggaatcgt caaccttccc ccagggaact agcaatggct 420

gattatatct tctacaggtt ttttgatgtt aacagttgca cactttctga acaattacct 480

gagaaaattg caggggtgga aggaaatctt ttgcttaatt caaaagttga gcaagtgaca 540

tcctgttcag accaggaagt gcatggtgtt gatcagaaga tgcttaatgt cccagttccc 600

cttccccagt caacggttat ggaggatgaa agtccagttg ctgcagtttc ccttcccccg 660

tcagtattca aggaggaaaa tgtggcttca gccattccct ttccccagcc agtggtcaag 720

gaggaaagtg cggctgctgc cattccccct ccccatgtag cactgaaaga ggagagtgtg 780

tccaaatcta cagagaacat taccaaacct gcacagaaag ttctccctgg ggagaggcca 840

ccaaagaggg tcaaattttc tgaaaatgtt acagtgcaaa atgtgccatt agatgttcct 900

gaaagaccaa gtcgcactgg acctttggaa ctagcaggta gacaagctga cagaagcaaa 960

tggttcaaga ttccatggga taccagacta cgaaatgctg atgagcaggg gacacttgtg 1020

tacattcaaa atcttgacat acagtttgca gctgctgaca tagaggagct tatacgtgat 1080

gctttacaac taaattgtat cgctaagcct attaaccacc caacttatga tgatccaaac 1140

aatggaaaag catatgctat attcaaaaca aaaagtgccg cagactctgc tatttcaaaa 1200

attaattcag gcttggtggt cggtggaaga cccctttatt gcagcaaagg attgcttaag 1260

gttccaaaac cttcagaaac tcttctcggg cacttaacaa tcaacaatat tagaatgggt 1320

ataagacaac gagaagaaca gaagaaggca gtttcaacct cgcattgttc tcaacccaat 1380

acaatggagt atgatttggc cttggattgg atgcttgtcc gagcaaagca agaaacgaaa 1440

tttaggacac ttcacaagaa gcataaagat gagaggaaga cctttgcgag taagatggga 1500

aagtaa 1506

<210> 3

<211> 7468

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcgtccgtac tgagacccaa ccacaaaaat ctcacctcct cctcctcctc cctctcccac 60

cgcggcctcc tcctgctacc tgggagccac gcgcccccgg cctccacctc gccgccctcc 120

tcgccggcgg ccgccacgcg tgagtcctct cccctcttcc tccccgccgt cccccgtcac 180

tgttccgcgc tggatttcgc tgcgcggccg cgcgtggttc cgcccccaac cccccaccgg 240

ggaccgcggg gctccggtcg ctggagagcg ctccgcgtcg ccccgtcggg ctccggggcc 300

gctggtcgtg gtcccccgcg cgcgcggcct ccggttgcgc ggcgcgggcg aggaatgccg 360

gcgcgcgtgc gggcgggcgg gccgaacgac cccggtcgaa cggctagggc gctaaatttt 420

ggtgctcgaa tggaggtgtc cttgcgaggt tttgggggat ttcgtgtggg ggcgtcgcac 480

gttcggtttg cgtttccccc gtctagggtt tggggtttgg tggattcgtc gtcggtgtga 540

tcgcatttag tggctctagc tgctgttggt ggtaatttta gttctcatat tatggattgg 600

tcatgtcaaa accctagatg agttccctgg aacccgttag ctcacctcat gggtttgttc 660

ttcgtcgtgc tggacaccct cctttgctct tgttctaaaa actaaggcat gcatgacgat 720

ccttgttgcg gtggtactgt tttatatatg cttatggtta atggtgagcc tattagtaag 780

gtgaaacagc ggatacgaac atgtcagttg aaaaagcatt catgttttta tttcctaccc 840

tatttaagaa cacacgtttg atcaaaggcg ctaactgttg ccttttaggt tgaaaacagg 900

gtactccaag ccattgttga gcctcaagtt ttatgcatgt actatgtagt tactcctcta 960

atggccttct tattcaccat gagcattcat gaaacttatt acattttctt tactcctgtt 1020

tagtgagcat gtagaattca tgccaaccgg aaaatgtagc agattgattt gtccaaaaga 1080

taaaaaatcg aacgacttcc tgtgggattt tattccagca taacctaaaa tgtaactaat 1140

cagcatgaca gatttattta tcaagcagat ggatctgtac ttccattatg tttgcttatt 1200

taccgcgaat attttggaac tttagaataa ccacagccta tccagaaaaa taagaattaa 1260

ttaggttggt ttaaaatgca tcaccatgca gcaatcggtt gcaatttcat atctttatat 1320

ttttttatgt gttatctttg atgttcccgc atgcattcag ctgtagataa aacattgcta 1380

cattcagttg caaaataggg ttcagctgtg aaataggact tttcaagaag tctgagagaa 1440

gctgtccctt tctttgttga gaaaataaca tctgctgcag ttaatatttc atctttctca 1500

attcattaaa ctaactaatg tatatacagc gtattagcta ggttaactaa tcttgcaaat 1560

gacatagatt tgctaggtta actaaaatgt taacaactca aattcaacat gtgtgaagaa 1620

actagattta cgattttcgt tatgaagcga atgtctaaat tcacacttga tacggtaata 1680

gtactattag tttgtaagca tggtttgtat gtttgttgac cacctagcat aaacagcaca 1740

attaacagac accacccttt cgagcttcag aaactacgta tgttctgtgc taacattatc 1800

aatagtcaag tctgatgtgt tgatattgcc taatttgatc taaagtttga cctgctgatt 1860

ttatcactct aggcttatgg tgagtgcaca gtgagctaca agttaccatt atcagaatgg 1920

atggtagtaa tgagaatatc caattctcat gggggaagaa gagagcaaaa ggtggtatta 1980

agatggatac acagttttat gactccttca catttgacaa tgtgaagtac tcactgtatg 2040

acaatgtata tctttttaag agtggtgagt ctgaacctta cattggaaag ataataaaga 2100

tatggcagca aaatcaggct aagaaagtaa agattctttg gttttttctc ccggatgaga 2160

ttcgaaaaca tttaagtggc cctgtaatgg aaaaggagat atttcttgct tgtggtgaag 2220

gcgttggcct tgctgatatc aacccactgg taagttcata tattttcccc ttcgtttttg 2280

aattggtttt cttgaatatc attttacctt atgctttctt gcaatatatt taaatatttt 2340

cattttgatc actcaatgga cagataatca ctattatgtg aacactatat caaatttgtt 2400

tctaattgtg aaaagtcatt ggatgggcaa tagtgtcgac attttgttaa ttccaaatat 2460

ctgttgttga gaagccatat cggtagctag aatcctagag ctacaagtta ccttatcaag 2520

ttgtatctag tactagttga tgtgaggaga tcatttccca cttttttttg ttgggaatcg 2580

tccaccttgt atttgtggta tatttagtta ttcacgcatg acatgaataa ttcgaagtta 2640

gagttttaat tctcatgtat aaaaagtgca tcacaatttt caaagagcaa tatttaaatt 2700

cacatttttg gaagtgaaaa tgcagtccaa ctgagttaga cagagtaggc attagcgtgt 2760

tacccatttg catgacctga gaagagccag cttggttgcg acaatcaact tgaaaattga 2820

gatcatttct agctggtaca gttaaacatc cttttgagct aattggcata ccattttagt 2880

agagcatggt taggtattaa cagtcatgat acaagattga aactttcctg ctattgtgta 2940

ttacctgtga atgttaagtc atttgccttt tccatccttt tactttttct gagaactaaa 3000

atattataat acccttttgt ttattggtca cccaggaagc tattggtggg aaatgcactg 3060

tgctttgcat ttcaaaggat gagaggaatc gtcaaccttc ccccagggaa ctagcaatgg 3120

ctgattatat cttctacagg ttttttgatg ttaacagttg cacactttct gaacaattac 3180

ctgagaaaat tgcaggggtg gaaggtcagc aatatatcag atttcatcag tgcattaaat 3240

tgcattttta atatggcaaa aaatttctcc accctcagta tccaaattgg tatttaatta 3300

tttttcttct ggcacaggaa atcttttgct taattcaaaa gttgagcaag tgacatcctg 3360

ttcagaccag gaagtgcatg gtgttgatca gaagatgctt aatgtcccag ttccccttcc 3420

ccagtcaacg gttatggagg atgaaagtcc agttgctgca gtttcccttc ccccgtcagt 3480

attcaaggag gaaaatgtgg cttcagccat tccctttccc cagccagtgg tcaaggagga 3540

aagtgcggct gctgccattc cccctcccca tgtagcactg aaagaggaga gtgtgtccaa 3600

atctacagag aacattacca aacctgcaca gaaagttctc cctggggaga ggccaccaaa 3660

gagggtcaaa ttttctgaaa atgttacagt gcaaaatgtg ccattagatg ttcctgaaag 3720

accaagtcgc actggacctt tggaactagc aggtagacaa gctgtaagta tctgaaccaa 3780

cactgaggat acatttccac cttatcaatg aatagcttta tgccattgat gttatgatat 3840

catgttaaac tttaaacatt cccccaggta actcagttaa tattatctcc acaactcatc 3900

tgcatctaat ctgttgtttg tatataagta aaataaaaca gttaacctgg actggccctg 3960

caatcttccc ataaaaaagg ccagaccgag ctcctgggct gatcccctgg acctgtccag 4020

cacaagggac tatatgagca gttgacctgg gaaaatctca gtgcaactgc tagttttttt 4080

tccccacctg ggcaagtcat tctatcctct atcgaccaac ggtgccccta tgtggcattt 4140

ggagttagca aaaattacat gaaaggctgg cctgggaacc caggaggcca ggatgtggta 4200

cttaaagctc tcatgtgaaa cctacttgta tgcattctta actaaggtat aaagtactat 4260

atgtgcctca tgcattctga ttgtcaattg agcagttttg ccgactgccc agttacccaa 4320

tgcattgaat gggttgattt acgatctggg tctaagagca atgagtaaaa gggccacatg 4380

ttccttcaat tatttctgtt caagaatttt attcggctga acatcatctg cttttactat 4440

taaggttcaa ccaatttcta agaaacaagc cataatcaaa atgttctggt tctacaattt 4500

tcctactgat agccgtgttt acttttgtgt gcttacaccc ttttctgcta tttaacagga 4560

cagaagcaaa tggttcaaga ttgtgagtaa tcatttttcc tacattgtct cttctctctt 4620

gcgtatatac tatgattgta cagaagattt acatctatgc ttcatgagtc aatgcttcaa 4680

aactattaga aaaacaaaaa tatttcagtt gaccttattt gtgggtgggt ttacctttta 4740

aatggaaatt tcagccatgg gataccagac tacgaaatgc tgatgagcag gggacacttg 4800

tgtacattca aaatcttgac atacagtttg cagctgctga catagaggta ttgtcttgtc 4860

tatctggttg acataaagcc caaactgctt tttttattat attcttggct tataatttat 4920

cacttcttta ctagctttgc tatgttctct gttgcacaaa ctttgcgatt tgttttcaat 4980

gtcttacacc tcttaatttc cacaaggcct tgtatatgag aatttgtaca gggaaggatt 5040

tcatatggct cggaaagaac tcccgtccga gtttccccag tgctgtagat ttccctcttc 5100

atgcgataaa catgacgcta actaataata ctaatatata tatatatata tatatatata 5160

tatatatatt gggcaccact tctgaacggg tgggcgaatg gatgagcaaa agatgcaaca 5220

aagtggggat tatcccgagt ctaaagtgtc atttttatgt aacctatttg tttttttgtt 5280

ttctctgctc tataaagtaa aaaaaaagat ccacttttac tatttttctc tcgatgagac 5340

aatggtacat gtttctctat tgagtgcgcc tttacgtacg cgtttccgct acccactaat 5400

tttgaaagat gtataaattg gaaagaatgt agggagcagt aaaaaagaga aatgttttgt 5460

ttacaggaac atatttgatt ttagaatctg ttttaatctt ttttgtgctt tctgtttcct 5520

aatttttgcc aattttcttg ggctggtgta gttaacactt ttgctataaa gagattaaaa 5580

atattggttc tacaacatca ctttctaccc ctaatttcag tacctaagag aggttgagta 5640

ggtgtaccat actatttgat gcttccttgt tctgccatac ttggacaata acttctaaaa 5700

tggatacgtg catgtcccac tctcttaggt gtccatgttt gctactttct gtgccttatc 5760

tgctcttttt tccagtatca tcaacatact taatgaatat ttatcttgat taccatgttt 5820

acaggagctt atacgtgatg ctttacaact aaattgtatc gctaagccta ttaaccaccc 5880

aacttatgat gatccaaaca atggtgagtg agttttgttt gtaatacctt gcaagtttgc 5940

cacattcagg caatgttctc gaatgcgatt taaaacaatc tgcttccttg tttgtaggaa 6000

aagcatatgc tatattcaaa acaaaaagtg ccgcagactc tgctatttca aaaattaatt 6060

caggcttggt ggtcggtgga aggtatctca ctctgttgct tgcagatttg ctggacgaaa 6120

tttactacta tatatgtgtt catgttgcat ttattgtgct ctgttttaag tggggtcact 6180

gtctgttata gttcacatga tggcatattg tcatctcatt acaaccccaa ctgcagaatt 6240

aagagatctt ttctttagga aagttaaggg aaacttctat tagcaattgg ttggttctat 6300

cttgatacca cctcagggac acattaccac actgcaattg cttattaggc aatttgtcaa 6360

caaaattgca tgtgatgcca tttgcactag ttacttactg ttattatttt tcaaatttct 6420

accgtggatt aaataacaat atgttgttca atatttttgg ttgacccttt ataattctct 6480

tattgaatta tttgcagacc cctttattgc agcaaaggat tgcttaaggt tccaaaacct 6540

tcagaaactc ttctcgggca cttaacaatc aacaatatta gaatgggtat aagacaacga 6600

gaagaacagg tgctgatgtt gtcctatgaa gtttgctcta tttcttttct ctgtcttaat 6660

atttttgcac aaccattatt ctttctccag aagaaggcag tttcaacctc gcattgttct 6720

caacccaata caatggagta tgatttggcc ttggattgga tgcttgtccg agcaaagcaa 6780

gaaacgaaat ttaggacact tcacaaggta tgtgcacttc cactggagat ctctgtgtat 6840

accagctttc agttttatcc atacagacct taaattttga atgctcaatt tatatctata 6900

gaagcataaa gatgagagga agacctttgc gagtaagatg ggaaagtaag tggcttccat 6960

ggatttggtt aagcgatggg aactgtcctg ttccgtgctt atcttggagt cctctactga 7020

gtactgacta tcattcctcg gagctttatg cactttttgc ctgaagcaac acttatctgc 7080

gagtttttct gctgcgcaag aatgaaatgc aacgaccatt tgagggggac aactaactgc 7140

accacactga ctctgctcat gttccgtaga gcattatttt tagaaaggaa agaattgtgc 7200

catagcttaa gaaaccaaag taacattggt agaagtagcc cttgcagcaa gttaggaaag 7260

ccagaggctg ttttaggtta ccccgcacat caatttgatc tcacatggac acatcagtta 7320

gatctgttgc tccatgttag atagcaaatc aacgcgtgcc gtcatgaaat gtgtatgtat 7380

atatttttaa attcatgacc tggctattag ttcattcatg tgactgctta tgtgtcttga 7440

gttacaagtt acaacttgac tccgttcc 7468

Claims

1.一种蛋白质，其特征在于，所述蛋白质是如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：

A1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.1的蛋白质；

2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质来源于水稻。

3.与权利要求1或2所述的蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B7)中的任一种：

B1)编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；

B2)含有B1)所述DNA分子的表达盒；

B6)降低B1)所述DNA分子表达的核酸分子；

4.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于：B1)所述DNA分子为如下b1)或b2)所示的基因：

b1)编码链的编码序列是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子；

b2)编码链的核苷酸是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子。

5.权利要求1或2所述的蛋白质、或权利要求3或4所述生物材料的下述C1-C2中的任一种中的应用也属于本发明的保护范围：

C1)调控分蘖力；

C2)制备调控分蘖力的产品。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述调控分蘖力为提升分蘖力；所述提升分蘖力为增加分蘖数和/或促进分蘖芽伸出。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述调控分蘖力为降低分蘖力；所述降低分蘖力为减少分蘖数和/或抑制分蘖芽伸出；所述降低分蘖力通过促进或提高权利要求1所述蛋白质的编码基因的表达实现。

8.一种提高水稻分蘖力的方法，其特征在于：包括抑制或降低受体水稻中基因的表达，得到分蘖力高于所述受体水稻的目的水稻；所述基因为编码权利要求1所述蛋白质的基因。

9.根据权利要求8的方法，其特征在于：所述抑制或降低受体水稻中基因的表达是通过CRISPR/Cas9***敲除所述受体水稻中所述基因实现的；所述CRISPR/Cas9***包括表达含有Cas9和gRNA的质粒，所述gRNA的靶序列为SEQ ID No.2的第148-167位。

10.植物试剂，其特征在于：所述试剂含有权利要求1或2所述的蛋白质或/和权利要求3或4所述的蛋白质相关的生物材料。