KR102567405B1 - 녹조류 비카르보네이트 수송체 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

녹조류 Cia8 폴리펩티드 및 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 본원에서 제공된다. 또한, 본원에서 제공된 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드 중 1종 이상을 포함하는 형질전환된 세포 및 트랜스제닉 식물이 본원에서 제공된다.

Description

녹조류 비카르보네이트 수송체 및 그의 용도

관련 출원에 대한 상호-참조

이 출원은 발명의 명칭이 "녹조류 비카르보네이트 수송체 및 그의 용도"인 2016년 6월 20일에 출원된 공동-계류중인 미국 가특허 출원 제62/352,278호의 이익 및 그에 대한 우선권을 주장하며, 그의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

서열 목록

이 출원은 2016년 6월 16일에 생성된, 명칭이 222220-2080_ST25.txt인 ASCII.txt 파일로서 전자 형태로 제출된 서열 목록을 함유한다. 서열 목록의 내용은 그 전문이 본원에 포함된다.

녹조류 및 다른 광합성 수생 유기체는 대개 자연 환경에서 낮고 변동하는 CO₂ 조건에 노출된다. 이들 유기체에 대한 CO₂ 이용가능성은 다른 인자 중에서도 물 중에서의 기체의 느린 확산, 2가지 무기 탄소 형태 (CO₂ 및 HCO₃ ^-)의 느린 상호전환 및 pH 변화에 의해 제한될 수 있다. 결과적으로, 거의 모든 수생 광합성 유기체는 루비스코 (Rubisco)에 의한 고정을 위한 무기 탄소 (Ci)를 효과적으로 농축시키기 위해, 제한적 CO₂ 조건 하에서 유도가능한 이산화탄소 농축 메커니즘 (CCM)을 진화시켰다 (Giordano et al., 2005). 녹조류, 클라미도모나스 레인하르드티이 (Chlamydomonas reinhardtii)에 대한 현재의 CCM 모델에서 (Jungnick et al., 2014; Wang and Spalding, 2014), 형질막 및 엽록체 외피 상의 비카르보네이트 수송체는 막을 통한 Ci, 특히 HCO₃ ^-의 이동을 허용하는 CCM의 핵심적 성분인 것으로 생각된다. 다른 CCM 성분은 CO₂ 및 HCO₃ ^-를 상호전환시키는 탄산 탈수효소 효소를 포함할 수 있다 (Mitra et al., 2005; Moroney et al., 2011). 씨. 레인하르드티이 (C. reinhardtii)에서 피레노이드로 지칭되는 구획은 엽록체의 기저에 있다. 피레노이드는 루비스코가 제한적 CO₂ 조건 하에서 격리되는 곳이다 (Kuchitsu et al., 1988; Rawat et al., 1996; Borkhsenious et al., 1998). 틸라코이드 세관 및 미니-세관의 광범위한 네트워크는 피레노이드와 회합되며 (Engel et al., 2015), 이는 아마도 HCO₃ ^-가 피레노이드 내로 진입하는 경로를 제공할 것이다. 탄산 탈수효소 CAH3은 이들 세관에서 발견되며, CAH3이 루멘 내에서 HCO₃ ^-를 고정을 위한 CO₂로 전환시키는 것으로 가설화된다 (Moroney and Ynalvez, 2007).

고 CO₂ 조건 (5％ v/v) 하에서 성장된 씨. 레인하르드티이 세포는 Ci에 대해 저 친화도를 나타낸다. 고 CO₂ 순응된 세포가 저 CO₂ 조건 (0.03％ v/v)에 노출되는 경우, 고 친화도 수송체의 유도가 보고되었다. CO₂는 세포에서 막을 가로질러 용이하게 확산될 것인 반면 (Gutknecht et al., 1977), 수많은 연구는 그 이래로 저 CO₂ 세포에서 루비스코에 의한 고정의 점으로의 Ci (특히 HCO₃ ^-)의 이동을 용이하게 하는 활성 수송 시스템에 대한 필요를 확립하였다 (Moroney et al., 1987; Sueltemeyer et al., 1988; Badger et al., 1994; Ohnishi et al., 2010). 또한, 분자적 및 생리학적 연구는 또한 세포의 형질막 및 엽록체 외피 상의 다중 형태의 Ci 수송체의 발생을 확인하였다 (Amoroso et al., 1998; Duanmu et al., 2009; Atkinson et al., 2015; Gao et al., 2015; Yamano et al., 2015). 해양 시아노박테리아에서, 형질막에서의 HCO₃ ^- 수송은 대개 높은 외부 Na⁺ 이온 농도와 커플링된다. 클라미도모나스 (Chlamydomonas)가 발견되는 담수 환경에서, 수송은 Na⁺가 상대적으로 낮기 때문에 H⁺-커플링된 것으로 생각된다 (Morth et al., 2011; Taylor et al., 2012). 결과적으로, 씨. 레인하르드티이 및 볼복스 카르테리 (Volvox carteri)로의 게놈 연구는 적어도 술페이트 및 포스페이트에 대해 H⁺- 및 Na⁺-커플링된 수송체 둘 다의 존재를 밝혀내었다 (Pootakham et al., 2010). 이들 분자 성분이 또한 비카르보네이트 흡수에 대해 발생하는지 여부는 아직 명확하지 않다.

지금까지, 씨. 레인하르드티이에서 2종의 고 및 1종의 저 친화도 비카르보네이트 수송 단백질이 특징화되어 있으며, 저 CO₂ 조건 하에서 기능적인 것으로 공지되어 있다. 첫째로, 고 광 활성화된 단백질 (HLA3)은 형질막에 국재화된 다중-약물 저항성 (Multi-Drug Resistance) 단백질 패밀리의 ATP-결합 카세트 (ABC)-유형 수송체이다 (Im and Grossman, 2002). Hla3 전사체는 고 광 및 저 CO₂ 조건 둘 다에 의해 유도되며, Cia5 유전자에 의해 코딩되는 CCM1 '마스터 조절제'에 의해 제어된다. 문헌 [Duanmu et al., (2009)]은 HLA3 RNAi 넉다운 돌연변이체에서, Ci 친화도 및 Ci 흡수의 유의한 감소를 보였으며, 이는 HCO₃ ^- 수송에 있어서의 단백질의 역할을 뒷받침한다. 둘째로, 수송체 LCI1은 데이터베이스에서 다른 막횡단 단백질과 거의 상동성을 갖지 않는 상대적으로 작은 단백질이다. LCI1은 저 CO₂ 조건 상에서 강하게 상향조절되며, 형질막에 국재화되었다 (Ohnishi et al., 2010). LCI1로의 연구에서, 저자들은 또한 Lcr1 (MYB-전사 인자가 결여된 클라미도모나스 균주) 배경에서 LCI1 단백질을 과다발현시킴으로써 증가된 Ci 흡수를 확인하였다. 따라서, HLA3 및 LCI1은 형질막 상에 위치한 Ci 수송체인 것으로 생각된다.

제3 수송체, NAR1.2 (LCIA로도 공지됨)는 포르메이트/니트라이트 수송체 패밀리의 엽록체 외피 단백질이다. NAR1.2 단백질은 mM 범위에 해당하는 K_(0.5) 값에서 밝혀진 바와 같이 비카르보네이트에 대해 보다 낮은 친화도를 갖지만, 증가된 HCO₃ ^- 흡수는 크세노푸스 라에비스 (Xenopus laevis) 난모세포에서, NAR1.2가 그들 세포에서 발현되는 경우 관찰된다 (Mariscal et al., 2006; Atkinson et al., 2015). NAR1.2는 비록 이를 뒷받침하는 직접적 증거는 없지만, 지금까지 엽록체 외피 상의 Ci 흡수로 인한 것이었다. NAR1.2 단백질은 Ci 흡수에 있어서 중요한 역할을 하는 반면, 이는 또한 조절 기능을 가질 수 있다. 이는 Hla3 전사체가 NAR1.2 단백질의 부재 하에서 축적되지 않았던 최근의 연구로부터 생기며, 따라서, 저자들은 이들 단백질이 비카르보네이트 축적에 있어서 협력함을 시사한다 (Yamano et al., 2015). 엽록체 내로의 또다른 제안된 비카르보네이트 경로에서, NAR1.2는 가용성 단백질 LCIB와 회합되는 것으로 보인다 (Wang and Spalding, 2014).

2가지 가용성 단백질 (LCIB/LCIC)은 복합체를 형성하며, 이들이 세포가 저 CO₂에 순응되는 경우 피레노이드와 가깝게 회합할 것이라는 관찰 후에, 피레노이드로부터 누출되는 CO₂의 재포획에 관여하는 것으로 생각된다 (Yamano et al., 2010; Wang et al., 2011). 현재는 미토콘드리아성인 것으로 확인된 (Atkinson et al., 2015) 다른 추정상의 수송체 CCP1 및 CCP2는 아직 해결되어야 한다. 모든 이런 관점에서, 클라미도모나스에서의 Ci 수송 시스템은 CCM의 보다 양호한 이해를 갖기 위해 규명되어야 할 것으로 남아 있음이 명백하다.

본 개시내용의 추가의 측면은 첨부된 도면과 함께 취해지는 경우, 하기 기재된 그의 다양한 실시양태의 상세한 설명의 검토 시 용이하게 이해될 것이다.
도 1A 내지 1C는 (도 1A) 고 CO₂ (공기 중 5％ CO₂) 및 (도 1B) 저 CO₂ (공기 중 0.01％ CO₂) pH 7.3에서의 씨. 레인하르드티이 균주의 성장에 대한 스폿 시험으로부터의 결과를 입증하는 화상을 나타낸다. 균주는 야생형 D66, Cia8 돌연변이체 및 대조군으로서 사용된 3가지 공지된 CCM 돌연변이체 Cia6, Cia5 및 Cia3을 포함한다. 좌측의 수는 0.15의 초기 OD₇₃₀ (약 1.5 x 10⁶ 세포) 및 2회의 일련 희석을 나타낸다. 도 1C는 액체 배양 (MIN)에서의 야생형 균주 D66 및 cia8 돌연변이체의 성장을 입증하는 그래프를 나타낸다. 배양물을 저 CO₂ (0.01 내지 0.025％)로 블로잉하는 에른마이어 플라스크에서 성장시켰다. 값은 평균 ± SE (n=4)로서 표현된다.
도 2A 내지 2B는 (도 2A) AphVIII 삽입의 위치를 나타내는 Cia8 유전자 좌위 (ID:Cre09.g395700)의 게놈 구조를 나타낸다. 녹색 막대, 공간 및 오렌지색 막대는 각각 엑손, 인트론 및 비번역된 영역을 나타낸다. 도 2B는 cia8 유전자의 엑손 10에서의 AphVIII 삽입의 확인을 입증하는 대표적인 겔의 화상을 나타낸다. 제1 레인 D66은 카세트가 없는 대조군 게놈 DNA이고, 다른 3개는 cia8 게놈 DNA이다. 레인 2는 삽입의 3'말단을 나타내고, 레인 3은 삽입의 5'말단을 나타낸다. 레인 4는 유전자에서의 프라이머 쌍을 사용하여 카세트에 플랭킹된 게놈 영역을 포함하는 전체 삽입 영역에 걸친다.
도 3은 역전사효소 PCR에 대한 주형으로서 고 및 저 CO₂ 성장된 세포로부터의 폴리 (A) RNA를 사용한 D66 및 Cia8 돌연변이체 균주의 RT-PCR 분석을 나타낸다. Cia8에 대해, 표 2에 나타낸 프라이머는 cDNA로부터의 1,500 bp 생성물을 증폭시킨다. 베타 액틴을 로딩 대조군으로서 사용하였다.
도 4는 예르시니아 프레데리크세니이 (Yersinia frederiksenii) SLC4와의 정렬에 기초한 CIA8에 대한 위상 모델 예측을 나타낸다. 회색 박스는 가변적 길이의 루프에 의해 연결된 추정상의 막 스패닝 나선이다. 잔기의 62％를 >90％ 신뢰 수준에서 모델링하였다. 예측을 PHYRE2에 의해 생성하였다 (Kelley et al., 2015).
도 5A 내지 5C는 씨. 레인하르드티이 야생형 및 Cia8 돌연변이체에서의 Ci-의존적 광합성 산소 방출을 나타낸다. A, pH 7.3에서 검정된 고 CO₂-성장된 세포 및 B, 저 CO₂-성장된 세포; C, pH 9.0에서 검정된 저 CO₂-성장된 세포. 세포를 고 CO₂에서 성장시키고, 저 CO₂로 4시간 동안 옮겼다. 도 5A 및 5B에서의 삽입체는 K_(0.5)의 측정에 사용된 500 μM 미만의 보다 낮은 농도를 나타낸다. 도 5C는 pH 9.0에서 검정된 저 CO₂-성장된 세포로부터의 결과를 입증하는 그래프를 나타낸다. 세포를 고 CO₂에서 성장시키고, 저 CO₂로 약 4시간 동안 옮겼다. 각각의 점은 3회의 별개의 실험의 평균 및 표준 오차를 나타낸다.
도 6A 내지 6G는 (도 6A 내지 6F) 키메라 단백질의 국재화를 나타내는 CIA8-GFP 형질전환체 세포의 라이브 영상을 나타낸다. 상부 패널은 wt D66 균주이고, 하부 패널은 CIA8:CrGFP로 형질전환된 D66 균주이다. 세포를 MIN 플레이트 상에서 성장시키고, 하기 광의 파장을 사용하여 공초점 현미경으로 관찰하였다: 410 내지 470 nm에서 차등 간섭 콘트라스트 (Differential Interference Contrast)- GFP:형광; 600 내지 700 nm에서 엽록소 자가-형광. 막대는 4.69 μm에 상응한다; 도 6G는 융합된 CIA8:CrGFP 단백질로 형질전환된 Cia8 돌연변이체 균주의 RT-PCR 분석의 결과를 나타낸다. 분석을 역전사효소 PCR에 대한 주형으로서 저 CO₂ 성장된 세포로부터의 폴리 (A) RNA를 사용하여 수행하였다. 표 2에 나타낸 프라이머는 cDNA로부터의 GFP 전사체 (710 bp)를 증폭시킨다.
도 7A 내지 7C는 야생형 (도 7A) 및 cia8 돌연변이체 (도 7B) 균주에서의 고 및 저 CO₂ 조건 하에서의 Ci 수송체 유전자에 대한 정량적 RT-PCR 결과를 입증하는 그래프를 나타낸다. 야생형 D66 세포를 고 CO₂ 하에서 48시간 동안 성장시킨 후, 저 CO₂ 순응으로 4시간 동안 처리하였다. Cia8 유전자의 결여는 SBF 패밀리에서의 다른 CCM 수송체 및 2가지 다른 유전자의 하향-조절을 유발한다 (도 7C). cblp 유전자를 내부 대조군으로서 사용하였다. 상대적 발현 수준은 1000/2^ΔCt로서 표현되며, 여기서, ΔCt= Ct_유전자 - Ct_cblp이다_.
도 8A 내지 8D는 (도 8A) 상보화된 Cia8 균주, com1 및 com2의 성장 표현형을 입증하는 화상의 패널을 나타낸다. 이들 균주는 본원에 기재된 바와 같이 Cia8 돌연변이체 내로 재도입된 야생형 Cia8 유전자를 가졌다. 도 8B는 상보화된 균주에서의 Cia8 전사체의 복원을 나타내는 RT-PCR 분석의 결과를 입증하는 그래프를 나타낸다. GAPDH를 로딩 대조군으로서 사용하였다. 도 8C는 pH 9.0에서의 야생형, D66, 및 1종의 상보화된 균주, com1에 대한 산소 방출을 입증하는 그래프 (도 8C)를 나타낸다. 각각의 점은 3회의 별개의 실험의 평균 및 표준 오차를 나타낸다. 도 8D는 도 8C에 제시된 데이터의 비카르보네이트 농도 (0 내지 500 μM)의 하단의 확대도를 나타낸다.
도 9는 고등 식물 및 다른 녹조식물로부터의 다른 SBF 수송체와의 CIA8 1차 단백질 서열의 클러스탈 오메가 (Clustal Omega) 정렬을 나타낸다. 종의 목록 및 그들의 NCBI 또는 피토좀 (Phytozome)에서의 수탁 번호: 모노라피디움 네글렉툼 (Monoraphidium neglectum) XP_013904301.1; 모노라피디움 네글렉툼, XP_013896513.1 코코믹사 서브엘립소이데아 (Coccomyxa subellipsoidea) C-169] XP_005649764.1 피세아 시첸시스 (Picea sitchensis), ABR16540.1 무사 아쿠미나타 (Musa acuminata) 아종 말라켄시스 (Malaccensis), XP_009404829.1 네룸보 누시페라 (Nelumbo nucifera), XP_010271688.1 비티스 비니페라 (Vitis vinifera), XP_002266805.1 시트러스 시넨시스 (Citrus sinensis), XP_006485208.1 소르굼 비콜로르 (Sorghum bicolor), XP_002440278.1, 포풀루스 유프라티카 (Populus euphratica) XP_011032852.1, 볼복스 카르테리 품종 나가리엔시스 (Volvox carteri f. nagariensis), XP_002955170.1 볼복스 카르테리, 좌위 명칭 Vocar.0008s0179; 오스트레오코쿠스 루시마리누스 (Ostreococcus lucimarinus) 좌위 명칭 gwEuk.2.273.1;
도 10은 100 mM NaCl이 있는 및 없는 MIN 플레이트 상에서의 클라미도모나스의 야생형 D66 및 CIA8 돌연변이체 세포의 성장을 나타낸다. 15 μL의 활발하게 성장하는 세포 배양물을 각각의 스폿에서 접종하고, 7일 동안 성장시켰다. (OD₇₃₀=0.15 내지 1.5x10⁶ 세포). Na⁺가 첨가된 경우 어느 균주에서도 성장의 차이는 관찰되지 않았다.
도 11A 내지 11B는 야생형 (WT) D66에서의, cia8 돌연변이체에서의, 및 상보화된 세포주 com1에서의 ¹⁴C 14C의 축적을 입증하는 그래프를 나타낸다. 세포를 상승된 CO₂ (3％ v/v CO₂) 상에서 성장시키고, 저 CO₂에 순응시켰다. 분석을 pH 9.0에서 수행하였다. (도 11B) CO₂ 고정된 및 (도 11A) 풀에 잔류하는 CO₂. 통계적 분석을 터키 (Tukey's) HSD 검정에 의해 수행하였다. 상이한 문자는 평균이 P=0.01에서 유의하게 상이함을 나타낸다.

본 개시내용을 보다 상세히 설명하기 전에, 이 개시내용은 기재된 특정 실시양태에 제한되지 않으며, 따라서, 물론 다양할 수 있음이 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 설명하는 목적을 위한 것이며, 제한인 것으로 의도되지 않음이 이해되어야 한다.

다양한 값이 제공되는 경우, 맥락이 명백하게 달리 나타내지 않는다면 하한의 단위의 1/10까지의, 그 범위의 상한 및 하한 사이의 각각의 개재하는 값, 및 그 언급된 범위에서의 다른 언급된 또는 개재하는 값은 본 개시내용 내에 포괄됨이 이해된다. 이들 보다 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 보다 작은 범위에 포함될 수 있으며, 또한 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 제외된 한계를 조건으로 본 개시내용 내에 포괄된다. 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 그들 포함된 한계 중 어느 하나 또는 둘 다를 제외하는 범위는 또한 본 개시내용에 포함된다.

달리 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 이 개시내용이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 등가의 임의의 방법 및 물질은 또한 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 이제 기재된다.

이 명세서에 인용된 모든 간행물 및 특허는 각각의 개별적 간행물 또는 특허가 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 지시된 것처럼 본원에 참조로 포함되며, 그와 관련하여 간행물이 인용하는 방법 및/또는 물질을 개시하고 기재하기 위해 본원에 참조로 포함된다. 임의의 간행물의 인용은 출원일 전에 그의 개시내용에 대한 것이며, 본 개시내용이 이전의 개시내용에 의해 이러한 간행물을 선행하도록 자격이 주어지지 않는다는 인정으로서 해석되지 않아야 한다. 또한, 제공된 간행물의 날짜는 독립적으로 확인될 필요가 있을 수 있는 실제 간행 날짜와는 상이할 수 있다.

이 개시내용을 읽을 때 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것인 바와 같이, 본원에 기재되고 예시된 개별적 실시양태의 각각은 본 개시내용의 범위 또는 정신으로부터 벗어나지 않고 다른 몇몇 실시양태 중 임의의 것의 특색으로부터 용이하게 분리되거나, 그와 조합될 수 있는 별개의 성분 및 특색을 갖는다. 임의의 인용된 방법은 인용된 사건의 순서로 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 수행될 수 있다.

본 개시내용의 실시양태는 달리 지시되지 않는다면 관련 기술분야의 기술 내에 있는 분자 생물학, 미생물학, 나노공학, 유기 화학, 생화학, 식물학 등의 기법을 채용할 것이다. 이러한 기법은 문헌에 충분히 설명되어 있다.

정의

개시된 요지를 설명하는 데 있어서, 하기 용어는 하기 제시된 정의에 따라 사용될 것이다.

본원에 사용된 바와 같은 "약", "대략" 등은, 수치 변수와 함께 사용되는 경우, 일반적으로 변수의 값을 및 실험적 오차 내에 있는 (예를 들어, 평균에 대해 95％ 신뢰 구간 내에 있는) 또는 지시된 값의 +-10％ 내에 있는 (어느 것이든 더 큰 것) 변수의 모든 값을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 일반적으로 적어도 2개의 염기-당-포스페이트 조합의 스트링을 지칭하며, 다른 것들 중에서도, 단일- 및 이중-가닥 DNA, 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 및 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일-가닥이거나, 보다 전형적으로, 이중-가닥 또는 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 혼성체 분자를 지칭한다. 또한, 본원에 사용된 바와 같은 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA 또는 RNA 및 DNA 둘 다를 포함하는 삼중-가닥 영역을 지칭한다. 이러한 영역에서의 가닥은 동일한 분자로부터의 것 또는 상이한 분자로부터의 것일 수 있다. 영역은 분자 중 1개 이상의 모두를 포함할 수 있지만, 보다 전형적으로 단지 분자 중 일부의 영역을 포함한다. 삼중-나선 영역의 분자 중 하나는 대개 올리고뉴클레오티드이다. "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 또한 그 중에서도 폴리뉴클레오티드의 이러한 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태, 뿐만 아니라 단순한 및 복잡한 세포를 비롯한 바이러스 및 세포의 DNA 및 RNA 특징의 화학적 형태를 포괄한다. 예를 들어, 용어 폴리뉴클레오티드는 1개 이상의 변형된 염기를 함유하는 상기 기재된 바와 같은 DNA 또는 RNA를 포함한다. 따라서, 비통상적인 염기, 예컨대 이노신, 또는 변형된 염기, 예컨대 트리틸화된 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA는, 단지 2개의 예를 명명하기 위해, 용어가 본원에 사용된 바와 같이 폴리뉴클레오티드이다. "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 또한 PNA (펩티드 핵산), 포스포로티오에이트, 및 천연 핵산의 포스페이트 골격의 다른 변이체를 포함한다. 천연 핵산은 포스페이트 골격을 가지며, 인공 핵산은 다른 유형의 골격을 함유할 수 있지만, 동일한 염기를 함유한다. 따라서, 안정성을 위해 또는 다른 이유로 변형된 골격을 갖는 DNA 또는 RNA는 용어가 본원에서 의도된 바와 같이 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"이다.

본원에 사용된 바와 같은 "데옥시리보핵산 (DNA)" 및 "리보핵산 (RNA)"은 일반적으로 비변형된 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 지칭한다. RNA는 tRNA (운반 RNA), snRNA (소핵 RNA), rRNA (리보솜 RNA), mRNA (전령 RNA), 안티-센스 RNA, RNAi (RNA 간섭 구축물), siRNA (짧은 간섭 RNA), 또는 리보자임의 형태일 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 "핵산 서열" 및 "올리고뉴클레오티드"는 또한 상기 정의된 바와 같은 핵산 및 폴리뉴클레오티드를 포괄한다.

본원에 사용된 바와 같은 "데옥시리보핵산 (DNA)" 및 "리보핵산 (RNA)"은 일반적으로 비변형된 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 지칭한다. RNA는 tRNA (운반 RNA), snRNA (소핵 RNA), rRNA (리보솜 RNA), mRNA (전령 RNA), 안티-센스 RNA, RNAi (RNA 간섭 구축물), siRNA (짧은 간섭 RNA), 또는 리보자임의 형태일 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 "유전자"는 염색체 상의 특정 위치를 점유하고, 유기체에서의 특징(들) 또는 소질(들)에 대한 유전적 지시를 함유하는 DNA의 서열에 상응하는 유전 단위를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 "좌위"는 주어진 유전자 또는 그의 부분이 주어진 종의 염색체 상에 점유하는 위치를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 "대립유전자(들)"는 유전자의 1개 이상의 대안적 형태 중 임의의 것을 지시하며, 여기서, 대립유전자는 적어도 1개의 소질 또는 특징과 관련된다. 이배체 세포 또는 유기체에서, 주어진 유전자의 2개의 대립유전자는 한 쌍의 상동성 염색체 상의 상응하는 좌위를 점유한다. 용어 "이형접합성"은 유기체 또는 세포가 상동성 염색체 상의 상응하는 좌위에 상이한 대립유전자를 갖는 유전적 상태를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 "동형접합성"은 유기체 또는 세포가 상동성 염색체 상의 상응하는 좌위에 동일한 대립유전자를 갖는 유전적 상태를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "외인성 DNA" 또는 "외인성 핵산 서열" 또는 "외인성 폴리뉴클레오티드"는 형질감염을 통해 세포, 유기체, 또는 소기관 내로 도입된 핵산 서열을 지칭한다. 외인성 핵산은 외부 공급원으로부터 기원하며, 예를 들어, 외인성 핵산은 또다른 세포 또는 유기체로부터의 것일 수 있고/거나, 이는 합성 및/또는 재조합일 수 있다. 외인성 핵산은 때로 상이한 유기체 또는 종으로부터 기원하는 반면, 이는 또한 동일한 종으로부터 기원할 수 있다 (예를 들어, 자연 발생 핵산에 추가로 또는 그에 대한 대체로서 세포 또는 유기체 내로 도입된 핵산의 여분의 카피 또는 재조합 형태). 전형적으로, 도입된 외인성 서열은 재조합 서열이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "재조합"은 일반적으로 비-자연 발생 핵산, 핵산 구축물, 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 이러한 비-자연 발생 핵산은 변형된, 예를 들어 결실, 치환, 전도, 삽입 등을 갖는 천연 핵산, 및/또는 분자 생물학 기술을 사용하여 결합된 상이한 기원의 핵산 서열의 조합 (예를 들어, "융합 단백질" (예를 들어, 2종의 상이한 단백질 또는 단백질 단편의 조합으로부터 형성된 단백질 또는 폴리펩티드)을 코딩하는 핵산 서열, 코딩 서열 및 프로모터 서열이 상이한 공급원으로부터의 것이거나, 다르게는 전형적으로 자연적으로 함께 발생하지 않는 프로모터 서열에 대한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 조합 (예를 들어, 핵산 및 구성적 프로모터) 등)을 포함할 수 있다. 재조합은 또한 재조합 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 지칭한다. 비-자연 발생 핵산 또는 폴리펩티드는 사람에 의해 변형된 핵산 및 폴리펩티드를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "형질감염"은 세포의 시토졸 뿐만 아니라 미토콘드리아, 핵, 또는 엽록체의 내부 공간 내로의 핵산 서열의 도입을 비롯한, 살아있는 세포의 막으로 둘러싸인 공간의 내부 내로의 외인성 및/또는 재조합 핵산 서열의 도입을 지칭한다. 핵산은 네이키드 DNA 또는 RNA의 형태일 수 있거나, 이는 다양한 단백질 또는 조절 요소 (예를 들어, 프로모터 및/또는 신호 요소)와 회합할 수 있거나, 핵산은 벡터 또는 염색체 내로 혼입될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 "형질전환" 또는 "형질전환된"은 도입된 핵산의 코딩 부분의 발현을 허용하도록 하는 방식으로 세포 내로의 핵산 (예를 들어, DNA 또는 RNA)의 도입을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 "형질전환된 세포"는 핵산 서열로 형질감염된 세포이다.

본원에 사용된 바와 같은 "트랜스진"은 유기체, 예컨대 박테리아 또는 식물의 세포를 형질전환시키는 데 사용되는 인공 유전자를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 "트랜스제닉"은 트랜스진을 함유하는 세포, 조직, 또는 유기체를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 아미노산 잔기 서열로서이다. 그러한 서열은 좌측에서 우측으로 아미노에서 카르복시 말단 방향으로 쓰여진다. 표준 명명법에 따라, 아미노산 잔기 서열은 하기와 같이 지시된 바와 같이 3문자 또는 단일 문자 코드 중 어느 하나에 의해 명명된다: 알라닌 (Ala, A), 아르기닌 (Arg, R), 아스파라긴 (Asn, N), 아스파르트산 (Asp, D), 시스테인 (Cys, C), 글루타민 (Gln, Q), 글루탐산 (Glu, E), 글리신 (Gly, G), 히스티딘 (His, H), 이소류신 (Ile, I), 류신 (Leu, L), 리신 (Lys, K), 메티오닌 (Met, M), 페닐알라닌 (Phe, F), 프롤린 (Pro, P), 세린 (Ser, S), 트레오닌 (Thr, T), 트립토판 (Trp, W), 티로신 (Tyr, Y), 및 발린 (Val, V).

본원에 사용된 바와 같은 "펩티드"는 단백질 또는 폴리펩티드에 비해 짧은 적어도 2개의 아미노산의 쇄를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 "변이체"는 참조 폴리펩티드와는 상이하지만, 필수적인 특성을 보유하는 폴리펩티드를 지칭한다. 폴리펩티드의 전형적인 변이체는 또다른 참조 폴리펩티드와는 아미노산 서열에 있어서 상이하다. 일반적으로, 차이는 참조 폴리펩티드 및 변이체의 서열이 전체적으로 가깝게 유사하고, 많은 영역에서 동일하도록 제한된다. 변이체 및 참조 폴리펩티드는 1개 이상의 변형 (예를 들어, 치환, 부가, 및/또는 결실)에 의해 아미노산 서열에 있어서 상이할 수 있다. 치환되거나 삽입된 아미노산 잔기는 유전 암호에 의해 코딩된 것일 수 있거나, 그렇지 않을 수 있다. 폴리펩티드의 변이체는 자연 발생, 예컨대 대립유전자 변이체일 수 있거나, 이는 자연적으로 발생하는 것으로 공지되지 않은 변이체일 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 "기능적 변이체"는 원래의 단백질 또는 폴리펩티드와 동일한 기능 또는 활성을 수행할 수 있지만, 반드시 동일한 수준으로는 아닌 (예를 들어, 변이체는 그것이 기본적인 기능을 보유하는 한, 향상되거나, 감소되거나, 변화된 기능성을 가질 수 있음) 단백질 또는 폴리펩티드의 변이체 (예를 들어, Cia8 단백질의 변이체)를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 "동일성"은 서열을 비교함으로써 측정된 바와 같은 2개 이상의 폴리펩티드 서열 또는 뉴클레오티드 사이의 관계를 지칭할 수 있다. 관련 기술분야에서, "동일성"은 또한 이러한 서열의 스트링 사이의 매치에 의해 측정된 바와 같은 폴리펩티드 사이의 서열 관련성의 정도를 지칭한다. "동일성"은 문헌 [Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., Ed., Oxford University Press, New York, 1988]; [Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., Ed., Academic Press, New York, 1993]; [Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., Eds., Humana Press, New Jersey, 1994]; [Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987]; 및 [Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., Eds., M Stockton Press, New York, 1991]; 및 [Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math. 1988, 48: 1073]에 기재된 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는 공지된 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다. 동일성을 측정하는 바람직한 방법은 시험되는 서열 사이의 가장 큰 매치를 제공하도록 설계된다. 동일성을 측정하는 방법은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램에서 코드화된다. 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 문헌 [Needelman and Wunsch, (J. Mol. Biol., 1970, 48: 443-453)]을 포함하는 분석 소프트웨어 (예를 들어, 미국 위스콘신주 매디슨의 지네틱스 컴퓨터 그룹 (Genetics Computer Group)의 서열 분석 소프트웨어 패키지 (Sequence Analysis Software Package), 알고리듬 (예를 들어, NBLAST, 및 XBLAST)을 사용함으로써 측정될 수 있다. 디폴트 파라미터는 본 개시내용의 폴리펩티드에 대한 동일성을 측정하는 데 사용된다.

본원에 사용된 바와 같은 "내성인" 또는 "내성"은 환경적 스트레스 또는 다른 제한적 인자의 해로운 효과를 완전히 또는 어느 정도로 극복하는 식물의 능력을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 본원에 사용된 바와 같은 "발현"은 폴리펩티드를 생산하는 구조적 유전자에 의해 겪게 되는 프로세스를 기재한다. 이는 전사 및 번역의 조합이다. 발현은 RNA 분자를 생산하는 핵산의 "발현"을 지칭하지만, 이는 폴리펩티드가 상응하는 핵산의 발현을 통해 생산되고 있음을 나타내는 폴리펩티드의 "발현"을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 "과다-발현" 및 "상향-조절"은 실질적으로 유사한 조건 하에서 "야생형" 식물 세포 (예를 들어, 유전자로 형질감염되지 않은 실질적으로 등가의 세포)보다 더 높은 수준에서의 형질전환된 식물 세포에서의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 (예를 들어, 유전자)의 발현 (따라서, 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 증가된 양을 생성함)을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 "하위-발현" 및 "하향-조절"은 야생형 식물 세포에서보다 더 낮은 수준에서의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 유전자)의 발현 (폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 감소된 양을 생성함)을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 유전자의 발현을 "억제하다" 또는 "억제하는"은 전사, 번역 및/또는 유전자의 발현에서의 다른 프로세싱 단계를 (완전히 또는 부분적으로) 감소시키거나 방지하도록 작용함으로써, 유전자 발현을 하향-조절하여, 야생형에 비해 유전자에 의해 코딩되는 활성 단백질의 감소된 양이 생성되도록 하는 무언가 (예를 들어, 안티센스 뉴클레오티드, 서프레서, 길항제 등)를 나타낸다.

본원에 사용된 바와 같이, 본원에 사용된 바와 같은 "플라스미드"는 플라스미드가 숙주 세포에서 복제되도록 무손상 "레플리콘"을 포함하는 비-염색체성 이중-가닥 DNA 서열을 지칭할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 세포 내로 외인성 핵산 서열을 도입하는 데 사용되는 비히클에 관하여 사용될 수 있다. 벡터는 선형 또는 원형 (예를 들어 플라스미드)의 DNA 분자를 포함할 수 있으며, 이는 숙주 세포 또는 숙주 세포 소기관 내로의 도입 시, 그의 전사 및 번역을 제공하는 추가의 절편에 작동가능하게 연결된 관심의 폴리펩티드를 코딩하는 절편을 포함한다. 이러한 추가의 절편은 프로모터 및 종결자 서열을 포함할 수 있으며, 또한 1개 이상의 복제 원점, 1개 이상의 선별가능한 마커, 인핸서, 폴리아데닐화 신호 등을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 효모 또는 박테리아 게놈 또는 플라스미드 DNA, 또는 바이러스 DNA로부터 유래되거나, 둘 다의 요소를 함유할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 "프로모터"는 코딩 서열의 전사를 유도할 수 있는 모든 서열을 포함한다. 특히, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "프로모터"는 일반적으로 시작 코돈에 근접하여 위치한 유전자의 5' 조절 영역으로서 기재된 DNA 서열을 지칭한다. 인접하는 코딩 서열(들)의 전사는 프로모터 영역에서 개시된다. 용어 "프로모터"는 또한 유전자의 전사를 개시하는 데 있어서 기능적인 프로모터의 단편을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 "작동가능하게 연결된"은 핵산의 코딩 서열의 발현에 유용한 조절 서열이 코딩 서열의 발현을 시행하도록 코딩 서열에 대해 적절한 위치에서의 핵산 분자에 놓이는 것일 수 있다. 이 동일한 정의는 때로 발현 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 폴리펩티드에서의 코딩 서열 및 전사 제어 요소 (예를 들어 프로모터, 인핸서, 및 종결 요소), 및/또는 선별가능한 마커, 및/또는 다른 기능적 서열의 배열에 적용된다.

본원에 사용된 바와 같은 "선별가능한 마커"는 그의 발현이 마커 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 세포를 확인하는 것을 허용하는 유전자를 지칭한다. 예를 들어, 재조합 핵산은 선별가능한 마커의 발현이 관심의 유전자를 갖는 세포의 성공적인 형질전환을 나타내도록, 관심의 유전자 및 프로모터에 작동가능하게 연결된 선별가능한 마커를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 "구성적 프로모터"는 그의 연관된 유전자 또는 폴리뉴클레오티드의 거듭되는 또는 편재적인 전사를 허용하는 프로모터이다. 구성적 프로모터는 일반적으로 세포 또는 조직 유형, 시간, 또는 환경에 의해 비조절된다.

본원에 사용된 바와 같은 "유도성 프로모터"는 물질 또는 화합물 (예를 들어 항생제, 또는 금속), 환경적 조건 (예를 들어 온도), 발달 단계, 또는 조직 유형에 반응하여 그의 연관된 유전자 또는 폴리뉴클레오티드의 전사를 허용하는 프로모터이다.

본원에 사용된 바와 같은 "야생형"은 자연 또는 선택적 교배 또는 트랜스진으로의 형질전환으로부터 초래될 수 있는 돌연변이체 형태로부터 구별되는 바와 같이, 그것이 자연에서 또는 한정된 집단에서 발생하는 바와 같은 유기체, 변종, 균주, 유전자, 단백질, 또는 특징의 전형적인 또는 평균 형태를 지칭할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 "전기천공"은 고 농도의 플라스미드 DNA (외인성 DNA를 함유함)를 숙주 세포 원형질체의 현탁액에 첨가하고, 약 200 내지 600 V/cm의 전기장으로 충격을 가하는 형질전환 방법이다.

본원에 사용된 바와 같은 "단리된"은 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체, 또는 그의 단편이 자연에서 정상적으로 회합되는 세포 및 다른 구성요소로부터 분리됨을 의미한다. 이 개시내용의 한 측면에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 그것이 그의 천연 또는 자연 환경에서, 예를 들어, 염색체 상에서 정상적으로 회합되는 3' 및 5' 인접한 뉴클레오티드로부터 분리된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체, 또는 그의 단편은 그것을 그의 자연 발생 대응물로부터 구별하기 위해 "단리"를 요구하지 않는다. 또한, "농축된", "분리된" 또는 "희석된" 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체, 또는 그의 단편은 농도 또는 부피 당 분자의 수가 그의 자연 발생 대응물의 그것보다 더 크게 "농축되거나" 더 적게 "분리되는" 점에서 그의 자연 발생 대응물로부터 구별가능하다. 그의 1차 서열에서 또는 예를 들어, 그의 글리코실화 패턴에 의해 자연 발생 대응물과는 상이한 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체, 또는 그의 단편은 그의 단리된 형태에 존재할 필요는 없는데, 이는 그것이 그의 1차 서열에 의해, 또는 대안적으로, 또다른 특징, 예컨대 글리코실화 패턴에 의해 그의 자연 발생 대응물로부터 구별가능하기 때문이다. 본원에 개시된 실시양태의 각각에 대해 명백히 언급되지는 않지만, 하기 및 적절한 조건 하에서 개시된 조성물의 각각에 대한 상기 실시양태의 모두는 이 개시내용에 의해 제공됨이 이해되어야 한다. 따라서, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드는 단리된 자연 발생 폴리뉴클레오티드로부터의 별개의 실시양태로서 제공된다. 박테리아 세포에서 생산된 단백질은 그것이 자연에서 생산되는 진핵생물 세포로부터 단리된 자연 발생 단백질로부터의 별개의 실시양태로서 제공된다.

본원에 사용된 바와 같은 "cDNA"는 세포에서 RNA 전사체에 상보적인 DNA 서열을 지칭한다. 이는 사람에 의해 제조된 분자이다. 전형적으로, cDNA는 주형으로서 RNA 전사체를 사용하여 역전사효소로 지칭되는 효소에 의해 시험관내에서 제조된다.

본원에 사용된 바와 같은 "정제된"은 자연 환경에 비해 증가된 순도를 갖는 핵산 서열, 펩티드, 또는 폴리펩티드에 관하여 사용된다.

본원에 사용된 바와 같은 "대조군"은 비교 목적을 위한 실험에 사용되고, 독립적인 변수 이외의 변수의 효과를 최소화하거나 구별하기 위해 포함되는 대안적 대상체 또는 샘플이다. "대조군"은 양성 또는 음성일 수 있다.

화학적 화합물, 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체, 또는 그의 단편을 포함하나 이에 제한되지 않는 분자, 화합물, 또는 조성물의 양에 관하여 사용되는 본원에 사용된 바와 같은 "농축된"은 샘플이 농도 또는 부피 당 분자의 수가 그의 자연 발생 대응물의 그것보다 더 크고/거나, 용량 당 그의 효능 및/또는 기능성이 그의 자연 상태에서의 그의 자연 발생 대응물에 비해 더 큰 점에서, 그의 자연 발생 대응물로부터 구별가능할 수 있음을 나타낸다.

화학적 화합물, 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체, 또는 그의 단편을 포함하나 이에 제한되지 않는 분자, 화합물, 또는 조성물의 양에 관하여 사용되는 본원에 사용된 바와 같은 "희석된"은 샘플이 농도 또는 부피 당 분자의 수가 그의 자연 발생 대응물의 그것보다 더 적은 점에서 그의 자연 발생 대응물로부터 구별가능함을 나타낸다.

본원에 사용된 바와 같은 "분리된"은 분리된 화합물, 작용제, 입자, 화학적 화합물, 또는 분자가 더 이상 원래 공급원 또는 집단의 부분인 것으로 간주되지 않을 수 있도록, 원래 공급원 또는 집단으로부터 물리적으로 나누어진 상태를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 "합성"은 화합물이 자연적으로 발견될 수 있는 자연 유기체의 외부에서 및 그로부터 독립적으로 발생하는 화학적 또는 생물학적 합성 프로세스에 의해 제조된 화합물을 지칭한다.

논의

녹조류 및 다른 광합성 수생 유기체는 대개 자연 환경에서 낮고 변동하는 CO₂ 조건에 노출된다. 이들 유기체에 대한 CO₂ 이용가능성은 다른 인자 중에서도 물 중에서의 기체의 느린 확산, 2가지 무기 탄소 형태 (CO₂ 및 HCO₃ ^-)의 느린 상호전환 및 pH 변화에 의해 제한될 수 있다. 결과적으로, 거의 모든 수생 광합성 유기체는 루비스코에 의한 고정을 위한 무기 탄소 (Ci)를 효과적으로 농축시키기 위해, 제한적 CO₂ 조건 하에서 유도가능한 이산화탄소 농축 메커니즘 (CCM)을 진화시켰다 (Giordano et al., 2005). 지금까지 씨. 레인하르드티이에서 2가지 고 및 1가지 저 친화도 비카르보네이트 수송 단백질이 특징화되어 있으며, 저 CO₂ 조건 하에서 기능적인 것으로 공지되어 있다. HLA3 및 LCI1은 형질막 상에 위치하는 Ci 수송체인 것으로 생각된다. 제3 수송체, NAR1.2 (LCIA로도 공지됨)는 포르메이트/니트라이트 수송체 패밀리의 엽록체 외피 단백질이다. NAR1.2는 비록 이를 뒷받침하는 직접적 증거는 없지만, 지금까지 엽록체 외피 상의 Ci 흡수로 인한 것이었다.

또한, 2가지 가용성 단백질 (LCIB/LCIC)은 복합체를 형성하며, 이들이 세포가 저 CO₂에 순응되는 경우 피레노이드와 가깝게 회합할 것이라는 관찰 후에, 피레노이드로부터 누출되는 CO₂의 재포획에 관여하는 것으로 생각된다 (Yamano et al., 2010; Wang et al., 2011). 현재는 미토콘드리아성인 것으로 확인된 (Atkinson et al., 2015) 다른 추정상의 수송체 CCP1 및 CCP2는 아직 해결되어야 한다. 모든 이런 관점에서, 클라미도모나스에서의 Ci 수송 시스템은 CCM의 보다 양호한 이해를 갖기 위해 규명되어야 할 것으로 남아 있음이 명백하다.

그렇기는 하지만, 본원에서 Cia8로 명명된, 비카르보네이트 수송에 관여할 수 있는 녹조류로부터의 용질 운반체 단백질, 그의 폴리펩티드, 및 그를 코딩하는 핵산이 본원에 기재된다. 또한, Cia8 폴리펩티드 및/또는 Cia8 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하고/거나 발현할 수 있는 변형된 세포 및 트랜스제닉 식물이 본원에서 제공된다. 본 개시내용의 다른 조성물, 화합물, 방법, 특색, 및 이점은 하기 도면, 상세한 설명, 및 실시예의 설명 시 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백하거나 그렇게 될 것이다. 모든 이러한 추가의 조성물, 화합물, 방법, 특색, 및 이점은 이 설명 내에 포함되고, 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.

핵산 서열

단리된 뉴클레오티드 및 cDNA 서열

본 개시내용은 전체적으로 또는 부분적으로, 녹조류 Cia8 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 단리된 뉴클레오티드 및 cDNA 서열을 기재한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 단리된 또는 합성 뉴클레오티드 또는 cDNA 서열에 의해 코딩되는 녹조류 Cia8 폴리펩티드는 비카르보네이트에 결합하고/거나 이를 수송할 수 있다.

일부 실시양태에서, 녹조류 Cia8 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드는 서열식별번호 (SEQ ID NO): 1 내지 3 중 어느 하나와 약 100％ 동일한 단리된 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 녹조류 Cia8을 코딩하는 cDNA는 서열식별번호: 3과 약 100％ 동일한 서열을 가질 수 있다. cDNA는 서열식별번호: 3 중 어느 하나와 적어도 99％ 동일성을 갖는 서열을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, cDNA는 서열식별번호: 3 중 어느 하나와 적어도 98％ 동일성을 갖는 서열을 가질 수 있다. 다른 실시양태에서, cDNA는 서열식별번호: 3 중 어느 하나와 적어도 95％, 적어도 90％, 적어도 85％, 적어도 80％, 적어도 70％, 또는 적어도 50％ 서열 동일성을 갖는 서열을 가질 수 있다. 추가의 실시양태에서, cDNA 서열은 서열식별번호: 3 중 어느 하나와 약 70％ 내지 약 80％, 또는 약 80％ 내지 90％, 또는 약 90％ 내지 약 100％ 서열 동일성을 갖는다.

일부 실시양태에서, 녹조류 Cia8 cDNA는 서열식별번호: 4 중 어느 하나와 적어도 90％ 동일성의 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다. 추가의 실시양태에서, 녹조류 Cia8 cDNA는 서열식별번호: 4 중 어느 하나와 약 90％ 내지 약 100％ 서열 동일성의 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다. 다른 실시양태에서, 녹조류 Cia8 cDNA는 서열식별번호: 4 중 어느 하나와 약 50％ 내지 약 100％ 서열 동일성의 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다.

본 개시내용은 또한 서열식별번호: 1 내지 3 중 어느 하나 내의 임의의 서열과 약 90％ 내지 100％, 약 95％ 내지 약 100％, 또는 약 99％ 내지 100％ 서열 동일성을 갖는 적어도 6개의 뉴클레오티드 서열의 합성 뉴클레오티드 단편 및 cDNA 단편을 비롯한 단리된 뉴클레오티드 단편을 제공한다. 일부 실시양태에서, 단리된 뉴클레오티드 또는 합성 뉴클레오티드 단편은 서열식별번호: 1 내지 3 중 어느 하나와 약 50％ 내지 약 100％ 서열 동일성을 갖는다.

일부 실시양태에서, 단리된 또는 합성 뉴클레오티드 단편은 막을 가로질러 비카르보네이트에 결합하고/거나 이를 수송할 수 있는 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다.

재조합 폴리뉴클레오티드 서열

또한, 이전에 기재된 단리된 뉴클레오티드 또는 cDNA 서열 또는 그의 단편 중 임의의 것을 갖는 재조합 폴리뉴클레오티드 서열, 및 단리된 뉴클레오티드 또는 cDNA 서열 또는 그의 단편에 작동가능하게 연결된 추가의 폴리뉴클레오티드 서열이 제공된다. 일부 실시양태에서, 비-코딩 뉴클레오티드는 분자의 기능적 특성에 영향을 미치지 않고 녹조류 Cia8 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5' 및/또는 3' 말단에 정치될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 코딩 영역의 3'-말단에서의 폴리아데닐화 영역이 포함될 수 있다. 폴리아데닐화 영역은 내인성 유전자로부터, 다양한 식물 유전자로부터, T-DNA로부터, 또는 화학적 합성을 통해 유래될 수 있다. 추가의 실시양태에서, 녹조류 Cia8 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드는 (예를 들어) 녹조류 Cia8 폴리펩티드의 전달을 공동-번역적으로 또는 번역후로 지정하는 녹조류 Cia8 폴리펩티드의 N-말단에서의 신호 또는 통과 (또는 리더) 서열을 코딩하는 핵산과 접합될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열은 또한 코딩된 녹조류 Cia8 폴리펩티드가 단백질의 합성, 정제, 및/또는 확인의 용이성을 위해 링커, 선별가능한 마커, 또는 다른 서열에 접합되도록 변경될 수 있다. 한 실시양태에서, 재조합 폴리뉴클레오티드 서열은 단리된 뉴클레오티드 또는 cDNA 서열 또는 그의 단편에 작동가능하게 연결된 적어도 1종의 조절 서열을 포함한다.

세포에서 외인성 녹조류 Cia8 유전자, 그의 단편, 또는 안티센스 뉴클레오티드를 발현시키기 위해, 외인성 뉴클레오티드는 (예를 들어, 벡터에서) 전사 및/또는 번역 개시 조절 서열, 즉, 세포에서 유전자의 전사 및/또는 코딩된 단백질의 번역을 지정하는 프로모터와 조합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 구성적 프로모터가 채용될 수 있다. 식물 세포에 적합한 구성적 프로모터는 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 전사 개시 영역, 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)의 T-DNA로부터 유래된 1'- 또는 2'-프로모터, 아라비돕시스 (Arabidopsis)로부터의 ACT11 및 Cat3 프로모터 (문헌 [Huang et al. Plant Mol. Biol. 1996, 33:125-139] 및 [Zhong et al. Mol. Gen. Genet. 1996, 251:196-203]), 브라시카 나푸스 (Brassica napus)로부터의 스테아로일-아실 운반체 단백질 데세츄라제 유전자 프로모터 (Solocombe et al. Plant Physiol. 1994, 104:1167-1176), 및 메이즈로부터의 GPc 1 및 Gpc2 프로모터 (문헌 [Martinez et al. J. Mol. Biol. 1989, 208:551-565] 및 [Manjunath et al. Plant Mol. Biol. 1997, 33:97-112])를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 박테리아 세포, 효모 세포, 진균 세포에 적합한 구성적 프로모터, 예컨대 박테리아 발현용 T-7 프로모터 및 효모에서의 발현용 알콜 데히드로게나제 프로모터는 일반적으로 관련 기술분야에 공지되어 있다.

다른 실시양태에서, 조직-특이적 프로모터 또는 유도성 프로모터는 특정 세포 유형에서, 특정 환경적 조건 하에서, 및/또는 발달의 특정 상태 동안 외인성 핵산의 발현을 지정하는 데 채용될 수 있다. 유도성 프로모터에 의한 전사에 영향을 미칠 수 있는 환경적 조건의 예는 혐기성 조건, 승온, 광의 존재, 화학물질 또는 호르몬과의 접촉, 또는 병원체에 의한 감염을 포함할 수 있다. 적합한 식물 유도성 프로모터는 뿌리-특이적 ANRI 프로모터 (Zhang and Forde. Science. 1998, 279:407), 및 광합성 기관-특이적 RBCS 프로모터 (Khoudi et al. Gene. 1997, 197:343) 및 토마토 과실 숙성-특이적 E8 프로모터 (Deikman, J., et al. Plant Physiol. 1992, 100: 2013-2017)를 포함할 수 있다.

선별가능한 마커는 또한 식물 세포에 대한 선별가능한 표현형을 부여하기 위해 재조합 핵산에 포함될 수 있다. 예를 들어, 선별가능한 마커는 살생제 저항성, 항생제 저항성 (예를 들어, 카나마이신, G418, 블레오마이신, 히그로마이신에 대한 저항성), 또는 제초제 저항성 (예를 들어, 클로로술푸론 또는 바스타 (Basta)에 대한 저항성)을 부여하는 단백질을 코딩할 수 있다. 따라서, 선별가능한 표현형의 존재는 숙주 세포의 성공적인 형질전환을 나타낸다. 예시적인 선별가능한 마커는 베타-글루쿠로니다제 (GUS) 리포터 유전자를 포함할 수 있다.

적합한 재조합 폴리뉴클레오티드는 제한 효소 소화, PCR, 라이게이션, 및 클로닝 기법을 포함하나 이에 제한되지 않는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 표준 방법을 사용함으로써 얻어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 막을 가로질러 비카르보네이트에 결합하고/거나 이를 수송할 수 있는 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩한다.

단리된 단백질 (폴리펩티드) 및 펩티드 서열

본 개시내용은 또한 녹조류로부터의 용질 운반체, 예컨대 Cia8에 상응하는 단리된 또는 합성 단백질 (폴리펩티드)을 기재한다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 서열식별번호: 4에 상응하는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 단리된 또는 합성 폴리펩티드는 서열식별번호: 4와 적어도 약 99％ 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 또는 합성 폴리펩티드는 서열식별번호: 4와 적어도 약 98％ 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 다른 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 서열식별번호: 4와 적어도 약 95％, 적어도 약 90％, 적어도 약 85％, 적어도 약 80％, 적어도 약 70％, 또는 적어도 약 50％ 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 또는 합성 폴리펩티드는 서열식별번호: 4와 약 70％ 초과, 또는 약 70％ 내지 약 90％, 또는 약 90％ 내지 100％ 서열 동일성을 갖는다.

일부 실시양태에서, 단리된 또는 합성 폴리펩티드는 막을 가로질러 비카르보네이트에 결합하고/거나 이를 수송할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 또는 합성 펩티드는 저 CO₂ 조건에서 성장을 개선시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 저 CO₂ 조건은 CO₂의 대기 수준일 수 있다. 일부 실시양태에서, 저 CO₂ 조건은 약 3％ 미만의 CO₂일 수 있다.

비변형된 폴리펩티드와 유사한 특징 (예를 들어, 보존적 아미노산 치환)을 갖는 분자를 초래하는 본 개시내용의 폴리펩티드의 구조에 있어서의 변형 및 변화가 이루어질 수 있다. 변형 기법은 일반적으로 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 특정 아미노산은 활성의 주목할 만한 손실 없이 서열에서 다른 아미노산에 대해 치환될 수 있다. 그 폴리펩티드의 생물학적 기능적 활성을 한정하는 것은 폴리펩티드의 상호작용 능력 및 성질이기 때문에, 특정 아미노산 서열 치환은 폴리펩티드 서열에 이루어질 수 있으며, 그럼에도 불구하고 기능적 변이체를 얻을 수 있다. 녹조류 Cia8에 상응하는 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 특성을 여전히 보유하는 아미노산 서열 치환체를 갖는 폴리펩티드는 이 개시내용의 범위 내에 있다.

본 개시내용은 또한 녹조류 Cia8에 상응하는 폴리펩티드의 단편에 상응하는 단리된 및 합성 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 서열식별번호: 4의 부분에 상응한다. 단리된 또는 합성 펩티드는 서열식별번호: 4의 임의의 부분과 적어도 약 90％, 또는 적어도 약 95％, 또는 적어도 약 99％ 서열 동일성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 또는 합성 펩티드는 서열식별번호: 4 내의 서열과 약 90％ 내지 약 95％, 또는 약 95％ 내지 약 99％, 또는 약 99％ 내지 약 100％ 서열 동일성을 가질 수 있다.

일부 실시양태에서, 단리된 또는 합성 펩티드는 막을 가로질러 비카르보네이트에 결합하고/거나 이를 수송할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 또는 합성 펩티드는 저 CO₂ 조건에서 성장을 개선시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 저 CO₂ 조건은 CO₂의 대기 수준일 수 있다. 일부 실시양태에서, 저 CO₂ 조건은 약 3％ 미만의 CO₂일 수 있다.

다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 단리된 또는 합성 펩티드 또는 그의 단편은 녹조류 Cia8에 대한 항체의 생산에 사용하기에 적합하다. 다시 말해서, 본원에 기재된 바와 같은 단리된 또는 합성 펩티드는 항체가 그에 대해 발생되는 항원으로서 기능한다. 일부 실시양태에서, 단리된 또는 합성 펩티드 서열 또는 그의 단편은 또한 항체의 에피토프이다. 녹조류 Cia8에 대해 발생된 항체는 적어도 녹조류 Cia8의 검출, 정량화, 및 정제를 위한 방법에 사용하기에 적합하다. 녹조류 Cia8 항체에 대한 다른 용도는 일반적으로 관련 기술분야에 공지되어 있다.

벡터

본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 안티센스 폴리뉴클레오티드 중 1종 이상을 갖는 벡터는 다양한 수준의 녹조류 Cia8을 발현하는 트랜스제닉 박테리아, 진균, 효모, 식물 세포, 및 트랜스제닉 식물을 생산하는 데 유용할 수 있다. 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열 중 1종 이상을 함유하는 벡터는 이 개시내용의 범위 내에 있다.

한 실시양태에서, 벡터는 녹조류 Cia8을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 여기서, DNA 분자는 서열식별번호: 1 내지 3 중 어느 하나와 적어도 약 90％, 또는 약 90％ 내지 약 95％, 또는 약 95％ 내지 약 100％ 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 벡터는 녹조류 Cia8을 코딩하는 DNA 분자를 포함할 수 있으며, 여기서, DNA 분자는 서열식별번호: 1 내지 3 중 어느 하나와 적어도 약 90％, 또는 약 90％ 내지 약 95％, 또는 약 95％ 내지 약 100％ 서열 동일성을 갖고, 녹조류 Cia8은 비카르보네이트에 결합하고/거나 이를 수송하고/거나, 저 CO₂ 조건에서 조류의 성장을 개선시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 서열식별번호: 3과 적어도 약 90％, 또는 약 90％ 내지 약 95％, 또는 95％ 내지 약 100％ 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA 분자를 갖는다.

한 실시양태에서, 벡터는 녹조류 Cia8이 그것이 형질전환되는 박테리아, 진균, 효모, 식물, 또는 다른 세포에서 발현되도록, DNA 분자에 작동가능하게 연결되거나, 녹조류 Cia8을 코딩하는 적어도 1종의 조절 서열을 가지 수 있다. 다른 실시양태에서, 벡터는 녹조류 Cia8이 그것이 야생형 박테리아, 진균, 효모, 또는 식물 세포에 비해 형질전환된 식물 세포에서 과다-발현되도록, 녹조류 Cia8의 발현을 개시하도록 기능하는 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 녹조류 Cia8 및 선별가능한 마커를 코딩하는 DNA 분자에 작동가능하게 연결된 적어도 1종의 조절 서열을 가질 수 있다.

트랜스제닉 식물

상기 기재된 폴리뉴클레오티드 서열 및 벡터는 트랜스제닉 식물을 생산하는 데 사용될 수 있다. 본 개시내용은 1개 이상의 세포를 갖는 트랜스제닉 식물을 포함하며, 여기서, 1개 이상의 세포는 녹조류 Cia8을 코딩하는 DNA 서열을 갖는 이전에 기재된 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 벡터 중 임의의 것을 함유한다. 한 실시양태에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 1 내지 3 중 어느 하나와 적어도 약 90％, 또는 약 90％ 내지 약 95％, 또는 약 95％ 내지 약 100％ 서열 동일성을 갖는 녹조류 Cia8 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 적어도 1종의 조절 요소를 함유한다.

또한, 상기 기재된 뉴클레오티드 서열 중 임의의 1종 이상, 및/또는 본 개시내용의 녹조류 Cia8 단백질을 코딩하는 핵산의 단편을 함유하는 벡터로 형질전환된 1개 이상의 세포를 갖는 트랜스제닉 식물이 본원에 기재된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 서열식별번호: 1 내지 3 중 어느 하나와 적어도 약 90％, 또는 약 90％ 내지 약 95％, 또는 약 95％ 내지 약 100％ 서열 동일성을 갖는 녹조류 Cia8 DNA 서열을 함유한다. 트랜스제닉 식물은 아라비돕시스, 벼, 밀, 옥수수, 메이즈, 담배, 대두, 브라시카 (Brassica), 토마토, 감자, 알팔파, 사탕수수, 및 수수를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 식물 종 또는 변종으로부터 제조될 수 있다.

일부 실시양태에서, 녹조류 Cia8을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 트랜스제닉 식물은 야생형 식물에 비해 녹조류 Cia8의 증가된 유전자 및/또는 단백질 발현을 가질 수 있다. 다른 실시양태에서, 트랜스제닉 식물은 녹조류 Cia8을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖고, 야생형 식물에 비해 녹조류 Cia8의 증가된 발현을 갖고, 녹조류 Cia8 폴리펩티드를 생산한다. 녹조류 Cia8 폴리펩티드는 막을 가로질러 비카르보네이트에 결합하고/거나 이를 수송할 수 있다.

일부 실시양태에서, 트랜스제닉 식물은 비카르보네이트에 결합하고/거나 이를 수송할 수 있는 녹조류 Cia8을 생산한다. 일부 실시양태에서, 트랜스제닉 식물은 녹조류 Cia8 단백질을 생산하고, 저 CO₂ 조건에서 개선된 성장을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 저 CO₂ 조건은 CO₂의 대기 수준일 수 있다. 일부 실시양태에서, 저 CO₂ 조건은 약 3％ 미만의 CO₂일 수 있다.

본 개시내용의 형질전환된 식물 세포는 이전에 기재된 바와 같은 1종 이상의 벡터를 식물 세포 내로 도입함으로써 생산될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 개시내용의 트랜스제닉 식물은 이전에 기재된 벡터 중 1종 이상으로 형질전환된 트랜스제닉 식물 세포로부터 성장될 수 있다. 한 실시양태에서, 세포는 서열식별번호: 1 내지 3 중 어느 하나와 적어도 약 90％, 또는 약 90％ 내지 약 95％, 또는 약 95％ 내지 약 100％ 서열 동일성을 갖는 녹조류 Cia8을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 1종의 조절 서열은 DNA 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다.

폭넓게 다양한 식물 세포를 벡터 또는 네이키드 핵산으로 형질전환시키는 기법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 기술 및 과학 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Weising et al. Ann. Rev. Genet. 1988, 22:421-477]을 참조한다. 예를 들어, 벡터 또는 네이키드 핵산은 식물 세포 원형질체의 전기천공 및 미세주사 (그러나 이에 제한되지 않음)와 같은 기법을 사용하여 식물 세포의 게놈 DNA 내로 직접적으로 도입될 수 있거나, 재조합 핵산은 탄도학적 방법, 예컨대 DNA 입자 포격을 사용하여 식물 조직에 직접적으로 도입될 수 있다.

미세주사 기법은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 과학 및 특허 문헌에 널리 기재되어 있다. 폴리에틸렌 글리콜 침전을 사용한 재조합 핵산의 도입은 문헌 [Paszkowski et al. EMBO J. 1984, 3:2717-2722]에 기재되어 있다. 전기천공 기법은 문헌 [Fromm et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985, 82:5824]에 기재되어 있다. 탄도학적 형질전환 기법은 문헌 [Klein et al. Nature. 1987, 327:70-73]에 기재되어 있다. 재조합 핵산은 또한 적합한 T-DNA 플랭킹 영역과 조합되고, 통상적인 아그로박테리움 투메파시엔스 숙주 벡터, 또는 다른 적합한 벡터 내로 도입될 수 있다. 아그로박테리움 투메파시엔스 숙주의 독력 기능은 세포가 박테리아에 의해 감염되는 경우, 식물 세포 DNA 내로의 외인성 핵산 및 인접한 마커를 포함하는 재조합 핵산의 삽입을 지정할 것이다. 디스아밍 (disarming) 및 바이너리 벡터의 사용을 비롯한 아그로박테리움 투메파시엔스-매개된 형질전환 기법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 과학 문헌에 널리 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Horsch et al. Science. 1984, 233:496-498]; [Fraley et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983, 80:4803]; 및 [Gene Transfer to Plants, Potrykus, ed., Springer-Verlag, Berlin, 1995]을 참조한다.

식물 세포 내로의 벡터 또는 재조합 핵산의 도입을 위한 추가의 방법은 식물 세포 원형질체의 형질전환 (안정한 또는 일시적)에 의한 것이다. 식물 원형질체는 단지 형질막에 의해 둘러싸이며, 따라서, 외인성 DNA와 같은 거대분자를 보다 용이하게 흡수할 것이다. 이들 조작된 원형질체는 전체 식물을 재생시킬 수 있다. 외인성 DNA를 식물 세포 원형질체 내로 도입하는 적합한 방법은 전기천공 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 형질전환을 포함할 수 있다. 전기천공 후, 형질전환된 세포는 선택적 작용제를 함유하는 적절한 배지 상에서의 성장에 의해 확인된다.

트랜스제닉 식물에서의 외인성 핵산의 존재 및 카피 수는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법, 예를 들어, 서던 블롯팅 분석, PCR, 및 시퀀싱을 사용하여 측정될 수 있다. 트랜스제닉 식물에서의 외인성 녹조류 Cia8 핵산의 발현은 트랜스제닉 식물에서의 녹조류 Cia8 mRNA 및/또는 녹조류 Cia8 폴리펩티드의 증가를 검출함으로써 확인될 수 있다. mRNA 또는 단백질을 검출하고, 정량화하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.

상기 형질전환 기법, 또는 현재 공지된 또는 이후에 개발될 다른 기법 중 임의의 것에 의해 유래되는 형질전환된 식물 세포는 배양되어 전체 식물을 재생시킬 수 있다. 실시양태에서, 이러한 재생 기법은 전형적으로 외인성 핵산과 함께 도입된 살생제 또는 제초제 선별가능한 마커에 의존하는, 조직 배양 성장 배지에서의 특정 식물호르몬의 조작에 의존할 수 있다. 배양된 원형질체로부터의 식물 재생은 문헌 [Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983]; 및 [Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985]에 기재되어 있다. 재생은 또한 식물 캘러스, 체외이식편, 기관, 또는 그의 부분으로부터 얻어질 수 있다. 이러한 재생 기법은 일반적으로 문헌 [Klee et al. Ann. Rev. Plant Phys. 1987, 38:467-486]에 기재되어 있다.

일단 외인성 녹조류 Cia8이 트랜스제닉 식물의 게놈에서 안정하게 혼입된 것으로 확인되면, 이는 생식적 교배에 의해 다른 식물 내로 도입될 수 있다. 교배되는 종에 따라 다수의 표준 번식 기법 중 임의의 것이 사용될 수 있다.

형질전환된 세포

이 개시내용은 또한 이전에 기재된 바와 같은 1종 이상의 단리된 뉴클레오티드 또는 cDNA 서열 및/또는 벡터로 형질전환된 1개 이상의 세포를 포괄한다. 일부 실시양태에서, 형질전환된 세포는 식물, 박테리아, 진균, 또는 효모 세포이다. 한 실시양태에서, 식물, 박테리아, 진균 또는 효모 세포는 이전에 기재된 바와 같은 1종 이상의 벡터를 함유한다. 또한, 집단 내의 세포의 약 1％ 내지 약 100％, 또는 약 50％ 내지 약 75％, 또는 약 75％ 내지 약 100％가 이전에 기재된 바와 같은 벡터를 함유하는 세포의 집단은 이 개시내용의 범위 내에 있다.

일부 실시양태에서, 집단 내의 1개 이상의 세포는 1종 초과의 유형의 벡터를 함유한다. 일부 실시양태에서, 벡터를 함유하는 모든 (약 100％) 세포는 동일한 유형의 벡터를 갖는다. 다른 실시양태에서, 벡터를 함유하는 모든 세포가 동일한 유형의 벡터 또는 복수의 벡터를 갖는 것은 아니다. 일부 실시양태에서, 집단 내의 세포의 약 1％ 내지 약 100％, 또는 약 50％ 내지 약 75％, 또는 약 75％ 내지 약 100％는 동일한 벡터 또는 복수의 벡터를 함유한다. 일부 세포 집단에서, 모든 세포는 동일한 종으로부터의 것이다. 다른 세포 집단은 상이한 종으로부터의 세포를 함유한다. 형질전환된 (트랜스제닉) 세포를 확립하기 위한 형질감염 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.

한 실시양태에서, 형질전환된 세포는 막을 가로질러 비카르보네이트에 결합하고/거나 이를 수송할 수 있는 펩티드 또는 폴리펩티드를 생산하고/거나 발현한다.

실시예

이제 본 개시내용의 실시양태를 기재하였지만, 일반적으로, 하기 실시예는 본 개시내용의 일부 추가의 실시양태를 기재한다. 본 개시내용의 실시양태는 하기 실시예 및 상응하는 텍스트 및 도면에 관하여 기재되지만, 본 개시내용의 실시양태를 이 기재에 제한하는 의도는 없다. 반대로, 의도는 본 개시내용의 실시양태의 정신 및 범위 내에 포함되는 모든 대안, 변형, 및 등가물을 커버하는 것이다.

실시예 1

도입

이 실시예는 돌연변이유발 스크린에서 확인된, 용질 운반체 단백질을 코딩하는, 본원에서 Cia8로 명명된 유전자 (피토좀 ID: Cre09.g395700)의 확인 및 특징화를 입증할 수 있다. Cia8 유전자는 용질 운반체 단백질 (SLC) 수퍼패밀리에 속하는 보존된 막횡단 단백질의 군 (Pushkin and Kurtz, 2006)인 Na⁺/담즙산 동시수송체 패밀리 (SBF)에 속하는 막횡단 단백질을 코딩한다. 결과는 Cia8 유전자 생성물이 씨. 레인하르드티이에서 비카르보네이트 흡수에 관여하고/거나, 저 CO₂ 조건에서 성장을 개선시킬 수 있음을 입증할 수 있다.

결과

Cia8 돌연변이체는 양호하게 성장하기 위해 고 CO ₂ 조건을 요구한다

Cia8 돌연변이체를 파로모마이신 저항성을 부여하는 스트렙토미세스 리모수스 (Streptomyces rimosus)로부터의 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제 유형 VIII 코딩 유전자 (AphVIII)를 함유하는 1.8-kb AphVIII 파라^R 카세트를 사용하여 삽입적 돌연변이유발 스크린 후에 확인하였다 (Sizova et al., 2001). 돌연변이체를 잠재적 CCM 돌연변이체가 저 CO₂ 상에서 성장되는 경우 느린 성장을 나타낼 MIN 플레이트 상에서 고 CO₂ (약 5％) 및 저 CO₂ (약 0.01％) 상에서 그들을 성장시킴으로써 스크리닝하였다 (Jungnick et al., 2014). Cia8 돌연변이체는 고 CO₂ 조건 상에서 양호하게 성장한 반면 (도 1A), 이는 저 CO₂ 상에서는 보다 약한 성장을 나타내었으며 (도 1B), 따라서 추가의 조사를 위해 취해졌다. 느리게 성장하는 표현형은 또한 세포를 0.01％ CO₂에서 액체 (MIN) 배양물에서 성장시킨 경우 명백하였으며, 여기서, cia8 돌연변이체에 대한 배가 시간은 D66에 대해 20시간에 비해 약 30시간이었다 (도 1C).

삽입의 확인

Cia8 유전자에서의 AphVIII 삽입체의 위치를 문헌 [Pollock et al. (2016)]에 의해 기재된 어댑터 PCR을 사용하여 측정하였다. 삽입은 도 2A에서의 유전자 모델에 나타난 바와 같이 Cia8 유전자의 제10 엑손에 위치한다. PCR 증폭을 삽입의 5' UTR 및 3' UTR을 증폭시키는 2개의 프라이머 쌍을 사용하여 수행하여 삽입의 존재를 확인하였다 (도 2B). 표 2는 연구에 사용된 프라이머의 목록을 나타낸다. 이 돌연변이체에서의 삽입 부위에 플랭킹된 게놈 DNA를 단리하고, 시퀀싱하였다. 시퀀싱된 게놈 DNA의 분석은 카세트의 5' UTR에서 (삽입의 말단에서) 유전자 서열의 16개 염기의 결실, 및 19개 염기의 새로운 영역이 삽입되었음을 밝혀내었다. 삽입의 3' UTR은 결실 또는 삽입이 없는 무손상이었다. 분석은 표적 유전자 서열이 제10 엑손에서 파괴되었으며, 다른 큰 DNA 결실 또는 삽입은 발생하지 않았음을 확인시켜 주었다.

유전자 발현

유전자에서의 전사의 파괴를 또한 삽입 부위에 걸친 유전자 특이적 프라이머 쌍을 사용한 역전사 PCR (RT-PCR)에 의해 확인하였다. RT-PCR 결과는 Cia8 돌연변이체에서의 무손상 Cia8 전사체의 검출가능한 발현이 없음을 나타내며 (도 3), 이는 전사체가 파괴되었고, 돌연변이체에서의 유전자 생성물이 검출가능한 수준 미만임을 확인시켜 주었다. Lici8 mRNA는 야생형 고 CO₂ 세포에서 검출되었다. 저 CO₂ 세포에서의 전사체의 현저한 상향조절이 관찰되었으며 (도 3), 이는 Cia8 유전자가 저 CO₂ 조건 하에서 유도가능함을 시사한다. 이 RT-PCR로부터의 결과는 또한 CIA8을 코딩하는 유전자가 대부분의 CCM 유전자의 마스터 조절제인 Cia5 유전자에 의해 조절되는 것으로 보이지 않음을 나타내는데, 이는 전사체가 Cia5 돌연변이체에서 야생형에서와 동등하게 발현되었기 때문이다.

Cia8 돌연변이체와 야생형 균주의 유전적 교차는 파로모마이신 저항성 대 파로모마이신-민감성 자손의 1:1 분리 비를 입증하였으며 (데이터는 도시하지 않음), 이는 돌연변이체가 단일 삽입을 운반함을 예시한다. PCR에 의한 추가의 조사는 파로모마이신 저항성 균주가 카세트를 운반하였음을 입증하였다. 표현형적 분석은 파로모마이신에 대해 저항성을 갖는 사분자가 저 CO₂ 조건 상에서 일관되게 병들었음을 나타내었다. 결과를 함께 취하여, Cia8 유전자 좌위는 저 CO₂ 조건 하에서 관찰된 느린 성장 표현형과 분리하고 있으며, 따라서, 이에 대한 원인이 된다고 결론내렸다.

구조의 예측 및 Cia8 유전자의 막횡단 도메인

cDNA 및 게놈 서열의 비교는 게놈에서 염색체 9 상에 위치한 Cia8이 12개의 엑손을 가짐을 나타낸다. 뉴클레오티드 서열에 기초하여, Cia8은 529개의 아미노산의 폴리펩티드를 코딩하며, 나트륨/담즙산 (SBF-유사) 용질 운반체 단백질 군과 가장 양호하게 정렬한다. PHYRE2 소프트웨어 (Kelley et al., 2015)를 사용하여 단백질의 구조를 예측하였다. 370개의 아미노산 (아미노산 160 내지 529)을 함유하는 단백질의 코어 막횡단 부분을 사용하는 것은 최고의 상동성 점수를 제공하였다. 예측 결과는 도 4에 나타낸 바와 같이 15 내지 24개의 아미노산을 갖는 10개의 추정상의 막횡단 도메인, 및 8 내지 30개의 아미노산의 막횡단 나선 사이의 세포외 루프를 밝혀내었다. TM 5 및 6 사이의 제3 루프는 나머지보다 더 길며, 이는 SLC4 단백질의 특징이다. 단백질은 박테리아 (예르시니아 프레데리크세니 (Yersinia frederikseni)) Na⁺/대사물 동시수송체에 대한 결정 구조에 대해 가장 양호하게 스레드하였지만 (82％), 이는 또한 몇몇 박테리아로부터의 HapA 단백질 (Na⁺/H⁺ 역수송체)에 양호하게 스레드하였다 (56 내지 98％).

다른 음이온 수송체에 대한 CIA8의 유사성

PFAM 데이터베이스에서의 연구는 CIA8과 유사한 8가지 다른 예측된 단백질을 밝혀내었다: Cre02.g147450; Cre06.g250450; Cre09.g393250; Cre12.g521950; Cre10.g448350; Cre12.g532500; Cre02.g095085 및 Cre02.g095086, 모두 Na⁺/담즙산 수송체로서 주석됨. CIA8과 이들 단백질의 서열 동일성은 19 내지 31％로 다양하다. 씨. 레인하르드티이에서의 Na/담즙산 수송체 유전자의 수는 다른 종과 상당히 비교할 만하며, 6종은 아라비돕시스에서 (Sawada et al., 2009), 7종은 인간에서 (He et al., 2009), 및 5종은 해양 규조 파에오닥틸룸 트리코르누툼에서 (Phaeodactylum tricornutum) (Ashworth et al., 2016) 보고되었다. 수는 이들 유형의 단백질에 의해 수송되는 이온의 수를 고려하면 놀랍지 않다. CIA8 단백질은 또한 고등 식물 종으로부터의 몇몇 SBF 클론과 상당한 서열 유사성을 나타내며, 이들 중 많은 것은 아직 특징화되지 않았다 (도 9). 가장 가까운 조류 동족체는 76％ 동일성을 갖는 볼복스 카르테리에서 발견되었다. CIA8과 유사성을 나타내는 또다른 단백질은 23％ 동일성을 갖는 효모 단백질 YNL275w이었다. 이 효모 단백질은 HCO₃ ^- 수송체 수퍼패밀리에 속하며, 잠재적 기질로서 HCO₃ ^-를 비롯한 몇몇 음이온을 수용하는 것으로 나타났다 (Zhao and Reithmeier, 2001). 이 분석은 Cia8 유전자 생성물이 보존된 도메인을 특징으로 하는 보존된 막 수송 단백질의 패밀리에 속하며, 이는 Ci 수송에 관여할 수 있음을 시사한다.

CIA8은 Ci에 대한 감소된 친화도를 갖는다

CIA8의 발현은 CO₂ 제한에 강하게 반응성이기 때문에, CCM에서의 그의 가능한 기능을 생리학적 검정을 사용하여 평가하였다. CIA8을 손실한 균주는 보다 높은 K_(0.5) (Ci)를 나타내었으며, 이는 이들이 야생형 세포보다 무기 탄소에 대해 더 낮은 친화도를 가졌음을 나타낸다 (도 5A 내지 5B). pH (7.3)에서 야생형 세포에 대한 K_(0.5) (Ci)는 25 μM이었다. 대조적으로, Cia8 돌연변이체 세포는 90 μM의 유의하게 더 높은 K_(0.5) (Ci)를 가졌으며 (표 1), 이는 돌연변이체에서 Ci에 대한 감소된 친화도를 시사한다. 산소 방출을 또한 pH 9.0에서 측정하였으며, 배지에서 우세한 Ci 종은 비카르보네이트일 것이고, 따라서, 산소 방출은 활성 비카르보네이트 흡수에 보다 의존적일 것이라고 가정하였다. K_(0.5)의 이동은 또한 보다 높은 pH에서 유의하였으며, Cia8 돌연변이체 세포는 야생형 세포에서의 100 μM에 비해 350 μM의 더 큰 K_0.5 (Ci)를 나타내었다 (도 5C, 표 1). 이 결과는 돌연변이체에서의 비카르보네이트에 대한 감소된 친화도, 및 결과적으로, Ci 흡수에 있어서 Cia8 유전자 생성물에 대한 역할을 확인시켜 준다.

씨. 레인하르드티이에서의 엽록체로의 CIA8의 국재화

표적 (Target)P/클로로(Chloro)P를 사용한 분석 (http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)은 CIA8 펩티드가 엽록체 막 단백질 (점수 81％)임을 시사하였다. 이 단백질의 N-말단 서열의 또다른 정렬을 SCL프레드-볼로냐 바이오컴퓨팅 그룹 (SCLpred-Bologna Biocomputing Group) (schloro.biocomp.unibo.it)을 사용하여 수행하였다. 상기 소프트웨어는 CIA8이 엽록체 통과 펩티드 (cTP; 점수 0.79) 및 틸라코이드 (0.81)를 가짐을 에측한다. 이는 또한 틸라코이드 막으로서의 위치 (0.6)를 예측한다. 대조군으로서, 아라비돕시스 틸라코이드 역수송체인 Kea3.3을 사용하였으며, 소프트웨어는 cTP (점수 0.77) 및 틸라코이드 막으로서의 할당 (0.51)을 예측한다. 이들 예측은 CIA8이 엽록체 단백질이라는 강한 지시를 제공한다.

이 세포하 국재화를 확인하기 위해, PsaD 프로모터의 제어 하에서 GFP에 융합된 Cia8 코딩 서열 (CIA8:CrGFP)을 발현하는 씨. 레인하르드티이 균주를 생성하였다. PsaD 프로모터는 씨. 레인하르드티이에서의 광계 I의 기질측 상에 위치한 풍부한 엽록체 단백질을 코딩하는 핵 유전자를 유도하는 고 발현 프로모터이다 (Fischer and Rochaix, 2001). RT-PCR 분석은 GFP 전사체가 이 균주에서 검출가능하였음을 밝혀내었다 (도 6G).

융합된 단백질 CIA8:CrGFP의 녹색 형광을 공초점 현미경 상의 라이브 영상화에 의해 엽록체에서 검출하였다. 이 결과는 CIA8 단백질이 씨. 레인하르드티이 세포의 엽록체에서 우세하게 축적됨을 나타내었다 (도 6A 내지 6F). 그러나, 신호는 엽록체 외피에 국한되는 것으로 보이지 않지만, 소기관 전반에 걸쳐 확산되며, 이는 틸라코이드 국재화를 시사한다.

CIA8 수송은 Na ⁺ 에 의존적이지 않다

시아노박테리아에서의 저 친화도 비카르보네이트 수송체인 BicA를 비롯한 몇몇 용질 수송체는 Na⁺ 의존성인 것으로 공지되어 있다 (Price et al., 2004; Price and Howitt, 2011). Cia8 유전자 기능이 Na⁺ 이온에 의존적일 수 있는지 여부를 측정하기 위해, 야생형 및 돌연변이체 세포를 상이한 농도의 Na⁺ (<10 μM 내지 200 mM) 상에서 성장시켰다. 둘 다의 배양물은 pH 6.8 플레이트 상에서 저 Na⁺ 농도 (<10 μM) 내지 100 mM 상에서 양호하게 성장하였다 (도 10). 그러나, 세포의 성장은 200 mM Na⁺에서 억제되었다. 야생형 및 Cia8 세포는 저 Na⁺ 농도에서 양호하게 성장하였다는 관찰은 Na⁺ 이온이 씨. 레인하르드티이에서의 HCO₃ ^-의 획득에 요구되지 않음을 나타낼 수 있으며, 담수에서의 외부 Na⁺ 농도는 일반적으로 <1 mM로 낮음을 반영할 수 있다 (Pootakham et al., 2010). 그러나, CIA8을 비롯한 수송체의 일부는 내부적이기 때문에, 외부 Na⁺ 농도를 변화시키는 것이 내부 농도를 변경시킬 것인지는 명확하지 않다.

Cia8의 발현은 저 CO ₂ 조건 상에서 상향조절된다

Cia8 돌연변이체에서 및 야생형에서 클라미도모나스에서의 다른 공지된 수송체의 발현을 정량화하고 비교하기 위해, Hla3, Nar1.2, Lci1 및 Cia8 뿐만 아니라 2가지 다른 SLC 유전자 (유전자 ID: Cre02.g147450 및 Cre09.g393250)의 발현을 정량적 RT-PCR 분석에 의해 조사하였다. RNA 샘플을 고 CO₂ 및 저 CO₂ 순응된 배양물로부터 얻었다. 결과는 야생형에서의 (도 7A), 및 Cia8 돌연변이체에서의 (도 7B) 이들 수송체 유전자의 발현의 수준을 나타낸다. 결과는 통상적으로 4시간 초과의 시간에서 발현이 증가하는 Hla3을 제외하고, 저 CO₂ 조건에 대한 순응 시 Cia8 유전자 및 다른 수송체의 상향조절을 확인시켜 준다 (Duanmu et al., 2009). 야생형에서, 저 CO₂ 조건에의 순응 시 Cia8 유전자의 4-배 상향조절이 있었다. 또한, 야생형 세포에서 2가지 SBF 유전자의 상향-조절이 있었다. 이들 2가지 SBF 유전자의 상대적 발현 수준은 또한 야생형에 비해 cia8 돌연변이체 세포에서 다소 더 낮았다 (도 7C). 데이터는 Cia8 유전자 생성물이 CCM에 관여함을 확인시켜 주는 반면, 이는 또한 CIA8의 손실은 저 CO₂ 조건 하에서 통상적으로 상향-조절되는 다른 유전자의 전사 제어에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다.

비카르보네이트 수송체의 상대적 발현 수준은 야생형에 비해 Cia8 돌연변이체 세포에서 더 낮았다. 이 하향-조절은 다른 수송체에 대한 이 Cia8 유전자의 조절 역할을 시사할 수 있다. 또한, 야생형 세포에서 2가지 다른 SLC 유전자의 주목할 만한 상향조절이 있었다. 데이터는 Cia8 유전자 생성물이 CCM에 관여하고, 그의 발현이 전사 수준에서 제어된다는 본 발명자들의 전제와 일치하는 것으로 보인다.

Cia8 유전자는 상보화될 수 있다

CIA8의 상보화를 pSP124 벡터 내로 전체 5'UTR 및 3'UTR을 포함하는 Cia8 cDNA (1,869 bp)를 그 자신의 프로모터 및 종결자의 제어 하에서 Cia8 돌연변이체 내로 발현시킴으로써 달성하였다. 형질전환된 세포를 블레오마이신 상에서 선별하였다. 10가지 형질전환체를 선별하고, 추가의 성장 시험 및 광합성 검정으로 처리하였다. 성장의 결과는 저 CO₂ 조건 상에서의 야생형 표현형이 상보화된 균주 (com1 및 com2로 지칭됨)에서 복원됨을 나타낸다 (도 8A). RNA를 이들 2가지 상보화된 균주로부터 추출하고, cDNA를 합성하였다. 결과의 RT-PCR 분석은 Cia8 전사체가 복원되었음을 나타내었다 (도 8B). 또한, pH 9.0에서의 com1의 Ci-의존적 산소 방출 검정은 상보화된 균주에서의 K_(0.5) (Ci)가 야생형의 그것과 동일하였음을 나타내었다. 또한, 방출된 최대 산소 (V_max)는 역시 야생형과 유의하게 상이하지 않았다 (도 8C 내지 8D). 이들 결과는 집합적으로 이 Cre09.g395700 코딩 서열이 Cia8 돌연변이체의 성장을 상보화시켰으며, 이는 전사체의 발현 및 Ci 흡수에서의 기능성을 복원하였음을 확인시켜 준다.

Ci 흡수 검정

Ci 흡수 활성에 대한 CIA8의 기여를 평가하기 위해, 실리콘 오일층 원심분리 방법을 사용하여 동위원소 식별, 예를 들어 D66에서의 및 CIA8에서의, 및 상보화된 세포주 com1에서의 ¹⁴C의 축적을 측정하였다 (도 11A 내지 11B). 우세한 Ci 종이 비카르보네이트임을 보장하기 위해 분석을 pH 9.0에서, 상승된 CO₂ (공기 중 약 3％ v/v CO₂)에서 또는 공기 중 (저 CO₂) 세포에서 성장된 세포를 사용하여 수행하였다. 모든 경우, 저 CO₂에 순응된 세포는 상승된 CO₂ 상에서 성장된 세포보다 세포에서의 축적된 Ci의 더 많은 양을 갖는다 (도 11A). Ci 흡수 및 광합성 속도를 비교하였으며, 야생형 세포는 Cia8 세포보다 더 큰 Ci 축적 및 더 큰 Ci 고정을 가졌다 (도 11B). 또한, 광합성은 com1 세포주에서 야생형 수준으로 거의 복원되었지만, Ci 축적은 충분히 복원되지 않았다. 이들 데이터는 Ci 흡수가 가장 가능하게는 비카르보네이트의 형태로 Cia8 세포에서 감소된다는 가설을 뒷받침한다.

논의

비카르보네이트 수송체 및 그의 흡수 및 축적에 대한 필요는 씨. 레인하르드티이 CCM의 중요한 특색이다. 씨. 레인하르드티이에서의 추정상의 비카르보네이트 수송체는 일반적으로 제한적 CO₂ 조건에 의해 유도된다. 또한, 수송체는 중첩하는 기능을 갖는 것으로 보인다. 단지 1종의 수송체의 발현이 감소되는 경우, 통상적으로 강한 성장 표현형이 있지 않으며, Ci 흡수에 대한 작은 효과가 관찰된다. 그러나, 2종 이상의 수송체가 감소되는 경우, Ci 흡수는 영향을 받으며, 저 CO₂ 상에서의 성장은 감소된다. 이 연구에서, 본 발명자들은 삽입적 돌연변이유발에 의해 새로운 돌연변이체를 생성하였고, Cia8 (저 CO₂ 유도성에 대해) 또는 Cia8 (Ci 축적에 대해)로 명명되고, 본원에서 호환적으로 사용되는 유전자 (피토좀 ID: Cre09.g395700)에서의 삽입을 갖는 돌연변이체를 확인하였다. 이 실시예의 주요 목적은 CIA8 단백질이 씨. 레인하르드티이의 CCM에 참여하였는지 여부를 측정하는 것이었다. 이를 특징화하였으며, 이 유전자에서의 삽입이 저 CO₂ 상에서의 보다 빈약한 성장을 유발하였고, 세포가 제한적 CO₂ 조건 상에서 성장된 경우 Ci 친화도의 유의한 감소를 초래하였음을 입증하였다. 상보화 실험에서, 야생형 유전자로부터의 Cia8 코딩 영역의 발현은 정상적인 성장 표현형 및 광합성 검정에서의 기능을 복원할 수 있었다 (도 8A 내지 8D).

CIA8 단백질은 약 55개의 서브패밀리에 속하는 막-결합된 수송체를 코딩하는 SLC 수퍼패밀리에 속한다. 이들 SLC 단백질은 다양한 기질을 수송한다. 연구는 일부 SLC 음이온 수송체가 비카르보네이트 흡수에 관여함을 보였다. 2가지 서브패밀리, 즉, Na⁺-의존적 Cl^-/HCO₃ ^- 교환제 (SLC4) 및 술페이트 수송체 (SLC26)는 지금까지 해양 규조, 시아노박테리아 및 포유동물에서 비카르보네이트 수송에 연루되었으며, BAND3은 인간에서의 원형이다 (Price et al., 2004; Romero, 2005; Price and Howitt, 2011; Nakajima et al., 2013; Romero et al., 2013). 다른 진핵생물 종에서 중요한 비카르보네이트 수송체임에도 불구하고, 이 서브패밀리의 SLC 유전자는 씨. 레인하르드티이에서 미지의 기능으로 남아 있다.

CIA8 단백질은 담즙산 수송체로서 명명된 막-결합된 수송체를 포함하는 SBF/BASS 서브패밀리에 속한다. 이들 단백질은 다양한 기질을 수송한다. 아라비돕시스에서, 이들 유전자 중 2가지가 특징화되었으며, BASS2는 메틸에리트리톨 4-포스페이트 (MEP) 경로에서 엽록체 외피를 가로질러 피루베이트 수송에 관여하는 반면, BASS4는 글루코스이놀레이트 대사 동안 2-케토 산을 수송한다 (Gigolashvili et al., 2009; Furumoto et al., 2011). PFAM 데이터베이스에서의 생물정보학적 연구는 일부 SBF 및 SBF-유사 음이온 수송체가 비카르보네이트 흡수에 관여할 수 있음을 밝혀낸다. 다른 진핵생물 종에서 중요한 수송체임에도 불구하고, 이 서브패밀리의 SBF/BASS 유전자 생성물은 씨. 레인하르드티이에서 미지의 기능으로 남아 있다.

이 연구에서 CIA8의 생리학적 특징화는 이것이 제한적 CO₂ 조건 하에서 CCM 기능 및 Ci 흡수에 관여한다는 생각을 뒷받침한다. CIA8 수송체는 CCM 기능에 상당한 기여를 하는 것으로 보이는데, 이는 그것이 단일 넉아웃 돌연변이체에서 별개의 표현형을 나타내는 지금까지 유일한 수송체이기 때문이다 (도 1). 다른 공지된 수송체 HLA3 및 NAR1.2는 단일 넉아웃 돌연변이체로서 확정적인 성장 표현형을 나타내지 않았으며 (Yamano et al., 2015), LCI1 형질전환체에 대해서도 역시 성장 차이는 보고되지 않았다 (Ohnishi et al., 2010). pH 7.3 및 9.0에서 Cia8 돌연변이체에서의 Ci-의존적 광합성의 감소된 속도 및 Ci에 대한 감소된 친화도 (도 5A 내지 5C)는 CIA8이 Ci 흡수에 관여할 수 있다는 증거를 제공한다.

SBF 수송체는 일부 동물 단백질에서 밝혀진 바와 같이 대개 Na⁺ 이온의 공동-수송과 연관되지만 (Romero et al., 2013), 이 실시예에서의 결과는 Na⁺ 이온이 CIA8 단백질의 기능성에 반드시 필수적이지는 않을 수 있음을 시사한다 (도 9). 저 Na⁺ 이온 농도 (예를 들어 <10 μM 내지 100 mM)는 돌연변이체 및 야생형에서 세포의 성장에 영향을 미치지 않았다. 이는 세포 배양물이 성장하는 TAP 및 MIN 배지가 첨가된 나트륨을 함유하지 않음에 기인할 수 있다. 따라서, 씨. 레인하르드티이 세포는 매우 저 농도의 나트륨으로 양호하게 성장한다. 해양 조류에서 Na⁺-커플링된 수송에 대한 충분한 뒷받침이 있지만, H⁺-커플링된 수송은 담수 조류에서 역할을 하는 것으로 생각되었다. 그러나, 다른 이온, 예컨대 Na+ 또는 K+는 비카르보네이트 이동에 커플링될 수 있다. 또다른 가능성은 음이온, 예컨대 클로라이드에 대한 비카르보네이트의 교환 (역수송)을 포함할 수 있다.

돌연변이체에서의 유전자 전사체의 분석은 CIA8 돌연변이체가 넉아웃임을 나타내었다. 야생형에서 Cia8 전사체는 고-CO₂ 세포가 저 CO₂에 순응된 경우 상향조절되었으며 (4-배), 이 유도는 다른 수송체와 일치하지만 (도 3 및 11A 내지 11B), 유도의 수준은 CCM 단백질의 일부만큼 높지 않다. 씨. 레인하르드티이에서의 전사체 풍부도에 의한 수송체의 조절은 널리 문서화되어 있다 (Ohnishi et al., 2010; Gao et al., 2015; Yamano et al., 2015). 이 유형의 조절은 주장하건대, 이들이 CCM이 기능적이지 않는 바와 같이 요구되지 않을 경우 고 CO₂ 조건 하에서 HCO₃ ^- 수송체의 발현을 방지한다. 이들 다른 수송체의 상대적 발현은 야생형에 비해 Cia8 돌연변이체에서 하향조절됨은 흥미로웠다. 이는 CIA8 단백질의 손실이 시토졸에서의 HCO₃ ^-의 축적을 초래하고, 이는 2가지 형질막 수송체 (HLA3 및 LCI1), 및 이후에 NAR1.2에 부정적으로 영향을 미치는 음성 피드백 메커니즘에 의해 설명될 수 있다. 대안적으로, 이는 Nar1.2 유전자 전사체가 최근 Hla3의 발현을 조절하는 것으로 나타난 것과 꼭 마찬가지로, Cia8 유전자가 이들 다른 유전자에 비해 조절 제어의 일부 형태를 가질 수 있을 지도 모른다 (Yamano et al., 2015).

과거의 몇몇 연구는 조류 CCM의 틸라코이드 막 상의 추정상의 HCO₃ ^- 채널 또는 수송체의 발생을 가설화하였다 (Raven, 1997; Wang et al., 2011; Jungnick et al., 2014). 이 연구에서, CIA8에 융합된 녹색 형광 단백질의 신호는 엽록체 전반에 걸쳐 고르게 확산되었다 (도 7). 소기관 전반에 걸친 이 국재화는 단백질이 HCO₃ ^-를 틸라코이드 루멘 내로 직접적으로 펌핑하는 전략적인 위치인 틸라코이드 막 상에 있을 수 있음을 시사한다. 이 점에서 CIA8이 동시수송체인지 역수송체인지 여부는 명확하지 않다. 그러나, 그것이 틸라코이드 막 상에 있는 경우, 이는 광에서 설정된 막횡단 H⁺ 구배를 사용하여 이온을 수송할 수 있다. CIA8이 틸라코이드 막 상에 있는 경우, 엽록체 외피 상에 국재화된 NAR1.2 단백질은 CIA8의 손실을 보상할 수 없을 것이며, 이는 이 연구에서의 본 발명자들의 결과와 일치한다. 또한, 이 국재화 결과로, Cia8 유전자 생성물은 CCM 기능에, 및 아마도 Ci 흡수에 상당히 기여할 것이다.

식물, 진균 및 동물에서 거의 모든 SLC4-유사 단백질은 원시적인 기능으로서 이 보레이트 수송 능력을 갖는다 (Parker and Boron, 2013). 보레이트 수송 기능을 갖는 SLC4-유사 단백질의 편재적인 발생은, 비카르보네이트 및 다른 이온이 보다 최근의 획득이 되도록, 보레이트 수송이 이들 단백질의 원래 기능이었음을 시사한다 (Parker and Boron, 2013). 단백질의 계통발생론 및 결합 메커니즘에 기초하여, 보레이트 및 HCO₃ ^- 수송 시스템의 흥미로운 유사성이 있다. 카라 카롤리나 (Chara carolina)의 세포에서의 생물물리학적 연구는 보레이트가 세포 내로의 비카르보네이트 유입을 억제하였음을 나타내었으며, 즉, 이들은 동일한 결합 부위에 대해 경쟁한다 (Lucas, 1975). 문헌 [Frommer and von Wiren, (2002)]은 이 유사성을 뒷받침하는 신장에서의 HCO₃ ^- 수송과 물관부에서의 보레이트 수송의 비교를 제공하였다. 또한, 한 연구는 고등 식물에서 유일하게 특징화된 SLC 단백질인 BOR1이 아라비돕시스에서 붕소를 수송함을 보였다 (Takano et al., 2002). 이 연구에 따르면, BOR1은 효모 막 단백질 YNL275w와 27％ 동일성을 공유한다. YNL275w 단백질은 일차적으로 보레이트 수송체이지만, 연구는 결합 검정에서 HCO₃ ^-를 비롯한 기질로서 몇몇 음이온을 흡수하는 그의 능력을 입증하였다 (Zhao and Reithmeier, 2001). 따라서, CIA8 단백질이 효모 YNL275w 단백질과 동일성을 공유한다는 것은 흥미로우며, 이는 공통적인 기원, 및 아마도, 생리학적 기능의 유사성을 시사한다. 이들 기능적 관계의 분석은 씨. 레인하르드티이에서의 비카르보네이트 수송에 있어서 SLC 단백질의 역할의 보다 양호한 이해를 제공할 수 있다.

결론적으로, CIA8 단백질은 씨. 레인하르드티이 CCM에서 역할을 하는 수송체이다. 유전자가 넉아웃되는 경우, 돌연변이체는 제한적 CO₂ 조건 상에서 성장되는 경우 손상된 Ci 흡수 및 성장 억제를 나타낸다. Cia8 유전자는 CO₂ 고정을 위해 틸라코이드 루멘 내로의 HCO₃ ^-의 직접적 흡수에 관여하는 추정상의 비카르보네이트 수송체를 코딩하는 것으로 관찰되었다. CIA8 단백질은 소수성이며, 예측 프로그램에 따르면 SBF/BASS 서브패밀리에서의 다른 공지된 수송체와 비교할 만한 위상을 갖는다.

물질 및 방법

세포 배양 및 성장

클라미도모나스 레인하르드티이 배양 조건은 문헌 [Ma et al., (2011)]에 기재된 바와 같았다. D66 균주 (nit2 ^- , cw15, mt ⁺ )는 로진 슈넬 박사 (Dr Rogene Schnell) (유니버시티 오브 알칸사스 (University of Arkansas), 리틀 록)로부터 얻었고, cc124 균주 (nit1 ^- , nit2 ^- , mt ^- )는 씨. 레인하르드티이 듀크 유니버시티 센터 (Duke University Center) (http://www.chlamy.org/)로부터 얻었다. 트리스-아세테이트-포스페이트 (TAP) 및 최소 (Minimal) (MIN) 배지 (아세테이트 없음)는 문헌 [Sueoka (1960)]에 따라 제조하였다. 성장 배지용 TAP 및 MIN 플레이트 둘 다는 약 1.2％ (w/v) 한천을 첨가함으로써 제조하였다. 세포 배양을 TAP 플레이트로부터의 콜로니를 에른마이어 플라스크 중 약 100 mL TAP 액체 배지 내로 접종함으로써 개시하였다. 배양물을 연속 조명 상에서 초기 로그 상까지 성장시키고 (약 100 μmol m^-2 s^-1), 약 48시간 동안 진탕하였다. TAP 성장된 배양물을 수확하고, MIN 배지로 세척하고, MIN 배지에 재-현탁시키고, 0.2 내지 0.3의 세포 밀도 OD₇₃₀ (약 2 내지 3 x10⁶ 세포 mL^-1)에 도달하도록 고 CO₂ (공기 중 약 5％ [v/v] CO₂) 버블링에 약 48시간 동안 연결하였다. CCM 유도를 위해, 세포를 저 CO₂ (공기 중 약 0.01％ [v/v] CO₂) 버블링으로 4시간 동안 옮겼다.

돌연변이유발, 저 CO ₂ 상-병든 돌연변이체의 단리, 표현형적 스크린

돌연변이체를 문헌 [Jungnick et al., (2014)]에 따라 돌연변이유발 스크린에서 생성하였다. 파로모마이신 저항성 (파라^R)을 부여하는 AphVIII 유전자를 함유하는 선형 플라스미드 (pSL18)를 전기천공에 의해 씨. 레인하르드티이의 D66 균주 내로 형질전환시켰다 (Shimogawara et al., 1998). 형질전환된 세포를 항생제 파로모마이신 (약 7.5 μg mL^-1; 인비트로젠 (Invitrogen))을 함유하는 TAP 플레이트 상에서 선별하였다. 항생제 저항성 균주를 상기 언급된 것과 동일한 광 조건을 갖는 고 CO₂ 챔버 (공기 중 약 5％ [v/v] CO₂) 및 저 CO₂ 챔버 (공기 중 약 0.01％ [v/v] CO₂)에서 성장에 대해 스크리닝하였다. 세포를 MIN 플레이트 상에서 스트리킹하고, 성장 챔버에 정치하였다. 스폿 시험을 활발하게 성장하는 세포를 액체 MIN 배지에 동일한 세포 밀도 (OD₇₃₀ =0.15, 0.07 및 0.03)로 현탁시키고, 각각의 현탁액 약 15 μl를 MIN 플레이트 상으로 스폿팅함으로써 수행하였다. 이들을 고, 주위 및 저 CO₂ 챔버에 7일 동안 정치하였다. 성장 챔버 중의 CO₂ 농도를 환경적 기체 모니터 (Environmental Gas Monitor) (EGM-4, PP 시스템즈 (PP systems), 미국 매사추세츠주)를 사용하여 측정하였다.

플랭킹 영역의 확인

어댑터-매개된 PCR 방법을 사용하여 AphVIII 삽입에 플랭킹된 DNA 영역을 확인하였다 (Pollock et al., 2016). 상동성 연구를 피토좀 데이터베이스 버전 10.3에서의 조인트 게놈 인스티튜트 (Joint Genome Institute) 씨. 레인하르드티이를 사용하여 수행하였다 (Merchant et al., 2007; Blaby et al., 2014).

연관 분석

유전적 교차 및 사분자 분석을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (Moroney et al., 1986; Harris, 2009). 간략하게, 로그 상에서의 Cia8 (mt⁺) 및 cc124 (mt^-) 세포 배양물을 질소 결핍 TAP 배지로 광에서 밤새 옮겨 생식자발생을 유도하였다. 다음날 아침, 각각의 배양물 약 3 mL를 혼합하여 약 3시간 동안 광에서 메이팅시켰다. 분취액 (약 0.5 mL)을 약 4％ 한천을 함유하는 TAP 마이너스-질소 배지 상에 플레이팅하였다. 플레이트를 암흑에서 2주 동안 저장하여 접합체 성숙을 시켰다. 약 14일 후, 접합체를 감수분열적 발아를 위해 약 1.2％ 한천 TAP 배지 플레이트로 옮겼다. 사분자 절개를 수행하고, 연관을 저 CO₂ 상에서 양호하게 성장하지 않은 자손과의 파로모마이신 저항성 유전자의 회합에 의해 측정하였다.

광합성 검정

씨. 레인하르드티이 배양을 로그 상에 도달하도록 약 100 mL의 TAP 배지에서 48시간 동안 종속영양적으로 시작하였다. 세포를 원심분리하고, 250 mL 에른마이어 플라스크로 옮기고, MIN 배지에 재-현탁시키고, 이들이 세포 밀도 OD₇₃₀ = 0.2 내지 0.3 (약 3x10⁶ 세포 mL^-1)에 도달할 때까지 약 5％ CO₂로 버블링하였다. 그 후, 배양물을 저 CO₂ (약 0.01％)로 약 4시간 동안 옮겨 CCM 유도를 하였다. 외부 Ci에 대한 친화도 (K_0.5[DIC]) (용해된 무기 탄소)를 문헌 [Ma et al., (2011)]에 따라 추정하였다. 상기 방법에서, 엽록소 약 100 μg의 등가물을 갖는 세포를 불활성 질소 기체, 즉, CO₂ 무함유로 버블링된 약 25 mM HEPES-KOH 완충제 (pH 약 7.3) 또는 약 25 mM CHES-KOH 완충제 (pH 약 9.0)에 현탁시켰다. 세포를 약 300 μmol m^-2s^-1로 조명된 O₂ 전극 챔버 (랭크 브라더스 (Rank Brothers), 영국 캠브리지)로 옮기고, 완충제 및 세포내 공간 중의 임의의 잔류하는 DIC를 고갈시키도록 방치하였다. 내인성 CO₂의 고갈 시, 순 O₂ 방출은 관찰되지 않았다. 기지의 농도의 NaHCO₃를 챔버 내로 주사하고, O₂ 방출의 속도를 측정하였다. K_0.5[DIC]를 산소 방출의 반 최대 속도에 요구되는 DIC 농도로서 계산하였다 (Badger, 1985). 엽록소 함량을 엽록소 a 및 b를 배합함으로써 측정하였다. 엽록소를 100％ 메탄올에서 추출하고, 분광광도계를 사용하여 측정하였다. K_0.5 (CO₂)는 반 V_max O₂ 방출에 도달하는 데 필요한 CO₂ 농도로서 취해진다.

세포내 국재화

전체 Cre09.395700 유전자 (4,846 bp)를 증폭시키고, EcoR1 및 NdeI 제한 부위를 사용하여 변형된 pSL18CrGFP 벡터 내로 도입하였다. Cre09.395700 유전자를 그것이 벡터에서 이미 클라미도모나스 코돈 최적화된 GFP 유전자와 인 프레임으로 삽입하였다 (Fuhrmann et al., 1999). 벡터를 KpnI 소화로 선형화하였다. Cia8 유전자 단편으로의 야생형 균주 D66의 형질전환을 선형화된 벡터로의 전기천공에 의해 달성하고, 파로모마이신 저항성 콜로니를 PCR을 사용하여 분석하였다. GFP-태그부착된 단백질을 화상화하기 위해, 약 5 μL의 세포를 약 1.5％ 저 융점 아가로스를 갖는 슬라이드 상으로 마운팅하였다. 세포를 레이카 (Leica) Sp2 공초점 현미경을 사용하여 화상화하였다. Kr/Ar 레이저를 약 488 nm의 파장에서 설정하여 eGFP 및 엽록소 둘 다를 여기시키고, 광전자증배관을 약 500 내지 520 nm로 설정하여 eGFP 형광을 검출하고, 약 660 내지 700 nm로 설정하여 엽록소 자가형광을 검출하였다. 20x 렌즈를 사용하여 세포를 화상화하였다.

유전자 발현 분석

RNA 추출을 제공된 지침 (인비트로젠)에 따라 트리아졸 시약을 사용하여 수행하였다. 약 1 μg의 총 RNA를 cDNA의 합성을 위한 주형으로서 사용하였다. 고 GC 함량을 갖는 전사체에 대한 수퍼스크립트 제1 가닥 합성 시스템 (Superscript First Strand Synthesis System) (인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스버드)을 사용하여 제조자의 지침서에 따라 cDNA를 합성하였다. 약 100 ng cDNA의 분취액을 ABI 프리즘 (Prism) 7000 서열 검출 시스템에서 제조자의 지침서 (어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems), 미국 캘리포니아주 포스터 시티)에 따라 정량적 PCR을 위한 SYBR 셀렉트 (Select) (어플라이드 바이오시스템즈, 미국 캘리포니아주 포스터 시티)로의 주형으로서 사용하였다. 정규화된 프라이머는 RT-PCR을 위한 GAPDH 유전자에 대해 특이적이었다. q-RTPCR을 위해, CBLP 유전자를 이들 실험에서 대조군으로서 사용하였다 (Mus et al., 2007). 각각의 cDNA에 대해 사용된 프라이머를 표 2에 열거한다.

CIA8의 상보화

Cia8 돌연변이체의 상보화를 Cia8 유전자의 야생형 카피를 함유하는 구축물로의 Cia8 세포의 형질전환에 의해 달성하였다. 구축물은 5' UTR 및 3' UTR 영역을 포함하는 Cia8 CDS 단편 (2,949 bp) 및 프로모터 영역의 1,080 bp 단편으로 이루어졌다. 이들 단편을 Not1 제한 부위를 사용하여 라이게이션한 후, pGEM-T 내로 라이게이션하였다. 시퀀싱된 단편을 BamHI 및 SacI 제한 부위를 사용하여 셔틀 벡터 pSP124 내로 클로닝하였다. 서열은 피토좀 버전 10.2 (phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal/html)로부터 얻었다. Cia8 게놈 단편을 증폭시키는 데 사용된 프라이머를 표 2에 나타낸다. 전기천공 방법을 세포 형질전환에 사용하고, 균주를 블레오마이신 저항성에 대해 선별하였다 (Shimogawara et al., 1998). 선별된 클라미도모나스 균주에서의 상보화된 DNA의 존재를 PCR을 사용하여 확인하였다.

Ci 흡수 검정

H¹⁴CO₃의 활성 종 흡수를 pH 약 9.0 (약 25℃)에서 실리콘 오일 원심분리-여과에 의해 종결된 약 15초 흡수 기간으로 수행하였다 (Price et al., 2004). KHCO₃ 분취액을 약 25 mM 스톡 (pH 약 9.5)으로부터 첨가하였다. pH 약 9.0에서 HCO₃ ^-로부터의 CO₂ 공급의 속도를 실험적으로 측정된 속도 상수를 적용함으로써 계산하였다. 표 1은 야생형 D66 및 Cia8 돌연변이체 세포에 대한 최대 산소 방출 활성 (V_max) 및 Ci 친화도, K_(0.5) 값을 입증한다. 세포를 고 CO₂ 상에서 48시간 동안 성장시키고, 저 CO₂로 4시간 동안 순응시켰다. 괄호에서: ± SE; n=3.

<표 1>

<표 2>

실시예 1에 대한 참고문헌

SEQUENCE LISTING <110> Board of Supervisors of Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College <120> A GREEN ALGA BICARBONATE TRANSPORTER AND USES THEREOF <130> 222220-2080 <150> US 62/352,278 <151> 2016-06-20 <160> 39 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4846 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cia8 Genomic DNA sequence, locus name: Cre09.g395700 <400> 1 gtatacatga tagcacgcct tgatatagcc caagaattgt gaaacgaaat tcggctttct 60 tgggcgcgta gggctacatt ggcaggcctt accttaaaaa aagatatatc actttcaccc 120 aacgatgtgc gccggcattc ggtcagcatc aacggcgggc ctgtcgacga cggcaatgca 180 gccgactcga gcgctcattc tatactcgca cctaaggacg gcgcctcgtt tcaatgtgct 240 tcaagagcct tgcttgcgga gttttgggtc ggtgtcggcg ttttggtcgc gccctagtca 300 tagtcggctc gtgggttgca acgccgcagc gggcgacgcc gcagcagcag gcgggcccgt 360 gcctctgccg ggcccgccac aggggccggc gccctccagc cctgcagcat ccacatcaga 420 ttctcaaaat cttaagcaca gtcatccgac gccagcagca cctgcaccag cagcctcatt 480 ggaacctgcc tccgcggcta gcggcgccgg cgtcagcacc 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gggggcatat 4740 gctgcaccta gctggagcga ggcggcatat gctgcagcag caggaggcgc tcgcatagct 4800 ggaggagggc ctgtgcgtgg gctcgggagg cacgaaccta tgaaag 4846 <210> 2 <211> 1869 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cia8 transcript sequence; Genbank Acession Number: Cre09.g395700.t1.1 <400> 2 gtatacatga tagcacgcct tgatatagcc caagaattgt gaaacgaaat tcggctttct 60 tgggcgcgta gggctacatt ggcaggcctt accttaaaaa aagatatatc actttcaccc 120 aacgatgtgc gccggcattc ggtcagcatc aacggcgggc ctgtcgacga cggcaatgca 180 gccgactcga gcgctcattc tatactcgca cctaaggacg gcgcctcgtt tcaatgtgct 240 tcaagagcct tgcttgcgga gttttgggtc ggtgtcggcg ttttggtcgc gccctagtca 300 tagtcggctc gtgggttgca acgccgcagc gggcgacgcc gcagcagcag gcgggcccgt 360 gcctctgccg ggcccgccac aggggccggc gccctccagc cctgcagcat ccacatcaga 420 ttctcaaaat cttaagcaca gtcatccgac gccagcagca cctgcaccag cagcctcatt 480 ggaacctgcc tccgcggcta gcggcgccgg cgtcagcacc agcaccagcg ccagcaccag 540 cgccgccagt accaacagca gcatagacag cagcgccacc acgaacggca gcagtggcgg 600 tggcgccgcg 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tgggcggttc tgacccggtg gcggcggcgg ccacgcggcg 1500 ggcgctgatc attgtggcct cacagaagac tctgcctgtg gccatggcgg tgctgggccg 1560 gctggcgcct gcggtgggcg ccgaggcggc gggctgcgcg gcggtgacgg ctgtgttcag 1620 tcacctggcg cagacgtgtg tggacttcgc actggtgtcc aggtggctgg agcacattca 1680 gcggcgagac atcaaagcca acaaggcggc ctagctggag cgagggggca tttgctgcac 1740 ctagctggag tgagggggca tatgctgcac ctagctggag cgaggcggca tatgctgcag 1800 cagcaggagg cgctcgcata gctggaggag ggcctgtgcg tgggctcggg aggcacgaac 1860 ctatgaaag 1869 <210> 3 <211> 1590 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cia8 cDNA sequence; GenBank Acession Number: Cre09.g395700.t1.1 CDS <400> 3 atgtgcgccg gcattcggtc agcatcaacg gcgggcctgt cgacgacggc aatgcagccg 60 actcgagcgc tcattctata ctcgcaccta aggacggcgc ctcgtttcaa tgtgcttcaa 120 gagccttgct tgcggagttt tgggtcggtg tcggcgtttt ggtcgcgccc tagtcatagt 180 cggctcgtgg gttgcaacgc cgcagcgggc gacgccgcag cagcaggcgg gcccgtgcct 240 ctgccgggcc cgccacaggg gccggcgccc tccagccctg cagcatccac atcagattct 300 caaaatctta agcacagtca tccgacgcca gcagcacctg caccagcagc ctcattggaa 360 cctgcctccg cggctagcgg cgccggcgtc agcaccagca ccagcgccag caccagcgcc 420 gccagtacca acagcagcat agacagcagc gccaccacga acggcagcag tggcggtggc 480 gccgcgccat cagctgtgtc cacggtggtg ggctggctgc gcaagctggt gacggagcag 540 tacctgccgc tcatgctgct ggccgcgctg gtggcggcgg cgctgcagcc gtcctggggt 600 ctggcggcct ctaagacgca gctgcagacg gcggtcacct tcaccatctt cgtgctgcag 660 ggagtcatgc tgcggcaggg cgaggcgaag aaggcgcttg gggcggccgg cgccatcgcc 720 tggggcatgg cctccatcct cctcatcacg ccactgctgg cgccactggc gggggcgctg 780 ccgctgcagc cgcctggact ggcgctgggc ctgcttgtgt tcggatgcat gcctaccacc 840 ctgtccagcg gcgtggcgct tacacaggtt ctgggcggca acacggccct ggcgctgctg 900 ctgaccatcg ccaccaacct ggcctccgtg ttcacactgc ccttcctgct gccctgggcg 960 ctcaagacga ccgcgtcgat cggaggcttt ggcgccgccg ccgcggtcgc gggcggctcc 1020 gccgctgctg ctgtgcggct ggaccccgtg ccgctgctgg tgcagctggt gcagtgcatc 1080 ctgctgccca cactgctggg cgccggcgtg cggggcgcca gcgagggcct gcgcagctgg 1140 gtggatgcca accggcgcac actgagtgtc atcagcggcg gcctgttgtc actggtgccc 1200 tggatgcagg tcagcaaggc cctggctcag ggcgtgacgg tggcgccggc ggcgctggcg 1260 gcggctgtgg cctggtcgct ggccttccat gtcgtgtacc tggggctcaa ctgcggagcc 1320 gccacgctgt tgaggttggg cggttctgac ccggtggcgg cggcggccac gcggcgggcg 1380 ctgatcattg tggcctcaca gaagactctg cctgtggcca tggcggtgct gggccggctg 1440 gcgcctgcgg tgggcgccga ggcggcgggc tgcgcggcgg tgacggctgt gttcagtcac 1500 ctggcgcaga cgtgtgtgga cttcgcactg gtgtccaggt ggctggagca cattcagcgg 1560 cgagacatca aagccaacaa ggcggcctag 1590 <210> 4 <211> 529 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cia8 polypeptide sequence <400> 4 Met Cys Ala Gly Ile Arg Ser Ala Ser Thr Ala Gly Leu Ser Thr Thr 1 5 10 15 Ala Met Gln Pro Thr Arg Ala Leu Ile Leu Tyr Ser His Leu Arg Thr 20 25 30 Ala Pro Arg Phe Asn Val Leu Gln Glu Pro Cys Leu Arg Ser Phe Gly 35 40 45 Ser Val Ser Ala Phe Trp Ser Arg Pro Ser His Ser Arg Leu Val Gly 50 55 60 Cys Asn Ala Ala Ala Gly Asp Ala Ala Ala Ala Gly Gly Pro Val Pro 65 70 75 80 Leu Pro Gly Pro Pro Gln Gly Pro Ala Pro Ser Ser Pro Ala Ala Ser 85 90 95 Thr Ser Asp Ser Gln Asn Leu Lys His Ser His Pro Thr Pro Ala Ala 100 105 110 Pro Ala Pro Ala Ala Ser Leu Glu Pro Ala Ser Ala Ala Ser Gly Ala 115 120 125 Gly Val Ser Thr Ser Thr Ser Ala Ser Thr Ser Ala Ala Ser Thr Asn 130 135 140 Ser Ser Ile Asp Ser Ser Ala Thr Thr Asn Gly Ser Ser Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ala Ala Pro Ser Ala Val Ser Thr Val Val Gly Trp Leu Arg Lys Leu 165 170 175 Val Thr Glu Gln Tyr Leu Pro Leu Met Leu Leu Ala Ala Leu Val Ala 180 185 190 Ala Ala Leu Gln Pro Ser Trp Gly Leu Ala Ala Ser Lys Thr Gln Leu 195 200 205 Gln Thr Ala Val Thr Phe Thr Ile Phe Val Leu Gln Gly Val Met Leu 210 215 220 Arg Gln Gly Glu Ala Lys Lys Ala Leu Gly Ala Ala Gly Ala Ile Ala 225 230 235 240 Trp Gly Met Ala Ser Ile Leu Leu Ile Thr Pro Leu Leu Ala Pro Leu 245 250 255 Ala Gly Ala Leu Pro Leu Gln Pro Pro Gly Leu Ala Leu Gly Leu Leu 260 265 270 Val Phe Gly Cys Met Pro Thr Thr Leu Ser Ser Gly Val Ala Leu Thr 275 280 285 Gln Val Leu Gly Gly Asn Thr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Thr Ile Ala 290 295 300 Thr Asn Leu Ala Ser Val Phe Thr Leu Pro Phe Leu Leu Pro Trp Ala 305 310 315 320 Leu Lys Thr Thr Ala Ser Ile Gly Gly Phe Gly Ala Ala Ala Ala Val 325 330 335 Ala Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Val Arg Leu Asp Pro Val Pro Leu 340 345 350 Leu Val Gln Leu Val Gln Cys Ile Leu Leu Pro Thr Leu Leu Gly Ala 355 360 365 Gly Val Arg Gly Ala Ser Glu Gly Leu Arg Ser Trp Val Asp Ala Asn 370 375 380 Arg Arg Thr Leu Ser Val Ile Ser Gly Gly Leu Leu Ser Leu Val Pro 385 390 395 400 Trp Met Gln Val Ser Lys Ala Leu Ala Gln Gly Val Thr Val Ala Pro 405 410 415 Ala Ala Leu Ala Ala Ala Val Ala Trp Ser Leu Ala Phe His Val Val 420 425 430 Tyr Leu Gly Leu Asn Cys Gly Ala Ala Thr Leu Leu Arg Leu Gly Gly 435 440 445 Ser Asp Pro Val Ala Ala Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Ile Ile Val 450 455 460 Ala Ser Gln Lys Thr Leu Pro Val Ala Met Ala Val Leu Gly Arg Leu 465 470 475 480 Ala Pro Ala Val Gly Ala Glu Ala Ala Gly Cys Ala Ala Val Thr Ala 485 490 495 Val Phe Ser His Leu Ala Gln Thr Cys Val Asp Phe Ala Leu Val Ser 500 505 510 Arg Trp Leu Glu His Ile Gln Arg Arg Asp Ile Lys Ala Asn Lys Ala 515 520 525 Ala <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer CIA8-F (forward primer) <400> 5 gcacatacta ttgaggtgcc g 21 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CIA8-R (reverse primer) <400> 6 cggctgtgtt cagtcacct 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer RIM3-1 <400> 7 cggtatcgga ggaaaagctg 20 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RIM3-2 <400> 8 taccggctgt tggacgagtt cttctg 26 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RX1 <400> 9 gccctcatag cccgccaaat cag 23 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RX2 <400> 10 aagccgataa acaccagccc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer CIA8CDSF2 <400> 11 cagtaccaac agcagcatag 20 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Cre09.g395700_CIA8-F2 <400> 12 atgtgcgccg gcattcg 17 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Cre09.g395700_CIA8-R2 <400> 13 ctaggccgcc ttgttggc 18 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer ACTIN F <400> 14 gccagaagga ctcgtacgtt 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer ACTIN R <400> 15 cgccagagtc cagcacgata 20 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer GAPDH F <400> 16 atggcgccaa agaaggttct tc 22 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer GAPDH R <400> 17 ctacatcttg gccgccacga tc 22 <210> 18 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer CIA8CDSEcoRIRnostop <400> 18 gatcgaattc acggccgcct tgttggcttt g 31 <210> 19 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer CIA8CDSNdeIF <400> 19 catgaccata tgatgtgcgc cggcattcgg tc 32 <210> 20 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer ShortGFP-F <400> 20 ccaagggcga ggagct 16 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer CrGFP-R <400> 21 cttgtacagc tcgtccatg 19 <210> 22 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer CIA8transcr_R_BamHI <400> 22 taggatccct ttcataggtt cgtgcctcc 29 <210> 23 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer CIA8prom_F_SacI <400> 23 cagagctcct caggcaaggt gatcaagtg 29 <210> 24 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer CIA8prom_R_NotI <400> 24 actagcggcc gcgtccgcat gttgcttatt tc 32 <210> 25 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer CIA8transcr_F_NotI <400> 25 actagcggcc gcgtatacat gatagcacgc cttg 34 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer HLA3_4,765F <400> 26 gagcgttgtg tgcactgttc 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer HLA3_4,884R <400> 27 tctctctgcg gctacatcct 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nar1.2_1,736F <400> 28 agttgaggca ggttgagagc 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Nar1.2_1,855R <400> 29 ccctgaccag ttgttgccat 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer LCI1_1,125F <400> 30 tggtttactg gccgcttctg 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer LCI1_1,244R <400> 31 tcacacagcc aatcgaggtt 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer CIA8_1,745F <400> 32 ctggagtgag ggggcatatg 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CIA8_1,867R <400> 33 ttcataggtt cgtgcctccc 20 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SLC_cre09.g393250_1,874F <400> 34 cgttactccc gtactcgtac c 21 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SLC_cre09.g393250_1,993R <400> 35 gcccaccgaa ctacagagag 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SLC_cre02.g147450_2,777F <400> 36 ataggcggca gggaaaactc 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SLC_cre02.g147450_2,896R <400> 37 tttgtggaat ccgcgtgaca 20 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer CBLPF <400> 38 cttctcgccc atgaccac 18 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer CBLPR <400> 39 cccaccaggt tgttcttcag 20

Claims (29)

1. 서열식별번호 (SEQ ID NO): 4와 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 녹조류 Cia8 단백질을 코딩하는 cDNA 분자이며, 여기서 녹조류 Cia8 단백질이 비카르보네이트를 수송하는 것인 cDNA 분자.
2. 제1항에 있어서, 서열식별번호: 3과 100％ 서열 동일성을 갖는 cDNA 분자.
3. 제1항에 있어서, 서열식별번호: 3과 99％ 이상의 서열 동일성을 갖는 cDNA 분자.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 녹조류 Cia8 단백질이 비카르보네이트에 결합하고/거나 이를 수송하는 것인 cDNA 분자.
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 4와 99％ 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA 분자.
6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에서와 같은 cDNA 분자를 포함하며, 여기서 cDNA 분자는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 것인 재조합 폴리뉴클레오티드.
7. 녹조류로부터의 Cia8 폴리펩티드에 상응하는 단리된 폴리펩티드 분자이며, 여기서 Cia8 폴리펩티드가 서열식별번호: 4와 95% 이상의 서열 동일성을 갖고, 녹조류 Cia8 단백질이 비카르보네이트를 수송하는 것인, 단리된 폴리펩티드 분자.
8. 제7항에 있어서, 서열식별번호: 4와 100％ 서열 동일성을 갖는 단리된 폴리펩티드 분자.
9. 제7항에 있어서, 서열식별번호: 4와 99％ 이상의 서열 동일성을 갖는 단리된 폴리펩티드 분자.
10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 비카르보네이트에 결합하고/거나 이를 수송하는 단리된 폴리펩티드 분자.
11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에서와 같은 cDNA 분자를 포함하는 벡터.
12. 제6항의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
13. 서열식별번호: 4와 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA 분자를 포함하는 벡터.
14. 제11항에 있어서, 적어도 1종의 선별가능한 마커 서열을 추가로 포함하는 벡터.
15. 제11항에서와 같은 벡터를 포함하는 세포.
16. 제15항에 있어서, 식물, 박테리아, 효모, 또는 진균 세포인 세포.
17. 세포 중 적어도 1개가 제11항에서와 같은 적어도 1종의 벡터를 포함하는 것인 세포의 집단.
18. 제17항에 있어서, 단백질 생산, 단백질 회수, 또는 번역후 단백질 변형을 최적화하는 적어도 1종의 벡터를 추가로 포함하는 세포의 집단.
19. 제17항에 있어서, 모든 세포가 동일한 종으로부터의 것인 세포의 집단.
20. 제17항에 있어서, 1개 이상의 세포가 상이한 종으로부터의 것인 세포의 집단.
21. 제17항에 있어서, 집단 내의 세포의 1％ 내지 100％가 동일한 유형의 벡터(들)를 함유하는 것인 세포의 집단.
22. 재조합 폴리뉴클레오티드를 함유하는 복수의 세포를 포함하는 트랜스제닉 식물이며,
    재조합 폴리뉴클레오티드는
    서열식별번호: 4와 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 녹조류 Cia8 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자이며, 여기서 녹조류 Cia8 폴리펩티드가 비카르보네이트를 수송하는 것인 DNA 분자, 및
    녹조류 Cia8 폴리펩티드가 상기 식물의 세포에서 발현되도록 상기 DNA 분자에 작동가능하게 연결된 적어도 1종의 조절 서열
    을 포함하는 것인 트랜스제닉 식물.
23. 제22항에 있어서, 녹조류 Cia8 폴리펩티드가 비카르보네이트에 결합하고/거나 이를 수송할 수 있는 것인 트랜스제닉 식물.
24. 제22항 또는 제23항에 있어서, DNA 분자가 서열식별번호: 1 내지 3 중 어느 하나와 동일한 것인 트랜스제닉 식물.
25. 제22항 또는 제23항에 있어서, DNA 분자가 서열식별번호: 1 내지 3 중 어느 하나와 99％ 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 트랜스제닉 식물.
26. 제22항 또는 제23항에 있어서, DNA 분자가 서열식별번호: 4와 동일한 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 것인 트랜스제닉 식물.
27. 제22항 또는 제23항에 있어서, DNA 분자가 서열식별번호: 4와 99％ 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 것인 트랜스제닉 식물.
28. 식물의 적어도 1개의 세포의 게놈 내로 서열식별번호: 4와 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 녹조류 Cia8 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자, 및 녹조류 Cia8 폴리펩티드가 상기 식물의 세포에서 발현되도록 상기 DNA 분자에 작동가능하게 연결된 적어도 1종의 조절 서열을 통합시키는 단계이며, 여기서 녹조류 Cia8 폴리펩티드가 비카르보네이트를 수송하는 것인 단계, 및
    상기 식물을 성장시켜, 녹조류 Cia8 폴리펩티드를 야생형 식물 세포에 비해 과다-발현시키는 단계
    를 포함하는, 식물에서의 녹조류 Cia8 폴리펩티드의 발현을 야생형 식물에 비해 증가시키는 방법.
29. 삭제

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