JP2019518461A - 緑藻重炭酸輸送体およびその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、「緑藻重炭酸輸送体およびその用途」と題する、2016年6月20日に出題された、同時係属中の米国仮特許出願第62/352,278号の利益と優先権を主張し、その内容の全体が本明細書に参考として組み込まれる。
本出願は、2016年6月16日に作成され、222220-2080_ST25.txtと題する、ASCII.txtファイルとして電子的様式で提出された配列表を含む。その配列表の内容の全体が本明細書に参考として組み込まれる。
緑藻とその他の光合成水棲生物は、自然環境において、しばしばCO2が低い状況やCO2が変動する状況に晒される。これらの生物に対するCO2利用性は、数ある要因の中、水におけるガスの遅い拡散、2つの無機質カーボン形状(CO2およびHCO3 −)の遅い相互変換、及びpHの変動に制限される。したがって、ほとんど全ての水棲光合成生物は、ルビスコ(Rubisco)で固定する無機質炭素(Ci)を有効に濃縮するために、CO2制限条件下で誘導可能な二酸化炭素濃縮メカニズム(CCM:carbon dioxide concentrating mechanism)を進化した(Giordanoほか、2005)。緑藻のChlamydomonas reinhardtiiに関して現在使用されているCCMモデル(Jungnickほか、2014;Wang及びSpalding、2014)では、細胞膜と葉緑体包膜上の重炭酸輸送体は、Ciを移動させる、とりわけHCO3 −を膜を通して移動させるCCMの重要な要素であると考えられている。CCMの他の要素は、CO2とHCO3 −を相互変換する炭酸脱水酵素を含む(Mitraほか、2005;Moroneyほか、2011)。C. reinhartiiには、葉緑体の底にピレノイドと呼ばれるコンパートメントがある。そのピレノイドが、CO2制限条件下でルビスコが隔離される場所である(Kuchitsuほか、1988;Rawatほか、1996;Borkhseniousほか、1998)。おそらくHCO3 −がピレノイドに入る経路を提供するために、ピレノイドにはチラコイド細管や微細管の広いネットワークが関係している(Engelほか、2015)。それらの細管に炭酸脱水酵素CAH3が存在し、CAH3が内腔の中でHCO3 −を固定用のCO2に変換することが仮定されている(Moroney及びYnalvez、2007)。
ここに開示する内容は、以下の用語を以下に説明する定義にしたがって使用しながら説明される。
緑藻やその他の光合成水棲生物は、自然環境において、しばしば低CO2やCO2が変動する状況に晒される。この生物に対するCO2利用性は、数ある要因の中、水におけるガスの遅い拡散、2つの無機質カーボン形状(CO2およびHCO3 −)の遅い相互変換、及びpHの変動に制限される。したがって、ほとんど全ての水棲光合成生物は、ルビスコ(Rubisco)で固定するための無機質炭素(Ci)を有効に濃縮するために、CO2制限条件下で誘導可能な二酸化炭素濃縮メカニズム(CCM:carbon dioxide concentrating mechanism)を進化した(Giordanoほか、2005)。現在までのところ、C. reinhardtiiにおける2つの高親和性重炭酸輸送タンパク質と1つの低親和性重炭酸輸送タンパク質が特徴づけられ、低CO2条件下で機能できることが知られている。HLA3とLCI1は、形質膜に位置するCi輸送体であると考えられている。3つ目の輸送体、NAR1.2(LCIAとも呼ばれる)は、ギ酸・亜硝酸輸送体ファミリーに属する葉緑体包膜のタンパク質である。これまでは、直接な証拠はないものの、NAR1.2は葉緑体包膜におけるCiの取り込みによるものとされてきた。
単離ヌクレオチド及びcDNAの配列
本開示は、緑藻Cia8ポリペプチドの全部または一部をコードできる単離ヌクレオチド及びcDNA配列を記載する。いくつかの実施形態では、ここに提供する単離または合成のヌクレオチドまたはcDNA配列にコードされる緑藻Cia8ポリペプチドは、重炭酸を結合、及び/または輸送できる。
また、上記の単離ヌクレオチドまたはcDNA配列またはその断片と、その単離ヌクレオチドまたはcDNA配列またはその断片に機能的に結合された追加のポリヌクレオチド配列との任意のものを有する組み換えヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態では、非コードヌクレオチドを、分子の機能的性質を影響せずに、緑藻Cia8ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの5’末端及び/または3’末端に配置することができる。ポリヌクレオチドのコード領域の3’末端にポリアデニル化領域を含むことができる。ポリアデニル化領域は、内在性遺伝子、各種の他の植物遺伝子、T−DNA、または化学合成に由来できる。さらなる実施形態では、緑藻Cia8ポリペプチドをコードするヌクレオチドは、翻訳と同時または翻訳後に緑藻Cia8ポリペプチドの移動を指示する緑藻Cia8ポリペプチドの(例えば)N末端におけるシグナルまたはトランジット(またはリーダー)配列をコードする核酸に結合されてもよい。また、ポリヌクレオチド配列は、コードされた緑藻Cia8ポリペプチドがリンカー、選択可能なマーカー、またはタンパク質の合成、精製、及び/または識別を容易化する他の配列に結合されるように変更できる。1つの実施形態では、組み換えポリヌクレオチド配列は、単離ヌクレオチドまたはcDNA配列、またはその断片に機能的に結合されている少なくとも1つの調節配列を含む。
本開示は、Cia8等の、緑藻からの溶質担体に対応する単離または合成タンパク質(ポリペプチド)も記載する。いくつかの実施形態では、単離ポリペプチドは、配列番号4に対応するアミノ酸配列を有することができる。単離または合成ポリペプチドは、配列番号4と少なくとも約99%の同一性を有するアミノ酸配列をもつことができる。いくつかの実施形態では、単離または合成ポリペプチドは、配列番号4と少なくとも約98%の同一性を有するアミノ酸配列をもつことができる。他の実施形態では、単離ポリペプチドは、配列番号4と少なくとも約95%、少なくとも約85%、少なくとも約80%、少なくとも約70%、または少なくとも約50%の配列同一性を有するアミノ酸配列をもつことができる。いくつかの実施形態では、単離または合成ポリペプチドは、配列番号4と約70%超、または約70%から約90%、または約90%から約100%の同一性を有する。
ここに記載されるポリヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチドを1つ以上を有するベクターは、様々なレベルの緑藻Cia8を発現するトランスジェニックの細菌、真菌、酵母、及び植物の細胞と、トランスジェニック植物の生産において有用となり得る。本開示の範囲内には、ここに記載するポリヌクレオチド配列の1つ以上を含むベクターが含まれる。
上記のポリヌクレオチド配列とベクターは、トランスジェニック植物を生成するために使用できる。本開示は、1つ以上の細胞を有するトランスジェニック植物であって、当該1つ以上の細胞は、緑藻Cia8をコードするDNA配列を有する上述の組み換えポリヌクレオチドまたはベクターのうち任意のものを含む植物を含む。1つの実施形態では、組み換えポリヌクレオチドは、配列番号1〜3のいずれか1つと少なくとも約90%、または約90%から約95%、または約95%から約100%の配列同一性を有する緑藻Cia8DNA配列に機能的に結合している少なくとも1つの調節エレメントを含む。
本開示は、前述のように1つ以上の単離ヌクレオチドまたはcDNA配列、及び/またはベクターで形質転換した1つ以上の細胞も包含する。いくつかの実施形態では、形質転換した細胞は、植物、細菌、真菌、または酵母の細胞である。1つの実施形態では、前述のように、植物、細菌、真菌、または酵母の細胞は、1つ以上のベクターを含む。また、集団の細胞のうち約1%から100%、または50%から75%、または75%から100%が前述のようにベクターを含む細胞の集団も本開示の範囲に含まれる。
さて、本開示の実施形態を概して記載した上で、以下の例は本開示の追加の実施形態を説明する。本開示の実施形態は、以下の例とそれに対応するテキスト及び図面に関連して記載されるが、本開示の実施形態をその記載に限定する意図はない。むしろ、本開示の趣旨及び範囲に属するすべての代案、変更、及び同等物が含まれることを意図する。
はじめに
この例は、ここでCia8と呼ばれ(Phytozome ID: Cre09.g395700)、溶質担体タンパク質をコードし、変異誘発スクリーニング(mutagenesis screening)で識別された遺伝子の識別と特徴づけを示す。Cia8遺伝子は、溶質担体タンパク質(SLC: solute carrier)スーパーファミリーに属する保存された膜貫通タンパク質の群(Pushkin及びKurtz、2006)であるNa+/胆汁酸共輸送体(symporter)ファミリー(SBF)に属する膜貫通タンパク質をコードする。結果によって、Cia8遺伝子の産物は、C. reinhardtiiにおける重炭酸の取り込みに関与し得ること、及び/または低CO2条件で増殖を向上させることができることが示される。
Cia8変異体は、よく増殖するためには高CO2条件が必要である
Cia8変異体は、パロモマイシン抵抗性を与えるStreptomyces rimosusに由来するアミノグリコシド3’−ホスホトランスフェラーゼ・タイプVIIIをコードする遺伝子(AphVIII)を含む1.8kb AphVIII paraRカセットを用いた挿入性変異誘発スクリーンに続いて識別された(Sizovaほか、2001)。変異体は、MINプレート上で高CO2(約5%)及び低CO2(約0.01%)で増殖させることによってスクリーンされ、そこでCCM変異体の可能性のあるものは、低CO2で増殖される場合に遅い増殖を示す(Jungnickほか、2014)。Cia8変異体は高CO2条件で良好に増殖した(図1A)が、低CO2ではそれほど増殖しなかった(図1B)ため、更なる研究を行った。細胞を0.01%CO2で液体(MIN)培養において増殖したときにも増殖の遅い表現型が見られ、そこでcia8変異体の倍加時間は、D66の20時間に比較して、30時間であった(図1C)。
Cia8遺伝子におけるAphVIIIインサートの位置は、Pollockほか(2016)が記載したアダプターPCRで決定された。インサートは、図2Aの遺伝子モデルに示されるように、Cia8遺伝子の第10エクソンに位置している。インサートの存在を確認するために、インサートの5’UTRと3’UTRを増幅する2つのプライマー対を用いてPCR増幅を行った。表2は、本研究において使用されたプライマーの一覧を示す。この変異体において挿入部位に隣接するゲノムDNAは単離され、配列決定された。配列決定されたゲノムDNAの解析によって、(インサートの末端で)カセットの5’UTRで遺伝子配列の16個の塩基が欠失され、19個の塩基の新しい領域が挿入されていることが明らかになった。インサートの3’UTRはそのままの状態で、欠失も挿入もなかった。この解析によって、目的の遺伝子配列が第10エクソンにおいて破壊され、他に大きなDNA欠失または挿入が生じなかったことが確認された。
遺伝子における転写の中断も、挿入部位にまたがる遺伝子特異的プライマー対を使用した逆転写PCR(RT−PCR)によって確認された。RT−PCRの結果は、Cia8変異体においてそのままの状態のCia8転写物の検出可能な発現が存在しなかったことを示し(図3)、したがって、転写物が破壊され、変異体において遺伝子生産物は検出可能なレベルより少なく存在することが確認された。野生型の高CO2細胞に、Lici8 mRNAが検知された。低CO2細胞で著しい転写体の発現増加(upregulation)が観察され(図3)、したがって、Cia8遺伝子は低CO2条件下で誘導可能であることが示唆される。このRT−PCRの結果は、転写物がCia5変異体と野生型において同等に発現されたため、CIA8をコードする遺伝子は、ほとんどのCCM遺伝子のマスター調節因子であるCia5遺伝子に調節されないようであることを示す。
cDNAとゲノムの配列を比較すると、ゲノムにおける9番染色体に位置するCia8は、12のエクソンを有することが示される。ヌクレオチド配列に基づくと、Cia8は529個のアミノ酸からなるポリペプチドをコードし、ナトリウム/胆汁酸(SBFに似た)溶質担体タンパク質群と最もよくアラインメントする。タンパク質の構造を予測するためにPHYRE2ソフトウェア(Kelleyほか、2015)を使用した。370個のアミノ酸(アミノ酸160〜529)を含むタンパク質の中心の膜間部分を使用すると、最も高い相同性スコアが得られた。予測の結果は、図4に示されるように、15〜24個のアミノ酸を備える推定膜間ドメインと、膜貫通ヘリックスの間にある8〜30個のアミノ酸からなる細胞外ループを明らかにする。TM5と6の間にある3番目のループは他のループよりも長く、それはSLC4タンパク質の特性である。このたんぱく質は、細菌(Yersinia frederikseni)のNa+/代謝物共輸送体に対して最もよく(82%)スレッドしたが、いくつかの細菌からのHapAタンパク質(Na+/H+交換輸送体)にもよくスレッドした(56〜98%)。
PFAMデータベースで検索した結果、CIA8に類似する予測タンパク質が8つ見つかった:Cre02.g147450;Cre06.g250450;Cre09.g393250;Cre12.g521950;Cre10.g448350;Cre12.g532500;Cre02.g095085;およびCre02.g095086、全てNa+/胆汁酸輸送体として注記されている。これらのタンパク質とCIA8の配列同一性は、19〜31%の間で異なる。C. reinhardtiiにおけるNa+/胆汁酸輸送体遺伝子の数については、Arabidopsisにおいて6つ(Sawadaほか、2009)、ヒトにおいて7つ(Heほか、2009)、及び海洋性珪藻Phaeodactylum tricornutumにおいて5つ(Ashworthほか、2016)が報告されているため、ほかの種に相当する。この種類のタンパク質によって輸送されるイオンの数を考慮すると、この数値は驚きではない。また、CIA8タンパク質は、多くの場合はまだ特徴づけられていない、高等植物に由来するいくつかのSBFクローンに対して相当な配列類似性を示す(図9)。最も近い藻の相同物は、76%の同一性を示したVolvox carteriにおいて見出された。CIA8に類似性を示す別のタンパク質は、23%の同一性を示す酵母タンパク質YNL275wであった。この酵母タンパク質は、HCO3 −輸送体のスーパーファミリーに属し、潜在的基質(substrate)として、HCO3 −を含むいくつかのアニオンを受けることが示された(Zhao及びReithmeier、2001)。この解析によって、Cia8遺伝子の生産物は、保存ドメインによって特徴づけられる保存膜輸送タンパク質のファミリーに属することが示唆され、Ciの輸送に関与し得ることも示唆される。
CIA8の発現はCO2制限に強く応答するため、CCMにおける潜在的機能を生理学的アッセイで評価した。CIA8を欠く株は、高いK(0.5)(Ci)を示し、よって野生型の細胞よりも無機質炭素に対する親和性が低いことが示された(図5A〜5B)。pH(7.3)で、野生型細胞のK(0.5)(Ci)は25μMであった。それに対してCia8変異体細胞は、90μMの著しく高いK(0.5)(Ci)を有し(表1)、よって変異体においては低いCi親和性が示唆された。媒質における主要なCi種類は重炭酸であり、よって酸素発生は重炭酸の能動的取り込みにより強く依存することを前提に、pH9.0でも酸素の発生を測定した。K(0.5)の変化は、高いpHでも有意であり、野生型細胞の100μMに比較してCia8変異体細胞は350μMのより高いK0.5(Ci)を示した(図5C、表1)。この結果は、変異体における低い重炭酸親和性を確証し、したがって、Ciの取り込みにおけるCia8遺伝子生産物の役割を確証する。
TargetP/ChloroP (http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)を用いた解析の結果、CIA8ペプチドは葉緑体膜のタンパク質であることが示唆された(スコア81%)。N末端の別のアラインメントをSCLpred-Bologna Biocomputing Group (scholor.biocomp.unibio.it)で実行した。このソフトウェアは、CIA8が葉緑体輸送ペプチド(cTP;スコア0.79)とチラコイド(0.81)を有することを予測した。また、チラコイド膜としてある位置を予測した(0.6)。Arabidopsisチラコイドの交換輸送体であるKea3.3がコントロールとして使用され、ソフトウェアはcTP(スコア0.77)とチラコイド膜としての割り当てを予測した。この予測は、CIA8が葉緑体タンパク質である強いしるしである。
シアノバクテリアにおける低親和性重炭酸輸送体であるBicAを含み、いくつかの溶質輸送体はNa+依存性であることが知られている(Priceほか、2004;Price及びHowitt、2011)。Cia8遺伝子機能がNa+に依存し得るか否かを決定するために、異なるNa+濃度(<10μM〜200μM)で野生型細胞と変異体細胞を培養した。両方がpH6.8のプレート上で低Na+濃度(<10μM)から100mMにおいてよく増殖した(図10)。しかし、200mM Na+で細胞の増殖が阻害された。野生型細胞とCia8細胞が低Na+濃度でよく増殖した観察は、C. reinhardtiiにおいてHCO3 −を取得するためにNa+イオンは不必要であることを示し得、淡水において外部のNa+濃度が一般に低い(<1mM)ことを反映し得る(Pootakhamほか、2010)。しかし、Cia8を含む一部の輸送体は内部の輸送体であるため、外部のNa+濃度を変えることで内部の濃度が変化することは明らかではない。
ChlamydomonasのCia8変異体と野生型における他の既知の輸送体の発現を定量化及び比較するために、Hla3、Nar1.2、Lci1、及びCia8に加え、他2つのSLC遺伝子(遺伝子ID:Cre02.g147450及びCre09.g393250)の発現を定量的RT−PCR解析で調べた。RNAのサンプルは、高CO2馴化及び低CO2馴化の培養から取得した。結果は、野生型(図7A)とCia8変異体(図7B)における、これらの輸送体遺伝子の発現レベルを示す。この結果は、通常は4時間を超えると発現が増加するHla3を除き、低CO2条件に馴化した場合にCia8遺伝子と他の輸送体の発現が増加することを確認する(Duanmuほか、2009)。野生型においては、低CO2条件に馴化した際に、Cia8遺伝子の4倍の発現増加が見られた。また、野生型細胞において、2つのSBF遺伝子の発現増加も見られた。また、この2つのSBF遺伝子の相対的な発現レベルは、野生型に比べてcia8変異体細胞においては多少低かった(図7C)。このデータによって、Cia8遺伝子生産物はCCMに関与していることが確認されるが、CIA8の損失は、低CO2条件では通常発現増加される他の遺伝子の転写的制御を影響し得ることも示唆される。
5’UTRと3’UTRをすべて含むCia8 cDNA(1869bp)を、自身のプロモーターとターミネーターの制御下で、pSP124ベクターへ導入し、Cia8変異体で発現させることでCIA8の補足(complementation)が達成された。形質転換された細胞は、ブレオマイシンによって選択された。10個の形質転換細胞が選択され、さらなる増殖試験と光合成アッセイにさらされた。増殖の結果は、補足株(com1及びcom2と呼ぶ)においては、低CO2条件の野生表現型が回復されたことを示す(図8A)。この2つの補足株からRNAを抽出し、cDNAを合成した。結果のRT−PCR解析は、Cia8転写物が回復されたことを示した(図8B)。さらに、pH9.0で行ったcom1のCi依存性酸素発生アッセイによって、補足株におけるK(0.5)(Ci)は野生型のものと同じであったことが示された。また、最大の酸素発生(Vmax)は、野生型とは大きく変わらなかった(図8C〜8D)。まとめてこの結果は、このCre09.g395700コード配列が、Cia8変異体の増殖を補足し、転写物の発現とCi取り込みにおける機能性を回復させたことを確証する。
Ci取り込み作用に対するCIA8の貢献を評価するために、同位体分別、例えば、D66、CIA8、及び補足細胞株com1における14Cの蓄積を測定するためにシリコーン油層遠心分離(silicone oil layer centrifugation)を使用した(図11A〜11B)。主要なCi種類が重炭酸であることを保証するために、高CO2(空気中約3% v/v CO2)または空気(低CO2)のセルで培養された細胞を用いてpH9.0で解析を行った。すべてのケースにおいて、低CO2に馴化した細胞は、高CO2で培養された細胞よりも多い量の蓄積Ciを有した(図11A)。Ci取り込みと光合成速度を比較すると、野生型細胞はCia8細胞よりも多量のCi蓄積とCi固定を有した(図11B)。さらに、com1細胞株において、Ci蓄積は完全に回復しなかったものの、光合成は野生型に近いレベルまで回復した。このデータは、重炭酸の形で取り込まれる可能性が高いCiの取り込みがCia8細胞において低下している仮定を裏付ける。
重炭酸輸送体とそれが果たす取り込み及び蓄積の必要性は、C. reinhardtiiのCCMの重要な特徴である。C. reinhardtiiにおける推定重炭酸輸送体は、一般に制限的CO2条件によって誘導される。また、輸送体の機能は重なるようである。1つだけの輸送体の発現が低下すれば、通常は強い増殖の表現型は生じなくなり、Ci取り込みに対して多少の影響が見られる。しかし、2つ以上の輸送体を減少すると、Ciの取り込みが影響され、低CO2における増殖も低下する。本研究では、挿入変異によって新しい変異体を生成し、(低CO2誘導可能な場合は)Cia8または(Ci蓄積の場合は)Cia8(この文書ではその名前は同じ意味で使用されている)と名付けた遺伝子(Phytozome ID:Cre09.g395700)において挿入を有する変異体を識別した。この例の最大の目的は、CIA8タンパク質がC. reinhardtiiのCCMに参加するか否かを決定することであった。この遺伝子における挿入は、低CO2におけるより低い増殖を引き起こし、細胞が制限されたCO2条件で増殖されたときにCi親和性の顕著な低下を引き起こしたことが、特徴づけられ、示された。補足性試験において、光合成アッセイで、野生型遺伝子からのCia8コード領域を発現することによって、正常の増殖表現型と機能を回復できた(図8A〜8D)。
細胞培養及び増殖
Chlamydomonas reinhardtiiの培養条件は、Maほか(2011)に記載された条件と同一であった。D66株(nit2-, cw15, mt+)はDr. Rogene Schnell(University of Arkansas, Little Rock)から取得し、cc124株(nit-, nit2-; mt-)はC. Reinhardtii Duke University Center (http://www.chlamy.org/)から取得した。Tris-Acetate-Phosphate(TAP)とMinimal(MIN)培地(無酢酸)は、Sueoka(1960)にしたがって作製した。増殖培地用のTAPとMINプレートの両方は、寒天(agar)を約1.2%(w/v)添加して作成された。細胞培養は、TAPプレートからエルレンマイヤーフラスコにおける100mLのTAP液体培地にコロニーを植え付けることによって開始された。培養は連続照明下で初期対数期まで増殖させ(約100μmol m−2 s−2)、及び48時間振動した。TAP増殖培養は収穫され、MIN培地で洗浄され、MIN培地において再懸濁され、そして0.2から0.3(約2〜3×106細胞 mL−1)の細胞密度OD730に達するために約48時間高CO2(空気中約5%[v/v]CO2)を泡立てながら接続した。CCM誘導のためには、細胞を低CO2(空気中約0.01%[v/v]CO2)に移動し、4時間泡立てた。
変異体は、Jungnickほか(2014)による変異誘発スクリーンで生成された。パロモマイシン抵抗性(paraR)を与えるAphVIII遺伝子を保有する直線状プラスミド(pSL18)で、電気穿孔法を用いてC. reinhardtiiのD66株を形質転換した(Shimogawaraほか、1998)。形質転換された細胞は、抗生物質パロモマイシン(約7.5μg mL−1、インビトロゲン)を含むTAPプレート上で選択された。抗生物質抵抗性の株は、上記と同様の光条件下で高CO2チャンバ(空気中約5%[v/v]CO2)及び低CO2チャンバ(空気中約0.01%[v/v]CO2)で増殖についてスクリーニングされた。細胞はMINプレート上にストリークされ、増殖チャンバに配置された。活発に増殖していた細胞を同じ細胞密度(OD730=0.15、0.07、及び0.03)で液体MIN培地に懸濁し、各懸濁液の約15μLをMINプレートにスポットすることによってスポット試験を行った。それらは7日間、高CO2、周囲CO2、及び低CO2のチャンバに置かれた。増殖チャンバにおけるCO2濃度はEnvironmental Gas Monitor(EGM-4, PP systems, Massachusetts)を用いて測定された。
AphVIII挿入を隣接するDNA領域を識別するためにはアダプター依存性PCR法を用いた(Pollockほか、2016)。相同性サーチは、Phytozomeデータベースのバージョン10.3におけるJoint Genome Institute C. reinhardtiiを用いて行われた(Merchantほか、2007;Blabyほか、2014)。
遺伝子交雑と四分子解析は、前述の通りに行われた(Moroneyほか、1986;Harris、2009)。対数期にあるCia8(mt+)とcc124(mt-)細胞培養を一時的に光の下で低窒素のTAP培地に移動し、配偶子形成を誘導するために一夜置かれた。翌朝、受精させるために各培養の3mLを光の下で3時間混ぜた。寒天を約4%含み、窒素を除いたTAP培地上に一定分量(約0.5mL)プレートした。接合子を熟成させるために、プレートは2週間暗い所に保存された。約14日間後に、減数***性発芽(meiotic germination)させるために接合子は約1.2%寒天のTAP培地プレートに移動された。四分子解析(tetrad dissection)が行われ、パロモマイシン抵抗遺伝子を低CO2でよく増殖しなかった子孫と関連づけることで連鎖を決定した。
従属栄養性のC. reinhardtiiの培養を約100mLのTAP培地において開始し、48時間培養させ、対数期に達成させた。細胞は遠心分離され、250mLのエルレンマイヤーフラスコに移動され、MIN培地に再懸濁され、OD730=0.2〜0.3(約3×106細胞 mL−1)の細胞密度を達成するまで5%のCO2で泡立てられた。その後、CCMを誘導させるために培養は4時間低CO2(約0.01%)に移動された。外部Ci(K0.5[DIC:dissolved inorganic carbon、溶存無機炭素])に対する親和性は、Maほか(2011)にしたがって予測された。この方法において、約100μgの葉緑素の均等物を有する細胞は、不活性窒素(つまりCO2フリー)ガスで泡立てられた25mMのHEPES−KOHバッファー(約7.3のpH)または25mMのCHES−KOHバッファー(約9.0のpH)の中に懸濁された。その細胞は、約300μmol m−2s−1で照明されたO2電極チャンバ(Rank Brothers, Cambridge Uk)に移動され、バッファーや細胞内に残存するDICが使い尽くされるまで放置される。内因的CO2が無くなると、正味のO2発生は観察されなかった。既知濃度のNaHCO3をチャンバに注入し、O2の発生速度を測定した。K0.5[DIC]は、酸素発生の最大半分の速度に必要であるDIC濃度として計算された(Badger、1985)。葉緑素含有量は葉緑素aとbを組み合わせることによって測定された。葉緑素は100%メタノールで抽出され、分光光度計を用いて測定された。K0.5(CO2)は、酸素発生Vmaxの半分に達するために必要なCO2濃度とした。
Cre09.395700遺伝子の全体(4846bp)が増幅され、EcoR1とNdel制限部位を用いて修飾されたpSL18CrGFPベクターに導入された。Cre09.395700遺伝子は、既にベクターに存在するChlamydomonasコドン最適化GFP遺伝子と同フレームにあるように挿入された(Fuhrmannほか、1999)。ベクターは、Kpn1切断で直鎖化された。Cia8遺伝子断片を用いた野生型株D66の形質転換は、直鎖化されたベクターで電気穿孔を行うことによって達成され、パロモマイシン抵抗性のコロニーはPCRを用いて解析された。GFPタグ付きのタンパク質をイメージするために、約5μLの細胞を約1.5%低融点アガロースと併せてスライドに載せた。細胞はLeica Sp2共焦点顕微鏡でイメージした。Kr/Arレーザーは、eGFPと葉緑素を両方励起させるために約488nmの波長に設定され、光電子増倍管は、eGFP蛍光を検知するために約500〜520nm、そして葉緑素自己蛍光を検知するために約660〜700nmに設定された。細胞をイメージするために20×のレンズを使用した。
提供ガイドライン(インビトロゲン)に従って、トリアゾル試薬を用いてRNAを抽出した。cDNAを合成するテンプレートとして総RNAの約1μgを使用した。製造者の指示に従ってcDNAを合成するために、高GC含有量の転写物用のSuperscript First Strand Synthesis System(Invitrogen, Carlsbad, CA)を使用した。製造者の指示(Applied Biosystems, Foster City, CA)に従ってABI Prism 7000配列検出システムにおいて定量的PCRを行うために、SYBR Select(Applied Biosystems, Foster City, CA)で使用するテンプレートとして、約100ngのcDNAのアリコートを用いた。正規化されたプライマーは、RT−PCR用のGAPFH遺伝子特有のプライマーであった。q−RTPCRには、コントロールとしてCBLP遺伝子が使用された(Musほか、2007)。それぞれのcDNAに対して使用されたプライマーは、表ににリストされている。
Cia変異体の補足は、Cia8細胞を、Cia8遺伝子の野生型コピーを含むコンストラクトで形質転換することによって達成された。コンストラクトは、5’UTRと3’UTR領域(2949bp)とプロモーター領域の1080bp断片を含むCia8 CDS断片からなるコンストラクトであった。これらの断片は、Not1制限部位を用いて連結され、その部位はそれからpGEM−Tに連結された。配列決定した断片は、BamHIとSacI制限部位を用いてシャトルベクターpSP124sにクローン化された。配列はPhytozomeバージョン10.2(phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal/html)から取得した。Cia8ゲノム断片を増幅するために使用されたプライマーは表2に表示されている。細胞形質転換には電気穿孔法が使用され、株はブレオマイシン抵抗性によって選択された(Shimogawaraほか、1998)。選択されたChlamydomonas株における補足DNAの存在は、PCRを用いて確認された。
H14CO3の活性種取り込みは、約9.0のpH(約25℃)で、シリコーン油遠心分離・ろ過で終了する約15秒の複数の取り込み期間で実行された(Priceほか、2004)。25mMストックからKHCO3アリコートが添加された(約9.5のpH)。約9.0のpHでHCO3 −から得られるCO2供給速度は、実験的に決定された速度定数を適用することによって算出された。表1は、野生型D66とCia8変異体細胞について、最高酸素発生活性(Vmax)とCi親和性、K(0.5)値を表す。細胞は48時間高CO2で増殖され、4時間低CO2に馴化された。カッコ内:±SE;n=3。
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Claims (29)
- 緑藻Cia8タンパク質をコードするcDNA分子。
- 前記cDNA分子は、配列番号3と100%の配列同一性を有する、請求項1に記載のcDNA分子。
- 前記cDNA分子は、配列番号3のいずれか1つと約90%以上の配列同一性を有する、請求項1に記載のcDNA分子。
- 前記緑藻Cia8タンパク質は、重炭酸に結合及び/又は重炭酸を輸送する、請求項1から3のいずれか1項に記載のcDNA分子。
- 前記cDNA分子は、配列番号4のいずれか1つと約90%以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項1から3のいずれか1項に記載のcDNA分子。
- 前記cDNA分子は、調節配列に機能的に結合している、請求項1から5のいずれか1項に記載のcDNA分子を含む組み換えポリヌクレオチド。
- 緑藻からのCia8ポリペプチドに対応する単離ポリペプチド分子。
- 前記ポリペプチド分子は、配列番号4のいずれか1つと100%の配列同一性を有する、請求項7に記載の単離ポリペプチド分子。
- 前記ポリペプチド分子は、配列番号4のいずれか1つと約90%以上の配列同一性を有する、請求項7に記載の単離ポリペプチド分子。
- 前記ポリペプチド分子は、配列番号4のいずれか1つと約70%以上の配列同一性を有する、請求項7に記載の単離ポリペプチド分子。
- 前記ポリペプチド分子は、重炭酸に結合及び/又は重炭酸を輸送する、請求項7から10のいずれか1項に記載の単離ポリペプチド分子。
- 請求項1から5のいずれか1項に記載のcDNA分子を含むベクター。
- 請求項6に記載の組み換えポリヌクレオチドを含むベクター。
- cDNA分子を含むベクターであって、前記cDNA分子は配列番号4のいずれか1つと約90%以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、ベクター。
- 少なくとも1つの選択可能なマーカー配列をさらに含む、請求項12から14のいずれか1項に記載のベクター。
- 請求項12から15のいずれか1項に記載のベクターを含む細胞。
- 前記細胞は、植物、細菌、酵母、又は真菌の細胞である、請求項16に記載の細胞。
- 少なくとも1つの細胞が請求項12から15のいずれか1項に記載の少なくとも1つのベクターを含む細胞集団。
- タンパク質の生成、タンパク質の回復、又は翻訳後のタンパク質の修飾を最適化する少なくとも1つのベクターをさらに含む、請求項18に記載の細胞集団。
- 前記細胞はすべて同種由来である、請求項18に記載の細胞集団。
- 1つ以上の細胞が異なる種に由来する、請求項18に記載の細胞集団。
- 前記集団内の前記細胞の約1%から約100%が、同じ種類のベクターを含む、請求項18から21に記載の細胞集団。
- 組み換えポリヌクレオチドを含む複数の細胞を含むトランスジェニック植物であって、前記組み換えポリヌクレオチドは、緑藻Cia8ポリペプチドをコードするDNA分子であって、配列番号1から3のいずれか1つと少なくとも約90%の配列同一性を有するDNA分子と、前記緑藻Cia8ポリペプチドが植物細胞の中で発現するように前記DNA分子と機能的に結合された少なくとも1つの調節配列とを含む、トランスジェニック植物。
- 前記緑藻Cia8ポリペプチドは、重炭酸に結合及び/又は重炭酸を輸送できる、請求項23に記載のトランスジェニック植物。
- 前記DNA分子は、配列番号1から3のいずれか1つと同一である、請求項23から24のいずれか1項に記載のトランスジェニック植物。
- 前記DNA分子は、配列番号1から3のいずれか1つと約90%以上の配列同一性を有する、請求項23から24のいずれか1項に記載のトランスジェニック植物。
- 前記DNA分子は、配列番号4と同一の配列を有するポリペプチドをコードする、請求項23から24のいずれか1項に記載のトランスジェニック植物。
- 前記DNA分子は、配列番号4と約90%以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項23から24のいずれか1項に記載のトランスジェニック植物。
- 植物における緑藻Cia8ポリペプチドの発現を、野生型植物に比較して増加させる方法であって、
前記緑藻Cia8ポリペプチドが植物細胞の中で発現するように、緑藻Cia8ポリペプチドをコードするDNA分子と、前記DNA分子に機能的に結合した少なくとも1つの調節配列とを、前記植物の少なくとも1つの細胞のゲノムに組み込むことであって、前記DNA分子は配列番号1から3のいずれか1つと少なくとも約90%の配列同一性を有する、組み込むことと、前記植物を成長させることと、を含み、こうして野生型の植物細胞に比較して緑藻Cia8ポリペプチドが過剰発現する、方法。
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